RESUMO
A glico-hemoglobina (GHb) é um parâmetro importante no controle glicêmico de pacientes com DM. Vários estudos clínicos mostraram claramente que a melhora no controle glicêmico está fortemente asso-ciada com a diminuição no desenvolvimento e/ou progressão das complicações em diabetes melito tipos 1 e 2. A medida exata e precisa da GHb é uma questão importante para os laboratórios clínicos. Vários fatores afetam os resultados e podem levar a resultados errôneos. Nesta revisão, discutimos os problemas da padronização da determi-nação da GHb para monitorar a terapia diabética e também os prin-cipais fatores interferentes. Os métodos para GHb podem ser diferente-mente afetados pelas interferências. O efeito da interferência pode ser clinicamente mais relevante com o pior controle glicêmico. O labo-ratório deve estar atento para estes fatores para evitar confusão na interpretação clínica dos resultados, e os clínicos devem contatar o laboratório sempre que houver discrepância entre a impressão clínica e o resultado laboratorial. (Arq Bras Endocrinol Metab 2004;48/4:451-463)
Descritores:Hemoglobina glicada; Controle metabólico do DM; Medi-da de GHb; Hemoglobina anômala; Anemia; Drogas
ABSTRACT
Glycohemoglobin (GHb): Clinical and Analytical Aspects.
Glycohemoglobin (GHb) has a key role in the assessment of glycemic control in diabetic patients. Several studies have clearly shown that improved glycemic control is strongly associated with decreased devel-opment and/or progression of diabetic complications in both type 1 and 2 diabetes mellitus. Therefore, accurate determination of GHb con-centration is an important issue for clinical laboratories. Several factors may affect and lead to erroneous results. We discuss the problems of standardization of GHb measurements for monitoring glycemic control and also consider the potential interfering factors on GHb measure-ments. Moreover, GHb assays may be affected by interference in differ-ent ways. The effect of interference may be more clinically relevant with poor metabolic control. Laboratory staff must be aware of all pitfalls to avoid adding more confusion to the clinical interpretation of HbA1c
val-ues and physicians should contact laboratories if discrepancies between clinical impressions and laboratory data are observed. (Arq Bras Endocrinol Metab 2004;48/4:451-463)
Keywords:Glycated hemoglobin; Metabolic control; Sample storage; Variant hemoglobin; Anemia; Drugs
Importância do Diabetes Melito e Uso Clínico da GHb/HbA1c
O
DIABETES MELITO(DM) pode se acompanhar de complicações crôni-cas micro e macrovasculares que estão associadas a elevada morbidadeJoíza Lins Camargo
Jorge Luiz Gross
Unidade de Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica (JLC) e Serviço de Endocrinologia (JLG), Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS.
Recebido em 29/12/03 Revisado em 15/06/04 Aceito em 23/06/04
e mortalidade.
A nefropatia diabética acomete mais de um terço dos pacientes e é a causa mais comum de doença renal terminal e ingresso em programas de hemodiálise (1), e a retinopatia diabética é a principal causa de cegueira entre os 20–74 anos. As doenças cardiovascu-lares (DCV) são responsáveis por mais de 50% das mortes em pacientes com DM tipo 2 (DM2) e tam-bém por 30% das internações em centros de tratamen-to intensivo (2).
Os níveis glicêmicos são um fator determinante do desenvolvimento e progressão das complicações do DM (3,4). A medida da glico-hemoglobina (GHb) é o parâmetro de referência para avaliar o grau do controle glicêmico em pacientes com DM (5). A Associação Americana de Diabetes (ADA) recomenda que a GHb seja medida regularmente em todos os pacientes a intervalos de 4 a 6 meses (6). Considerando a alta prevalência do DM e o impacto das complicações da doença na sociedade, a dosagem da GHb é um dos procedimentos mais importantes no laboratório clíni-co atual. O número de requisições deste teste tem aumentado consideravelmente nos últimos dez anos, e os laboratórios devem estar preparados para fornecer resultados exatos e precisos de GHb, para ajudar o clínico a prevenir e manejar as complicações do DM. No Hospital de Clínicas de Porto Alegre, o número médio de requisições mensais para GHb era 340 em 1996 e aumentou para 750 em 2003, indicando um aumento de 120% no número de exames realizados mensalmente (dados da Unidade de Bioquímica, Hos-pital de Clínicas de Porto Alegre).
As dosagens de GHb foram disponibilizadas no laboratório clínico no início da década de 80 (7). O teste foi logo introduzido na prática clínica para auxiliar no manejo dos pacientes com DM (8). No entanto, foi apenas na década de 90 que o verdadeiro valor clínico desta dosagem laboratorial ficou definitivamente esta-belecido, a partir de dois grandes ensaios clínicos (3,4) que analisaram o papel do controle intensivo da glicemia no desenvolvimento das complicações crônicas do DM. No estudo Diabetes Control and Compli
-cations Trial (DCCT) (3), o risco para o
desenvolvi-mento e progressão das complicações crônicas do DM foi intimamente relacionado com o grau do controle glicêmico, medido pela GHb, fração HbA1 c. Os resul-tados do DCCT determinaram a relação dos valores de H b A1 ccom a glicemia média e estabeleceram objetivos a serem atingidos em pacientes com DM tipo 1. Houve redução no risco de desenvolver retinopatia, microal-buminúria, proteinúria e neuropatia clínica no grupo que foi tratado intensivamente comparado com o
grupo que teve tratamento convencional. Também foi observado um aumento exponencial no desenvolvi-mento destas complicações com o audesenvolvi-mento dos níveis de HbA1 c(figura 1).
