UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
AVALIAÇÃO DOS PATÓTIPOS DE ESCHERICHIA COLI
CIRCULANTES NO REBANHO BOVINO E IDENTIFICAÇÃO DOS
FATORES DE VIRULÊNCIA DAS CEPAS DE STEC ISOLADAS
NO ESTADO DE SÃO PAULO
THIAGO LUIZ BELÉM SPINA
BOTUCATU - SP Setembro/2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
AVALIAÇÃO DOS PATÓTIPOS DE ESCHERICHIA COLI
CIRCULANTES NO REBANHO BOVINO E IDENTIFICAÇÃO DOS
FATORES DE VIRULÊNCIA DAS CEPAS DE STEC ISOLADAS
NO ESTADO DE SÃO PAULO
THIAGO LUIZ BELÉM SPINA
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UNESP – Campus de Botucatu para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária – Área de Concentração Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar.
Orientador: Prof. Ass. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto
BOTUCATU - SP Setembro/2015
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SECÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO – CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651
Spina, Thiago Luiz Belém.
Avaliação dos patótipos de Escherichia coli circulantes no rebanho bovino e identificação das cepas de STEC isoladas no estado de São Paulo / Thiago Luiz Belém Spina, - Botucatu, 2015
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
Orientador: José Paes de Almeida Nogueira Pinto Capes: 50505009
1. 1. Bovino - Doenças. 2. Escherichia coli. 3. Virulência (Microbiologia). 4. Fatores de virulência. 5. Toxina
Shiga.
Palavras-chave: Bovinos; Escherichia coli; Fatores de virulência; STEC.
Nome do Autor: Thiago Luiz Belém Spina
Título: Avaliação dos patótipos de Escherichia coli circulantes no rebanho bovino e identificação dos fatores de virulência das cepas STEC isoladas no estado de São Paulo
Comissão Examinadora:
Prof. Ass. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto Presidente e orientador
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP Botucatu
Prof. Adj. Márcio Garcia Ribeiro Membro
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP Botucatu
Profa. Adj. Vera Lúcia Mores Rall
Membro
Departamento de Microbiologia e Imunologia IBB – UNESP Botucatu
Agradecimentos
Aos meus pais, João e Eliana Spina, que sempre me mostraram com muito amor os caminhos da vida, com infinita dedicação e esforço para proporcionar sempre o melhor. À minha família, base permanente e fonte de inspiração e incentivo.
À minha namorada, Fernanda Oliveira, companheira de todas as horas, sempre com uma palavra carinhosa. Sou privilegiado por fazer parte da sua vida, esse período foi vencido com muito mais leveza graças a você.
Ao meu orientador, Prof. José Paes de Almeida Nogueira Pinto, pela amizade e pelos ensinamentos transmitidos ao longo dos anos, fundamentais para meu amadurecimento profissional. Muito obrigado pelo apoio e confiança.
Ao amigo Ricardo Yamatogi, por toda ajuda e ensinamentos compartilhados, fundamentais para a realização do projeto.
Aos meus amigos, que tive e tenho o prazer de conviver: Renan Denadai, Luiz Scagion, Luis Henrique Gomes, Veridiana von Zuben, Thiago Guida, Samadhi Gomes, Danuta Doiche, Fabio Possebon, Fabiano Alves, Rodrigo Barros, Felipe Agostinho, Isabella Agostinho, Marcelo Curiati, Pedro Justolin, Thales Nunes, Mateus Freitas, Felipe Guimarães, Luciana Souza, Mayra Martins, Mateus Mioni, Pedro Pinczowski. Não há solidão mais triste do que a do homem sem amizades.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Inspeção de Alimentos, professores, residentes e funcionários, em especial Germano Biondi, Gilda Amaral, Karina Basso, Karina Amaral, Otávio Martins, Letícia Borges, Cibeli Viana, Caio Zuim, Julia Galvão, Thiago Izidoro, Juliano Pereira, Vanessa Mendonça. Sou muito grato pela harmoniosa convivência e troca de experiências.
Ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, que por meio do Serviço de Inspeção Federal (SIF) intermediou o contato com o frigorífico, o qual também agradeço, possibilitando a realização das coletas das amostras.
À CAPES, pelo apoio financeiro, sem o qual não seria possível a realização do trabalho.
À FMVZ, que me acolheu em 2005, e desde lá tive a certeza de estar no lugar certo, no melhor lugar. Botucatu foi fundamental para minha formação profissional e pessoal, através do ensino de primeira linha e convivência com pessoas incríveis. Sou eternamente grato por todas as experiências vividas aqui, e sempre terei motivos para voltar.
SUMÁRIO
RESUMO... 1
ABSTRACT ... 2
1. INTRODUÇÃO ... 3
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 4
2.1. Doenças Transmitidas por Alimentos ... 4
2.2. Escherichia coli – patótipos e mecanismos de virulência ... 5
2.3. Reservatórios e fontes de infecção ... 10
2.4. STEC em bovinos ... 10 3. ARTIGO CIENTÍFICO ... 12 1. Introdução ... 14 2. Material e Métodos ... 15 3. Resultados... 20 4. Discussão ... 21 5. Conclusão ... 26 Referências ... 26
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (Revisão de literatura) ... 31
RESUMO
A carne bovina pode ser um importante veículo de vários patógenos para os humanos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC), associada com diarreia em animais e humanos. Neste estudo, investigou-se em bovinos abatidos no estado de São Paulo, a prevalência dos diferentes patótipos de E. coli diarreiogênica e o perfil de virulência dos isolados de STEC. De um total de 431 animais, STEC foi identificada em 116 (26,9%) amostras de fezes, das quais 111 (25,8%) STEC eae- e 5 (1,2%) STEC eae+. O patótipo EPEC foi detectado em 20 (4,6%) amostras de fezes dos animais testados. Os demais patótipos de E. coli diarreiogênica não foram identificados. Dos 95 isolados de STEC analisados quanto ao perfil de virulência, todos albergavam stx2, enquanto que 28 (29,5%) continham stx1. Os genes iha e saa, que codificam adesinas, foram encontrados em 93,7% (89/95) e 66,3% (63/95), respectivamente. O gene espP, que codifica uma protease que auxilia na colonização intestinal, foi detectado em 61,1% (58/95) e a hemolisina ehxA em 54,7% (52/95). Também foram identificados em menores frequências os genes subAB, nleE e nleB. STEC está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de São Paulo, carreando genes comumente isolados de patógenos humanos, o que reforça a importância da inspeção e fiscalização nos abatedouros.
