INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE
Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação Programa de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal
Dissertação
PADRONIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE UMA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL OBJETIVANDO A CORRELAÇÃO ENTRE A TITULAÇÃO DA VACINA COMERCIAL FRENTE AO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA DAS GALINHAS (CAV) E O NÍVEL DE ANTICORPOS EM GALINHAS PREVIAMENTE
IMUNIZADAS
Filippe Scortegagna
Filippe Scortegagna
PADRONIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE UMA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL OBJETIVANDO A CORRELAÇÃO ENTRE A TITULAÇÃO DA VACINA COMERCIAL FRENTE AO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA DAS GALINHAS (CAV) E O NÍVEL DE ANTICORPOS EM GALINHAS PREVIAMENTE
IMUNIZADAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal do Instituto Federal Catarinense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área de concentração: Produção e Sanidade Animal).
Orientador: Paulo Augusto Esteves
Coorientador (es): Diogenes Dezen e Arlei Coldebella
Scortegagna, Filippe.
Padronização e validação de uma técnica de PCR em tempo real objetivando a correlação entre a titulação da vacina comercial frente ao vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV) e o nível de anticorpos em galinhas previamente imunizadas/ Filippe Scortegagna – 2019. Páginas 47.
Orientador: Paulo Augusto Esteves
Co-orientador: Diogenes Dezen e Arlei Coldebella
Dissertação (Mestrado Profissional) / Instituto Federal Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal.
1. Palavra-chave; 2. Palavra-chave; 3. Palavra-chave; até cinco, separadas com ponto e vírgula.
Filippe Scortegagna
Padronização e validação de uma técnica de PCR em tempo real objetivando a correlação entre a titulação da vacina comercial frente ao vírus da Anemia Infecciosa das Galinhas
(CAV) e o nível de anticorpos em galinhas previamente imunizadas
Dissertação aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências, Curso de Graduação Produção e Sanidade Animal, Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense.
Data da Defesa: 13/12/2019
Banca examinadora:
Prof. Dr. Paulo Augusto Esteves. (Orientador)
Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil
Prof. Dr. Diogenes Dezen
Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil
Dr. Luizinho Caron
Doutor em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Estadual de Campinas, Brasil e PIADC/ARS/USDA, Estados Unidos.
À minha família, em especial a minha esposa Viviane e minha filha Helena por me darem suporte e apoio incondicional.
Agradecimentos
Aos meus pais Enio e Neiva, pelo esforço que empreenderam para que eu pudesse chegar hoje aqui e por todo amor incondicional e suporte que sempre me deram, vocês são e sempre serão exemplo para mim.
Á minha esposa Viviane e a minha filha Helena pelo apoio e paciência que sempre tiveram durante essa jornada, compreendendo as ausências, motivando nas horas de desânimo e se alegrando junto nas horas de felicidade. Vocês são a razão de todo esse esforço e tenho certeza que nada seria possível sem a sua presença.
Um agradecimento especial ao meu orientador Dr. Paulo Esteves, que além de um excelente profissional é um ser humano fantástico, com carisma e inteligência incomuns. Obrigado pelo suporte e por me emprestar um pouco do seu conhecimento durante esses anos. Quero agradecer também pela paciência e dedicação com as quais conduziu a orientação desse mestrado de forma brilhante.
Aos demais professores e colaboradores do Instituto Federal Catarinense, instituição da qual eu tive a honra de fazer parte durante a graduação e agora durante o mestrado. O trabalho e a dedicação com que exercem suas funções servem de inspiração para mim e me fazem ter certeza de que escolhi uma das melhores instituições de ensino do Brasil. Obrigado pelos ensinamentos, dedicação e apoio que sempre nos deram, seja durante as aulas ou nas conversas informais pelos corredores.
Aos meus colegas e agora amigos de mestrado pela troca de experiências e conhecimento, pelas risadas e rodas de chimarrão. Vocês fizeram esse tempo ser mais leve e proveitoso.
Aos colaboradores da Embrapa Suínos e Aves pela receptividade com que me receberam e pela dedicação com que me ajudaram. Em especial à Tânia, à Dra. Iara e ao meu co-orientador Dr. Arlei, por comprarem a minha ideia e abdicarem do seu tempo e das suas tarefas para me ajudar. Sinto-me extremamente honrado pela oportunidade de ter trabalhado e compartilhado algumas ideias com vocês.
Á empresa BRF S.A. e aos inúmeros excelentes profissionais que nela trabalham, em especial ao time da Gerência Corporativa de Laboratórios, hoje liderada pelo Rafael F. Ferreira e à coordenadora e amiga Camila Plieski por terem investido em mim e me dado total apoio durante esses dois anos. Obrigado por cederem as instalações, o tempo e material humano que foram essenciais para a conclusão desse trabalho. Tenho e sempre terei muito orgulho de ter feito parte desse time e dessa empresa que é referência em qualidade.