Os resultados do DCCT foram confirmados pelo United Kingdon Prospective Diabetes Study (UKPDS) em 1998 (4), em pacientes com DM tipo 2. Este estudo também mostrou que a intensificação do tratamento da hiperglicemia reduz a incidência das complicações. Para cada 1% de decréscimo absoluto em HbA1c, houve diminuição de 35%, 25% e 7% no risco de complicações microvasculares, mortes rela-cionadas ao DM e mortes em geral, respectivamente.
Normalmente, estes ensaios clínicos demons-traram que a cada decréscimo absoluto de 1% em HbA1c, há uma redução de 30 a 35% no risco de com-plicações microvasculares do DM.
Esta mesma relação entre níveis de HbA1c e o desenvolvimento das complicações crônicas do DM também foi observada em outros ensaios clínicos pu-blicados nas últimas décadas (9-16).
Embora a maioria dos estudos não tenha sido primariamente delineada para estabelecer a relação entre controle glicêmico e DCV, análises de subgrupos de dados nas coortes do DCCT e UKPDS mostraram uma associação fortemente sugestiva entre controle glicêmico e doença macrovascular. Na coorte do UKPDS (4), a taxa de eventos cardiovasculares foi alta. Houve uma redução de 18% nos casos de infarto agudo do miocárdio (IAM) no grupo de pacientes que teve tratamento intensivo, mas este achado apresentou significância estatística limítrofe (P= 0,052). Quando o grupo foi observado como um todo, houve uma relação altamente significante entre HbA1ce o risco de DCV nestes pacientes (15). Apenas um estudo (16) relatou aumento da incidência de doença
macrovascu-Figura 1.Relação da glico-hemoglobina/HbA1ce risco de complicações microvasculares.
Adaptado de Skyler JS. Endocrinol Metab Clin 1996; 2 5 : 2 4 3 -5 4 .
lar em pacientes com DM2 tratados intensivamente. Neste estudo, o grupo selecionado tinha DM por vários anos. Estes dados sugerem que o efeito do con-trole glicêmico pode ser diferente em pacientes no estado inicial da doença, como os pacientes do UKPDS, e em pacientes com mais de 10 anos de duração do DM. No entanto, mais estudos são necessários para comprovar esta relação.
Na população de indivíduos não-diabéticos e com DM, níveis mais elevados de GHb/HbA1c tam-bém são marcadores de risco cardiovascular, de even-tos e mortalidade. A coorte de Norfolk (17) apresen-tou um aumento no risco de doença macrovascular com o aumento dos níveis de HbA1c nos indivíduos sem DM.
Com base nas evidências acima, pode-se con-cluir que níveis elevados de GHb/HbA1 cestão asso-ciados, em todas as populações estudadas, com aumento das complicações do DM, ou seja, a HbA1 c é um marcador do risco de complicações no DM. O tratamento dos pacientes com DM deve, portanto, procurar atingir os níveis mais próximos do normal possível da homeostase glicêmica e o grau do controle glicêmico deve ser avaliado pela medida da GHb/ H b A1 c.
Valor ideal de HbA1c: Qual o objetivo do tratamento?
O tratamento deve ter como objetivo a normalização dos níveis glicêmicos. Baseado nos dados do DCCT e UKPDS (3,4), recomenda-se atingir valores de HbA1c< 7,0% (5,6). Este foi o valor alcançado pelos pacientes tratados intensivamente nos ensaios clínicos e abaixo do qual há uma diminuição considerável das complicações crônicas (figura 1). A ADA recomenda que medidas terapêuticas adicionais devem ser implan-tadas quando os valores excederem 8,0% (6). Devido a essa última recomendação, muitos clínicos não tratam o DM tão agressivamente como deveriam, e deixam para intensificar o controle glicêmico só quando com valores de HbA1c> 8,0%. Conseqüentemente, os valo-res de HbA1c, na maioria dos pacientes, estão acima da meta de 7,0% preconizada. Devido a isso, a meta para HbA1c recomendada pela Federação Internacional de Diabetes (IDF European Policy Group), com o respal-do respal-do Colégio Americano de Enrespal-docrinologia (ACE) (18,19), é 6,5%. O UKPDS mostrou que o risco de ocorrer complicações micro e macrovasculares é maior para os valores de HbA1c> 6,5% (4). Este valor se cons-titui de três desvios-padrão (3DP) acima da média de H b A1 c para populações não-diabéticas. Estudos indicam que valores mais elevados de HbA1c, ainda
que dentro dos limites normais, já estão associados com desenvolvimento de complicações, principal-mente cardiovasculares, em coortes sem diabetes (17). A Academia Nacional de Bioquímica Clínica Americana (NACB), respaldada pela ADA, recomenda que a determinação de HbA1c seja feita pelo menos duas vezes ao ano em todos os pacientes portadores de DM tipos 1 e 2 (5). Este intervalo deve ser menor, a cada 3 ou 4 meses, para aqueles pacientes que não atingem o controle glicêmico desejável.
Um aspecto importante a ser observado é que muitos pacientes desconhecem a existência do teste A1 c e, conseqüentemente, não sabem que existem metas a serem atingidas. Dados norte-americanos (20) revelam que cerca de 40% dos pacientes com DM não tem o teste A1 crealizado na freqüência recomendada. Aqueles que têm o teste realizado apresentam níveis > 8% em mais de 50% dos casos. Estes dados não surpreendem, pois os pacientes que foram recrutados para participar da maioria dos ensaios clínicos apresentavam valores de H b A1 cao redor de 9% na época da seleção (3,4).