ABSTRACT
Beef can be an important vehicle for various pathogens to humans, especially Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), associated to human and animal diarrhea. In this study, the prevalence of different pathotypes of diarrheagenic E. coli, and virulence profiles of STEC were investigated among feces of cattle slaughtered in São Paulo state, southeast of Brazil. From a total of 431 animals, STEC was identified from 116 (26,9%) samples, being 111 (25,8%) STEC eae- and 5 (1,1%) STEC eae+. EPEC pathotype was detected among 20 (4,6%) of animals. The other pathotypes of diarrheagenic E. coli were not identified. Of the 95 STEC isolates assessed for virulence profile, all harbored stx2, while 28 (29,5%) contained stx1. Iha and saa, genes encoding adhesins, were found at 93,7% (89/95) and 66,3% (63/95), respectively. EspP, gene which encoding a protease related with intestinal colonization, was detected in 61,1% (58/95) and ehxA hemolysin was present in 54,7% (52/95). SubAB, nleE and nleB genes were also detected in lower rates. STEC is widespread in cattle herds of São Paulo, containing commonly isolated genes from human pathogens, which reinforces the importance of inspection and surveillance in the slaughterhouses.
1. INTRODUÇÃO
O comércio mundial de carnes, assim como os demais setores do agronegócio, parece sentir de forma mais amena os efeitos de qualquer crise econômica, sempre registrando projeções otimistas. À medida que o consumo mundial aumenta, as exportações dos maiores produtores acompanham o ritmo, alavancadas por grandes mercados importadores como Estados Unidos e emergentes como Oriente Médio e Ásia. Segundo perspectivas do USDA, até 2023, o comércio global de carnes irá crescer 22% e o Brasil seguirá como principal exportador de carne bovina e de frango (USDA, 2014).
No estado de São Paulo, a bovinocultura é uma importante atividade no contexto econômico, com rebanho de aproximadamente 10 milhões de cabeças e diversas plantas frigoríficas. Em 2014, mais de 3 milhões de cabeças foram abatidas no Estado, segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2014a).
Com o ritmo de produção acelerado e crescente público consumidor, relatos de surtos alimentares relacionados a produtos cárneos são frequentes. De 2000 a 2014, o Ministério da Saúde do Brasil registrou, em média, 662 surtos ao ano, relacionados ao consumo de alimentos contaminados, principalmente nas regiões Sul e Sudeste.
No Brasil, Escherichia coli (E. coli) é o terceiro micro-organismo mais frequente como agente de doenças transmitidas por alimentos, responsável por mais de 500 surtos notificados nos últimos quinze anos. Nesse período, a carne bovina, “in natura” ou processada, esteve envolvida em mais de 7% dos surtos alimentares notificados, oficialmente (BRASIL, 2014b).
Devido ao fato de E. coli ser um habitante comensal do trato intestinal de animais de sangue quente, está amplamente distribuída entre as diversas espécies. Algumas cepas podem ser ou se tornar patogênicas, e o bovino representa o principal reservatório de algumas variantes potencialmente patogênicas aos humanos. Por isso, a constante e adequada inspeção e fiscalização da produção e do abate são de suma importância para minimizar qualquer eventual risco à saúde pública.
A importância dos bovinos no papel de reservatório de E. coli, e os produtos cárneos como possíveis fontes de infecções humanas são questões
de relevância em relação à saúde pública. Os dados obtidos no presente trabalho serão incorporados à literatura, tanto no tocante à presença de E. coli patogênica em bovinos no estado de São Paulo, bem como dos patótipos deste agente microbiano. Além disso, foi intuito deste estudo verificar a presença de genes envolvidos nos mecanismos de virulência predominantes nas cepas isoladas.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Doenças Transmitidas por Alimentos
As Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) são responsáveis por uma alta morbimortalidade na população, principalmente entre grupos considerados de vulnerabilidade (risco), idosos, crianças e pessoas imunocomprometidas. Os surtos relacionados às DTA ocorrem com alta frequência em vários países, independente do fator econômico. Por conta disso, a implantação de sistemas que melhorem a obtenção de alimentos livres de patógenos vem se tornando uma exigência pelos consumidores e pelos órgãos oficiais de saúde (World Health Organization - WHO, 2009).
Como um dos sinais clínicos mais comuns relacionados nestes surtos, podemos destacar a diarreia infecciosa, responsável por mais de duas milhões de mortes/ano em todo mundo (BRYCE et al., 2005). No Brasil, segundo órgãos oficiais, entre 2000 e 2007 foram registrados cerca de 17 milhões de casos de diarreia infecciosa e, considerando as diversas, merece destaque a ingestão de alimentos contaminados e causas manipulados de forma inadequada (WHO, 2009).
Nas últimas décadas, a emergência dos micro-organismos causadores de doenças alimentares, colocou em evidência enteropatógenos de risco à saúde pública, como certas bactérias (Salmonella, Campylobacter jejuni, Escherichia coli), parasitas (cryptosporidium, cripstospora, trematódeos) e vírus (rotavírus e norovírus) [WHO, 2009].
2.2. Escherichia coli – patótipos e mecanismos de virulência
Dentre os enteropatógenos, E. coli é um dos principais habitantes comensais do intestino de animais de sangue quente. Algumas cepas são patogênicas para animais e/ou humanos. São divididos em patógenos intestinais (sendo responsáveis por quadros de diarreias) e patógenos extraintestinais, causando infecção urinária, sepse e meningite (NATARO & KAPER, 1998).
O grupo das E. coli diarreiogênicas (DEC) pode ser dividido em 7 patótipos, ou classes, subdivididos conforme tipos de afecção em animais e/ou humanos, mecanismos de patogenicidade e fatores de virulência, a saber: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli produtora de toxina Shiga-toxina (STEC)/ E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) e E. coli difusamente aderente (DAEC) (NATARO & KAPER, 1998) (Figura 1).