E por fim, mas não menos importante, quero agradecer profundamente aos meus colegas dos LSAs de Videira e Concórdia por terem me aguentado durante todo esse tempo, cobrindo as minhas ausências, me ensinando e me ajudando com a parte mais laboriosa do trabalho. Profissionais de alto gabarito e amigos que levarei para a vida. Uma menção especial ao Eder e à Claudia pelos intermináveis testes e adaptações de técnica para que chegássemos ao resultado final e pelas inúmeras aulas teóricas e práticas sobre biologia molecular. E um último agradecimento especial à Angélica e à Keila, pelo suporte e parceria, pelas coletas de sangue, vacinas, inoculações, pesquisas e, principalmente, por fazerem a maior parte disso sem a minha presença, mesmo não sendo sua obrigação. Não tenho palavras para descrever o quão agradecido estou pelo seu apoio. Vocês são de mais.
Finalizo os meus agradecimentos com uma frase de Warren Buffett que virou uma filosofia de vida para mim e descreve um pouco sobre a importância de todas essas pessoas citadas acima: “É melhor estar perto de pessoas melhores que você. Escolha parceiros e colegas de trabalho que têm um comportamento melhor que o seu, você acabará indo para a mesma direção com eles”.
Só fazemos melhor aquilo que repetidamente insistimos em melhorar. A busca da excelência, portanto, não deve ser um objetivo, mas sim um hábito (Aristóteles)
Resumo
SCORTEGAGNA, Filippe. Padronização e validação de uma técnica de PCR em tempo real objetivando a correlação entre a titulação da vacina comercial frente ao vírus da Anemia Infecciosa das Galinhas (CAV) e o nível de anticorpos em galinhas previamente imunizadas. 2019. 43f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Araquari, 2019.
Anemia Infecciosa das Galinhas (CAV) é uma doença viral aguda, amplamente difundida ao redor do mundo caracterizada por grave anemia aplástica temporal e imunossupressão severa, fazendo com que as aves fiquem suscetíveis a doenças oportunistas. Apenas aves jovens apresentam doença clínica, porém aves adultas podem desenvolver a forma subclínica que está relacionada a quedas zootécnicas e de produção, podendo levar à uma perda de até 18% do lucro líquido do lote. A única maneira de controle é com um programa de vacinação efetivo. Para que isso ocorra é necessário saber a quantidade de antígeno presente na dose da vacina e qual será a resposta imune gerada nas aves imunizadas. Desta forma, o objetivo desse estudo foi padronizar uma técnica de titulação da vacina de CAV por PCR em tempo real, correlacionando a quantidade de material genético presente na vacina com a resposta imune sorológica dos animais. Assim sendo, 35 aves SPF, com 6 semanas, foram divididas em 6 grupos e imunizadas com diferentes diluições de uma vacina comercial, para avaliação de produção de anticorpos. Após, foram realizadas 3 coletas de soro (7, 14 e 21 dias pós-vacinação). Simultaneamente à última coleta as aves foram desafiadas com uma dose de um vírus de CAV não atenuado, seguido por mais 3 coletas de soro e sangue total para avaliar presença de anticorpos (ELISA) e da ocorrência de doença subclínica. Todas as diluições da vacina foram avaliadas por qPCR e o resultado do CT foi comparado com a titulação de anticorpos. A soroconversão deu-se aos 21 dias pós-vacinação, sendo que apenas os grupos GC (sem vacinação) e G5 (diluição de 10-4) permaneceram com títulos de anticorpos dentro do grupo 0. Nenhuma ave apresentou quadro de anemia durante o período de avaliação. Analisando a influência do CT da vacina na produção de anticorpos, os resultados demonstraram que para cada aumento de 1 unidade no CT ocorre redução de 26% na probabilidade de ocorrência de aves nos grupos vacinais 3 e 4 e de 24% na ocorrência de aves nos grupos vacinais 1 a 4. De acordo com os dados obtidos neste estudo, o CT ideal para que a vacina seja efetiva é de 25,96 e 28,87 para que respectivamente 90% e 80% dos animais não estejam no grupo 0 e 16,63 e 19,29 para que as aves estejam nos grupos 3 e 4. Esses resultados demonstraram que é possível e viável utilizar-se da PCR em tempo real para realizar a titulação de vacina de CAV e que existe, estatisticamente, uma correlação positiva entre o CT encontrado na vacina e o título de anticorpos no soro das aves. Futuros estudos a serem desenvolvido em breve com um maior número amostral irão proporcionar um valor mais preciso dos resultados obtidos na presente análise.
Palavras-chave: doenças virais; imunologia; doenças infecciosas aviárias; imunossupressão; soroconversão.
Abstract
SCORTEGAGNA, Filippe. Standardization and validation of a real-time PCR technique aiming at the correlation between commercial vaccine titration against Chicken Anemia Virus (CAV) and antibody level in previously immunized chickens. 2019. 43f. Dissertation (Master degree in Science) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Araquari, 2019.