O conhecimento dos médicos e pacientes sobre o teste tem um papel importante no manejo clínico. Recentemente, campanhas nacionais americanas, pro-movidas por órgãos públicos e privados, foram lançadas com o objetivo de divulgar o teste e orientar sobre a interpretação dos resultados. A campanha “The
Diabetes A1c Initiative™”, promovida pela Associação
Americana de Educadores em Diabetes (AADE), foi lançada nacionalmente no Dia Mundial do Diabetes (14 de novembro) do ano passado. Com o lema “Aim.
Believe. Achieve.”, o objetivo da campanha foi alertar e
educar os pacientes com DM para alcançar valores de HbA1c< 7% e, com isso, baixar os riscos de compli-cações do DM.
No Brasil, não existem dados sobre a disponi-bilidade do teste nos laboratórios. Também não há informação sobre o conhecimento, por parte dos pacientes, da importância e necessidade de se realizar o teste A1c. A Sociedade Brasileira de Diabetes recomen-da que o teste A1cseja feito regularmente, no mínimo duas vezes ao ano, e os valores devem ser mantidos no limite superior do intervalo de referência do método utilizado para dosagem (21).
Clínicos e pacientes devem entender bem o sig-nificado da GHb/HbA1c, e saber sobre as limitações que envolvem a dosagem, para garantir o valor clínico do teste A1c.
Devido ao impacto das complicações crônicas do DM, para pacientes e sociedade, o teste A1c tem sido utilizado como indicador importante na avaliação e monitoramento da qualidade da assistência aos
pacientes com DM pelas diferentes instituições (5). Informações sobre a freqüência com que é solicitado e os níveis alcançados pelos pacientes têm sido requisi-tadas como forma de garantir que o teste A1c seja uti-lizado e que as metas recomendadas para o controle glicêmico sejam atingidas.
Reação de Glicação Não-Enzimática e GHb Em 1955, Kunkel e Wallenius (22) descreveram, pela primeira vez, a heterogeneidade da hemoglobina nor-mal (Hb) em adultos. A seqüência de aminoácidos dos componentes menores, que foram separados por cro-matografia, era idêntica ao componente principal (hemoglobina A0). Estudos posteriores (23) identi-ficaram subfrações que eluíam mais rápido que HbA0, e foram coletivamente chamadas de Hb “rápidas” e nomeadas, individualmente, como HbA1a, HbA1b e HbA1c, conforme a ordem de eluição da coluna. Rah-bar e cols. (24) mostraram que estas frações estavam elevadas nos eritrócitos de pacientes com DM. Em 1971, pela primeira vez, foi descrita a relação entre as hemoglobinas rápidas, a glicemia média e as compli-cações crônicas de pacientes com DM (7).
A formação da GHb ocorre via uma reação de glicação não-enzimática entre o grupo aldeído livre da glicose, ou outros açúcares, e um grupo amino livre na molécula da hemoglobina. Esta reação é conhecida como reação de Maillard. A reação envolve a formação de um composto intermediário instável (base de Schiff, aldimina ou fração lábil), que se forma rapidamente e é proporcional à concentração de glicose momentânea (25). Este composto sofre, lentamente, o rearranjo de Amadori e forma uma cetoamina estável e irreversível (proteína glicada/GHb).
Existem vários sítios de glicação na molécula de hemoglobina. O resíduo terminal de valina na cadeia corresponde a aproximadamente 60-80% da glicose ligada. Outros sítios de ligação também ocorrem na cadeia . Outros açúcares podem se ligar à molécula e contribuem para a fração total glicada (HbA1). O componente especificamente ligado à glicose é co-nhecido como HbA1c(26).
A natureza heterogênea da GHb tem gerado confusão na nomenclatura e no componente que está sendo medido por um determinado método. A Inter
-national Federation of Clinical Chemistry – IFCC (27)
define GHb como o termo genérico para denominar os componentes menores da hemoglobina. O termo inclui todas as hemoglobinas modificadas com a gli-cose ou outros açúcares, incluindo HbA1e suas frações HbA1a, HbA1b, HbA1ce HbA1d, bem como as outras hemoglobinas anômalas glicadas (HbS, HbF, HbC)
que, eventualmente, possam estar presentes. As espé-cies mais conhecidas de GHb são HbA1, HbA1c e GHb total (todas as frações ligadas a um açúcar, em qualquer sítio da cadeia de Hb, inclusive as Hb anô-malas). Recentemente, baseados nos dados do DCCT e UKPDS (3,4), que usaram métodos que mediam especificamente HbA1c, o termo “teste A1c” tem sido recomendado (5,6,28).
Relação da Glicose e GHb
A glicação não-enzimática da hemoglobina é determi-nada principalmente por três fatores: concentração média da glicose plasmática, tempo de meia-vida da hemácia e permeabilidade da membrana do eritrócito à glicose. A membrana de eritrócitos humanos é livre-mente permeável à glicose (29). Sendo assim, a con-centração plasmática de glicose e o tempo de meia-vida da hemácia são os principais determinantes da reação de glicação da proteína em seres humanos. Como a meia-vida dos eritrócitos é, em média, até 120 dias, podemos dizer que a GHb é um índice da média da glicemia nos 120 dias que precedem à coleta do material para o teste laboratorial. A GHb reflete, mais especificamente, o controle glicêmico dos meses que precederam a dosagem.