O grupo produtor de Shiga-Toxina (STEC) tem emergido como importante agente zoonótico, relacionado principalmente aos alimentos de origem animal (GYLES, 2007), e está naturalmente presente nos animais de produção, levando a ocorrência de infecção humana pelo consumo de carne crua ou mal passada contaminada por esse agente (ELDER et al., 2000).
STEC foi reconhecida por causar doenças em humanos em 1983 (RILEY et
al., 1983) e a infecção pode causar desde diarreia branda, diarreia sanguinolenta (colite hemorrágica), até sérias complicações como a síndrome hemolítica urêmica (SHU). O principal fator de virulência desse patotipo é a toxina Shiga (Stx), codificada por bacteriófagos específicos. A Stx é levada pelo sistema sanguíneo aos rins e, ao impedir a síntese protéica e alterar a permeabilidade vascular, pode levar à SHU, caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia e falência renal.
FIGURA 1: Os seis patotipos de E. coli diarreiogênicas e seus principais mecanismos de virulência. a) EPEC – E. coli enteropatogênica formando a lesão “attaching and effacing” (AE) [3] e as microcolônias compactas mediadas pelo BFP (“Bundle-forming pilus”) [1 e 2]. b) EHEC/STEC – E. coli enterohemorrágica produzindo a toxina Stx e formando a lesão AE semelhante a EPEC. c) ETEC – E. coli enterotoxigênica aderindo ao enterócito e produzindo as toxinas termolábeis (LT) e termoestáveis (ST). d) EAEC – E. coli enteroagregativa, produzindo biofilme e secretando citotoxinas e enteroxinas. e) EIEC – E. coli enteroinvasiva, multiplicando-se no interior de enterócitos e migrando para as células adjacentes. f) DAEC – E. coli difusamente aderente causando alterações nas microvilosidades (extraído de Kaper et al., 2004).
Muitos casos de doenças diarreicas no mundo causados por STEC estão associados ao sorotipo O157:H7, embora os sorogrupos O26, O103, O113 e O145 também sejam relatados em enfermidades que causam infecções do trato gastrintestinal em humanos (CAPRIOLI et al., 2005; DOS SANTOS et al., 2010). Segundo o Centro de Controle de Doenças e Prevenções (CDC), dos Estados Unidos, esses sorogrupos, além do O121, são responsáveis por cerca de 71% das doenças causadas por STEC não O157 nos Estados Unidos (BOSILEVAC & KOOHMARAIE, 2011).
Tendo em vista a possível contaminação no sistema de produção, os países importadores de produtos cárneos brasileiros determinaram um controle mais rigoroso quanto à presença deste patógeno. Deste modo, devido a
crescente exportação dos produtos cárneos e preocupados em atender as exigências do mercado externo, principalmente da carne bovina e de frango, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) instituiu em 2013 uma norma do Programa Nacional de Controle de Patógenos (PNCP) com a finalidade de triar e identificar a presença de cepas de STEC, principalmente os sorogrupos mais envolvidos em surtos alimentares como O26, O45, O103, O111, O121 e O145 e O157 (BRASIL, 2013).
Além da produção da shiga-toxina, as STEC possuem outros mecanismos de virulência, que podem ser adquiridos de outros micro-organismos do mesmo ou de diferentes patótipos, através da transferência horizontal de genes ou por mutações. Localizado no plasmídeo O157 (pO157), o gene ehx codifica a produção de uma hemolisina de alta virulência. O pO157 também pode albergar outros fatores de virulência como espP, uma protease que atua na colonização intestinal e na aderência às células do epitélio intestinal. A toxB é uma proteína que auxilia na adesão às células intestinais enquanto a katP auxilia na colonização intestinal, codificando uma peroxidase. O plasmídeo O113 contém outros importantes fatores de virulência, como subAB e saa, que codificam adesinas que atuam na adesão às células epiteliais intestinais. Genes cromossomais também expressam importantes mecanismos de virulência, como os localizados na ilha de patogenicidade (“pathogenic island” – PAI) denominada O122 (PAI O122) na qual pode ser encontrado o gene efa1, que codifica uma proteína de alto peso molecular que se mostrou eficaz em mediar a aderência de um isolado do sorotipo O111:H- às células epiteliais. Ainda na PAI O122, os genes nleA, nleB e nleE codificam proteínas que atuam na inibição da resposta inflamatória da célula hospedeira. Os genes iha e paa codificam adesinas, dos quais o último atua no desenvolvimento da lesão “attaching and effacing” (DONNENBERG, 2013).
O patótipo STEC pode ser dividido entre os que possuem a ilha de patogenicidade denominada região LEE (Locus of Enterocyte Effacement), STEC eae+ ou EHEC (nomenclatura antiga), e os que não possuem LEE (STEC eae-). Além da toxina stx, STEC eae+ é capaz de produzir uma lesão nos enterócitos denominada "attaching and effacing" (Lesão AE). Essas lesões são resultantes do sistema de secreção tipo III, codificado pela região LEE (DONNENBERG, 2013). As primeiras infecções por STEC eae+ foram
relatadas em 1982 nos Estados Unidos e, desde então, isolados de STEC eae+ têm sido responsáveis por um grande número de surtos envolvendo centenas de indivíduos. A Argentina é o país que mais registrou casos de SHU, com aproximadamente 400 novos casos todos os anos (ETCHEVERRIA et al., 2010). Vários agentes etiológicos têm sido associados a esta patologia, mas a infecção por STEC eae+ é a mais comum, estando geralmente associado ao sorotipo O157:H7 (RIVERO et al., 2004).
STEC possui grande importância do ponto de vista zoonótico. No entanto, outros patótipos encontrados nos animais, tais como E. coli enteropatogênica (EPEC), também são considerados patógenos emergentes (WASTESON, 2001). A EPEC foi o primeiro patótipo de E. coli descrito por Bray no Reino Unido, em 1945, após um grande surto de diarreia em crianças. Era considerado um sorogrupo (variedade antigênica baseada somente no antígeno somático do LPS) distinto de E. coli, isolado de crianças com diarreia, mas não de crianças saudáveis. A principal característica de patogenicidade das EPEC consiste na produção da lesão AE, embora diferentemente das STEC eae+, não produzem a toxina Stx (KAPER et al., 2004).
