Identificação de mutações funcionalmente associadas ao mutante IL7R'alfa' na LLA-T : Identification of mutations functionally associated with IL7R'alpha' mutant in T-ALL

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto De Biologia

GISELE OLINTO LIBANIO RODRIGUES

IDENTICAÇÃO DE MUTAÇÕES FUNCIONALMENTE

ASSOCIADAS AO MUTANTE IL7Rα NA LLA-T

IDENTIFICATION OF MUTATIONS FUNCTIONALLY

ASSOCIATED WITH IL7Rα MUTANT IN T-ALL

CAMPINAS

2017

IDENTICAÇÃO DE MUTAÇÕES FUNCIONALMENTE

ASSOCIADAS AO MUTANTE IL7Ra NA LLA-T

IDENTIFICATION OF MUTATIONS FUNCTIONALLY

ASSOCIATED WITH IL7Rα MUTANT IN T-ALL

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na Área de Genética Animal e Evolução

Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology, on the area of Animal Genetics and Evolution

Orientador: JOSÉ ANDRÉS YUNES

CAMPINAS

2017

VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA GISELE OLINTO LIBANIO RODRIGUES E ORIENTADA PELO DR. JOSÉ ANDRÉS YUNES

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Identification of mutations functionally associated with IL7Rα mutant in T-ALL

Palavras-chave em Inglês: Leukemia

Mutation Genomics

Área de concentração: Genética Animal e Evolução Titulação: Doutora em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:

José Andrés Yunes [Orientador] Letícia Frohlich Archangelo

Mariana Emerenciano Cavalcanti de Sá Jörg Kobarg

Henrique Marques Barbosa de Souza Data da defesa: 09-10-2017

Programa de Pós Graduação: Genética e Biologia Molecular

Rodrigues, Gisele Olinto Libanio, 1981-

R618i Identificação de mutações funcionalmente associadas ao mutante IL7Rα na LLA-T / Gisele Olinto Libanio Rodrigues. – Campinas, SP: [s.n.], 2017.

Orientador: José Andrés Yunes.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

1. Leucemia. 2. Mutação. 3. Genômica. I. Yunes, José Andrés. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. José Andrés Yunes

Prof. Dra. Leticia Fröhlich Archangelo

Prof. Dr. Jörg Kobarg

Prof. Dr. Henrique Marques Barbosa de Souza

Prof. Dr. Mariana Emerenciano Cavalcanti de Sá

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

"Omnis cellula e cellula" Rudolf Virchow (1821-1902)

Dedico este trabalho a meus pais Emilia e Roberto, ao meu marido Francisco, e a todas as crianças que lutam contra a leucemia infantil

Aos meus pais, Emilia e Beto (gorduchinha e grisalhinho), meus principais incentivadores e admiradores. As únicas pessoas no mundo que me dão a certeza absoluta de que eu estou amparada 24 horas por dia, 7 dias por semana. Vocês são minha vida!

Aos meus irmãos, Juninho e Raphael, amigos e companheiros para qualquer situação. Por me protegerem mesmo eu sendo a mais velha, e por torcerem por mim sempre.

À minhas cunhadas, Dani e Rosa, irmãs queridas que fazem a diferença na família, sempre prontas para me ajudar em qualquer parada.

Aos meus sobrinhos, Rodrigo e Daniel, que enchem a minha vida de amor e alegria!

Ao Chico, minha inspiração, meu companheiro de estudo e caminhada nessa vida. Que escutou pacientemente meus problemas com os controles e resultados negativos, e que aguentou os meus estresses com prazos e apresentações. Poder chegar em casa e bater um papo com você sobre os experimentos ou um paper legal é doidimais!

À minha cunhada e sogra, Tete e Antonieta, por me acolherem na família, e pelo enorme incentivo sempre. Vocês são as Marias das nossas vidas!

Ao Andres, por me orientar e me dar todo o aporte necessário para que a pesquisa fosse feita da melhor forma possível. Pelas inúmeras aulas de como testar hipóteses experimentalmente de uma forma extremante inteligente. Por me dar liberdade de propor e executar experimentos, mesmo aqueles que parecem malucos. Por sempre estar disponível para ajudar a pensar e resolver as dificuldades do projeto. Por ficar bravo junto comigo com todas as burocracias que a gente precisa enfrentar diariamente para fazer pesquisa. Por ter me dado incontáveis demonstrações de que humildade e simplicidade são compatíveis com cientistas brilhantes. Muito obrigada por todos os ensinamentos!

À Lívia, amiga de doutorado e madrinha de casamento, por me ajudar com os experimentos, por ser minha companhia tarde da noite no laboratório e durante as disciplinas da pós, por discutir projeto e burocracias mesmo com diferença de fuso horário, pela parceria de pedal, pelas cervejas, pelas calorosas discussões políticas e por todo o período que passamos juntas em Barão Geraldo.

À Priscila, por ter iniciado a pesquisa que originou a minha tese e uma nova linha de pesquisa do laboratório de biologia molecular, por ter me recebido no laboratório e compartilhado comigo sua experiência, por estar sempre disposta a ajudar no que for necessário, pela força imensurável nessa reta final.

À todos os membros e ex membros do laboratório de biologia molecular do hospital Boldrini: Aninha, Jotta, Mô, Mosca, Gurizon, Rafa, Oico, Naty, Gabis, Carol Arruda, Izabel, Belinha, Dani, Léo, Carol, Pedro, Juan, Dr Pedro, pela convivência, e por me proporcionarem um dos momentos mais incríveis da minha vida ao organizar com tanto carinho e detalhe a minha festa de casamento. O que era para ser uma formalização necessária para a burocracia do visto, no máximo um almoço com os pais e longe do resto da família, se transformou em tempo recorde em uma super mega festa! Foi tanto amor que até hoje eu me emociono

À Dra Silvia, pela oportunidade de desenvolver o meu projeto no Hospital Boldrini.

Ao Laboratório de Microarranjos de DNA (LMA) do LNBio/CNPEM, em especial à responsável técnica, Maria Eugênia, pelo suporte na parte de microarranjos.

Ao laboratório multifuncional da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, em especial ao pesquisador responsável, Fábio Rossi, pelo suporte na parte de microarranjos.

A Dra Socorro e Elda, INCA, pela colaboração com o nosso grupo de pesquisa.

Aos secretários e coordenadores do programa de pós graduação em genética e biologia molecular da UNICAMP, que são essenciais para nos dar assistência, especialmente no durante o ingresso ou egresso da pós graduação.

Aos funcionários do hospital Boldrini, pela companhia e por compartilhar experiências. Aos pacientes e familiares, que mesmo em momentos extremamente difíceis e delicados, prontamente se colocam a disposição para ajudar a pesquisa no que for necessário.

Às pretties, Flavinha, Alice, Mari e Marcela, pela amizade e força que sinto muito de perto, mesmo cada uma estando em lugar diferente do mundo.

Às amigas de infância, Naty e Kelly, por estarem sempre presentes, mesmo quando eu estou longe.

À todos os familiares e amigos que de longe ou de perto, fazem minha vida mais leve e cheia de força para seguir em frente.

To Professor Scott Durum, for giving me the great opportunity of being part of his research group, for his mentorship, and guidance during my internship at his laboratory.

To Wenqing Li, for teaching me at the bench-side and for the invaluable assistance in planning functional assays and in interpreting data.

To Sarah Crammer, Emilee Senkevitch, Julie Hixon, and Caroline Andrews for receiving me at the lab and for all the support and help.

To professor Howard Young, for all his input on the data interpretation in the lab meetings. To my dear friends from NCI, Shuo Liu, Xiaofei Wang, Han han, Hai yun Xin, Zhen Han, Mieke De Buck, Ross Porter, Erika Olney and Net, for sharing their experiences, not only related with the job but their culture and accomplishments as well. For making me feel confident at the scary CIP meeting LOL, for the friendship! Thank you guys!