Infectious Chicken Anemia (CAV) is an acute viral disease, widespread around the world characterized by severe temporal aplastic anemia and severe immunosuppression, making birds susceptible to opportunistic diseases. Only young birds present clinical disease, but adult birds may develop the subclinical form that is related to zootechnical and production falls, which may lead to a loss of up to 18% of the net profit of the flock. The only way to control it is with an effective vaccination program. For this to occur it is necessary to know the amount of antigen present in the vaccine dose and what will be the immune response generated in the immunized birds. Thus, the objective of this study was to standardize a CAV vaccine titration technique by real-time PCR, correlating the amount of genetic material present in the vaccine with the serological immune response of the animals. Thus, 35 6-week SPF birds were divided into 6 groups and immunized with different dilutions of a commercial vaccine for antibody production evaluation. After, 3 serum collections were performed (7, 14 and 21 days after vaccination). Simultaneously to the last collection, the birds were challenged with a dose of an attenuated CAV virus, followed by 3 additional serum and whole blood collections for antibody (ELISA) and subclinical disease occurrence. All vaccine dilutions were evaluated by qPCR and the CT result was compared with antibody titration. Seroconversion occurred at 21 days post-vaccination, and only GC (no vaccination) and G5 (10-4 dilution) groups remained with antibody titers within group 0. No birds showed anemia during the period. of evaluation. Analyzing the influence of vaccine TC on antibody production, the results showed that for every 1 unit increase in TC there is a 26% reduction in the likelihood of birds occurring in vaccine groups 3 and 4 and a 24% reduction in the occurrence of birds in vaccines. vaccine groups 1 to 4. According to the data obtained in this study, the ideal TC for the vaccine to be effective is 25.96 and 28.87 so that respectively 90% and 80% of the animals are not in group 0 and 16.63 and 19.29 so that birds are in groups 3 and 4. These results demonstrated that it is possible and feasible to use real-time PCR to perform CAV vaccine titration and that there is a statistically positive correlation. between the CT found in the vaccine and the antibody titer in bird serum. Further studies to be developed soon with a larger sample size will provide a more accurate value of the results obtained in the present analysis.
Keywords: viral diseases; immunology; avian infectious diseases; immunosuppression; seroconversion.
Lista de Figuras
Figura 1 Tempos e temperaturas de ciclagem utilizados para a amplificação
(desnaturação, anelamento e polimerização) das moléculas de DNA... 23 Figura 2 Isoladores utilizados no trabalho... 25 Figura 3 Cronograma de vacinação, desafio e coletas... 27 Figura 4 Relação entre a diluição da vacina e o CT encontrado na análise de
qPCR... 30 Figura 5 Médias aritméticas da razão S/N em função da dose de vacina e do
tempo após aplicação da vacina... 31 Figura 6 Porcentagens estimadas de aves protegidas em função do CT da vacina:
(a) grupos vacinais 3 e 4 e (b) grupos vacinais > 0... 34 Figura 7 Resultados de hematócrito por grupo e por coleta... 35
Lista de Tabelas
Tabela 1 Sequência de oligonucleotídeos para a detecção de DNA e mRNA de Vírus de Anemia Infecciosa das Galinhas utilizando ensaios de Taqman em tempo real... 22 Tabela 2 Quantidade de insumos e reagente utilizados para realizar a qPCR de
uma amostra... 23 Tabela 3 Amostras utilizadas para teste de sensibilidade (1 a 9) e especificidade
(10 a 11)... 24 Tabela 4 Dose da vacina fornecida para cada grupo de animais... 26 Tabela 5 Divisão dos grupos e interpretação dos resultados de sorologia para
CAV... 28 Tabela 6 Resultado de CT por concentração de vacina na amostra... 29 Tabela 7 Médias e erros-padrão da razão S/N em função da dose da vacina e do
tempo de aplicação da vacina... 31 Tabela 8 Frequência de aves por grupo em função das doses de vacina e do
tempo após a vacinação... 31 Tabela 9 Resultado do hematócrito... 35
Lista de Abreviaturas e Siglas
BLAST Ferramenta Básica de Pesquisa de Alinhamento Local CAV Vírus da Anemia Infecciosa das Galinhas
CT Limiar do ciclo (Cycle Threshold)
DICT50 Dose Infectante em Cultura de Tecido 50% DNA Ácido Desoxirribonucleico
ELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática PCR Reação em Cadeia da Polimerase PFU Unidade Formadora de Placa
qPCR Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa RNA Ácido Ribonucleico
SUMÁRIO
1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE ... 13
2 OBJETIVOS ... 16
2.1 Geral ... 16
2.2 Específicos ... 16
3 CORRELAÇÃO ENTRE A TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL E A TITULAÇÃO DE VACINA COMERCIAL FRENTE AO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA DAS GALINHAS (CAV) E O NÍVEL DE ANTICORPOS EM ANIMAIS IMUNIZADOS ... 18
3.1 Introdução ... 20 3.2 Material e Métodos ... 21 3.3 Resultados ... 29 3.4 Discussão ... 36 3.5 Conclusão ... 40 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 41 5 REFERÊNCIAS ... 42 6 ANEXOS ... 47
1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE
O Vírus da Anemia das Galinhas, também conhecido como Chicken Anemia Virus (CAV) pertencente à família Circoviridae, gênero Gyrovirus, trata-se de um vírus não envelopado, de formato icosaédrico e diâmetro médio de 25 a 26,5nm, sendo considerados um dos menores vírus animais (Simionatto et al., 2005; Eltahir et al., 2011; Yamakawa, 2015), sendo que o primeiro isolamento registrado de CAV ocorreu no Japão em 1979 através da propagação em pintinhos de um dia. (Yuasa et al., 1979).