A lesão AE caracteriza-se pela aderência íntima da bactéria à membrana do enterócito, formação de uma estrutura semelhante a um pedestal, cuja base é rica em actina e outros elementos do citoesqueleto, e destruição das microvilosidades. A formação da lesão AE depende da expressão de vários genes cromossômicos, agrupados na ilha de patogenicidade LEE, que codificam a intimina, uma adesina que irá se ligar à membrana do enterócito, além de uma série de proteínas efetoras que causam modificações no citoesqueleto e o sistema de secreção tipo III, que possibilitará a transferência das mesmas. Além desses fatores, uma proteína receptora da intimina (denominada Tir) é codificada e transportada para a célula hospedeira através do sistema de secreção (MOON et al., 1983; KNUTTON et al., 1991; MCDANIEL et al., 1995).
Algumas amostras de EPEC albergam um plasmídeo de 60 MDa chamado plasmídeo EAF (EPEC adherence factor) (pEAF), que contém o operon bfp, responsável por codificar uma fímbria denominada Bundle-forming pilus (BFP) e o ativador transcricional Plasmid encoded regulator (Per), que ativa bfp e outros genes da região LEE (HERNANDES et al., 2009). Por esses
fatores, o patotipo EPEC é sub-dividido em dois grupos, EPEC típica (tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC), com base na presença de pEAF (com expressão do operon bfp) nas tEPEC e ausência deste nas aEPEC (KAPER 1996; TRABULSI et al., 2002).
Enquanto a infecção por tEPEC ocorre principalmente em crianças menores de um ano de idade, predominantemente em países em desenvolvimento (NATARO & KAPER, 1998), apresentando diarreia aguda como principal sinal clínico (LEVINE & EDELMAN, 1984; FAGUNDES-NETO, 1996), as aEPEC são associadas a quadros endêmicos ou surtos de diarreia acometendo crianças e, ocasionalmente, adultos (AFSET et al., 2004). Em ensaios de aderência em células HeLa ou HEp-2 cultivadas in vitro, as tEPEC produzem o padrão de adesão localizada (AL), que é mediado pela produção de BFP. Nesse padrão, são formadas microcolônias compactas, em uma ou mais áreas da superfície celular, após 3 horas de contato (NATARO & KAPER, 1998). Já a maioria das amostras de aEPEC produz um padrão de aderência com microcolônias mais frouxas (adesão semelhante à localizada ou AL-like), que são visualizadas somente em períodos de ensaios mais longos (6 horas) (RODRIGUES et al., 1996), embora amostras de aEPEC produzindo o padrão de aderência agregativa (AA) ou difusa (AD) tenham sido reportadas (VIEIRA et al., 2001, ABE et al., 2009).
Outros patotipos como as ETEC, EIEC EAEC e DAEC também podem ser encontrados nos produtos de origem animal. As EAEC são bactérias com um padrão de aderência agregativa e reconhecidas por causar diarreia persistente em crianças e adultos. As ETEC são importantes agentes de diarreia em animais e humanos e produzem toxinas termo lábil (LT) e termo estável (ST). As EIEC são bactérias similares a Shigella e causam diarreia e disenteria. Finalmente, há as DAEC, bactérias definidas por apresentarem um padrão de aderência difusa e impedirem a ação de enzimas que atuam na camada glicoproteica da borda em escova dos enterócitos, embora sua ação como agente de diarreia é discutível (KAPER et al., 2004).
2.3. Reservatórios e fontes de infecção
Os animais de produção, principalmente bovinos, são os reservatórios naturais de E. coli. Fezes de animais portadores contaminam pastos e reservatórios de água, expondo humanos e outros animais ao patógeno. Há ainda bovinos denominados “super-shedders”, que, influenciados por fatores ambientais, do micro-organismo e do próprio animal, albergam maior quantidade de bactérias no intestino, excretando maiores cargas infectantes por longos períodos (CHASE-TOPPING et al., 2008). Além da contaminação ambiental, os produtos de origem animal podem veicular o agente para os humanos (KAPER et al., 2004). A ingestão de carne crua ou mal cozida, leite cru, manuseio de materiais contaminados ou contaminação de alimentos (como sementes e vegetais frescos) por dejetos animais, são as principais formas de infecção dos humanos (KUHNERT et al., 2000; STEVENS et al. 2002).
Assim, os alimentos, principalmente os produtos cárneos, são considerados importantes veículos de E. coli diarreiogênicas (DEC) e a sua contaminação pode ser atribuída a práticas higiênicas inadequadas durante o processo de abate, tornando a linha de produção uma das principais rotas de transmissão do agente entre animais infectados e humanos, sendo uma das primeiras etapas do processo “farm to fork”, que tem como objetivo garantir a segurança do alimento disponibilizado ao consumidor (MILNES et al., 2008). Assim, a pesquisa de STEC em bovinos tem sido objeto de preocupação pelos profissionais de saúde, pois animais aparentemente saudáveis podem ser reservatórios, transportando DEC de potencial zoonótico, que podem ser inseridos na cadeia produtiva através de pontos falhos, relacionados a higiene, durante o processamento (HUSSEIN, 2007; ISLAM et al., 2008; RHOADES et al., 2009).
2.4. STEC em bovinos
Scott et al. (2006) encontraram 95 cepas de STEC isoladas a partir de amostras ambientais e fecais em regiões de produção de gado de corte da Irlanda, afirmando que o ambiente, atuando como reservatório do agente, possibilitou a contaminação crescente do rebanho.
Alguns pesquisadores avaliaram a presença de E. coli em diversos tipos de reservatórios. Kagambèga et al. (2012) isolaram o agente de amostras de fezes de animais em diversos sistemas de produção na Finlândia e relataram 21% de isolados STEC, dos quais 37% de bovinos, 30% de suínos e 6% de frangos, além de 24% de EPEC, sendo 37% de frangos, 32% de suínos e 8% de bovinos. Na Argentina, Alonso et al. (2012) analisaram 1057 amostras de aves (carcaça, miúdos e produtos processados), encontraram 20% de EPEC, 5% de STEC e 2,4% dos dois patótipos.