RESUMO

A leucemia linfóide aguda de células T (LLA-T) é uma malignidade derivada da transformação de precursores linfoblásticos e representa de 10 a 15% dos casos de LLA infantil. O paciente com LLA-T tende a apresentar-se ao diagnóstico com uma contagem muito alta de blastos circulantes, massa mediastinal e envolvimento do sistema nervoso central. O prognóstico das crianças e adolescentes com LLA-T tem melhorado muito nos últimos anos. Entretanto alguns casos ainda recaem durante a terapia ou dentro dos primeiros dois anos após o tratamento da doença e eventualmente vão a óbito. Avanços metodológicos permitiram maior entendimento das alterações genéticas subjacentes à LLA-T. A sinalização mediada por IL7/IL7R é essencial para a homeostase e o desenvolvimento normal dos precursores de células T. Cerca de 10% dos pacientes com LLA-T pediátrica, apresentam mutações na cadeia alfa do receptor para a interleucina 7 (IL7Rα), que levam à ativação constitutiva desta proteína e consequentemente à proliferação descontrolada destas células. Algumas alterações genéticas constituem importantes fatores para iniciar a leucemia, mas em muitos casos estas alterações são insuficientes para formar um fenótipo leucêmico completo, sugerindo a necessidade de mutações oncogênicas colaborativas. Com o objetivo de identificar possíveis mutações colaborativas ao IL7R oncogênico, nós investigamos o perfil mutacional de nove casos de LLA-T pediátrica com IL7R mutante, através do sequenciamento do exoma e microarranjo de SNP/CNV utilizando amostras pareadas Diagnóstico x Remissão. Os resultados demonstram associação estatisticamente significativa entre IL7R mutado e alterações no gene PHF6, sugerindo que esses dois genes devem contribuir para LLA-T de forma colaborativa. Alterações na via de sinalização WNT também foi evidenciada como uma via potencialmente colaborativa ao IL7R oncogênico. Além disso, a pseudo-quinase SGK223 está sendo descrita neste trabalho pela a primeira vez como gene potencialmente implicado no desenvolvimento da LLA-T pelo menos nos casos portadores do IL7R mutante. Juntos os resultados fornecem entendimento sobre o panorama de alterações genéticas dos casos de LLA-T portadores da mutação IL7R.

ABSTRACT

Acute T-cell lymphocytic leukemia (T-ALL) is a malignancy derived from the transformation of lymphoblastic precursors and accounts for 10 to 15% of cases of childhood ALL. The T-ALL patient tends to present at diagnosis with a very high count of circulating blasts, mediastinal mass and involvement of the central nervous system. The prognosis of children and adolescents with T-ALL has improved greatly in recent years. However some cases still relapse during therapy or within the first two years after the treatment of the disease and eventually die. Methodological advances allowed a better understanding of the genetic alterations underlying T-ALL. IL7/IL7R-mediated signaling is essential for homeostasis and normal development of T-cell precursors. About 10% of patients with pediatric T-ALL have mutations in the IL7 receptor alpha chain (IL-7Rα), which lead to the constitutive activation of this protein and consequently an uncontrolled proliferation of these cells. Some genetic alterations are important factors to initiate the leukemia, but in many cases these alterations are insufficient to trigger a complete leukemic phenotype, suggesting the occurrence of collaborative oncogenic mutations. In order to identify possible collaborative mutations to the oncogenic IL7R, we investigated the mutational profile of nine pediatric T-ALL cases through the exome sequencing and SNV/CNV microarray using paired samples Diagnosis x Remission. Our results demonstrate a statistically significant association between mutated

IL7R and alterations in PHF6 gene, suggesting that these two genes may contribute to T-ALL

collaboratively. Alterations in the WNT signaling pathway were also evidenced as a potentially collaborative pathway to oncogenic IL7R. In addition, pseudo-kinase SGK223 is being described in this work for the first time as a gene potentially implicated in the development of T-ALL at least in cases harboring the mutant IL7R. Together our results provide insights into the genetic alteration landscape of T-ALL carrying the mutant IL7R.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática dos subrugpos genéticos na LLA-T (TLX3, TLX1, HOXA e TAL/LMO) em relação ao estágio de maturação das células T, baseado nos sistemas de classificação EGIL ou TCR. ... 22 Figura 2 - Receptores para citocinas da família γc. ... 24 Figura 3 - Esquema da proteína IL7Rα (topo) e alterações dos aminoácidos (inferior). . 26 Figura 4 - Comparacão entre a via de sinalização IL7R fisiológica e mutante. ... 27 Figura 5 - Evolução das descobertas e métodos de detecção de alterações genéticas. ... 29 Figura 6 - Defeitos em diferentes vias moleculares que contribuem para a patogênese da

LLA-T. ... 31 Figura 7 – Perfil mutacional dos pacientes com LLA-T portadores do IL7R mutado.

... Error! Bookmark not defined. Figura 8 – Níveis de expressão de PHF6, DNM2, CTCF e RB1 em células D1

estavelmente expressando IL7R_Mut. ... 100 Figura 9 – Ensaio de vantagem proliferativa após o silenciamento de Rb1, Ctcf e Dnm2.

... 101 Figura 10 – Análise da ativação de STAT5 por phosflow. ... 102 Figura 11 – Viabilidade celular de células D1 co-expressanto estavelmente hIL7R_Mut

e/ou os diferentes shRNAs. ... 104 Figura 12 – Vias de internalização dependente e independete de clatrina. ... 105 Figura 13 – Análise de citometria dos níveis de expressão de mIL7R na superfície

celular de DN1, D1_DNM2_D194N e D1_DNM2_WT. ... 106 Figura 14 – Expressão do IL7R endogeno na superfície de células D1 expressando

DNM2 mutante ou selvagem após estímulo com IL7. ... 107 Figura 15 – Fosforilação de STAT5 em células D1 expressando DNM2_D194N ou

DNM2_WT. ... 108 Figura 16 – Análise da expressão de IL7R mutante ou selvagem na superfície de células

D1 co-transduzidas com DNM2 mutante ou selvagem. ... 109 Figura 17 – Análise dos níveis de ativação de STAT5 em D1_IL7R_Mut e D1_IL7R.WT

expressando ou não DNM2.WT e DNM2.D194N. ... 110 Figura 18 – Representação esquemática da proteína SGK223 com as mutações

Figura 19 – Análise de proliferação de células D1 co-expressando os mutantes

SGK223_S690R e IL7R_P2 . ... 112 Figura 20 – Viabilidade celular de células D1 co-expressando a mutação em IL7R e a

versão selvagem ou mutante de SGK223. ... 113 Figura 21 – Ensaio de migração de celular D1 co-expressando os mutantes IL7R e

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

LLA-T - Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T LLA- B - Leucemia Linfoblástica Aguda de Células B CNV - Copy Number Variation

SNV - Sigle Nucleotide Variation SNP- Single Nucleotide Polymorphism InDel - Inserções e Deleções

TCR - T Cell Receptor

CD - Cluster de Diferenciação IL7- Interleucina 7

IL7Ra- Cadeia alfa do Receptor de Interleuceina 7 IL7R- Receptor de Interlucina 7

IL7R_Mut- Receptor de Interleuceina 7 Mutante V(D)J- V (variable) J (joining) D (diversity) TSLPR- Thymic Stromal Lymphopoietin KO- Knockout

KD- Knockdown

ETP ALL- Early T-cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia LMA- Leucemia mieleóide aguda

LLC- Leucemia linfoide crônica MM - Mieloma múltiplo

LDGCB- Linfoma difuso de grandes células B LF- Linfoma folicular

LCP- Leucemia de células pilosas

MW- Macroglobulinemia de Waldenström LMA- Leucemia Mielóide Aguda

DRM- doença residual mínima DGV- Data Base Variants shRNA- short hairpin RNA gRNA- Guide RNA

SUMÁRIO

Leucemia Linfoblástica Aguda de célula T (LLA-T) ... 19

A sinalização de IL-7 no desenvolvimento de células T ... 22

A sinalização de IL7 nas neoplasias ... 25

IL7Rα é recorrentemente mutado na LLA ... 26

O genoma leucêmico e uso de dados ômicos para a caracterização de neoplasias hematológicas ... 28 HIPÓTESE DE TRABALHO ... 33 OBJETIVO ... 34 OBJETIVO GERAL ... 34 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 34 MATERIAL E METODOS ... 35

