R evista d a So cied a d e B rasileira de M edicina Tropical 2 6(2):83-87, abr-jun, 1993
AVALIAÇÃO DE PREPARAÇÕES ANTIGÊNICAS DE
STRONGYLOIDES STERCORALIS PARA O
IMUNODIAGNÓSTICO DA ESTRONGILOIDÍASE
Cláudio Lúcio Rossi, Emília Emiko Hieda Takahashi, Angela Lauand
Sampaio Teixeira, Sílvia de Barros-Mazon e Rose Clélia Grion Trevisan
P reparações antigênicas de Strongyloides stercoralis p a ra o im unodiagnóstico da estrongiloidíase têm sido tradicionalm ente obtidas p ela extração de antígenos do parasita com solução salina. No presente trabalho, após obtenção da preparação antigênicade S. stercoralis com extração salina, a fr a ç ã o residual f o i solubilizada com uréia, e as duas preparações fo ra m avaliadas para o bnunodiagnóstico da estrongiloidíase, através de uma técnica imunoenzimática. N ão fo r a m encontradas diferenças significativas entre as duas preparações, em term os de atividade antigência específica e reatividade cruzada. A dificuldade de obtenção de larvas de S. stercoralis tem sido um fa to r limitante para o desenvolvim ento de reações m ais sensíveis e específicas que possam ser empregadas no imunodiagnóstico da estrongiloidíase. A possibilidade de um m aior rendimento, em termos de m aterial antigênico ativo, abre perspectivas de fra cio n a m en to do extrato bruto do parasita, na tentativa de se encontrar fr a ç õ e s com m aioratividade antigênica específica e m enor reatividade cruzada.
Palavras-chaves: Strongyloides stercoralis. Estrongiloidíase. Imunodiagnóstico. Antígenos.
Strongyloides stercoralis é um parasita com
distribuição geográfica mundial, tendo maior prevalência em países tropicais5. A maioria dos indivíduos com estrongiloidíase é assintomática ou apresenta manifestações clínicas brandas, não patognom ônicas2 9.
O diagnóstico de estrongiloidíase tem sido tradicionalm ente feito por métodos parasitológicos baseados na identificação de larvas de S. stercoralis nas fezes dos indivíduos infectados. Entretanto, muitos autores têm ressaltado a falta de sensibilidade desses m étodos810.
O desenvolvim ento de testes sorológicos confiáveis para o diagnóstico da estrongiloidíase p o d e te r g ra n d e u tilid a d e em s itu a ç õ e s ep id em io ló g icas e clín ica s. A té o presente m om ento, poucas tentativas têm sido feitas para o
T rab alh o realizado no D epartam ento de Patologia Clínica da F aculdade de C iências M édicas da U niversidade E stadual de C am pinas, C am pinas, SP.
E n d ereço p a ra c o rresp o n d ên cia : D r. C láudio Lúcio Rossi.
D epto. de Patologia C lín ica/F C M /U N IC A M P . C P: 6111, 13081-970 C am pinas, SP.
R ecebido para publicação em 3 0 /1 2 /9 2 .
d esen v o lv im en to d esses te s te s 1 6 11 13 14 15. Tradicionalmente, preparações antigênicas de S.
stercoralis, resultantes de extração de antígenos com
solução salina, têm sido utilizadas nas técnicas sorológicas padronizadas. Todavia, tais preparações carecem de adequada sensibilidade e especificidade, por representarem extratos brutos do parasita. Uma d as p r in c ip a is lim ita ç õ e s e n c o n tra d a s no desenvolvimento de testes sorológicos mais sensíveis e específicos, é a dificuldade em se obter quantidades suficientes de antígenos que perm itam seu posterior fracionamento e análise.
Estudos prévios têm mostrado que, após a extração de antígenos de Schistosoma mansoni com solução salina, a fração residual do parasita solubilizada com uréia, pode apresentar quantidades significativas de materiais antigênicos ativos16 17.
No presente trabalho, após obtenção de uma preparação antigênica de S. stercoralis com extração salina, uma segunda preparação antigênica foi obtida pela solubilização da fração residual com uréia, e as d u a s p r e p a ra ç õ e s fo ra m a v a lia d a s p a ra o imunodiagnóstico da estrongiloidíase, através de uma técnica imunoenzimática (ELISA).