Monaghan et al. (2013), na Irlanda, analisaram 2700 amostras de solo, fezes frescas colhidas no pasto, couro e carcaças bovinas para EPEC e encontraram 3,9% de cepas positivas nas fezes, 6,4% no couro, 2% no solo e 0,7% nas carcaças. Outros autores como Wang et al. (2013), no Japão, analisaram somente a presença do patótipo EPEC em centenas de amostras, incluindo alimentos (peixes, frutos do mar, carnes, vegetais e alimentos prontos para o consumo), fezes de animais de produção (bovinos e suínos) e fezes de humanos. No total encontraram 159 cepas, das quais 12,6% provenientes de alimentos, 54% de animais de produção e 33,3% de origem humana.
No Brasil os dados não são muito distintos dos encontrados na literatura internacional, nas diversas áreas de produção. Saridakis et al. (1997) analisaram 204 amostras de fezes de bezerros, obtendo 879 cepas de E. coli. Destas, 19 foram identificadas como EPEC. Moreira et al. (2003) pesquisaram a presença de STEC em rebanhos leiteiros e encontraram 1127 cepas de E. coli isoladas a partir de 243 animais sadios. A prevalência deste patótipo foi de 44% nos bezerros, 57% nas novilhas e 52% nas vacas adultas. Vicente et al. (2005), pesquisando STEC em 454 amostras fecais, 54 amostras de água e 30 amostras de leite, encontraram respectivamente 59,9%, 1,9% e 3,3% de contaminação por E. coli, mostrando uma contaminação ambiental, animal e do alimento.
Sandrini et al. (2007) isolaram STEC em 95% das propriedades estudadas, em 49% dos animais testados, em 5% das amostras de água de consumo humano, em 8,35% das amostras de água de consumo animal e em 5% das amostras de leite. Em suínos, Borges et al. (2012) analisaram 441 amostras de fezes e carcaças suínas, encontrando somente 0,4% de STEC em carcaças e 3,5% e 3,2% de EPEC em fezes e carcaças respectivamente.
Martins et al. (2013) avaliaram a presença de E.coli oriundas de intestinos de suínos, encontrando 3,3% de EPEC e 2,2% de STEC.
Portanto, estas observações enfatizam a importância de se realizar um estudo mais definido dos patótipos de E.coli, dando maior importância a STEC e EPEC, subtipos patogênicos mais encontrados em animais de produção e frequentemente relatados em bovinos.
3. ARTIGO CIENTÍFICO
O artigo científico a seguir será submetido à revista Veterinary Microbiology. As normas de publicação estão disponíveis em http://www.elsevier.com/journals/veterinary-microbiology/0378-1135/guide-for-authors.
Avaliação dos patótipos de Escherichia coli circulantes no rebanho bovino e identificação dos fatores de virulência das cepas STEC isoladas
no estado de São Paulo
Thiago Luiz Belém Spinaa, Ricardo Seiti Yamatogia, Rodrigo Tavanelli Hernandesb, José Paes de Almeida Nogueira Pintoa
aDepartamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP, Brasil bDepartamento de Microbiologia e Imunologia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP, Brasil RESUMO
A carne bovina pode ser um importante veículo de vários patógenos para os humanos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC), associada com diarreia em animais e humanos. Neste estudo, investigou-se em bovinos abatidos no estado de São Paulo, a prevalência dos diferentes patótipos de E. coli diarreiogênica e o perfil de virulência dos isolados de STEC. De um total de 431 animais, STEC foi identificada em 116 (26,9%) amostras de fezes, das quais 111 (25,8%) STEC eae- e 5 (1,2%) STEC eae+. O patótipo EPEC foi detectado em 20 (4,6%) amostras de fezes dos animais testados. Os demais patótipos de E. coli diarreiogênica não foram identificados. Dos 95 isolados de STEC analisados quanto ao perfil de virulência, todos albergavam stx2, enquanto que 28 (29,5%) continham stx1. Os genes iha e saa, que codificam adesinas, foram encontrados em 93,7% (89/95) e 66,3% (63/95), respectivamente. O gene espP, que codifica uma protease que auxilia na colonização intestinal, foi detectado em 61,1% (58/95) e a hemolisina ehxA em 54,7% (52/95). Foram identificados em menores frequências os genes subAB, nleE e nleB. STEC está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de São Paulo, carreando genes comumente isolados de patógenos humanos, o que reforça a importância da inspeção e fiscalização nos abatedouros.
1. Introdução
O Brasil é o maior exportador mundial de carne bovina e possui o segundo maior rebanho, com cerca de 200 milhões de cabeças. Quanto ao mercado interno, o consumo per capita registra taxas crescentes, atualmente em 37,4 kg por habitante ao ano (MAPA, 2015). Concomitantemente ao aumento da produção e consumo, há a preocupação em relação ao potencial que a carne bovina tem em veicular patógenos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC).
Os ruminantes, principalmente os bovinos, são os reservatórios primários de STEC e a infecção em humanos dá-se especialmente pela ingestão de carne crua ou mal cozida (Nataro and Kaper, 1998). Estima-se que, anualmente, surtos de origem alimentar causados por contaminação por E. coli, principalmente STEC, afetem 62 mil pessoas, levem à 1843 hospitalizações e causem 52 mortes somente nos Estados Unidos (Sargeant et al., 2004). Grande parte dos casos envolve a carne bovina e derivados como alimento responsável pelo surto. A infecção em humanos pode causar diarreia e uma grave complicação, a síndrome hemolítica urêmica (SHU), caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia e falência renal (Bosilevac and Koohmaraie, 2011).
Uma vez que os bovinos representam a principal fonte de STEC para o homem, a pesquisa nos rebanhos é um importante meio para avaliar o potencial de disseminação do agente no ambiente e na cadeia produtiva da carne, através de eventuais pontos falhos de higiene durante o processamento.
