TÍTULO: ESTABELECIMENTO DE TÉCNICA DE EXTRAÇÃO DE RNA VIRAL PARA IDENTIFICAÇÃO DE ROTAVÍRUS EM AMOSTRAS DE FEZES
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): EDUARDA DE OLIVEIRA BARBOSA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): MARIA CLARA DUARTE FREGOLENTE ALVES ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): GABRIELLE YURI KURODA, LETICIA APARECIDA ALVES MOREIRA, MARCIA MARIA TSURUTA
1. Resumo
Os rotavírus são os principais causadores de diarreia, responsáveis por 20 a 60% dos casos de hospitalização de crianças. Os rotavírus pertencem à família
Reoviridae, gênero Rotavirus, e apresentam-se como partículas esféricas de simetria
icosaédrica, não envelopadas, com 100nm de diâmetro com três camadas proteicas concêntricas e com 11 segmentos genômicos de RNA fita duplas (dsRNA) que codificam, cada um, a síntese de uma proteína viral especifica. O objetivo do presente projeto foi estabelecer a técnica de extração de dsRNA viral no Núcleo de Pesquisa em Neurociência (NUPEN) da Universidade Cidade de São Paulo (UNICID) para identificação de rotavírus em amostras de fezes de animais. A partir das amostras de fezes de animais coletadas foram realizadas as técnicas de preparo das amostras, extração do dsRNA viral por fenol-clorofórmio e visualização dos segmentos em gel de poliacrilamida a 7,5%, de acordo com o protocolo de técnicas. Essas técnicas foram aplicadas em 78 amostras coletadas, obtendo resultado negativo em 60 amostras e resultado inconclusivo em 18 amostras. Este projeto permitiu implantar de maneira adequada a metodologia de extração de dsRNA de origem viral. Com isso, podemos planejar utilizar a técnica a fim de detectar a presença de rotavírus em amostras de fezes de outros indivíduos ou animais.
2. Introdução
A gastroenterite é a segunda doença que mais mata crianças com idade inferior a cinco anos no mundo todo (WHO, 2010) e a cada ano ocorrem cerca de 125 milhões de quadros de diarreia grave (GREENBERG & ESTES, 2009). Os rotavírus são os principais causadores, responsáveis por 20 a 60% dos casos de hospitalização devido à diarreia (NESTI & GOLDBAUM, 2007).
Os rotavírus pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus, e apresentam-se como partículas esféricas de simetria icosaédrica, não envelopadas, com 100nm de diâmetro com três camadas proteicas concêntricas. A camada mais interna - core viral- é constituída por quatro proteínas, que têm a elas associadas uma proteína que constitui o capsídeo intermediário. Essa proteína, denominada VP6, é bastante imunogênica e induz a formação de anticorpos diferentes conforme a espécie de rotavírus. A terceira camada, ou capsídeo externo, é constituída por duas proteínas: VP7 e a VP4. Essas duas proteínas possuem papéis igualmente importantes na imunogenicidade dos rotavírus. (GREENBERG & ESTES, 2009).
O genoma dos rotavírus é constituído por 11 segmentos de dsRNA, com tamanhos que variam de 3302 a 663 pares de bases. Cada segmento do dsRNA codifica para pelo menos uma proteína, sendo seis proteínas estruturais (VP) e seis não-estruturais (NVP) (GREENBERG & ESTES, 2009).
A classificação dos rotavírus é complexa e tem sofrido mudanças relativamente constantes. Atualmente as cinco espécies de rotavírus (A, B, C, D, E) são definidas em função da VP6 (ICTV).
De acordo com a proposta de nomenclatura binária para os sorotipos de rotavírus, a especificidade antigênica da VP7 é designada pela letra G, de glicoproteína, e a especificidade antigênica da proteína VP4 é dada pela letra P, dado esta proteína ser sensível a proteases. Segundo estudos realizados os tipos mais comuns de rotavírus são: G1, G2, G3, G4 e P[4], P[6] e P[8], observando-se maior incidência de rotavírus tipo G1P[8] (GREENBERG & ESTES, 2009). A presença de múltiplos tipos G e/ou P nas amostras é consistente com infecções de mais de um tipo de rotavírus, o que aumenta a chance de rearranjos genéticos durante infecções naturais (PEREIRA, et. al., 1993).