Amostras dos pacientes com LLA ... 35

Declaração ética ... 35

SNP/CNV Microarranjo ... 35

Sequenciamento do exoma, detecção e anotação de variantes ... 36

Cultura de células ... 37

Produção de partículas lentivirais ou retrovirais ... 37

Transfecção de células 293T e Phoenix ... 38

Transdução de células D1 ... 39

Construção do mutante DNM2 humano ... 39

Western blotting ... 40

Marcação extracelular ... 41

Ensaio de proliferação ... 41

Ensaio de apoptose ... 41

Fosforilação de STAT5 ... 42

Ensaio de migração células ... 42

RESULTADOS ... 44 Capítulo 1: Mutações associadas ao mutante IL7Rα colaboram para o desenvolvimento da LLA (Review - Cramer, SDC, Rodrigues, GOL et al., 2017). (Manuscrito da revisão) ... 44 Capítulo 2: Análise do perfíl mutacional dos pacientes com LLA-T portadores do mutante IL7R (Rodrigues GOL et al, manuscrito em preparação) ... 63 Capítulo 3: Análise funcional dos genes recorrentemente mutados em LLA-T com IL7R mutante (Dados não publicados) ... 91

Seleção dos genes recorrentemente mutados na LLA-T portadores do IL7R mutante para os

ensaios funcionais ... 91

Knockdown dos genes Phf6, Rb1, Dnm2, Ctcf e Sgk223 na linhagem celular D1, expressando IL7R_Mut através do uso de shRNA ... 99

O silencimento de Rb1, Ctcf ou Dnm2 não induz vantagem proliferativa na linhagem celular D1 estavelmente transduzida com IL7R_Mut ... 100

O Knockdown of Rb1, Ctcf ou Dnm2 mediado por shRNA não aumenta a ativação da via IL7 em células D1 estavelmente transduzidas com o IL7R humano oncogênico (D1_IL7R_Mut) ... 101

O Knockdown of Rb1, Ctcf ou Dnm2 mediado por shRNA não aumenta a viabilidade celular em células D1 estavelmente transduzidas com o IL7R humano oncogênico (D1_hIL7R_Mut) ... 103

Construção e expressão do mutante DNM2 humano na linhagem celular D1, transduzidas ou não com o IL7R oncogênico humano (D1_hIL7R_mut) ... 104

A expressão do mutante DNM2_D194N não aumenta a expressão de Il7r murino (mIL7R) na superfície celular da linhagem celular D1 ... 106

A expressão de DNM2_D194N não aumenta a ativação da via de IL7 na linhagem celular D1. ... 107

A co-expressão estável de DNM2_D194N e IL7R_Mut ou IL7R.WT não aumenta a expressão do IL7R humano na superfície celular da linhagem D1 ... 108

Co-expressão de DNM2_D194N e IL7R_Mut não aumenta a ativação da via IL7R na linhagem celular D1. ... 109

Co-expressão dos mutantes humanos SGK223 e IL7R em células D1 ... 110

O mutante SGK223 não induz vantagens proliferativas em D1_IL7R_Mut ... 111

O mutante SGK223.S690R não aumenta a viabilidade celular das células D1_IL7R_Mut ... 112

O mutante SGK22_S690R não aumenta a migração das células D1_IL7R_Mut ... 113

Knockout de Phf6 através de CRISRP/Cas ... 114

DISCUSSÃO ... 116 CONCLUSÃO ... 123 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 124 ANEXO I (Mapas vetores) ... 154 ANEXO II (Iniciadores Construção DNM2) ... 156 ANEXO III (Anticorpos) ... 157 ANEXO IV (Clones SGK223) ... 158 ANEXO V (Clones CRISPR/Cas PHF6) ... 159 ANEXO VI (CLONES shRNAs) ... 159 ANEXO VII (Artigo publicado) ... 160 ANEXO VIII (Artigo submetido) ... 161 ANEXO IX (Ética humano Boldrini) ... 162 ANEXO X (Ética humano Boldrini) ... 163 ANEXO XI (Ética humano Boldrini) ... 164 ANEXO XII (Ética humano Boldrini) ... 165 ANEXO XIII (Ética humano INCA) ... 167

INTRODUÇÃO

Leucemia Linfoblástica Aguda de célula T (LLA-T)

Dentre os tipos de canceres observados na infância, a leucemia linfoblástica aguda (LLA) é considerado o mais comum (Roberts and Mullighan, 2015). A LLA é caracterizada pela expansão clonal de células progenitoras hematopoiéticas que passaram por um processo de transformação maligna em algum dos estágios de diferenciação (McCulloch, 1993).

A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) é um subtipo de leucemia aguda linfoblástica derivada da transformação de precursores dos linfócitos T e representa de 10-15% e 20-25% dos casos de LLA infantil e adulta respectivamente, sendo que os casos remanescentes, cerca de 85%, são classificados como LLA de precursores de células B (LLA -B) (Hunger and Mullighan, 2015a). Embora menos frequente, a LLA-T tem sido historicamente definida por apresentar pior prognóstico comparada à LLA-B, o subgrupo mais comum (Aifantis et al., 2008). Quando os primeiros protocolos de tratamento estavam sendo implementados, as taxas de cura da T eram de aproximadamente 10% para LLA-T e 40% para LLA-B (Greaves et al., 1981), o que levou à classificação dos pacientes com LLA-T como um grupo de leucemia de alto risco (Nachman et al., 1998). Diante dessas observações clínicas, houve uma intensificação dos protocolos de terapia para LLA-T, resultando em uma melhora expressiva na taxa de cura para 80% em crianças (Pui et al., 2008). Entretanto, os casos de recaída durante a terapia, ou no primeiro ano após o tratamento, ainda continuam exigindo atenção (Brandalise et al., 2016; Freyer et al., 2011; Nguyen et al., 2008).

A incidência da LLA-T é mais alta em meninos (aproximadamente 2:1) do que em meninas (Goldberg et al., 2003). O paciente com LLA-T apresenta-se ao diagnóstico com uma alta contagem de blastos circulantes, neutropenia, anemia e baixa contagem de plaquetas no sangue. Além disso, é comum esses pacientes apresentarem massa mediastinal e infiltração meníngea do sistema nervoso central (Belver and Ferrando, 2016).

O processo de transformação dos precursores de célula T, envolve diversas anormalidades genéticas, incluindo alterações cromossômicas estruturais, como aneuploidias e rearranjos cromossomais, além de variação no número de cópias – do inglês Copy Number

Variation (CNV), Variação de Único Nucleotídeo – do inglês Sigle Nucleotide Variation

Ferrando, 2016; Iacobucci and Mullighan, 2017; Mullighan, 2013; Pui et al., 2008). Nos últimos anos, mais atenção tem sido dada para mutações envolvendo genes relacionados à regulação epigenética (Ntziachristos et al., 2012; Zhang et al., 2012). O conjunto dessas alterações genômicas resultam em mudanças funcionais de oncogenes e genes supressores de tumor, perturbando o controle normal do crescimento celular, proliferação, sobrevivência e diferenciação durante o desenvolvimento dos precursores de células T, isto é, desenvolvimento dos timócitos. Na Tabela 1, apresentamos os genes mais frequentemente mutados na LLA-T. (Belver and Ferrando, 2016).

Tabela 1 - Mutações recorrentes na LLA-T

Gene Frequência % Referências

Mutações ativadoras (oncogenes)

NOTCH1 >60 Weng et al., 2004

IL7R 10 Zenatti et al., 2011

JAK1 4-8 Belver and Ferrando, 2016

JAK3 7 Zhang et al., 2012

NRAS 5 Belver and Ferrando, 2016

FLT3 5-10 Paietta et al., 2004; Zhang et al., 2012

Mutações inativadoras (supressores de tumor) Fatores de transcrição

RUNX1 10-20

Gatta et al., 2012; Grossmann et al., 2013; Keersmaecker

LEF1 10-15 Gutierrez et al., 2010b

ETV6 13 Van Vlierberghe et al., 2011; Zhang et al., 2012

WT1 10 Tosello et al., 2009

BCL11B 10 Gutierre et al., 2010z; Zhang et al., 2012

Transdução de sinal

PTEN 10-15 Palomero et al., 2007

NF1 3 Balgobind et al., 2008; Zhang et al., 2012

Ubquitia ligase

FBXW7 8-30 O'Neil et al., 2007; Thompson et al., 2007

Reguladores da cromatina

IL7R, interleukin-7 receptor; NRAS, Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog; JAK, Janus kinase; FBXW7,

F-box and WD repeat domain containing 7; FLT3, fms related tyrosine kinase 3; RUNX1, runt related transcription factor 1; SUZ12, suppressor of zeste 12; WT1, Wilms tumour 1; ZEB2, zinc finger E-box binding homeobox 2’ ETV6, ETS variant 6; EZH2, enhancer of zeste 2; RB1, retinoblastoma 1; LEF1, Lymphoid Enhancer Binding Factor 1; BCL11B, B-Cell CLL/Lymphoma 11B; NF1, Neurofibromin 1; PHF6, PHD Finger Protein 6; EED, Embryonic Ectoderm Development; frequências de mutações não inclui CNAs.