A relação da glicose e GHb é complexa e não pode ser explicada por um simples cálculo matemático. Modelos matemáticos e dados clínicos (3,30-32) mostram que a média glicêmica dos 20-30 dias anteri-ores à coleta da amostra contribui com aproximada-mente 50% do resultado final, e que os 90-120 dias precedentes contribuem com apenas 10%. Isso signifi-ca que o valor de HbA1c, em qualquer momento, tem a contribuição de todos os eritrócitos: velhos (120 dias de idade) e novos. No entanto, os níveis recentes de glicose (1-2 meses anteriores) contribuem mais para o resultado final. Devido a isso, a GHb pode detectar grandes variações da glicemia em pequenos períodos de tempo, como 3 a 4 semanas. É possível detectar mudanças clinicamente relevantes nos valores de HbA1c sem precisar esperar 120 dias após os supostos episódios hiperglicêmicos.
Estudos cinéticos na formação da GHb (30) sugerem que a reação de glicação da Hb é uma reação de primeira ordem e ocorre em condições de equi-líbrio. O tempo requerido para se alcançar um ponto médio entre o valor inicial e um novo valor é relativa-mente constante em 30-35 dias.
Os dados do DCCT (3) proporcionaram infor-mações importantes sobre a complexa relação entre glicemia média e GHb. Existe uma forte correlação entre glicemia e GHb (r= 0,81, P< 0,0001) e, para
cada 1% de variação da GHb (%HbA1c), há uma varia-ção de 35mg/dL da glicemia média (32). Esta relavaria-ção originou-se da análise de mais de 26.000 resultados de HbA1c de 1439 pacientes da coorte do DCCT. Em média, foram analisados 18 valores de HbA1cpara cada paciente e seus perfis glicêmicos correspondentes (7 pontos de glicemia – antes das refeições, 90 minutos após as refeições e antes de dormir). Estes dados mostraram que a relação GHb e Glicemia é previsível e pode ser resumida pela equação: Glicose (mg/dL)= (1,98%HbA1c – 4,29) / 0,056. Esta relação pode ser utilizada para se ter uma idéia aproximada dos valores de glicose apropriados para cada paciente, para que os valores de GHb recomendados possam ser alcançados e mantidos na prática (tabela 1). A correlação entre os valores de HbA1c e glicemia de jejum foi menor (r= 0,69) do que a encontrada para HbA1c e glicemia média estimada pelo perfil glicêmico de sete pontos. Os valores elevados de glicose de jejum subestimam os valores de HbA1c. Os níveis glicêmicos pós-refeições apresentam uma melhor correlação com os valores de HbA1c. Níveis pós-desjejum tendem a superestimar HbA1c, enquanto que as glicemias pós-almoço apre-sentam uma relação similar àquela da glicemia média determinada pelo perfil glicêmico (32).
Em pacientes tipo 2, a relação entre glicemia e HbA1c parece ser mais complexa (33). Em geral, os níveis glicêmicos, durante diferentes períodos do dia, apresentam uma correlação menor do que a encontra-da para pacientes tipo 1, sendo que os níveis pré-refeição foram os mais relacionados com os níveis de HbA1c. Em DM tipo 2, HbA1c parece fornecer pouca informação sobre os níveis pós-prandiais e, conseqüen-temente, pode não ser um bom índice para as variações dos níveis glicêmicos após as refeições. Devido a isso, há sugestões de que o monitoramento de pacientes com DM2 seja feito através de medidas de glicemias de
jejum, HbA1c e também de medidas glicêmicas pós-prandiais (33). Esta relação em pacientes tipo 2 precisa ser melhor estudada.
Na prática, os pacientes que mantiverem seus níveis glicêmicos médios ao redor de 170mg/dL (9,5mmol/L) alcançarão o valor-alvo de 7% recomen-dado para HbA1c. Aqueles pacientes com glicemias > 200mg/dL (11,1mmol/L) necessitarão ação adi-cional no tratamento. A determinação da glicemia não substitui o teste A1c, mas pode dar uma idéia do valor da A1c no acompanhamento ambulatorial dos pa-cientes. Precauções devem ser tomadas na interpre-tação destas relações. Os dados são válidos apenas quando métodos similares ao usado pelo DCCT, ou métodos DCCT alinhados/convertidos, são utilizados para a dosagem de HbA1c(5).
Métodos para Dosagem da GHb
Existem mais de 30 métodos diferentes para a dosagem de GHb disponíveis para uso no laboratório clínico (5,34). Eles medem a GHb baseados nas diferenças físi-cas, químicas ou imunológicas entre a fração glicada ( H b A1ou HbA1 c) e a não-glicada HbA0(figura 2).
De uma maneira geral, os métodos podem ser classificados em dois grandes grupos (tabela 2): Métodos Baseados na Diferença de Carga Elétrica Entre GHb e HbA0
A cromatografia de troca catiônica (HPLC e minico-lunas) e a eletroforese usam este princípio. O princípio baseia-se no fato de que a ligação da glicose, ou de outro açúcar, ao amino grupo terminal da cadeia altera a carga total da hemoglobina, fazendo com que a fração glicada migre mais rápido em um campo elétrico ou em resinas de troca iônica, permitindo a separação das frações.