2. Material e Métodos
2.1. Coleta das amostras
Entre os meses de outubro de 2013 a agosto de 2014, foram coletadas amostras provenientes de 88 propriedades rurais, referentes a 63 cidades distintas (Figura 1), em um total de 491 animais. Foram 7 coletas, realizadas em frigorífico com Inspeção Federal da região centro-oeste paulista. As amostras foram coletadas durante o processo de abate no frigorífico, na etapa de oclusão do reto, sendo realizado 1 swab da região retal por animal, coletando-se 5 animais por lote. Cada swab foi armazenado em um tubo de ensaio contendo 7 mL de meio de transporte Cary Blair (Difco®). A seguir, todas as amostras foram alocadas em caixas isotérmicas em temperatura de refrigeração para posterior análise no laboratório de pesquisa do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública - FMVZ. Cabe salientar que os animais foram escolhidos aleatoriamente, sendo cada lote oriundo de uma propriedade diferente.
2.2. Isolamento de E. coli
As amostras colhidas no frigorífico foram semeadas em meio seletivo de Ágar MacConkey e incubadas por aproximadamente 18-24 horas a 35ºC. Foram selecionadas 4 colônias fermentadoras de lactose com morfologia típica para E. coli, e 1 não fermentadora de lactose de cada tipo morfológico.
Todas as colônias foram identificadas bioquimicamente através do cultivo no meio de cultura EPM (Escola Paulista de Medicina), MILi (motilidade, indol e lisina) e Citrato de Simmons (Toledo et al., 1982a; Toledo et al., 1982b). As
amostras confirmadas bioquimicamente como E. coli foram armazenadas em ágar nutriente e repicadas em caldo BHI (infusão cérebro coração), sendo incubadas a 35ºC/24h e congeladas para posteriores testes moleculares.
FIGURA 1: Localização no estado de São Paulo das cidades de origem dos lotes de bovinos amostrados. Fonte: Google My Maps
2.3. Identificação de cepas de E. coli diarreiogênicas por PCR
As cepas identificadas bioquimicamente como E. coli foram investigadas quanto à presença de marcadores de virulência associados aos diferentes patótipos através da PCR multiplex, para detecção de EPEC (eae), STEC (stx), EHEC (eae e stx), EIEC (ipaH) e EAEC (aggR), e PCR comum para detecção de ETEC (toxinas LT e/ou ST).
Para obtenção do DNA, a partir do material armazenado em caldo BHI, foi separada uma alíquota de 200 µL em um microtubo de 0,5 mL. O produto foi centifugado a 10.000g por 10 minutos e o sobrenadante desprezado. O pelete
foi ressuspendido em água livre de nucleases, homogeneizado e aquecido até a temperatura de 99ºC, em termociclador (Mastercycler® gradient, Eppendorf), para o rompimento da parede bacteriana e liberação do material genético. O produto foi então centrifugado a 10.000g por 5 minutos e o sobrenadante coletado em microtubo de 1,5 mL.
As reações de amplificação foram realizadas utilizando o mix GoTaq® Green Master Mix (Promega) conforme recomendações do fabricante, sendo empregados primers conforme Aranda et al. (2007). O programa utilizado foi uma reação de desnaturação de 95ºC por 10 minutos, 30 ciclos de desnaturação de 95ºC por 20 segundos, anelamento de 52ºC por 20 segundos e extensão de 72ºC por 30 segundos. Após os ciclos, foi realizado uma extensão final de 72ºC por 7 minutos.
Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese (Electrophoresis Power Supply Model EPD 600 – Amersham-Pharmacia Biotech Inc.) em gel de agarose 1,5% (Sigma Aldrich) em tampão de ácido bórico-Tris-EDTA (TBE) e revelados com Syber Green® (0,5 mg/ml - Invitrogen). Os fragmentos de DNA foram analisados comparativamente com marcadores de DNA de 100 bp (GE Healthcare), sendo fotografados em analisador de imagens (Alphaimager – Alpha easy FC Software – AlphaInotech Corporation). Em todas as reações realizadas foram utilizados um controle negativo, através da substituição da amostra por água livre de nucleases, e um controle positivo para cada gene utilizado na identificação dos patótipos. Como controle interno, foi utilizado nas amostras a avaliação do marcador genético RNA 16S, com auxílio dos primers segundo Greisen et al. (1994).
2.4. Pesquisa de genes de virulência das amostras STEC isoladas
Os isolados de STEC foram analisados, por PCR, quanto à presença de alguns genes presentes nos plasmídeos O157 (ehxA, espP, toxB) e O113 (subAB, saa), na ilha de patogenicidade O122 (nleA, nleB, nleE, efa1), além de genes cromossômicos (iha, paa). Por meio da qPCR, foi realizada a subtipagem dos genes stx, em stx1 e stx2. Os primers utilizados no estudo encontram-se descritos na Tabela 1.
2.5. Análise estatística
Foram utilizados os testes de Qui-quadrado e Fisher (PROC FREQ – SAS Institute, 2011) para confrontar as porcentagens dos diferentes patótipos encontrados (STEC eae- ou eae+ e EPEC) dentro dos três níveis amostrais (colônias, animais e lotes). Os mesmos testes foram utilizados para verificar possíveis associações entre a presença dos genes de virulência pesquisados. Foi adotado o nível de significância de 5% (P<0,05).
TABELA 1. Primers utilizados para detecção dos genes de virulência de cepas STEC, isoladas a partir de swab retal de bovinos, em São Paulo, Brasil.