R ossi CL, T akahashi EEH , Teixeira A L S, B arros-M azon S , Trevisan RCG. A valiação de p re p a r a ç õ e s antigênicas de S trongyloidcs stercoralis p a ra o im unodiagnóstico da estrongiloidíase. R evista da S o cied a d e B rasileira de M edicina Tropical 26:83-87, abr-jun, 1993.
M A TERIA L E M ÉTODOS
Reagentes
Quando não especificado no texto, os reagentes foram obtidos da Sigma Chemical C o ., Saint Louis, MO. Tris (hidroximetil) - amino metano (Tris) e peróxido de hidrogênio a 30% (H20 2) foram obtidos da Aldrich C o., Milwaukee, WI.
Preparação dos antígenos de S. stercoralis
Larvas de S. stercoralis recuperadas de cultura de fezes com carvão, através de uma modificação do método de Baermann12, foram lavadas várias vezes por centrifugação e estocadas a -70°C até o momento de uso. A preparação antigênica resultante da extração salina foi obtida segundo Gam, Neva e K ro to sk i3. R esum idam ente, as larvas foram descongeladas e ressuspendidas em solução salina tamponada com fosfato 0,15M , pH 7,2 (SST), contendo 5mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (FFM S). A pós fragm entação das larvas por sonicação (2,5m in), o material foi deixado sob agitação lenta, a 4°C, durante 18h, para a extração de antígenos. Após centrifugação a 32.000 xg, durante 30 min, a 4°C, o sobrenadante (preparação ES) foi cuidadosamente removido, aliquotado e estocado a -70°C. O precipitado, resultante da centrifugação, foi ressuspendido em tampão Tris- HC10,05M , contendo uréia 8M e FFM S 5mM , pH 8 .0 material foi sonicado como previamente descrito e deixado sob agitação lenta, a 4°C, durante 2h. Após centrifugação a 32.000xg, por 30 min, a 4°C, o sobrenadante foi cuidadosamente removido 3 submetido a cromatografias de exclusão em colunas PD-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), equilibradas com tampão Tris-H C10,05M , pH 8, contendo 0,2M de NaCl. O eluente contendo proteínas (preparação EU) foi aliquotado e estocado a -70°C.
ELISA
A técnica ím unoenzim ática utilizada neste trabalho foi adaptada a partir de uma técnica previamente descrita para a detecção de anticorpos específicos da classe JgG anti-S. stercoralis11. As concentrações protéicas das preparações antigênicas,
bem como a concentração ótim a do conjugado, selecio n ad as p ara u so , fo ram d e te rm in ad a s previamente através de ensaios de titulação em placas de ELISA. Placas de poliestireno com ori fíci os de fundo chato (C orning, N ew Y ork) fo ra recobertas com 200;ul/orifício das preparações E., ou EU, diluídas a 4fxg de proteína/m l com tampão carb o n ato -b icarb o n ato 0 ,1 M , pH 9 ,6 . Após incubação por 3h, a 37°C, as placas foram lavadas três vezes com SST contendo 0,1% de Tween 20 (SST/Tw). A seguir, 200/xl das am ostras dos soros diluídas em SST-Tw contendo 0,1% de albumina bovina sérica, foram adicionados aos orifícios. Após incubação por lh , à tem peratura am biente, as placas foram lavadas com SST-Tw como previamente descrito. D uzentos m icrolitros do conjugado, imunoglobulina de cabra anti-IgG hum ana marcada com peroxidase, diluído a 1:750 com SST-Tw, foram adicionados aos orifícios e as placas foram deixadas em repouso por 1 h , à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com SST-Tw, como já descrito, e 200/íl do sistem a substrato foram adicionados aos orifícios. O sistema substrato era composto de 3 ,3 ', 5,5'-tetram etilbenzidina e H20 2 nas concentrações finais de 0,42m M e 0,004% , respectivamente. Trinta minutos após a adição do sistema substrato, as reações foram bloqueadas adicionando-se aos orifícios 50/^1 de H 2S 0 4 4N. As absorbâncias das reações foram lidas a 450nm em uma leitora de placas. Todas as diluições dos soros foram testadas em triplicata e a densidade ótica (D .O .) média foi considerada. Todas as placas continham 8 replicatas do controle de antígeno. A ^ *j. final p ara cada d ilu iç ã o do soro foi determinada, subtraindo-se a média das D .O . dos 8 controles de antígenos. Um resultado foi considerado positivo, quando a D .O . final foi superior a 2 desvios-padrões (DP) acima da média de um grupo de soros negativos, obtidos de 12 indivíduos sem nenhuma evidência de estrongiloidíase, testados na mesma placa.