A galinha é o único hospedeiro conhecido para CAV e a doença caracteriza-se por grave anemia aplástica temporal, destruição das células da linha eritoblastoide, atrofia do timo, imunossupressão e aplasia da medula óssea (Lucio et al., 1990; Simeonov et al., 2014). O efeito imunossupressor se deve à destruição de células T, granulócitos e progenitores de macrófagos, além de efeitos adversos causados em algumas células como as natural killer e alterações em mediadores como citocinas, o que leva ao aumento de susceptibilidade a infecções secundárias (Hagood et al., 2000; Yamakawa, 2015).
Galinhas de todas as idades são suscetíveis à infecção, porém os sinais clínicos manifestam-se apenas quando a mesma acontece nos primeiros dias de vida (Yuasa et al., 1979). Embora ainda não muito estudada, a infecção subclínica é a forma mais frequente da doença, sendo responsável pelo aumento do índice de conversão alimentar e diminuição do peso médio, causando prejuízos ao produtor (Simionatto et al., 2005).
Além das perdas zootécnicas já citadas, a anemia e a imunodeficiência transitória em pintos jovens frequentemente levam as aves acometidas a complicações por infecções secundárias virais, bacterianas ou fúngicas e contribui para a diminuição da imunidade (Todd, 2000; Dhama et al., 2008; Vaziry et al., 2013; Yamakawa, 2015).
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Apesar de muitas vezes ocorrer transmissão horizontal via fecal-oral, a transmissão vertical, da matriz para o embrião, é a forma mais comum. As taxas de morbidade, mortalidade e a severidade da doença variam de acordo com o título do vírus, via de infecção, idade das aves, imunidade passiva e amostras de maior patogenicidade (Simionatto et al., 2005; Yamakawa, 2015).
A infecção por CAV representa uma séria ameaça econômica para a indústria de frango, uma vez que está amplamente difundida nos plantéis ao redor do mundo (Rosenberger & Cloud, 1989; McNulty, 1991; Ducatez et al., 2005; Kim et al., 2010) e que os lotes infectados podem ter crescimento retardado e mortalidade entre 10 e 20%, ocasionalmente alcançando 60%. Existem relatos de que a doença pode levar à perda de cerca de 18% do lucro líquido, devido à diminuição do ganho de peso e mortalidades (Markowski-Grimsrud et al., 2002).
O diagnóstico de CAV pode ser feito através do isolamento viral, apesar deste apresentar baixa sensibilidade e alta complexidade. Assim, devido à grande dificuldade da realização exitosa da técnica de isolamento viral, testes sorológicos e a utilização de métodos moleculares de detecção do genoma viral, como a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), permitem a detecção de CAV de forma rápida e econômica (Simionatto et al., 2005; Yamakawa, 2015).
O método de isolamento serve tanto para fins de diagnóstico, quanto para a titulação de vacinas, onde se observa o efeito citopático do vírus (arredondamento das células e morte celular) em camadas de células T - linfoblastóides conhecidas como MSC-MSB1. A maior dificuldade referente ao isolamento de CAV é o fato de o mesmo não se multiplicar em cultivos celulares convencionais e dificilmente o fazer em ovos embrionados de galinha. Mesmo nas células MSB1, o crescimento é lento, com títulos baixos e são necessárias pelo menos 7 a 10 subculturas de células inoculadas para uma determinação precisa final de títulos infecciosos. Além disso, a dificuldade em produzir as células linfoblastóides (que são adquiridas a partir de linfomas da Doença de Marek e Leucose Linfóide), a necessidade de que as mesmas possuam poucas passagens para que seja feito a leitura com mais assertividade e o alto custo envolvido na aquisição, manutenção e estocagem destas células, torna o isolamento e a titulação das vacinas de anemia via cultivo celular práticas inviáveis para os laboratórios comerciais (Santos, 2013).
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A forma mais simples e eficaz de prevenir a doença é ter um programa de vacinação estabelecido, na qual as matrizes são imunizadas para que transmitam imunidade para a progênie através de anticorpos maternos. Essas vacinas consistem em uma suspenção do vírus ou frações do CAV, diluído em um veículo que, quando administradas a um indivíduo, induzem uma resposta imunológica que o capacita para futuramente responder a desafios de campo, ou, como no caso em questão, tais anticorpos são transmitidos à progênie (Canal & Vaz, 2007; Salle & Moraes, 2009).
Como os principais problemas causados pela anemia estão relacionados às aves jovens e a maior parte das contaminações se dá por via vertical, o principal objetivo dos programas de vacinação contra esse agente é imunizar as matrizes para que elas, primeiramente não eliminem o vírus via fezes e posteriormente possam passar imunidade materna para os pintinhos.