Diversos rearranjos cromossômicos acontecem de forma mutuamente exclusiva na LLA-T (Van Vlierberghe et al., 2008b), afetando oncogênese como TAL1, LMO2, TLX1,

TLX3, MYB, e HOXA (Van Vlierberghe et al., 2008b). Baseado em assinaturas de expressão

gênica, relacionadas com estágio de desenvolvimento dos timócitos, é possível dividir a LLA-T em diferentes subgrupos moleculares, tais como LLA-TAL/LMO, LLA-TLX1/HOX11, LLA-TLX3/HOX11L2 e HOXA. (Ferrando et al., 2002; Soulier et al., 2005a). Interessantemente, na maioria da vezes as assinaturas de expressão gênica correlacionam-se com a presença de rearranjos específicos (Van Vlierberghe et al., 2010a). Ao contrário desses rearranjos, algumas lesões ocorrem em todos os subgrupos moleculares de LLA-T, como é o caso de deleções de CDKN2A/ARF (Hebert et al., 1994) e mutações ativadoras de NOTCH1 (Weng et al., 2004), as quais são abordadas com maior detalhe no manuscrito revisão que produzimos sobre mutações que colaboram com a sinalização via IL7R no desenvolvimento da LLA (Capítulo 1).

A identificação do estágio de maturação dos timócitos, feita através da detecção de marcadores imunológicos, é utilizada para classificação da LLA-T, e pode ser baseada em dois distintos sistemas 1) cluster de diferenciação (CD) 2) rearranjo dos receptores de células T do inglês T cell receptor (TCR). (Van Vlierberghe et al., 2010a) (Figura 1).

PHF6 20-40 Van Vlierberghe et al., 2010

SUZ12 10 Zhang et al., 2012

Figura 1 - Representação esquemática dos subgrupos genéticos na LLA-T (TLX3, TLX1, HOXA e TAL/LMO) em relação ao estágio de maturação das células T, baseado nos sistemas de classificação EGIL ou TCR. Mutações ativadoras em NOTCH1 e deleções em p15/p16 são representadas pela linha azul claro. A alta expressão dos genes LYL1, LMO2, ERG,

PTCRA e TCRA está representada pela linha azul escuro e os marcadores imunofenotípicos são

mostrados pela linha cinza.

A sinalização de IL-7 no desenvolvimento de células T

A sinalização normal, mediada por Interleucina 7 (IL7) e o receptor de Interleucina 7 (IL7R) é essencial para o desenvolvimento e homeostase dos precursores de células T, contribuindo para proliferação e sobrevivência das células T através dos seus efeitos sobre ciclo celular e apoptose (Jiang et al., 2004; Khaled et al., 2005; Khaled et al., 1999; Kim et al., 2003; Li et al., 2006; Opferman et al., 2003).

O receptor de IL-7 é formado por duas unidades, a cadeia alfa (IL7Rα), e a cadeia gama (gc), a qual é compartilhada por outros receptores, incluindo IL2R, IL4R, IL9R, IL15R e IL21R (Giri et al., 1994; Kimura et al., 1995; Kondo et al., 1993; Russell et al., 1993) (Figura 2). IL7Rα também pode dimerizar com o receptor de linfopoietina estromal tímica – do ingles thymic stromal lymphopoietin (TSLPR) o qual é codificado pelo gene CRLF2. A

sinalização do TSLPR ainda é pouco compreendida (revisado por Mazzucchelli and Durum, 2007). Algumas funções descritas para esta via, incluem, o envolvimento na homeostase das células T CD4+, desenvolvimento das células T regulatórias e ativação de células dendríticas (Liu et al., 2007) e envolvimento na patogênese de alergia e asma (Gauvreau et al., 2014).

A ausência de interleucina (IL7) ou da cadeia alfa do receptor de interleucina 7 (IL7Ra) causa imunodeficiência severa combinada em humanos (Macchi et al., 1995; Noguchi et al., 1993b; Puel et al., 1998; Roifman et al., 2000; Russell et al., 1995), e impede o desenvolvimento e sobrevivência homeostática de células T da periferia em camundongos (von Freeden-Jeffry, Vieira et al. 1995). Apesar do requerimento de IL7 para o desenvolvimento de células B em camundongos (von Freeden-Jeffry, Vieira et al. 1995), em humanos o número de células B não é afetado pela ausência de IL-7 (Noguchi, Nakamura et al. 1993, Puel, Ziegler et al. 1998). Os sinais desencadeados pelo IL7R são importantes não apenas para a sobrevivência e proliferação celular, mas também possuem papel relevante na recombinação V(D)J dos genes de receptor de células T (TCR) e das imunoglobulinas (Ig) das células T e B, respectivamente. Os sinais do IL7R resultam em alteração da cromatina nos loci dos genes TCR/IG de tal modo a torná-los acessíveis às recombinases RAG1/RAG2 (Durum, Candeias et al. 1998). Durum e colaboradores (Durum, Candeias et al. 1998) utilizaram enzimas de restrição sensíveis à DNA metilado e demonstraram que a via IL7R controla a estrutura da cromatina, aumentando acessibilidade para recombinação V(D)J. Além disso, eles também demonstraram que o knockdown de Il7Ra, γc ou JAK3 impede a recombinação do locus TCRγ. Os mecanismos moleculares propostos para os efeitos da sinalização do IL7R no remodelamento da cromatina sugerem que a sinalização de IL7R ativa fatores de transcrição, provavelmente STAT5, que se ligam à sequencias regulatórias no locus

TCRγ levando ao recrutamento de histonas acetiltrasferases para o locus TCRγ, o que por sua

vez induzem o remodelamento da cromatina tornando o DNA mais acessível para atuação das proteínas RAG (Huang and Muegge, 2001).

A IL7 é produzida por células estromais, nos órgãos linfoides. Entretanto, outros tipos de células, em diferentes órgãos, tem sido descritas como produtoras de IL7, como as células endoteliais vasculares, fibroblastos e células dendriticas foliculares (Kroemer et al., 1998) epitélio intestinal (Watanabe et al., 1995) e queratinócitos (Heufler et al., 1993).

Figura 2 - Receptores para citocinas da família γc. Retirado de (Rochman et al., 2009), modificado.

A sinalização de IL7R depende da heterodimerização das cadeias IL7Rα e gc, a qual é facilitada por IL7. A formação do dímero leva à transfosforilação de JAK1 e JAK3, que são proteínas quinases ancoradas à porção intracelular da cadeias alfa e gama do IL7R, respectivamente. Uma vez fosforilada, JAK3 fosforila o resíduo tirosina 449 (Y449) do IL7Rα (Kondo et al., 1994; Noguchi et al., 1993a). Uma vez que Y449 esteja fosforilado, o IL7R recruta e fosforila STAT5 a qual, por sua vez, dimeriza e é translocada para o núcleo, induzindo a transcrição de genes que vão atuar regulando a proliferação e sobrevivência celular (revisado por Mazzucchelli and Durum 2007). A ativação da via IL7R induz a divisão celular através da estabilização Cdc25c e/ou desestabilização de p27kip1, os quais são respectivamente, ativadores e inibidores de quinase dependente de ciclina (Khaled et al., 2005; Li et al., 2006). O impacto da ativação da via IL7R na sobrevivência celular, são atribuídos principalmente ao efeito antiapoptótico decorrente da indução das proteínas anti-apoptoticas Bcl-2, Mcl1 e pela inibição de proteínas pro-anti-apoptoticas Bax, Bax e Bim (Khaled et al., 2002; Kim et al., 1998; Li et al., 2010; Li et al., 2004; Opferman et al., 2003).