Soros
Os seguintes grupos de soros, provenientes de in d iv íd u o s in f e c ta d o s , fo ra m u tiliz a d o s :
S tr o n g y lo id e s s te r c o r a lis ( n = 1 7 ) ; A scaris lumbricoides (n = 3); Schistosoma m ansoni (n = 3); Giardia lamblia (n = 3); Hymenolepis nana (n = 2);
R ossi CL, T aka h a sh i EEH , Teixeira A L S, B arros-M azon S , Trevisan RCG. A valiação de p rep a ra çõ es antigênicas de S trongyloides sterco ralis p a ra o im unodiagnóstico da estrongiloidíase. Revista da Sociedade Brasileira de M edicina T ropical 26:83-87, abr-jun, 1993.
Enterobius vermicularis (n = 2); Taenia sp (n = 2).
O diagnóstico, em todos os grupos, foi determinado por meios parasitológicos. Em todos os casos, nenhuma infecção simultânea com outros parasitas intestinais foi observada, em pelo menos três exames de fezes consecutivos.
U m p o o l de soros reagentes para S. stercoralis foi obtido, m isturando-se partes iguais de soros de indivíduos com estrongiloidíase, comprovada por meios parasitológicos e sorologia positiva para o parasita.
Os soros controles negativos foram obtidos de estudantes da Faculdade de Ciências Médicas da U N IC A M P e d e f u n c io n á r io s do n o sso Departamento. Estes indivíduos tinham, pelo menos, três exames protoparasitológicos negativos e não tinham história passada de infecção por S. stercoralis.
RESULTADOS
Em term os de concentração de proteínas, a proporção entre as extrações com SST e uréia foi de
1,7:1.
As ativ id ad es antigênicas específicas das
preparações ES e EU foram avaliadas, através de ELISA, utilizando os soros de indivíduos com estrongiloidíase diluídos a 1:10. D os 17 soros te sta d o s, 13 foram reag en tes com as duas preparações, 1 foi reagente com a preparação ES e duvidoso com a preparação EU e 3 não reagiram com as duas preparações. Um p o o l de 8 soros de indivíduos com estrongiloidíase e com sorologia positiva para S. stercoralis também foi testado por ELISA com as duas preparações. As densidades óticas finais das reações entre as preparações ES e EU e o pool de soros diluídos a 1/100 foram, respectivamente, 0,75 e 0,74.
A reatividade dos soros de indivíduos portadores de outras infecções parasitárias com as preparações ES e EU é mostrada na Tabela 1. Estes soros foram testados com diluições seriadas, com eçando em 1/10. Dos 15 soros testados, somente 2 reagiram com as duas preparações antigênicas. Estes eram provenientes de um indivíduo com esquistossom ose e de um com ascaridíase. Nestes soros falso- p o sitiv o s, não foram observadas d ife re n ç as significativas entre os títulos de ELISA obtidos com as preparações ES e EU.
Tabela 1 - A valiação da reatividade entre preparações antigênicas de S. stercoralis e soros de indivíduos portadores de infecções heterólogas, através de ELISA.
n° caso Tipo de infecção Títulos de ELISAa
ESb EU C 1 A. lumbricoides 80 40 2 < 10 < 10 3 < 10 < 10 4 S. m ansoni 20 10 5 < 10 < 10 6 < 10 < 10 7 G. lamblia < 10 < 10 8 < 10 < 10 9 < 10 < 10 10 H. nana < 10 < 10 11 < 10 < 10 12 E. vermicularis < 10 < 10 13 < 10 < 10 14 Taenia sp < 10 < 10 15 < 10 < 10
A Títulos foram expressos como as recíprocas das diluições dos soros. B P reparação antigênica de S. stercoralis obtida com extração salina. c Preparação antigênica obtida com solubilização pela uréia da fração residual
R ossi CL, T akahashi EEH , Teixeira A L S, Barros-M azon S, Trevisan RCG. A valiação de p re p a ra ç õ e s antigênicas de Strongyloides stercoralis p a ra o im unodiagnóstico da estrongiloidíase. R evista da S o cied a d e B rasileira de M edicina Tropical 26:83-87, ahr-jun, 1993.