As minicolunas cromatográficas invadiram os la-boratórios clínicos na década de 80 por serem baratas e de fácil acesso. Estes métodos são pH e temperatura de-pendentes, apresentam problemas de calibração e baixa reprodutibilidade (35). Por não possuírem resolução suficiente para separar as frações glicadas, eles medem a fração glicada total (HbA1). Nos últimos anos, eles têm sido substituídos por sistemas de HPLC mais robustos e automatizados (35-38). O método de HPLC por troca iônica foi utilizado pelo DCCT (3) e é recomendado como método de referência interino para a dosagem de GHb até que os órgãos internacionais decidam sobre o método de referência definitivo (27,39).
Métodos Baseados em Ligações Específicas Esses métodos usam a diferença estrutural ou química Tabela 1. Valores aproximados de glicemia média e os
valores correspondentes de HbA1cpara uso clínico.
HbA1c Glicemia Média
( % ) (estimada pelo perfil (estimada pela glicemia
de 7 pontos) de jejum) m g / d L m g / d L 4 65 85 5 100 112 6 135 139 7* 170 166 8 205 193 9 240 220 10 275 248 11 310 275 12 345 302
* valor máximo recomendado pela ADA. Adaptado de Rohlfing CL, et al (ref. 32).
entre GHb e HbA0para separar as frações.
Cromatografia de afinidade: baseia-se na reação
específica dos grupos 1,2 cis-diol, resultantes da li-gação da hemoglobina com a molécula de glicose, com o ácido fenilborônico ou derivados. Nestes métodos, a GHb liga-se à coluna ou ao suporte contendo o boronato e a fração HbA0elui primeiro. As variações de temperatura e pH, presença de Hb anômalas, ure-mia e fração lábil não afetam estes métodos. (40).
Métodos imunológicos: usam anticorpos
dire-cionados ao N-terminal glicado da hemoglobina (seqüências que variam de 3 a 8 aminoácidos) e são específicos para a fração HbA1c, sendo que os resulta-dos são expressos com porcentagem de HbA1c. A grande vantagem destes ensaios é a facilidade de automatização em autoanalisadores bioquímicos comuns. Ensaios utilizando imunoturbidimetria (41) e imunoaglutinação estão disponíveis no mercado (42).
Com a popularização do teste A1c, esta moda-lidade de ensaio tem sido recentemente utilizada para Figura 2.Princípio dos métodos utilizados para dosar GHb: a) troca iônica; b) afinidade; c) imunoensaio.
Princípio Geral Separação por diferença de carga das frações Separação por ligação a compostos específicos Método Minicoluna – Troca Iônica HPLC – Troca Iônica Eletroforese Cromatografia por Afinidade Afinidade/Cap-tura iônica Imunoensaios Princípio específi-co
HbA1, menos positi-va em pH neutro, liga-se mais fraca-mente à coluna e elui primeiro
Frações glicadas são eluídas por gradiente de pH
Migração em campo elétrico: HbA1cé mais lenta devido à glicose Afinidade com ácido amino fenil-borônico (HPLC e minicolunas)
Afinidade + cap-tura iônica + fluo-rescência Imunoturbidimetria (IT) Imunoaglutinação (IA) Tipo de GHb dosada HbA1 HbA1 A1aA1bA1c Lábil (?) HbA1 A1c GHb Total GHb Total HbA1c (S1c, C1c, D1c) Principais Interferentes HbF e outras Hb Lipemia/Icterí-cia Temperatura Fração lábil Uremia pH HbF e outras Hb Uremia/Aspirina Vitamina C (?) Vitamina E (?) Uremia HbF ? ? ? CV (%) Interen-saio > 10 < 5 5 – 10 < 5 5 – 6 6 – 8 Certifi-cação NSGP Não Sim Sim Sim Sim Sim Marcas Comerci-ais Disponíveis Labtest ** Biodiagnóstica ** Doles Biosystem Biorad Variant I e II TOSOH Hitachi Menarini Beckman Sebia Helena Primus HPLC Pierce e Isolab Minicolunas IMX Abbot TinaQuant Roche Dade Bering Di-mension DCA Bayer Metrika
* Métodos referência IFCC não são aplicados para uso na rotina e não constam na tabela. ** Teste disponível apenas no Brasil.
Tabela 2.Métodos para dosagem de glico-hemoglobina no laboratório clínico. *
desenvolver testes rápidos para monitoramento do paciente em casa ou no consultório médico na hora da consulta (point of care testing – POCT). Estes métodos utilizam sangue capilar e cassetes descartáveis que con-têm o conjunto reativo (42,43). Os resultados são disponibilizados em menos de 10 minutos e apresen-tam uma boa correlação e concordância com os resul-tados dos métodos tradicionalmente usados no labo-ratório clínico. Uma desvantagem é o custo elevado de, aproximadamente, 15 a 25 dólares por teste.
Método Enzimático: recentemente foi descrito
um método que utiliza proteases para digerir a hemo-globina produzindo “frutosil-aminoácido” (44). Pela ação de uma oxidase, este composto produz peróxido de hidrogênio, que reage com cromogênios na pre-sença de peroxidase. A hemoglobina total é medida espectrofotometricamente e o resultado é dado como a relação GHb/Hb total.