Genes Primers (5´-3´) Referência
pO157
ehxA GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG (Toma et al., 2003)
TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA
espP AAACAGCAGGCACTTGAACG (Brunder et al., 1997)
GGAGTCGTCAGTCAGTAGAT
toxB ATACCTACCTGCTCTGGATTGA (Tarr et al., 2002)
TTCTTACCTGATCTGATGCAGC
pO113
subAB GTACGGACTAACAGGGAACTG GCAAAAGCCTTCGTGTAGTC (Paton et al., 2004) Saa CGTGATGAACAGGCTATTGC ATGGACATGCCTGTGGCAAC (Paton and Paton, 2002)
PAI O122
nleA ATGAACATTCAACCGACCATACAATCTG TTAGACTCTTGTTTCTTGGATTATATCA (Afset et al., 2006) nleB GGTGTGCTGGTAGATGGA CAGGGTATGATTCTTGTTTATG (Afset et al., 2006) nleE CTAATACTCAGGGCGTGTCC ACCGTCTGGCTTTCTCGTTA (Afset et al., 2006) efa1 AAGGTGTTACAGAGATTA TGAGGCGGCAGGATAGTT (Nicholls et al., 2000)
Outros
Iha CAGTTCAGTTTCGCATTCACC GTATGGCTCTGATGCGATG (Scaletsky et al., 2009) Paa GGATCCATGAGGAACATAA CTCGAGAGTGCCTTTCCTGG (Batisson et al., 2003)
Stx1 AGTCGTACGGGGATGCAGATAAAT (Souza et al., 2013)
CCGGACACATAGAAGGAAACTCAT
Stx2 GGCACTGTCTGAAACTGCCC (Souza et al., 2013)
3. Resultados
3.1. Prevalência dos patótipos de ECD
Das 1494 colônias isoladas de E. coli, 18,5% (276/1494) foram positivas para algum patótipo de E. coli diarreiogênica. Foram caracterizadas como STEC eae- 15,9% (238/1494) das colônias e 0,6% (9/1494) eram STEC eae+ (EHEC). 1,9% (29/1494) foram positivas para EPEC.
Avaliando os animais amostrados, de um universo de 431 indivíduos, 136 (31,6%) albergavam E. coli diarreiogênica. Destes, 25,8% (111/431) foram positivos para STEC eae- e 1,2% (5/431) para STEC eae+ (EHEC). Foi identificada EPEC em 4,6% (20/431) dos animais. Apenas 5 animais albergavam mais de um patótipo de E. coli diarreiogênica. Quatro deles foram positivos para EPEC e STEC eae-. Um animal foi positivo para STEC eae- e STEC eae+, concomitantemente.
Dos 88 lotes analisados, 74 (84,1%) revelaram pelo menos um animal portador de E. coli diarreiogênica. Foi encontrada STEC eae- em 64,8% (57/88) dos lotes e STEC eae+ em 5,7% deles (5/88). EPEC foi isolada em 13,6% (12/88) dos lotes analisados (Tabela 2).
Os patótipos ETEC, EIEC, DAEC e EAEC não foram isolados em nenhumas das amostras avaliadas.
TABELA 2. Resultados positivos para caracterização do patótipos de E. coli diarreiogênicas (ECD) a partir das colônias, dos animais e lotes isolados de swab retal de bovinos.
Amostras TOTAL
RESULTADOS POSITIVOS PATÓTIPOS ECD
STEC EPEC
eae- eae+
Colônias 1494 15,9% (238)a 0,6% (9)b 1,9% (29)c
Animais 431 25,8% (111)a 1,2% (5)b 4,6% (20)c
Lotes 88 64,8% (57)a 5,7% (5)b 13,6% (12)b
3.2. Genes de virulência
Todos os isolados de STEC possuíam o gene stx2 e 29,47% carreavam os genes stx1 e stx2, simultaneamente. A segunda maior prevalência encontrada foi a do gene iha, em 93,68% das amostras. Em seguida saa, espP e ehxA foram encontrados em 66,32%, 61,05% e 54,74%, respectivamente. O gene subAB foi prevalente em 33,68%. Poucos isolados de STEC possuíam os genes da ilha de patogenicidade O122, sendo detectados apenas nleE (2,11%) e nleB (1,05%) (Tabelas 4 e 5 – anexo).
Um total de 28 combinações de genes de virulência foi observado. Foram encontradas algumas associações significantes entre os genes, analisando-os em pares: ehxA e espP, subAB, saa ou stx1; espP e subAB ou saa; subAB e saa; saa e stx1. O perfil genético mais comum foi ehxA espP subAB saa iha stx2 (17,89%), seguido por iha stx2 (16,84%), ehxA espP saa iha stx1 stx2 (8,42%), ehxA espP saa iha stx2 (7,37%) e saa iha stx2 (7,37%) (Tabela 3).
TABELA 3. Perfis de virulência mais prevalentes entre as amostras STEC isoladas a partir de swab retal de bovinos, em São Paulo, Brasil.
Combinação de genes Nº de amostras % de amostras
ehxA espP subAB saa iha stx2 17 17,89%
iha stx2 16 16,84%
ehxA espP saa iha stx1 stx2 8 8,42%
ehxA espP saa iha stx2 7 7,37%
saa iha stx2 7 7,37%
ehxA espP subAB saa iha stx1 stx2 4 4,21%
espP iha stx2 4 4,21%
4. Discussão
A distribuição de STEC no rebanho bovino mostrou-se relevante, visto que a maioria dos lotes analisados possuía pelo menos um animal portador do
patógeno. A prevalência de STEC encontrada neste trabalho foi de 26,91% dos animais testados, dado semelhante ao relatado em alguns estudos realizados no Brasil e outros países (Rogerie et al., 2001; Irino et al., 2005). Porém, os dados disponíveis na literatura são bem variados, encontrando-se prevalências de STEC que variam entre 12 a 72% (Rogerie et al., 2001; Ayaz et al., 2014; Ferreira et al., 2014; Kumar et al., 2014).
Diversos estudos levaram em consideração a contaminação de E. coli diarreiogênica em bovinos e o papel destes como fonte de alimento, ao analisarem a presença de STEC nas carcaças. Rigobelo et al. (2008), relataram 1,4% de carcaças positivas. Na Argentina, Etcheverria et al. (2010) encontraram 12,34% de carcaças positivas para STEC. Bohaychuk et al. (2011) encontraram STEC em 5,4% das amostras de swab de carcaça bovina. Elder et al. (2000), nos Estados Unidos, pesquisaram a entrada e disseminação de STEC, principalmente o sorogrupo O157, em animais e carcaças. Fezes de 327 bovinos foram testadas, sendo 28% positivas para o patógeno. Testes feitos durante o abate em amostras de couro, carcaça antes da evisceração, carcaça após a evisceração e produto final apontaram 11%, 43%, 18% e 2% de positividade. Dados como estes reforçam a importância de se evitar contaminação da carcaça durante o abate, como ocorre quando a evisceração é realizada de forma inadequada.