A sinalização de IL7 nas neoplasias

Nos últimos anos, várias pesquisas tem se dedicado a entender o funcionamento da via IL7/IL7R na sinalização de células leucêmicas. Em decorrência desses estudos, atualmente sabemos que, além da sua marcante importância no desenvolvimento normal de células T, a ativação da via IL7/IL7R também pode auxiliar na sobrevivência e proliferação de neoplasias de células B e T (Barata et al., 2004a; Karawajew et al., 2000; Makrynikola et al., 1991; Silva et al., 2011; Touw et al., 1990a).

Assim como nas células normais, a estimulação do IL7R na LLA-T ativa a via PI3K/AKT/mTOR, resultando em efeitos pró-sobrevivência e anti-apoptoticos (Barata et al., 2004c). Além disso, a apoptose espontânea é inibida em células T neoplásicas estimuladas com IL7 em decorrência do aumento de Bcl-2 (Barata et al., 2001b; Karawajew et al., 2000).

Os efeitos de IL7 na biologia da LLA também foram estudados em células humanas in vitro. Em 1990, touw e colaboradores (Touw et al., 1990b) demonstraram que a IL7 induz a proliferação de precursores humanos de células B e de LLA-T. Posteriormente, foi reportado que a IL7 inibe a apoptose em células de LLA-T pediátricos, e que esse efeito é positivamente relacionado com a expressão de IL7Ra na superfície celular (Karawajew et al., 2000). Além disso, células de LLA-T primarias mantidas na presença de IL7 apresentam aumento na proliferação e viabilidade celular, além de aumento na progressão do ciclo celular graças à repressão de p27Kip1 (Barata et al., 2001a; Barata et al., 2004b). Estudos In vivo também forneceram informações relevantes sobre a sinalização induzida por IL7 na LLA. Camundongos knockout (KO) para IL7 xenotransplantados com uma linhagem celular de LLA-T humana apresentaram atraso no desenvolvimento da doença, além de uma disseminação restrita das células leucêmicas. Diferentemente, os camundongos selvagem para IL7 tiveram infiltração nos órgãos e maior disseminação das células leucêmicas, sugerindo que IL7 acelera a expansão da leucemia in vivo (Silva et al., 2011).

Ao contrário do observado nas leucemias, muito pouco se conhece sobre o envolvimento da sinalização Il7/IL7R em tumores sólidos. Apesar do mRNA tanto de IL7 quanto IL7R ter sido detectado em vários tipos diferentes de tumores sólidos (Al-Rawi et al., 2003), na maioria dos casos ainda não é claro se IL7 tem um efeito direto sobre esses tumores. Em 2001, Kramer e colaboradores associaram IL7 como um importante fator no desenvolvimento de hiperplasia da próstata (Kramer et al., 2001) e, mais recentemente, o envolvimento de IL7 e IL7R foram descritos na invasão e migração de células de câncer de próstata (Qu et al., 2016). Além disso, existe uma correlação entre expressão do IL7R e o

tamanho de alguns canceres de mama (Al-Rawi et al., 2003). A via IL7/IL7R também já foi estudada no contexto do câncer de pulmão, onde verificou-se que a sinalização via IL7R regula positivamente VEGF-D através da via c-Fos/c-Jun em uma linhagem celular de carcinoma de pulmão humano. Além disso, os níveis de expressão de ambos IL7 e IL7R correlacionam com vários fatores que podem potencialmente contribuir para o desenvolvimento e progressão do câncer de pulmão, como densidade dos vasos linfáticos e sobrevivência do paciente (Hu et al., 2008).

IL7Rα é recorrentemente mutado na LLA

Mutações oncogênicas no gene da cadeia alfa do IL7R são reportadas em aproximadamente 10% dos casos de LLA-T pediátricas (Shochat et al., 2011; Zenatti et al., 2011) e em uma frequência mais baixa, aproximadamente 2% dos casos, em leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B (B-LLA) (Shochat et al., 2011). As mutações descritas até o momento foram classificadas como somáticas e localizadas no exon 6 da do gene IL7R. Na maioria dos casos a mutação resulta na inserção de uma cisteína no domínio transmembrana da porção extracelular do receptor (Figura 3).

Figura 3 - Esquema da proteína IL7Rα (topo) e alterações dos aminoácidos (inferior).Estão indicados os dois domínios tipo fibronectina extracelular tipo III contendo quatro cisteínas pareadas e um motivo WS × WS, o domínio transmembranar, a cauda citoplasmática com o motivo Box 1 e os resíduos de tirosina envolvidos na transdução de sinal. A região onde ocorrem as

mutações é indicada por uma caixa. As mudanças de aminoácidos envolvendo introdução de uma cisteína são indicadas na laranja; Caixas cheias denotam deleções-inserções e estão alinhados com a respectiva sequência de aminoácidos deletada. Adaptado de (Zenatti et al., 2011).

Interessantemente, a inserção do resíduo de cisteína contribui para a formação não usual de um homodímero entre as cadeias alfa do IL7R e para sinalização via JAK1/STAT5 independentemente da ligação de IL7 ou da cadeia gama, resultando em proliferação e sobrevivência celular (Figura 4). (Durum, 2014; Shochat et al., 2011; Zenatti et al., 2011).

Figura 4 - Comparacão entre a via de sinalização IL7R fisiológica e mutante. A) Proteína IL7R normal, sinaliza traves um heterodímero entre as cadeias alpha e gamma. A ativação da via é dependente da ligação de IL7; B) Proteína IL7R mutante frequentemente possui a inserção de uma cisteína no domínio transmembrana resultando em formação de homodímeros entre as cadeias alpha. A ativação da via de sinalização é portanto, independente da cadeia gamma e da ligação de IL7 (Ribeiro et al., 2013; Zenatti et al., 2011).

Mutações ativadoras envolvendo o exon 6 do gene IL7R também foram relatadas em 6% dos casos de leucemia linfoblástica aguda infantil com fenótipo T mais imaturo – do inglês - Early T-cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (ETP ALL) (Zhang et al., 2012). Mutações no IL7R também já foram reportadas em pacientes com LLA-B BCR–

ABL1–like, ou Philadelphia chromosome like (Ph-like), um subtipo de LLA B que não expressa a proteína quimérica BCR–ABL1 codificada pela translocação t(9;22)(q34;q11.2), mas apresenta um perfil de expressão similar aos paciente Ph-like positivos (Roberts et al., 2014).

Embora as mutações no IL7R nas LLA sejam caracterizadas como mutações com ganho de função, além de conferirem proliferação independe de citocinas em diferentes linhagens celulares (Shochat et al., 2011; Xiao et al., 2016; Zenatti et al., 2011; Zhang et al., 2012), a expressão do IL7R mutante em progenitores linfoides comuns ou progenitores da medula óssea não geraram leucemia (Yokoyama et al., 2013), sugerindo necessidade de eventos transformadores adicionais para alcançar o fenótipo leucêmico completo (Tremblay and Curtis, 2014). De fato, expressão do IL7R mutante em timocitos knockout para p19ARF Desenvolveram LLA-T de fenótipo imaturo (Treanor et al., 2014).

O genoma leucêmico e uso de dados ômicos para a caracterização de neoplasias hematológicas

O avanço das tecnologia de sequenciamento e a possiblidade da utilização de dados ômicos na clínica, tem revolucionado o nosso entendimento sobre a patogênese das neoplasias nos últimos anos (Figura 5) (revisado por Braggio et al., 2013; Mullighan, 2013).

Figura 5 - Evolução das descobertas e métodos de detecção de alterações genéticas.

Abreviações: Leucemia Mielóide Crônica (LMC); Leucemia Mieloide Aguda (LMA); Leucemia linfoide aguda (LLA); Leucemia mieleóide aguda (LMA); Leucemia linfoide crônica (LLC); Mieloma múltiplo (MM) Linfoma difuso de grandes células B (LDGCB), Early-T phenotype-Leucemia linfoide aguda (ETP-LLA); Linfoma folicular (LF); Leucemia de células pilosas (LCP); Macroglobulinemia de Waldenström (MW) Modificado de (Braggio et al., 2013).

Conforme descrito previamente, a transformação de precursores hematopoéticos é um processo que envolve uma grande variedade de alterações genéticas. Alguns raros casos são associados com síndromes e/ou predisposição genética, ou com a exposição à radiação ionizante ou a quimioterápicos específicos inibidores da topoisomerase, como o etoposideo (revisado por Greaves, 1997; Hjalgrim et al., 2003; Pui et al., 2008).