O Brasil ainda não possui um programa externo da qualidade específico para GHb. A participação em programas internos e externos, para garantir a quali-dade de todos os resultados, é uma exigência dos órgãos fiscalizadores para a obtenção de Certificado de Acreditação para o laboratório clínico. Apesar disto, os dois maiores Programas Externos para Garantia da Qualidade, gerenciados pela Sociedade Brasileira de Patologia Clínica (SBPC – PELM) e Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC – Control-Lab) ainda não contemplam o parâmetro GHb (45,46). A SBPC – PELM está programando, para 2004, a primeira remessa de controles para análise de GHb. Padronização e Harmonização dos Resulta-dos
Em geral, métodos utilizando diferentes princípios de ensaio apresentam excelente correlação, e não existem dados suficientes para mostrar se um ou outro méto-do, ou fração, tem valor clínico superior. No entanto, os valores de GHb/HbA1c fornecidos por um labo-ratório podem não corresponder com os valores fornecidos por outro laboratório, mesmo usando o mesmo método e medindo a mesma fração. Não existe concordância entre os valores de referência e a com-paração dos resultados é muito difícil (5,35,47-49). A mesma amostra pode apresentar um valor de 7% em um laboratório e 9% em outro. A carência de padronização limita o uso destes métodos. Apesar do uso de fórmulas de conversão, oriundas de estudos comparativos, ser uma prática largamente adotada, a validade desta ferramenta para padronização dos resul-tados de GHb depende do método originalmente uti-lizado. Em um estudo prévio (35), relatamos que as
fórmulas de conversão, baseadas em métodos que não medem a fração HbA1c(como as minicolunas de troca iônica, métodos baseados em afinidade e eletroforese), têm uma variabilidade que pode resultar em diferenças absolutas maior que 1% do valor verdadeiro. Esta vari-ação pode mascarar uma verdadeira, e clinicamente re-levante, diferença em níveis de HbA1c. Os métodos com baixa reprodutibilidade inferem um grande erro nos resultados convertidos. No entanto, quando mé-todos precisos são utilizados, o erro na conversão dos resultados é muito menor e aceitável para uso clínico.
A preocupação com a padronização dos méto-dos para GHb foi intensificada no início da década de 90, com a previsão dos resultados finais do DCCT(49). Desde 1984, o National Diabetes Data Group (NDDG) reconhecia a necessidade de padronização, e grupos de estudo discutiam o problema (50). Em 1991, mudanças foram feitas no programa externo de qualidade para GHb do College of American Patholo
-g i s t s (CAP) para permitir uma melhor avaliação da
vari-ação interlaboratorial e exatidão dos resultados. Os métodos foram divididos por categorias, e a GHb medida por cada laboratório foi especificada (HbA1, A1 c ou GHb total). Foi o primeiro mapeamento da situação, e um programa piloto de padronização foi proposto (51). Outros estudos foram realizados e mostraram que a padronização era viável (52-55).
Após a publicação dos resultados do DCCT (3), preocupados com o impacto clínico dos resultados de GHb no manejo do paciente diabético, vários comitês internacionais trabalharam na padronização e unifi-cação dos resultados de GHb (47,56,57). O National
Glycohemoglobin Standardization Program ( N G S P )
(39), patrocinado pelas Associações Americanas de Diabetes (ADA) e de Química Clínica (AACC), começou, em 1996, a comparar e certificar os dife-rentes métodos utilizados para dosar GHb, com o intuito de relacionar os diferentes valores de GHb obtidos com os valores de HbA1cdo DCCT. O centro de referência é o laboratório que participou como laboratório central do DCCT na Universidade de Mis-souri. O objetivo principal do NGSP é certificar os métodos a nível de fabricantes, mas laboratórios podem também obter certificação a nível de labo-ratório de referência (nível 1) ou clínico (nível 2). O programa inclui a análise e monitoramento da precisão e desvio, considerando o método do DCCT como referência. Os critérios para certificação são: CV< 5% (< 3% para Laboratórios de Nível 1) e um erro de ± 5% para os valores estabelecidos pelo laboratório central (valores DCCT). Desta maneira, cada método ou laboratório pode informar os resultados de GHb em %
HbA1cdiretamente comparáveis com os do DCCT. O sucesso desta iniciativa está implícito no grande número de métodos certificados e na pequena variação interlaboratorial obtida pelos métodos certificados nos programas externos de garantia da qualidade (58).
A descrição de novas técnicas para dosagem da GHb, como a espectrometria de massa e técnicas mole-culares recombinantes, levaram alguns grupos a estudar propostas de métodos de referência (59-61). A Fede-ração Internacional de Bioquímica Clínica (IFCC) aprovou recentemente um método de referência para GHb (27). O método é baseado em clivagem da GHb em peptídeos específicos, separação por HPLC de troca iônica e identificação por espectrometria de massa ou por eletroforese capilar. A correlação entre resultados do IFFC e NGSP é excelente, porém os valores absolutos são diferentes. Em média, os valores IFFC são 1 , 6 % H b A1 cmais baixos que os valores do NGSP e, con-seqüentemente, do que os do DCCT (58). Os resulta-dos do IFCC são basearesulta-dos na exatidão analítica, e os resultados dos métodos certificados pelo NGSP são baseados em evidências clínicas. Estudos da relação dos resultados do IFCC e DCCT estão em andamento para saber quais valores devem ser utilizados. O impacto da mudança de valores no manejo clínico será grande. Enquanto os órgãos internacionais não chegam a um acordo, o NGSP continuará certificando os métodos de GHb e incluirá o método do IFCC como um dos méto-dos âncora da rede de laboratórios do programa. Os programas externos de garantia da qualidade da Europa já estão informando os resultados de GHb IFFC, junta-mente com os valores DCCT/NGSP.