As cidades de origem dos rebanhos amostrados são localizadas predominantemente num raio de 200 km em relação ao matadouro em que foram abatidos os animais, na região central de São Paulo, porém há animais oriundos de propriedades rurais localizadas a quase 700 km de distância entre elas. Isso indica que E. coli produtora de Shiga-toxina está disseminada em
bovinos de diferentes locais do estado de São Paulo, tendo sido isolada de rebanhos provenientes de 11 mesorregiões do estado, de um total de 15. Foram identificados bovinos albergando cepas com o mesmo perfil de genes de virulência, originários de propriedades rurais de 5 regiões diferentes do estado. Isto sugere que cepas com perfil de virulência semelhantes estão circulantes mesmo em locais com considerável distância geográfica.
O gene stx2 foi encontrado em todos os isolados de STEC, estando muito associado a complicações severas em humanos, pois devido a características bioquímicas entre a toxina e seus receptores, causa maiores danos vasculares quando comparado a stx1 (Nakajima et al., 2001). Na Argentina registra-se um dos maiores índices de síndrome hemolítica urêmica (SHU) do mundo, muito associada à infecção por STEC (Etcheverría et al., 2010). Uma hipótese para, no Brasil, não haver altos índices de SHU poderia ser a diferença do gene stx que circula nos dois países, aliada a outros fatores como os hábitos de consumo da carne bovina naquele país, frequentemente mal cozida. Apesar de não ter sido realizada a detecção dos subtipos de stx2, sabe-se que stx2a, stx2c e stx2d são mais relacionados à doença severa em humanos (Beutin et al., 1994).
O plasmídeo O157 está presente na maioria de STEC isolados de humanos (Beutin et al., 1994). Presentes no pO157, ehxA e espP, têm importante atividade hemolítica e estão relacionados à exacerbação do quadro hemorrágico (Brunder et al., 1997). Neste estudo tais genes foram detectados na maioria dos isolados de STEC.
O fator de adesão iha, homólogo a uma adesina encontrada no Vibrio cholerae (Tarr et al., 2000), foi um dos fatores de virulência mais prevalentes
nos isolados de STEC. Esta proteína é mais comumente relacionada ao patótipo STEC eae+, antes denominado EHEC, e mais estudos são necessários para esclarecer seu papel na colonização intestinal.
O gene eae foi encontrado em poucos isolados de STEC, concordando com dados de outros estudos (Mora et al., 2011; Amézquita-López et al., 2012). A intimina (eae), codificada na região LEE, está relacionada com aumento da virulência, ao permitir que a bactéria provoque as lesões “attaching and effacing” no epitélio intestinal. No entanto, cepas que não possuem o gene eae (STEC eae-) também são relacionados a doença severa em humanos (Bekal et al., 2014).
Devido à falta da região LEE nas STEC eae-, outros fatores devem promover a adesão aos enterócitos, como a adesina saa. Cepas saa-positivas são mais frequentes em isolados de bovinos do que de humanos, indicando uma especificidade maior na colonização intestinal nesta espécie animal (Jenkins et al., 2003). Nos isolados analisados neste estudo, saa foi detectado em quase 70% das cepas eae-.
O patótipo EPEC foi identificado em 4,64% dos animais pesquisados, prevalência semelhante à encontrada em outros estudos. Monaghan et al. (2013) e Bolton et al. (2014) encontraram 3,9% e 5,8% de EPEC nos animais testados, respectivamente. Assim como as STEC, as EPEC têm grande importância em saúde pública, já que são uma das principais causas de diarreia bacteriana infantil nos países em desenvolvimento ou em áreas de saneamento precário (Nataro and Kaper, 1998).
Os dados encontrados neste trabalho corroboram o fato de que os bovinos são importantes reservatórios de E. coli, principalmente do patótipo
relacionado à produção de Shiga-toxina, o que é preocupante no tocante à saúde pública. Para garantir a segurança do produto final, cuidados no processo de produção são fundamentais para evitar contaminações, que se originam no início da cadeia produtiva.
Diversos fatores podem influenciar na contaminação do rebanho. Estudos demonstraram que o patógeno pode ser rapidamente disseminado quando o gado encontra-se confinado. Scott e colaboradores (2006) relataram 8,6% de bovinos positivos para STEC e após 2 meses essa porcentagem passou para 52%. O sistema de produção confinado parece estar mais relacionado em diversos estudos quanto à disseminação do patógeno), e o risco é ainda maior quando há a presença de bovinos denominados “super-shedders”, que são indivíduos que albergam maiores quantidades da bactéria no intestino por longos períodos, excretando maior carga de patógenos no ambiente. Isto reforça a importância de se realizar regularmente a limpeza dos currais e instalações de manejo (Chase-Topping et al., 2008; Farrokh et al., 2013). A sazonalidade é outro ponto que parece influenciar em maior disseminação do agente e contaminação, pois as excreções variam de acordo com as estações, obtendo o pico de eliminação nos meses quentes. Este fato foi comprovado por Ayaz et al. (2014), que relataram maior prevalência neste período. Além disso, variáveis como idade, sexo, raça, desmame, transporte, composição da ração, densidade populacional do rebanho, saúde dos animais e tipo da cepa presente no rebanho, apresentam-se como potenciais fatores influentes na prevalência e excreção da bactéria (Callaway et al., 2009; Farrokh et al., 2013; Kulow et al., 2012). Os bovinos portadores de bactérias patogênicas, quando influenciados por estes fatores, podem excretar uma
quantidade ainda maior de bactérias, contaminando pastos e cursos d’água (Fremaux et al., 2008).
Medidas como educação ambiental em saúde para a população, principalmente em locais carentes de saneamento básico, além da permanente inspeção e fiscalização nos abatedouros, são de suma importância para evitar a perpetuação do patógeno na cadeia produtiva da carne, colocando em risco a saúde pública.
5. Conclusão
O patógeno E. coli STEC está amplamente distribuído no estado de São Paulo, sudeste brasileiro, a exemplo do relatado pela literatura em outras regiões e países. Dentre os genes pesquisados, comumente relacionados a patógenos isolados em humanos, quase todos foram detectados, alguns com altas prevalências. Os perfis genéticos de virulência observados evidenciam a intensa permuta de genes entre os micro-organismos, o que pode resultar na disseminação de cepas mais virulentas no ambiente.
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