A característica marcante das malignidades linfoides são as alterações genéticas somáticas (Aifantis et al., 2008; Belver and Ferrando, 2016; Iacobucci and Mullighan, 2017; Mullighan, 2013; Pui et al., 2008). Destas, os rearranjos cromossômicos são usualmente tidos como um dos primeiros eventos durante o processo da leucemogênese, muitas vezes com origem pré-natal, in útero. Os estudos que comprovam o surgimento dos rearranjos cromossômicos durante a hematopoese fetal, vem de pesquisas com irmãos gêmeos univitelinos acometidos pela leucemia. Verificou-se que a leucemia em ambos gêmeos apresentava a mesma anormalidade cromossômica somática t(4;11), que inclusive pôde ser encontrada no sangue do “teste do pezinho” colhido ao nascimento (Greaves et al., 2003; Greaves and Wiemels, 2003; Pui et al., 2008). Entretanto os irmãos gêmeos não apresentam a

leucemia ao mesmo tempo, podendo haver diferença de anos entre o surgimento da leucemia em um dos irmãos e o surgimento no outro, sugerindo, portanto, a necessidade de outras mutações.

Essas observações, reforçam o modelo de dois-passos de Knudson (do inglês -

Knudson two-steps), um trabalho clássico publicado da década de 70 baseado no estudo de

crianças com retinoblastoma. Knudson introduziu a ideia de que o desenvolvimento do retinoblastoma envolve dois eventos genéticos complementares. Crianças com histórico de retinoblastoma na família tendem a apresentar a doença mais cedo, pois ao herdarem um dos alelos já mutado, um único evento adicional é suficiente para o desenvolvimento do retinoblastoma, ao passo que no caso do retinoblastoma esporádico, são necessários dois eventos de mutação (ambos alelos) do gene RB1 para o aparecimento do câncer (Knudson, 1971). A nossa visão atual acerca das neoplasias é fundamentada nesses achados. Atualmente, sabemos que todos os canceres humanos exibem uma multiplicidade de alterações genéticas e epigenéticas, e que um número dessas alterações são necessárias para a progressão gradual que culmina no desenvolvimento do câncer (McFarland et al., 2013; Roberts and Gordenin, 2014; Stratton et al., 2009; Watson et al., 2013)

O genoma das LLAs tipicamente apresenta um número menor de alterações genéticas - 10-20 mutações não-silenciosas por paciente - se comparado a tumores sólidos, com exceção dos casos ocasionais de leucemia de recaída com fenótipo hipermutante (Ma et al., 2015; Mullighan, 2013). A organização da cromatina, defeitos no mecanismo de reparo do DNA, tempo de replicação e nível de transcrição do DNA estão entre os fatores reconhecidos por influenciar a taxa de mutação dos genomas neoplásicos (Liu et al., 2013; Roberts and Gordenin, 2014). Além disso, há décadas, hipóteses controversas sobre a correlação entre infecções e o desenvolvimento de leucemia infantil, são discutidas entre diferentes pesquisadores e persistem até os dias de hoje. A hipótese da infecção tardia é uma das mais antigas, e sugere que a falta de exposição a agentes infecciosos interfere com a modulação do sistema imune, resultando em uma resposta anormal a infecções tardias, originando a LLA em crianças (Greaves, 1997). Contudo, considerando as diferenças biológicas que existem entre os diferentes casos de leucemia, é razoável considerar múltiplos mecanismos de origem para a mesma.

As tecnologias utilizadas para a detecção dessas alterações genéticas têm se aprimorado a cada dia em uma velocidade extraordinariamente alta. De acordo com

Mullighan (Mullighan, 2013), as técnicas que vem sendo utilizadas para a detecção dessa ampla variedade de lesões genômicas na LLA podem ser classificadas em três grandes categorias 1) pesquisas citogenéticas, que avaliam alterações estruturais cromossômicas; 2) primeira geração de análise genômica em larga escala através de hibridização genômica comparativa, microarranjo de polimorfismo de nucleotídeo único e perfil de expressão gênica; 3) tecnologias de sequenciamento massivo em paralelo, que permite o sequenciamento do genoma e/ou exoma completo e transcriptoma.

Em conjunto, todas as tecnologias utilizadas para caracterização genômica das leucemias têm identificado novas alterações genéticas implicadas em diversas vias moleculares. Na LLA-T são reportadas alterações recorrentes em genes que participam da hematopoese, ciclo celular, epigenética, maquinaria ribossomal, sinalização de NOTCH1 e transdução de sinal (Figura 6) (De Keersmaecker et al., 2013; Neumann et al., 2013; Tosello and Ferrando, 2013; Van Vlierberghe et al., 2011; Van Vlierberghe and Ferrando, 2012; Zhang et al., 2012).

Figura 6 - Defeitos em diferentes vias moleculares que contribuem para a patogênese da LLA-T. Modificado de (De Keersmaecker et al., 2013; Neumann et al., 2013; Tosello and Ferrando, 2013; Van Vlierberghe et al., 2011a; Van Vlierberghe and Ferrando, 2012; Zhang et al., 2012).

Embora os projetos de sequenciamento em larga escala tenham contribuindo substancialmente para a identificação de numerosas alterações genéticas presentes nos mais

diversos tipos de câncer (Cancer Genome Atlas Research, 2008; Futreal et al., 2004; International Cancer Genome et al., 2010), nem todas as alterações genéticas detectadas tem relação causal com a doença, e portanto os termos mutações “drivers” e mutações “passengers”, passaram a ser respectivamente utilizados para diferenciar as mutações que fornecem vantagem seletiva e, portanto, contribuem para o inicio e/ou progressão do câncer, daquelas mutações que são biologicamente neutras e não conferem vantagem (Greenman et al., 2007; Haber and Settleman, 2007; Stratton et al., 2009). O grande desafio atual tem sido aprimorar ferramentas de bioinformática para distinguir as mutações “drivers” das “passengers”. Pelo menos duas abordagens são frequentemente utilizadas para fazer a distinção entre mutações drivers e passengers 1) avaliação da frequência de mutações e 2) predição do impacto funcional das mutações (Pon and Marra, 2015). Além disso, a identificação de mutações tumor-especificas, que pode ser feita através da comparação de sequencias de DNA pareadas tumor versus normal, pode fornecer informações importantes para a identificação de mutações drivers (Roberts and Gordenin, 2014; Yan et al., 2011).

Apesar dos desafios na distinção e validação das mutações drivers, o impacto positivo das tecnologias de sequenciamento em larga escala tem sido expressivo. O caso de um paciente com leucemia mielóide aguda (LMA) que apresentou exames de citogenética normais e foi posteriormente analisado através do sequenciamento massivo, ganhou relevância por ter identificado uma mutação no gene DNMT3A, uma metiltranferase que nunca havia sido associada à LMA e após esse estudo passou a ser investigada em grandes coortes, revelando que 22 a 30% de pacientes com AML possuem mutações nesse gene. Atualmente, mutações em DNMT3A são consideradas alvos extremamente relevantes na LMA (Ley et al., 2008) Além disso, a aplicação de sequenciamento massivo para identificar novos alvos nos casos de recaída (Tzoneva et al., 2013), acompanhar doença residual mínima (DRM) (Kotrova et al., 2015; Logan et al., 2011) e auxiliar na genotipagem para transplante de medula óssea (Bentley et al., 2009; Chapman et al., 2012) tem ocupado um espaço cada vez maior na clínica.

HIPÓTESE DE TRABALHO

Embora o mutante IL7Rα resulte no aumento da proliferação e sobrevivência de diferentes linhagens celulares, essa mutação individualmente não parece ser suficiente para a transformação neoplásica de células T primárias, sugerindo que outras lesões genéticas devem colaborar com IL7Ra mutante para o desenvolvimento completo da LLA-T. A nossa hipótese é que análises genômicas de vários casos de LLA-T com IL7R mutante podem levar à identificação de mutações co-ocorrentes e, portanto, provavelmente colaborativas com a mutação do IL7R para o desenvolvimento da LLA-T.