A gravidade das gastroenterites por rotavírus é de conhecimento universal e seu maior impacto pode ser observado em países em desenvolvimento onde estão associados fatores agravantes como a desnutrição e coinfecção com outros patógenos (LINHARES, 2000). Apesar da ausência destes agravantes, países desenvolvidos também apresentam circulação significativa de rotavírus na população infantil (BRESEE, et al., 1999). A infecção por rotavírus é autolimitada, podendo apresentar sintomas ou não. Os quadros da doença podem variar de leves a graves, podendo levar à desidratação. (GREENBERG & ESTES, 2009). O grupo etário com maior detecção é de crianças menores de dois anos e a prevalência aumenta nos meses frios, como, por exemplo, maio, junho e julho (DEGIUSEPPE, et
al., 2013).
Prevalece, o consenso de que o melhor método para o controle das gastroenterites por rotavírus se dá através de estratégia vacinal (LINHARES, 2000). Em 2006 a imunização de crianças contra os rotavírus foi incluída no Programa Nacional de Vacinação no Brasil, tendo sido implantada, também, em outros 11 países da América Latina (LINHARES, et. al., 2011). Para tanto, uma vacina atenuada de genótipo G1P[8] é utilizada (CORREIA, et al., 2010) e como consequência verifica-se um acentuado declínio no número de casos de gastroenterite e/ou de hospitalizações ou mortalidade associadas a essa enfermidade, principalmente entre crianças entre 1 a 4 anos de idade (GURGEL, et
Após a vacinação foi encontrada uma incidência do genótipo G2P[4], que poderia ter adquirido vantagem seletiva ou esta variação pode ser associada a uma periodicidade temporal dentro do padrão clínico (ASSIS, et al., 2013; MORILLO, et
al., 2010). Os dados obtidos fazem relação com a prevalência mundial (LINHARES,
2000). A redução na ocorrência da doença por rotavírus é importante, pois implica na redução das comorbidades e nos encargos financeiros ao sistema de saúde brasileiro (ASSIS, et al., 2013; MORILLO, et al., 2010).
Antes, durante e após a implantação da vacina no calendário nacional a distribuição genotípica foi alterada conforme pode ser observado pela Tabela 1.
Tabela 1: Identificação de genotipos de
rotavírus observadas antes, durante e após a inclusão da vacina oral para rotavírus no calendário vacinal do Brasil.
Antes Durante Após
G1P[8] G1P[8] G2P[4] G1P[6] G2P[4] G3P[8] G2P[4] G9P[8] G3P[8] G9P[8] G12P[8]
Recentemente, relatou-se uma alta prevalência de G2P[4] associada com essa vacinação no Brasil (NAKAGOMI, et al., 2008), sugerindo que essa vacina monovalente possivelmente criou condições em que o G2P[4] poderia adquirir vantagem seletiva sobre genótipos P[8] (ARAUJO, et al., 2007). Com isso, as atuais pesquisas visam analisar a prevalência e circulação dos genótipos de rotavírus em crianças menores de cinco anos.
Para a identificação dos rotavírus em amostras de fezes, diferentes metodologias são utilizadas. Pereira e colaboradores (1993), utilizaram a extração do dsRNA seguida de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e o ensaio imunoenzimático (ELISA). A caracterização genotípica de amostras positivas pode ser realizada por reação em cadeia de polimerase precedida de transcrição reversa
(RT-PCR) seguido de PCR multiplex para amplificação dos genes codificadores de proteínas VP7 e VP4 e principais genótipos (GOUVEA, et. al., 1990).
No trabalho de PIMENTEL & COSTA (2010), foi utilizada para identificação e caracterização dos diferentes genótipos de rotavírus a extração de RNA viral, segundo a técnica de Pereira et. al, (1993). O método de visualização utilizado foi a EGPA a 7,5%, preparado de acordo com COSTA et al. (1990).
3. Objetivo
Estabelecer a técnica de extração de dsRNA viral no NUPEN da UNICID para identificação de rotavírus em amostras de fezes.
4. Metodologia
Antes de iniciar as metodologias, foram preparadas as soluções necessárias de Tampão Fosfato Salina (PBS) e Duodecil Sulfato de Sódio (SDS).
O preparo do PBS foi realizado conforme dados da Tabela 2.
Tabela 2: Reagentes e suas quantidades utilizadas para o preparo de 1000 mL de
PBS.
Reagente Massa ou Volume
NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2HPO4 12 H2O – 2,89 g 7 H20 – 2,1636 g Anidro – 1,1463 g KH2PO4 0,2 g
Água destilada (complementar para) 1000 mL
Preparo do SDS: foram preparadas 100mL de solução a 10% em água destilada.
Para a implantação da técnica de extração de dsRNA foram utilizadas amostras de fezes de animais dos biotérios existentes no NUPEN. Amostras de
rotavírus de símio (SA-11) obtidos a partir de cultura celular foram utilizadas como controle positivo nas reações.