DISCUSSÃO
O diagnóstico definitivo de estrongiloidíase é dado, pelo achado de larvas de S. stercoralis nas fezes de pessoas infectadas. Entretanto, as larvas do parasita podem estar presentes em pequenas quantidades, ou mesmo ausentes dos materiais examinados, de modo que vários autores têm salientado a falta de sensibilidade dos métodos p arasito ló g ico s7 10. As técnicas so ro ló g icas, principalmente as imunoenzimáticas, pc lem ser uma boa a lte rn a tiv a p a ra o d ia g n ó stico da estrongiloidíase. A maioria dos trabalhos realizados, até o presente momento, indica que a sensibilidade das técnicas imunoenzimáticas para detecção de anticorpos específicos da classe IgG anti-S.
stercoralis é próxim a a 85 %1311. A dificuldade de
o b te n ç ã o d e la rv a s d e S. s te r c o r a lis e, consequentem ente, a obtenção de quantidades suficientes de material antigênico ativo, tem sido um fator limitante para o imunodiagnóstico da estrongiloidíase5.
Trabalhos prévios têm mostrado que antígenos ligados à m em brana de parasitas podem ser solubilizados na presença deuréia1617.O s resultados do presente trabalho mostraram que a fração residual de S. stercoralis, resultante da extração salina, após solubilização com uréia, apresentou quantidades significativas de material antigênico ativo. As preparações antigênicas ES e EU parecem ter grau sim ilar de reatividade cruzada com soros de indivíduos portadores de infecções heterólogas. Particularmente importante foi a forte reatividade observada com o soro de um indivíduo com ascaridíase. Essa reatividade cruzada também tem sido observada po r outros autores, utilizando preparações antigênicas de S. stercoralis ou S.
ratti4 10 l5.
A sensibilidade e a especificidade de uma técnica imunológica dependem, em grande parte, da preparação antigênica utilizada. A possibilidade de um m aior rendimento de material antigênico de
S. stercoralis, através de um segundo processo de
extração, com uréia, abre perspectivas para o fracionamento do extrato bruto do parasita, na tentativa de se encontrar frações com maior atividade antigênica específica e m enor reatividade cruzada.
SUM M ARY
A queous-soluble (AS) antigens fr o m larvae o f Strongyloides stercoralis, extracted with phosphate- buffered saline, are traditionally u s e d fo r serodiagnosis ofstrongyloidiasis. To identify sources o f a ntigensfor use in serodiagnosis, residual particulates fr o m parasite larvae after aqueous extraction were solubilized with Tris-buffered 8M urea, yielding a urea-soluble (US) antigen fraction. Both A S and US antigens fr o m S. s te rc o ra lis w ere e v a lu a te d by an e n zy m e -lin k e d im m unosorbent assay. No significalive differences were observed between A S and US antigens fr o m the parasite regarding specific antigenic activity a nd cross-reactivity. lm m unoassays are highly dependent on the antigen fo r sensitivity a nd specificity. C rude extracts fr o m S. stercoralis should be fu r th e r studied, m ainly in relation to antigenic fra ctio n s which could provide even more sensitive and specific results. Studies o ffra ctio n a tio n o f S. stercoralis m ust take into account the antigen y ield o f both lhe crude extract and fra ctio n s, since larvae o f parasite are norm ally difficult to obtain. C onsidering this aspect, the results fr o m this study are very useful, since the extraction with urea subslantialty increased the am ounts o f antigenic m ateriais norm ally obtained with the classical aqueous extraction.