OBJETIVO

- Prospectar mutações do tipo CNV, SNV e Indel em amostras de LLA-T portadoras do IL7R mutado;

- Selecionar genes ou vias recorrentemente afetados por mutações nos casos de LLA-T portadores do IL7R mutante;

- Avaliar funcionalmente o efeito conjunto do IL7R mutado e as outras mutações selecionadas, em termos de sobrevivência e proliferação celular;

MATERIAL E METODOS

Amostras dos pacientes com LLA

As amostras de DNA de blastos leucêmicos e/ou amostras de remissão (DNA de células saudáveis, ou seja, germline), foram obtidas de pacientes diagnosticados com LLA-T, portadoras de mutação no gene IL7R, atendidas no Centro Infantil Boldrini (Campinas, SP) ou no Instituto Nacional do Câncer (Rio de Janeiro, RJ).

Declaração ética

A pesquisa foi conduzida de acordo com os padrões éticos e de acordo com a Declaração de Helsinki e com as diretrizes nacionais e internacionais. O uso de amostras de pacientes foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa (CEP) do Centro Infantil Boldrini, Campinas, Brasil, (Anexos I, II, III e IV) ou pelo Comitê de Ética e Ciência do Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, Brasil, (Anexo V) com o consentimentos dos pais.

SNP/CNV Microarranjo

O DNA de amostras de leucemia e/ou de remissão foi amplificado, marcado e hibridizado com o Affymetrix Cytoscan HD de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 250ng de DNA genômico foi digerido com a enzima NspI e os fragmentos obtidos foram ligados a um adaptador, seguido pela amplificação por PCR utilizando um par de iniciadores complementares à sequencia do adaptador. O produto de PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 2% para confirmar que a maioria dos amplicons se localizavam entre 150 e 2000pb. O produto de PCR foi purificado utilizando beads magnéticas, fragmentado com DNAse I e visualizados em gel de agarose 4% para confirmar que os fragmentos se encontravam entre 25 e 125pb. Os amplicons foram marcados com biotina e hibridizados no microarranjo. A hibridização dos microarranjos foi feita no forno de hibridização GeneChip 645. Os microarranjos foram lavados e revelados com o auxílio da estação fluídica GeneChip 450 e imagens foram obtidas no scanner GeneChip 3000 7G. Os arquivos de dados foram gerados utilizando o software GeneChip Comand Console, versão 3.2.2.

Os arquivos .CEL gerados pelo Comand Console, foram processados e analisados no software Chromosome Analysis Suite (ChAS), usando o parâmetro “Normal

Diploid”, recomendado para amostras de câncer em que mais de 50% do genoma é susceptível de ser rearranjado. A versão do genoma hg19 foi utilizado como referência para as anotações. Apenas os segmentos que incluíam pelo menos 50 marcadores para ganhos e 25 marcadores para perda, em um comprimento mínimo de 100kbp, foram incluídos nas análises. 7 pacientes foram analisados com o seu DNA normal pareado a partir da amostra de remissão e apenas os CNVs presentes nas amostras de leucemia e ausentes nas amostras de remissão foram considerados. Além disso, todos os eventos foram visualizados através do genoma e as regiões com baixo número de marcadores foram descartadas via curadoria manual.

Sequenciamento do exoma, detecção e anotação de variantes

O sequenciamento do exoma foi realizado na empresa BGI (www.bgi.com) e as análises de bioinformática foram realizadas em colaboração com o Dr Francisco Lobo (UFMG). Resumidamente, o DNA genômico das amostras de LLA-T e as respectivas amostras pareadas de remissão foram randomicamente fragmentadas através da ultra-sonicação pelo Covaris, gerando uma biblioteca de fragmentos distribuídos principalmente entre 150 to 200bp. A captura foi realizada com kit de captura Exome Agilent SureSelect 51

Mb (Agilent). Cada biblioteca capturada foi sequenciada na plataforma Hiseq (Illumina) como

uma cobertura média de 80 e 50X para as amostras de leucemia e remissão, respectivamente. As sequencias foram geradas com reads de 100bp pair-end. O software Burrows-Wheeler

Aligner (BWA) (Li and Durbin, 2010) foi utilizado para mapear as reads no genoma de

referência (versão hg38). Os arquivos de mapeamento obtidos (arquivos bam) foram submetidos ao programa GATK/picard para 1) a remoção de reads duplicadas como artefatos de PCR; 2) realinhamento local nas regiões de pequenos indels para a minimização de falso-positivos e 3) recalibração dos valores de qualidade para a eliminação de vieses sistemáticos dos dados causados por variáveis como vizinhança do nucleotídeo, conteúdo C+G da read e plataforma de sequenciamento, dentre outros (McKenna et al., 2010). Os arquivos .bam obtidos após as boas práticas recomendadas pelo GATK foram então submetidos à detecção de variantes somáticas, onde as duas amostras de cada paciente – LLA-T e remissão – são investigadas visando a detecção de variantes exclusivamente encontradas em LLA-T. As variantes somáticas de um único nucleotídeo – do inglês Somatic Single Nucleotide Variants (SNVs), bem como as pequenas inserções e deleções somáticas – do inglês Small Insertion/Deletion (InDels) foram detectadas pelo software Varscan2 (Koboldt et al., 2012). Para considerarmos uma variante como somática, a mesma tinha que 1) estar presente em duas ou mais reads independentes; 2) possuir uma frequência (Variant Allele Frequency,

VAF, calculada dividindo-se o número de reads que apresentam a mutação pelo total de reads que mapearam em um determinado locus) maior que 5%; 3) estar ausente da lista FLAGS, a qual compreende genes recorrentemente mutados em exomas públicos de indivíduos saudáveis. Estes genes são recorrentemente encontrados como falso-positivos em análises de exoma (Shyr et al., 2014) Selecionamos algumas das variantes de genes recorrentemente mutados (>= 2 pacientes) para curadoria manual utilizando o Genome Browser Integrative

Genomics Viewer (IGV) (Robinson et al., 2011).

Cultura de células

A linhagem de células D1, dependente de IL7 e derivada de tímocitos de camundongos TP53(-/-) (Kim et al., 2003), foi mantida em meio RPMI-1640 (Mediatech, Inc., cat# 10-040-CV), 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado por aquecimento (ThermoScientific HyClone FBS #SH30910.03), 55 µM 2-Mercaptoethanol (Gibco, cat#21985-023), 100U/ml penicilina 100µg/mL estreptomicina (Gibco, cat#21985-023) e 50 ng/ml de rmIL7 (PeproTech, Inc, cat#217-17), em uma concentração de 1 x 106 células/ml. Células 293T (ATCC® CRL-3216™) e células de empacotamento Phoenix-Eco

(ΦNX-Eco/Orbigen RVC-10002) foram mantidas em meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium

(DMEM/ Corning 10-013-CV) suplementando com 10% de SFB, 100U/ml penicina 100µg/mL estreptomicina (Gibco, cat#21985-023). As células foram repicadas a cada três dias na concentração de 1:10 (D1) ou 1:5 (293T) e mantidas à 37 oC com 5% CO2.

Produção de partículas lentivirais ou retrovirais

Os vetores lentiviais com shRNA, gRNA, genes mutantes ou os respectivos controles (non-template scramble para shRNA, vetor vazio ou gene selvagem para super-expressão) foram adquiridos das empresas Sigma Aldrich, Santa Cruz ou Genecopeia (Anexo

VI). O mutante para o gene DNM2, foi gerado in house utilizando a técnica de PCR overlaping, descrita em maior detalhe no tópico “Construção do mutante DNM2 humano”. A

linhagem celular de empacotamento Phoenix-Eco (Orbigen) foi usada para o empacotamento das partículas retrovirais, enquanto a linhagem celular 293T (ATCC® CRL-3216™), juntamente com os plasmídeos empacotadores (pMD2.VSVG, pMDLg/p#54and pRSV-Rev –

anexo VI) foi utilizada para o empacotamento das partículas lentivirais. O meio de cultura

Driven Filter Unit, PVDF, 33mm/Millipore, Cat# SLHV033RS) e usado para a transdução

das células-alvo.