A partir das amostras de fezes, foram preparadas suspensões a 10% em PBS após centrifugação a 2.000 rpm por 10 minutos. As amostras de fezes e suspensões foram armazenadas a 4°C durante todo o período do estudo.
A extração do dsRNA viral foi feita por fenol-clorofórmio segundo Herring e colaboradores (1982) com modificações. Partindo de 500 μL da suspensão fecal, foram adicionados 50 μL de SDS a 10% e seguiu-se uma incubação a 37° C por 30 minutos. Foram então acrescidos 500 μL de fenol-clorofórmio (v/v) e a suspensão foi agitada em Vortex por 1 a 2 minutos. Após centrifugação a 12.000 rpm por 10 minutos, a fase aquosa foi removida e a ela foram adicionados 50 μL de NaCl a 20% e 1.000 μL de etanol a 4° C. A reação foi incubada a -20° C por 18 horas e então se seguiu com a centrifugação a 12.800 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e ao precitado foram adicionados 20 μL de mistura dissociante. Antes da eletroforese os extratos foram incubados a 56°C por 15 minutos.
5. Desenvolvimento
A técnica utilizada no presente projeto (HERRING, et al., 1982) não apresentou problemas em sua aplicação, comparada com a amostra controle positiva ao final da visualização do gel. O volume/ condição e duração de cada etapa se encontram na tabela 3.
Tabela 3: Etapas, quantidade e duração do método utilizado
neste projeto de Herring e colaboradores (1982).
Herring (1982)
ETAPAS Volume/Condição Duração
Suspensão Fecal 500µL - SDS 50µL - Banho-Maria 37ºC 30min Fenol-Clorofórmio 500µL - Agitação - 1 a 2 min Centrifugação 12.000 rpm 10min NaCl 20% 50µL -
Etanol 1.000µL -
OVERNIGTH -20ºC 18h
Centrifugação 12.800 rpm 10min
Mistura Dissociante 20µL -
Incubação 56ºC 15min
A técnica segundo Herring e colaboradores (1982) foi aplicada em 78 amostras de animais, sendo 52 amostras de ratos e 26 amostras de pombos.
6. Resultados
Os dados de coleta das amostras, bem como os resultados obtidos após a EGPA se encontram na Tabela 4.
Tabela 4: Número total de amostras coletadas, animal doador e
resultado obtido após EGPA.
Animal Resultados Total
Negativo Inconclusivo
Rato 34 18 52
Pombo 26 0 26
Total 60 18 78
Dezoito amostras de fezes de rato, após corrida eletroforética, não apresentaram segmentos. Porém, como não houve visualização do controle positivo, o resultado foi caracterizado como inconclusivo. Estas amostras devem ter a extração repetida para confirmação do resultado.
A visualização do dsRNA e o perfil eletroforético das amostras e controle positivo em gel de poliacrilamida após coloração com nitrato de prata se encontra nas Figuras 1 e 2.
C+ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 28 36 37 38 39 40 41 C+ 21 22 23 24 25 26 27 29 30 31 32 33 34
6. Considerações Finais
Várias técnicas têm sido aplicadas para a extração de dsRNA. As mais utilizadas são as técnicas segundo Herring e colaboradores (1982) e Pereira e colaboradores (1993), além de outras técnicas que apresentam caráter didático.
Fazendo uma breve comparação entre as duas técnicas, não há diferença de reagentes e se assemelham em grande parte da aplicação. Diferenciam-se em volume/condição e em duração/tempo de conclusão da mesma. O volume é inversamente proporcional ao tempo de conclusão. Com isso, a elaboração do método de Herring é concluída de forma mais rápida, contudo as duas técnicas continuam sendo utilizadas, mostrando-se eficazes. De acordo com a literatura, a opção por uma das técnicas não influencia na veracidade dos resultados.
A extração do dsRNA viral feita por fenol-clorofórmio segundo Herring e colaboradores (1982) com modificações foi aplicada de forma correta, portanto, pode ser utilizada para a análise de outras amostras de fezes que venham a ser coletadas.
7. Fontes Consultadas
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Figura 1 – Gel em poliacrilamida após
coloração com prata. C+: controle positivo; Colunas de 1 a 18: amostras negativas (Z10 à Z20, Z28, Z36 à Z41).
Figura 2 – Gel de poliacrilamida após
coloração com prata. C+: controle positivo; Colunas de 1 a 14: amostras negativas (Z21 à Z27, Z29 à Z34).
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