No Brasil, alguns grupos trabalham na consci-entização da importância dos resultados de HbA1c, mas pouco tem sido feito para padronizar os resultados (62). Em um estudo piloto recente (63) realizado no estado do Rio Grande do Sul, os métodos utilizados pelos laboratórios foram mapeados e classificados por
grupos (tabela 3). A realidade dos laboratórios clínicos do sul do país é muito diferente da realidade interna-cional. Apenas 23,6% dos laboratórios avaliados usam métodos certificados pelo NGSP, e 76,4% utilizam métodos não certificados e não podem ter seus resul-tados comparados aos resulresul-tados do DCCT. O méto-do de microcromatografia de troca iônica é o mais uti-lizado entre os laboratórios do Rio Grande do Sul (71,9%), apresentando, nas diferentes marcas comer-ciais, uma grande variação entre resultados.
Fatores que Afetam os Resultados
Dependendo dos métodos utilizados, muitos fatores podem afetar ou interferir nos resultados. Os fatores mais conhecidos são a fração lábil e a conservação da amostra (64-66). Estes estudos são antigos e há carência de dados recentes que possam ser aplicados aos novos métodos e equipamentos disponíveis no mercado.
Recentemente, relatamos o efeito destas va-riáveis nas dosagens de GHb (67). A fração lábil é uma importante contribuição, quando não é adequada-mente eliminada ou quantificada pelo método que está sendo usado, nos valores de HbA1c. Em nosso estudo, utilizando um método de HPLC, as amostras que não apresentaram pico definido para a fração lábil no cro-matograma foram superestimadas em até 1,64% de HbA1c. Como uma maneira prática de evitar esta inter-ferência, propomos um pré-tratamento da amostra, que consiste de incubação do sangue total por 6h a 37°C, para eliminação desta fração lábil. Em relação ao armazenamento das amostras, verificamos que as amostras que são mantidas sob refrigeração (4°C) apresentam estabilidade por 10 dias, e o armazena-mento sob -20°C subestima significativamente a con-centração de HbA1 c, independente do tempo de armazenamento. As amostras mantidas sob -80°C são estáveis até 3 meses. Sugerimos que as amostras que não podem ser imediatamente analisadas sejam
manti-Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Método Mini Coluna Mini Coluna Mini Coluna Mini Coluna Mini Coluna Mini Coluna Imuno-turbi-dimetria HPLC/LPC Eletroforese Laboratórios (N = 89) 32 11 10 6 4 1 14 7 4 Marca Labtest Katal Biodiagnóstica Biosystems Doles Biobrás Roche Biorad Celm Princípio Troca iônica Troca iônica Troca iônica Troca iônica Troca iônica Troca iônica Imunológico Troca iônica Troca iônica Valor de Referência (%) 5,3 – 8,0 5,0 – 7,0 6,0 – 8,0 6,0 – 8,0 4,5 – 8,0 4,5 – 7,0 4,8 – 6,0 4,0 – 6,4 6,0 – 9,2 Certificação NGSP Não Não Não Não Não Não Sim Sim Não
Tabela 3.Métodos para determinação de HbA1c/glico-hemoglobina utilizados por laboratórios clínicos do Rio Grande do Sul.
das sob refrigeração por até 10 dias, e que o armazena-mento a longo prazo deve ser feito a -80°C. Mais estu-dos são necessários para explicar o fato surpreendente de que amostras estocadas a -20°C perdem a estabili-dade já no primeiro dia de armazenamento.
Além destas variáveis pré-analíticas, algumas doenças e estados patológicos, como anemias, dislipi-demias, e alguns medicamentos podem alterar signi-ficativamente os resultados de GHb (5,6).
A presença de hemoglobinas (Hb) anômalas é considerada um importante fator de interferência posi-tiva ou negaposi-tiva nas dosagens de GHb, independente do método utilizado (68). Relatos de diferentes inter-ferências, em diferentes métodos, têm sido publicados nos últimos anos (69-74), enfatizando que cada labo-ratório deve ter conhecimento da influência das hemo-globinopatias no método que está sendo empregado. A interferência das hemoglobinas anômalas é maior nos métodos com base na separação de cargas, como HPLC de troca catiônica. Alguns métodos de HPLC identificam e quantificam as Hb variantes, outros podem apenas expressar resultados muito baixos ou altos (68). Os métodos imunológicos parecem não ser afetados por esta interferência. Em geral, os anticorpos anti-HbA1c utilizados nos ensaios reconhecem os 3-5 primeiros aminoácidos do N-terminal da cadeia que está ligado à glicose. Esta seqüência inicial é igual para a HbA e as Hb variantes comuns.
Como a concentração de GHb depende da meia-vida normal dos eritrócitos (5,6), doenças hemo-líticas ou outras condições que encurtam a sobrevida das células reduzem significativamente os níveis de GHb. O papel da anemia nos níveis de GHb tem sido pouco estudado. Provavelmente, pacientes com dife-rentes tipos de anemia apresentem níveis reduzidos de GHb e, uma vez corrigida a anemia, tenham os valores de GHb aumentados. Este fato pode estar relacionado com aqueles pacientes que apresentam um controle glicêmico, medido pela GHb, em desacordo com a história clínica ou glicemia. Alguns estudos mostram que as anemias deficientes de ferro e de vitamina B12 alteram os níveis de GHb (75-77). É provável que ane-mias por outras causas, como as de doenças crônicas, afetem os resultados de GHb da mesma forma.