Transfecção de células 293T e Phoenix

Plaqueamos 0.5x106 células 293T ou Phoenix em placas de cultura de células de 6 poços em 2mL de meio meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementando com 10% de SFB, 100U/ml penicina 100µg/mL estreptomicina (Gibco, cat#21985-023) um dia antes da transfecção, de modo a obter no dia seguinte uma confluência de 70-80%/poço. No dia seguinte, 1h antes da transfecção, o meio de cultura foi substituído por meio DMEM 10%SFB sem antibióticos, mantendo as células à 370C e 5% CO2. Os plasmídeos foram diluídos em 250µl de OPTI-MEM (OPTI-MEM I Reducing Serum Medium/Invitrogen, Cat# 31985-062) de acordo com quantidades listadas na tabela abaixo:

*Anexo VI

Em um tubo separado, 250µl de OPTI-MEM foi utilizado para diluir 10µL de lipofectamina (Lipofectamine 2000/Invitrogen, Cat# P/N 52887). Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente (TA), 250µl dos plasmídeos/OPTI-MEM e 250µl de lipofectamina/OPTI-MEM foram combinados e os 500µl resultantes dessa mistura foram incubados por 20 minutos em temperatura ambiente utilizados para transfectar as células 293T ou Phoenix-NxEco. Aproximadamente 12h após a transfecção o meio de transfecção foi substituído por meio DMEM e as células foram novamente incubadas por 20-24h. O sobrenadante viral foi coletado, filtrado a 0,45um e utilizado imediatamente para transduzir as células-alvos. Para os vetores que possuem gene repórter, a eficiência da transfecção foi acompanhada com o auxilio de microscópio de fluorescência. Em alguns casos o

Lentivirus

célula empacotadora 293T

Retrovirus

célula empacotadora Phoenix NX-Eco Vetores* Quantidade (µg) Vetores* Quantidade (µg)

pMD2.VSVG 0,58 pcL-Eco 2

pMDLg/p#54 1,08 Vetor de transferência 2

pRSV-Rev 0,41

sobrenadante viral foi coletado, substituído por novo meio de cultura e as células incubadas novamente por um período de 20-24h para uma coleta viral adicional.

Transdução de células D1

As células D1 foram transduzidas com 1 ml (v:v) do sobrenadante viral coletado de células Phoenix ou 293T transfectadas com IL7R mutante, shRNA, gRNA ou os seus respectivos controles. A combinação célula/sobrenadante viral foi centrifugada a 2.000 rpm por 1 h em temperatura ambiente com 8ug/ml de polibreno (Chemicon #TR-1003-G) ou através da adsorção em retronectina (RetroNectin-Recombinant Human Fibronectin Fragment Cat. #T100A/B). Após 48h as células foram monitoradas para acompanhar a fluorescência do gene reporter ou no caso das transduções com shRNA foram submetidas à seleção com 10mg/ml de puromicina, por uma semana.

Construção do mutante DNM2 humano

O gene DNM2 humano foi amplificado a partir de uma biblioteca de cDNA

comercial (dynamin-2 isoform 1 [Homo sapiens] Sequencia ID: ref NP_001005360.1) e

mutação somática p.Asp194Asn, detectada no paciente P3 (tabela suplementar 5 do

capitulo 2) foi introduzida por sobreposição de PCR (iniciadores em Anexo VII) com o uso

do kit Platinum™ Taq DNA Polymerase High Fidelity – Invirogen (Cat# 11304011). O mutante denominado DNM2.D194N foi clonado no vetor retroviral pMIG: MSC-IRES9wt)/EGFP (mapa em Anexo VI) com uso do kit rapid DNA Ligation – Roche (Cat# 11635379001) e das enzimas de restrição BglI e EcoRI, conforme esquema e condições abaixo:

Condição 1: obtenção do gene DNM2 a partir da biblioteca de cDNA comercial; condição 2: obtenção dos amplicons 1 e 2 contendo a mutação D194N; condição 3: junção dos amplicons 1 e 2; condição 4: amplificação do DNM2.D194N.

Western blotting

O silenciamento dos genes Dnm2, Phf6, Sgk223, Ctcf e Rb1 foi avaliado através de Western blot. As proteínas totais foram extraídas a partir de aproximadamente 30x106 células transduzidas. As células foram peletadas por centrifugação, ressuspendidas em 100µL de tampão de lise (Triton 100 lysis buffer - 62.5 mM Tris-HCl at pH. 6.8, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 50 mM dithiothreitol, com 2% SDS), sendo posteriormente vortexado e incubado por 5 minutos no gelo. O sobrenadante do lisado celular foi coletado após centrifugação em velocidade máxima por 3 minutos. Os extratos de proteínas foram quantificados por ensaio de Bradford (Coomassie Plus (Bradford) Assay Reagent/ Thermo

Scientific #23238) e 50µg de proteína foram separadas por eletroforese em gel de

poliacrilamida 4-12% (Invitrogen Novex Tris-Glycine/EC6035). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose através de eletroforese (Bio-Rad) e as membranas foram posteriormente bloqueadas com solução bloqueio feita de 5% leite em TBS-T (5% leite em pó, 1X Tris-buffered saline (TBS), 1% Tween 20) por 1h. As membranas foram lavadas com TBS-T e incubadas com os anticorpos primários diluídos 1:500 para anti-Sgk223 ou 1:1000 para os demais anticorpos (Anexo VIII), em solução de bloqueio, de um dia para o outro a 4°C. Após a incubação, a membrana foi lavada por 3 vezes com solução TBS-T e incubada por 1 hora com o respectivos anticorpos secundários diluídos 1:1000 em TBS-T. As membranas foram lavadas 3 vezes por 5 minutos com solução TBS-T e as bandas relativas às proteínas imunorreativas foram reveladas com 2mL de substrato (SuperSignal

West Dura Extended Duration Substrate #34076) em filme (Carestream Kodak BioMax MR film MR-1 870 1302).

Marcação extracelular

1x106 células D1 foram peletadas por centrifugação, lavadas com 2mL de tampão de marcação (PBS pH 7.2 Corning 21-040-CV /1% SFB) por duas vezes, ressuspendidas em 1mL de meio RPMI-1640 (Mediatech, Inc., cat# 10-040-CV), 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado por aquecimento (Thermo Scientific, cat# SV30014.03), 55 µM 2-Mercaptoethanol (Gibco, 023), 100U/ml penicina 100µg/mL estreptomicina (Gibco, cat#21985-023) e incubadas a 370C por 4h na ausência de IL7. Após o período de incubação as células foram lavadas com 1mL de tampão de marcação e o pellet foi ressupendido em 100µL do tampão de marcação adicionado dos anticorpos anti-IL7R murino ou humano conjugados com (PE-Cy5, APC ou Alexa Fluor 647) seguindo-se um período de incubação de 20 minutos a 4°C. Após a incubação com o anticorpo, as células foram lavadas com PBS pH 7.2 (Corning 21-040-CV) e o pellet foi ressuspendido em 500µL de PBS/1% parafolmaldeido. As células foram posteriormente examinadas por citometria de fluxo e analisadas com o software FCS

Express 6 Flow Cytometry RUO Professional. Para descrição dos anticorpos ver Anexo VIII.

Ensaio de proliferação

As células D1 estavelmente expressando shRNA e/ou o gene mutado (bem como os respectivos controles: scramble, plasmídeo vazio ou gene selvagem) foram plaqueadas em placas de 96 wells de fundo reto em meio de cultura sem IL7 em uma concentração de 5x104/100µL e incubadas à 370C em diferentes tempos. O número de células foi avaliado em diferentes tempos através do ensaio de MTT (Promega G4101). 15µL de reagente MTT foram adicionados a cada poço e incubado por 4 horas à 370_{C para precipitação dos cristais.} Após a incubação com MTT, 100µL da solução de solubilizante de parada (Promega #G401B) foi adicionada e a placa foi incubada a 370_{C de um dia para o outro. O valor de} absorbância foi medido a um comprimento de onda de 570 nm.

Ensaio de apoptose

Células apoptoticas foram determinadas por citometria de fluxo após marcação com Annexina V e V-7AAD. 1x106 células foram lavadas duas vezes com PBS e então ressupendidas em tampão de ligação (1x Binding Buffer – APC Annexin V kit/BD

PharmingenTM_{) na concentração de 1x10}6_{/mL. 100µL da solução célula/binding buffer foi} então transferido para um tubo de cultura celular de 5mL e adicionado 5µL de anticorpo