Atualmente, todas as vacinas comerciais disponíveis no Brasil contra CAV são compostas por cepas de vírus vivo atenuado, diferenciando apenas a forma de aplicação, aonde algumas são feitas via água e outras via intramuscular e a estirpe utilizada, embora alguns estudos já tenham testado com certo sucesso vacinas de DNA e Imunocomplexo (Moeini et al., 2011; Schat et al., 2011).
Como forma de monitoramento, tanto da saúde do plantel das matrizes de frango de corte, como da eficiência da vacinação, as empresas incluíram a anemia infecciosa das galinhas em seus programas de monitoria sorológica, onde são coletadas amostras de sangue em diferentes idades dos lotes, durante toda a vida produtiva dos animais.
A principal ferramenta utilizada para realizar a monitoria dos níveis de anticorpos circulantes contra CAV é o ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), que se baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. Existem várias modalidades de ELISA, porém as mais comuns e de maior importância para a sanidade animal são os ELISA Direto, ELISA Indireto e de ELISA de Bloqueio e, embora o princípio seja o mesmo, a forma de ligação e a presença de um segundo anticorpo na formulação definem as variações (Lequin, 2005).
Ensaios de ELISA indireto já foram desenvolvidos e utilizados para identificação de anticorpos contra CAV, sendo o primeiro deles descrito por Todd et al. (1990), porém o pequeno número de sítios de ligação do vírus devido ao seu tamanho, aliado
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ao custo e dificuldade de se realizar a técnica, incentivou os pesquisadores a buscarem métodos alternativos e o ELISA de bloqueio, ou de competição, foi desenvolvido e é utilizado até hoje (Todd et al., 1999).
O Elisa de bloqueio para CAV basicamente utiliza uma placa de titulação impregnada com antígenos aonde, na primeira incubação, os anticorpos presentes na amostra reagem com os antígenos e formam um complexo. Após a lavagem, adiciona-se um conjugado enzimático de anticorpos monoclonais contra CAV que irá preencher os sítios dos antígenos que não foram ocupados pelos anticorpos da amostra e, depois de uma segunda lavagem para retirar os anticorpos que não se ligaram, adiciona-se um substrato cromogênico que, na presença de enzima, vai reagir com um cromóforo para gerar uma cor azul que será lida por um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 650 nm (Idexx, 2016).
Como o conjugado só se liga aos antígenos que não forma previamente complexados pelos antígenos da amostra, conclui-se que, ao contrário de um ELISA indireto, quanto mais anticorpos na amostra, menor será a emissão de cor e por isso, resultados de absorbância menores representam títulos maiores e leituras maiores são indicativas de títulos menores (Idexx, 2016).
A unidade utilizada para determinar o título presente na amostra é a razão S/N, que nada mais é do que o valor da absorbância encontrada na amostra dividido pela média de absorbância dos dois controles negativos e é baseado nessa razão que os resultados são emitidos e as amostras são separadas em grupos no histograma. O grupo 0 é composto por amostras com razão S/N maiores do que 0,80, enquanto as do grupo 1 têm valores entre 0,80 e 0,55 e assim por diante, constando no grupo 2 valores entre 0,54 e 0,5, grupo 3 de 0,34 a 0,20 e grupo 4 com razões S/N menores do que 0,2. Na prática, animais no grupo 0 não estão protegidos e tem grandes chances de passarem o vírus via vertical para a progênie. Animais entre os grupos 1 e 3 possuem anticorpos protetores porém não são extremamente efetivos em passar essa proteção para os pintinhos e animais no grupo 4 estão totalmente protegidos e conseguirão passar esses anticorpos maternos de forma efetiva e duradoura (Malo & Weingarten, 1995).
Como uma segunda ferramenta de controle, todos os lotes ou partidas de vacinas vivas que serão utilizadas nos plantéis, passam por uma titulação interna
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prévia para confirmar o título fornecido pelo fabricante ou para ajuste de dose caso os valores sejam diferentes. O problema da vacina de CAV é que, como foi mencionado anteriormente, o isolamento é muito fastidioso e a titulação, por consequência, torna-se extremamente difícil, imprecisa, ou mesmo inviável, o que obriga a empresa e o veterinário sanitarista a confiarem no título disponível na bula.
Como existem inúmeras variáveis que podem interferir na titulação final de uma vacina e na sua capacidade de desafiar o sistema imune (tais como o tempo e temperatura de transporte, forma de armazenamento, título inicial da partida, entre outros), é de grande importância para o setor avícola o desenvolvimento de uma ferramenta que possa ser utilizada para a realização de uma avaliação mais prática, confiável e precisa da carga antigênica presente na vacina, além do seu potencial imunológico, auxiliando na obtenção de uma previsão aproximada da resposta imune dos animais após o processo de imunização.
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2 OBJETIVOS
2.1 Geral
• Padronizar uma técnica de titulação de vacina de Anemia Infecciosa das Galinhas (CAV) por PCR em tempo real, correlacionando a quantidade de material genético presente na vacina à resposta imune sorológica dos animais.
2.2 Específicos
• Padronizar uma técnica de PCR em tempo real (qPCR) capaz de identificar a presença de material genético de CAV, tanto vacinal, quanto de campo.