K e y - w o r d s : S t r o n g y lo i d e s s t e r c o r a l is . Strongyloidiasis. Im munodiagnosis. Antigens.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. C arrollSM , K arthigasuK T, G roveD l. Serodiagnosis
o f human strongyloidiasis by an enzyme-linked im m unosorbent assay. Transactions o f the Royal Society o f Tropical M edicine and H ygiene 75:706- 709, 1981.
2. C arvalho-F ilho E. S trongyloidiasis. Clinics in G astroenterology 7:179-200, 1978.
3. Gam AA, N eva FA , K rotoski W A . Com parative sensitivity and specificity o f ELISA and 1HA for serodiagnosis ofstrongyloidiasis with larval antigens. A merican Journal o f T ropical M edicine 37:157- 161, 1987.
4. Genta RM . Predictive value o f an enzyme-linked im m unosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis o f strongyloidiasis. A m erican Journal o f Clinicai Pathology 89:391-394, 1988.
5. Genta RM. Global prevalence o f strongyloidiasis: criticai review with epidem iologic insights into the prevention o f dissem inated disease. Reviews of
Rossi CL, T akahashi EEH , Teixeira A L S, Barros-M azon S, Trevisart RCG. A va lia çã o de p re p a ra ç õ e s antigênicas de Strongyloides sterco ralis p a ra o im unodiagnóstico da estrongiloidíase. R evista da S ociedade B rasileira de M edicina T ropical 26:83-87, abr-jun, 1993.
Infectious D iseases 11:755-767, 1989.
6. G enta R M , W eil GJ. Antibodies to Strongyloides stercoralis larval surface antigens in chronic strongyloidiasis. L aboratory Investigation 47:87- 90, 1982.
7. G rove D l. Strongyloidiasis in Allied ex-prisoners o f w ar in South-East Asia. British M edicai Journal 280:598-601, 1980.
8. G r o v e D l, B la i r J . D ia g n o s is o f h u m a n strongyloidiasis by im m unofluorescence, using Strongyloides ratti and S. stercoralis larvae. The A m erican Journal ofT ropical M edicineand Hygiene 30:344-349, 1981.
9. M ilder JE , W alzer PD , K ilgore G, Rutherford I, Klein M. Clinicai features o f Strongyloides stercoralis infection in an endem ic area o f the United States. G astroenterology 80:1481-1488, 1981.
10. N eva FA . Biology and im munology o f human strongyloidiasis. Jo u rn al o f Infectious Diseases 153:397-407, 1986.
11. N eva FA , Gam AA, B urke J. C om parison o f larval antigens in an enzym e-linked im m unosorbent assay for strongyloidiasis in h um ans. Journal o f Infectious D iseases 144:427-432, 1981.
12. R ugai E, M attos T , Brisola AP. Nova técnica para isolar larvas de nem atóides das fezes; modificação
do método de Baerm ann. Revista do Instituto Adolfo Lutz 14:5-8, 1954.
13. Sato Y , R yum on I. G elatin p a rtic le indirect agglutination test for serodiagnosis o f human strongyloidiasis. Japanese Journal o f Parasitology 39:213-219, 1990.
14. Sato Y ,T a k a ra M ,O tsu ru M . D etectionofantibodies in strongyloidiasis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Transactions o fth e Royal Society o f Tropical M edicine and H ygiene 79:51-55, 1985. 15. T rib o u le y -D u re t J , T rib o u ley J, A ppriou M ,
M egraud RN. A pplication du test E LISA au d ia g n o stic d e la stro n g ilo id o s e . A n n ales de Parasitologie 53:641-648, 1978.
16. T sang V CW , Tao Y, M addison SE. Systematic fractionation o f Schistosom a m ansoni urea-soluble egg antigens and their evaluation by the single-tube, kinetic-dependent, enzym e-linked, im m unosorbent assay (k-ELISA). Journal o f Parasitology 67:340- 350, 1981.
17. Tsang V CW , T sang KR, H ancock K, Kelly MA, W ilson BC, M addison SE. Schistosom a m ansoni adult microsom al antigens, a serologic reagent. I. S y s te m a tic f r a c tio n a tio n , q u a n tita tio n , an d characterization o f antigenic com ponents. Journal o f Im munology 130:1359-1365, 1981.