Recentemente (78), estudamos as condições associadas com os valores muito baixos de GHb. Em um grupo de 130 pacientes que apresentaram valores de GHb abaixo do limite inferior do intervalo de refe-rência do método de HPLC utilizado, a presença de hemoglobinas anômalas foi observada em 56% (73 pacientes). Estes pacientes não apresentavam sinais ou sintomas de hemoglobinopatias, a maioria era branca,
e a eletroforese de Hb revelou que todos eram terozigotos para Hb S, C ou D. Considerando a he-terogeneidade étnica da população brasileira, estes dados mostram-se relevantes na interpretação do con-trole glicêmico de pacientes com DM. Neste mesmo estudo, os valores muito baixos de GHb também foram relacionados com a presença de anemia. Na ausência de Hb variantes, a anemia foi observada em 35% dos pacientes que apresentaram valores muito baixos de GHb. Estes dados sugerem que diferentes graus de anemia podem estar associados a valores mais baixos de GHb. Isto pode ser devido a pequenas alte-rações no tempo de meia-vida das hemácias ou na velocidade de formação da GHb, ocasionando uma diminuição aparente dos níveis de GHb.
A Hb carbamilada, resultado da reação da Hb com a uréia em pacientes urêmicos (uremia> 160mg/dL), pode ser uma fonte significativa de erro nas dosagens de GHb. Estudos divergem quanto à significância clínica e à magnitude desta interferência, que é dependente do método que está sendo utilizado (79-81).
A ação de drogas, como a aspirina, na formação e determinação da GHb tem sido estudada (79,82,83). A aspirina pode levar à formação de um derivado de Hb “acetilado”, o qual, devido à sua carga elétrica, migra junto com a GHb naqueles métodos que baseiam-se na diferença de carga para a dosagem de GHb, resultando em valores falsamente elevados. Em um destes estudos (82), foi demonstrado que a ingestão de aspirina acarreta um aumento aparente de GHb. Outros dois estudos (79,83) não encontraram diferenças nos valores de GHb após ingestão de aspiri-na. Da mesma forma que a interferência pelas Hb anô-malas e pela uremia, a interferência da aspirina é méto-do-dependente. O consumo abusivo de álcool, seme-lhante à aspirina, pode levar à formação do mesmo derivado “acetilado”, interferindo também nas dosagens de GHb (83).
Em paralelo, o uso prolongado de vitamina C e E também tem sido estudado como possível fonte de interferência negativa nas dosagens de GHb (84-86). O estresse oxidativo é apontado como uma provável causa do aparecimento das complicações do DM. Oxi-dantes e anti-oxiOxi-dantes têm um papel importante na terapia destas complicações. Vitaminas C, E e -carotenos têm sido usados como anti-oxidantes em pacientes com DM (87). A suplementação de vitamina E e C melhora o controle glicêmico de pacientes com DM (88-90). Recentemente (91), foi relatado que os níveis de GHb podem ser modificados pela dieta ou pelo estilo de vida em indivíduos normais. O consumo de álcool, vitamina C e E foi relacionado com o risco
de indivíduos não-diabéticos apresentarem níveis mais baixos de GHb. Todavia, os resultados destes estudos são contraditórios e não está claro, até o momento, se o uso das vitaminas C ou E altera verdadeiramente os valores de GHb devido a uma inibição na glicação pro-téica ou se este efeito é devido a outros fatores, não relacionados à glicação, mas à formação de produtos derivados, que podem causar erros metodológicos.
Em um ensaio clínico randomizado e controla-do (67), estudamos o efeito de controla-doses usuais de aspiri-na, vitamina C e vitamina E nos níveis de HbA1c, medidos por três métodos diferentes, dois sistemas de HPLC e um imunoensaio, em um grupo de volun-tários não-diabéticos. O tratamento com vitaminas C ou E, em doses farmacológicas, não tem nenhum impacto nos níveis de GHb de indivíduos não-diabéti-cos, quando determinados pelos métodos empregados no estudo. A aspirina induz um modesto aumento nos níveis de GHb. Mais estudos são necessários para con-firmar este efeito em pacientes com DM.
Comentários Finais
Os estudos que avaliaram o papel do controle glicêmi-co no desenvolvimento das glicêmi-complicações diabéticas (3,4,92) mostraram que redução absoluta de 1% em H b A1 c determinou uma redução significativa no desenvolvimento ou progressão das complicações crônicas, como retinopatia, nefropatia e doenças car-diovasculares. Estima-se que mais de 5 milhões de brasileiros tenham diabetes (1). O tratamento das complicações crônicas consome parte significativa do orçamento destinado à assistência médica.
Devido ao grande número de fatores que podem afetar os diferentes métodos, cada labo-ratório deve estar atento às fontes de erros que podem alterar seus resultados de GHb. Embora a maioria destas interferências esteja relatada na liter-atura internacional, os resultados dos estudos são contraditórios. Outro aspecto importante a ser men-cionado é que as interferências são dependentes dos métodos empregados para realizar as dosagens. Uma interferência pode ocorrer em uma magnitude clini-camente significativa em um método e ser negligível em outro.
Os laboratórios clínicos devem estar preparados para fornecer resultados exatos e precisos de GHb/HbA1c, para ajudar o clínico a prevenir e mane-jar as complicações do DM.
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Endereço para correspondência:
Jorge Luiz Gross
Serviço de Endocrinologia
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Rua Ramiro Barcellos 2350, Prédio 12, 4º andar 90035-003 Porto Alegre, RS
Fax: (51) 3332-5188