• Desenhar uma curva de CT capaz de identificar a quantidade de vírus contida no frasco da vacina.
• Correlacionar o CT da qPCR com a concentração vacinal e com a resposta sorológica dos animais.
• Definir um ponto de corte para avaliar se a vacina pode ser aprovada para utilização.
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3 CORRELAÇÃO ENTRE A TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL E A TITULAÇÃO DE VACINA COMERCIAL FRENTE AO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA DAS GALINHAS
(CAV) E O NÍVEL DE ANTICORPOS EM ANIMAIS IMUNIZADOS
Autores
Filippe Scortegagna a, Angelica de Simas a, Keila Catarina Prior a, Diogenes Dezen a, Arlei Coldebella b, Luizinho Caron b, Iara Maria Trevisol b, Paulo Augusto Esteves b
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3.1 Introdução
Anemia Infecciosa das Galinhas é uma doença viral aguda, relatada pela primeira vez no Japão em 1979 aves de um dia (Yuasa et al., 1979). A doença é caracterizada por uma grave anemia aplástica temporal, destruição das células da linha eritoblastoide, atrofia do timo, imunossupressão e aplasia da medula óssea. Além da anemia, um problema severo causado pela enfermidade é a depleção do sistema imune das aves, fazendo com que as mesmas fiquem suscetíveis aos patógenos oportunistas, causando danos ainda maiores (Sommer & Cardona, 2003; Davidson et al., 2004).
O agente causador da doença é conhecido como Vírus da Anemia Infecciosa das Galinhas (CAV) pertence ao gênero Gyrovirus, recentemente classificado na família Circoviridae (ICTV, 2015). Possui DNA de fita simples e cadeia circular (2.3 kb) que codifica três proteínas: VP1 (51,6 kDa), VP2 (30kDa) e VP3 (13,6 kDa). A VP1 e a VP2 estão envolvida com a imunidade, enquanto a VP3, também conhecida como apoptina, está associada com as células infectadas e é responsável pela apoptose celular. Por não possuir envelope, o vírus da anemia é bastante resistente no ambiente e a agentes químicos e físicos como o calor (Pringle, 1999, Todd, 2000).
A galinha é considerada o único hospedeiro natural do vírus e, embora galinhas de todas as idades sejam susceptíveis à infecção, apenas animais jovens com menos de 3 semanas apresentam a doença clínica (Yuasa et al., 1987). Animais adultos, porém, segundo Von Bulow (1991) ao entrarem em contato com o agente, sem terem anticorpos protetivos, podem desenvolver a doença subclínica que pode ser considerada a forma mais comum e que acarreta em um enorme prejuízo econômico para o produtor (Chettle et al., 1989; McNuty, 1991).
Além das perdas zootécnicas, pode-se ainda levar em conta o prejuízo relacionado às condenações de abate, sejam elas totais ou parciais. Apesar de normalmente não causar condenação por si só, a infecção por CAV causa depressão no sistema imune e abre caminho para a entrada de vários outros agentes virais, bacterianos ou fúngicos que farão com que os prejuízos sejam maiores. Segundo alguns estudos recentes, no Brasil, a porcentagem de condenação em abatedouros referente a agentes patogênicos varia entre 26,30 e 56,13%, o que significa um total de 1,15 a 4,66% de todos os animais abatidos (Santana et al., 2008; Oliveira et al., 2016; Almeida et al., 2017).
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As principais formas de controle da doença envolvem biosseguridade e vacinação (Back, 2019), porém como o vírus já está amplamente difundido e presente em praticamente todos os lotes comerciais de galinhas ao redor do mundo, um programa sólido e eficiente de vacinação passa a ser a única ferramenta disponível para tal. Entre os fatores que contribuem para excelência em um programa de vacinação estão a eficiência da vacina, o cálculo da dose necessária e o acompanhamento sorológico periódico para identificar possíveis falhas vacinais e garantir a cobertura da mesma e a soroconversão dos animais. (Canal & Vaz, 2007).
Devido ao fato da titulação do CAV em cultivo celular tratar-se de uma técnica muito complexa de ser executada e de ser um procedimento sujeito a uma série de fatores que aumentam a imprecisão do resultado obtido, é importante que existam ferramentas que possam facilitar e garantir a obtenção deste tipo de avaliação de maneira mais precisa e exequível (Santos, 2013).
Portanto, conhecer a titulação inicial do lote de vacina que será utilizada para o cálculo da dose, poder prever o título aproximado da resposta imune dos animais e o grau de proteção dos mesmos para CAV de forma precisa, fácil e reproduzível são necessidades relevantes de várias indústrias do segmento avícola.
Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi padronizar uma técnica de titulação de vacina de CAV por PCR em tempo real, correlacionando a quantidade de material genético presente na vacina com a resposta imune (sorológica) dos animais utilizados.
3.2 Material e Métodos
3.2.1 Comitê de ética
Os procedimentos propostos neste projeto foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto Federal Catarinense - campus Concórdia (Protocolo 13-2019).
3.2.2 Vacina
Para a realização dos testes e definição dos parâmetros, foi utilizado uma vacina comercial, via água, contendo vírus vivo atenuado liofilizado, cepa Cux-1, com quantidade por dose de 104,5 a 105,1 DICT
50. O frasco continha 2.500 doses e estava dentro do prazo de validade.
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A hidratação e a diluição da vacina, tanto para a realização da qPCR, quanto para a vacinação, foram realizadas seguindo todas as recomendações do fabricante presentes na bula.
3.2.3 qPCR Primes
As sequências de primers e probes (Tabela 1) que foram confeccionadas para a realização da técnica de PCR em tempo real foram retiradas do estudo prévio de Markowski-Grimsrud et al. (2002) e conferidas no banco de dados do Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) no National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Os primers pesquisados são específicos para CIA-1 e Cux-1, duas das principais cepas de Anemia circulantes no Brasil e presente nas principais vacinas vivas disponíveis no mercado.
Tabela 1: Sequência de oligonucleotídeos para a detecção de DNA e mRNA de Vírus de Anemia Infecciosa das Galinhas utilizando ensaios de Taqman em tempo real.
CIA-1 cepa Cux-1 cepa
CAV Q5' 5'-GCCCCGGTACGTATAGTGTGAG-3' 22-mer 989–1010 1010–1031 CAV probe
5'-(6FAM)-CTGCCGAACCCCCAATCTACT-ATGACTATCC-(TAMRA)-3' 31-mer 1012–1042 1033–1063 Cux-1 specific
Q3' primera 5'-CCGTGAGAAAGATGACCCCTT-3' 21-mer N/A 1070–1090 CIA-1 specific
Q3' primera 5'-CCGTGAGAAATATGATTCCTTGG-3' 23-mer 1047–1069 N/A
Comprimento Posição no genoma
Nome Sequência
aOs três nucleotídeos diferentes entre as cepas Cux-1 e CIA-1 estão destacadas em negrito e sublinhadas.
Extração
A extração do material genético contido nas amostras foi realizada através do método de extração por colunas de sílica, com o auxílio de kits comerciais NewGene® Prep e NewGene® Preamp da empresa Simbios Biotecnologia, seguindo conforme recomendações do fabricante (Simbios Biotecnologia, 2018a; Simbios Biotecnologia, 2018b).
Amplificação
A amplificação do DNA e a leitura foram realizadas no equipamento StepOnePlus™, utilizando o kit comercial AgPath-ID™ One‑Step RT‑PCR Reagents da Thermo Fisher. Os
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tempos e temperaturas de ciclagem, bem como o volume de reagentes do máster mix utilizados foram adaptados do manual do kit (Applied Biosystems, 2019) e estão dispostos, respectivamente, na Figura 1 e Tabela 2.
A reação de amplificação foi realizada com um ciclo de desnaturação inicial de 10 minutos a 95oC, seguido de 40 ciclos de amplificação (95oC por 15 segundos e 60oC por 45 segundos).
Figura 1: Tempos e temperaturas de ciclagem utilizados para a amplificação (desnaturação, anelamento e polimerização) das moléculas de DNA.
Tabela 2: Quantidade de insumos e reagente utilizados para realizar a qPCR de uma amostra.
Reagente Quantidade (µL)
Água Livre de Nuclease 3,2
Primer Iniciador 10µM 1 Primer Reverso 1 10µM 1 Primer Reverso 2 10µM 1 Probe 10µM 0,3 Mix de Enzimas 25X RT-PCR 1 Buffer 2X RT-PCR 12,5
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Validação
Para testar a sensibilidade técnica, foram utilizadas seis diluições de uma vacina comercial composta por vírus vivo atenuado, assim como uma cepa do mesmo vírus utilizado na vacina (Cux-1), porém não atenuado e duas cepas de vírus selvagem.
A especificidade in vitro foi testada utilizando pool de DNA de bactérias e outras espécies de vírus que acometem aves e in silico através de consulta ao GenBank.
Tabela 3: Amostras utilizadas para teste de sensibilidade (1 a 9) e especificidade (10 a 11).
Nº Amostra
1 Vacina comercial (Dose do fabricante)
2 Vacina comercial 10-1 3 Vacina comercial 10-2 4 Vacina comercial 10-3 5 Vacina comercial 10-4 6 Vacina comercial 10-5 7 Cux-1 8 Cepa selvagem 1 9 Cepa selvagem 2 10 Pool vírus* 11 Pool bactérias**
* Material previamente extraído contendo: Vírus de Gumboro (IBD), vírus de bronquite (IBV) e Reovírus tipo I (REO).
** Material previamente extraído contendo: Salmonella spp., Escherichia coli e Staphylococcus spp.
3.2.4 Vacinação e Desafio
Aves
Para a experimentação com os animais, foram utilizadas 35 aves SPF (Livres de Patógenos Específicos), com 6 semanas de idade, oriundas da incubação de ovos da mesma qualidade e negativos na sorologia para CAV.
Delineamento experimental
Os animais foram divididos aleatoriamente em 6 grupos, contendo 5 animais cada e alojados em diferentes cabines isoladas (Figura 2), onde recebiam ar filtrado, água potável e
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comida ad libitum. A temperatura era controlada através de exaustores e aquecedores regulados por um termostato.
Figura 2: Isoladores utilizados no trabalho
Um grupo foi selecionado como controle (GC) e não recebeu a dose de vacina. Os demais grupos receberam doses de vacina diluídas, serialmente na base dez, partindo da diluição padrão recomendada pelo fabricante (Tabela 4).
A primeira diluição da vacina, assim como a dose recomendada, a via de aplicação e a idade para vacinação, foram seguidas exatamente conforme a recomendação do fabricante.
Realizou-se a análise de qPCR de todas as diluições da vacina para posterior comparação com o resultado da sorologia.
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Tabela 4: Dose da vacina fornecida para cada grupo de animais
Grupo Dose Vacina
G1 Conforme recomendação do fornecedor
G2 10-1 (1:10)
G3 10-2 (1:100)
G4 10-3 (1:1000)
G5 10-4 (1:10000)
GC Sem vacina
As aves foram vacinadas, via inglúvio, com 6 semanas de idade, sendo que cada dose continha, segundo o fabricante, uma DICT50 entre 104,5 a 105,1. Para o desafio, utilizou-se 400µL de água ultrapura contendo uma concentração de 103,75 PFU do vírus estirpe Cux-1.
A rota de administração da vacina foi utilizada conforme recomendação do fabricante e a do antígeno foi realizada por via intramuscular por ser mais efetiva (Rosenberger & Cloud, 1989).
Baseado no estudo de Tongkamsai et al. (2019), as coletas de sangue foram realizadas com 7, 14 e 21 dias pós-vacinação. No mesmo dia da terceira coleta, foi realizado o desafio dos animais com a cepa Cux-1 não atenuada, seguida por mais três coletas de sangue com 7, 14 e 21 dias pós-desafio (28, 35 e 42 dias pós-vacinação), conforme Figura 3.
O sangue foi posteriormente centrifugado com o intuito de separar o coágulo do soro, que foi coletado e congelado para as análises de ELISA. Nas coletas pós-desafio, além do ELISA, também foi realizada a avaliação do hematócrito, com o intuito de quantificar a concentração de hemácias circulantes nos animais e verificar uma possível doença causada pelo próprio desafio. Para tanto, nessas amostras, antes de centrifugar, coletou-se uma alíquota de sangue inteiro que foi enviada para a Embrapa Suínos e Aves de Concórdia/SC.
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Figura 3: Cronograma de vacinação, desafio e coletas
3.2.5 Testes Laboratoriais
Sorologia
A presença de anticorpos no soro das aves foi analisada pelo método de ELISA de bloqueio usando Kit teste de anticorpo contra CAV (Idexx Laboratories, Westbrook, ME). O soro foi diluído em 1:100, de acordo com as instruções do fabricante e a leitura de absorbância foi realizada em um comprimento de onda de 650nm em uma leitora automática EL310 (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). Os cálculos de Razão S/N, titulação correspondente de anticorpos e divisão dos resultados em grupos de imunização foram feitas através do software xChek 3.3.
O software divide os resultados em 5 grupos, conforme Tabela 5, baseado em um estudo de Malo & Weingarten (1995). Títulos de 0 a 999 possuem uma carga de anticorpos menor do que 7 log2 e estão classificados no Grupo 0. Essas aves, além de não estarem protegidas, ainda poderão infectar sua progênie via vertical, caso sejam infectadas próximo à postura. Aves com títulos entre 1000 e 8660 são classificadas entre os grupos 1 e 3 e possuem uma concentração de anticorpos variando entre 8 e 10 log2. Esses animais possuem anticorpos protetores, ou seja, não há eliminação de vírus nas fezes e, se não está nas fezes de aves infectadas, não está em ovos embrionados e, consequentemente, não há transmissão via vertical. Apesar de não nascerem infectados, os pintinhos de origem dessas matrizes não estarão completamente protegidos caso ocorra exposição ao vírus e podem
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desenvolver a doença. Títulos maiores do que 8661 são classificados no grupo 4 e correspondem a uma concentração de anticorpos maior do que 11 log2, o que significa que os animais estão fortemente imunizados e, além de não transmitirem o vírus para o ovo, ainda passarão imunidade materna, que conseguirá proteger o pintinho durante toda a idade crítica.
Tabela 5: Divisão dos grupos e interpretação dos resultados de sorologia para CAV
Grupo ELISA Razão S/N VN log2 Interpretação
0 <1000 >0,8 <7 Negativos/Baixos títulos positivos 1 1000-2460 0,8-0,55 8-10 Positivo-moderado (Títulos protetivos) 2 2461-5050 0,54-0,35 8-10 Positivo-moderado (Títulos protetivos) 3 5051-8660 0,34-0,2 8-10 Positivo-moderado (Títulos protetivos)
4 ≥8661 <0,2 ≥11 Altamente protegido
Fonte: Malo & Weingarten, 1995.
Hematócrito
A análise do volume de eritrócitos contido no sangue dos animais foi realizada através do método do microhematócrito, utilizando-se tubo capilar centrifugado a 1.200g por 5 minutos, sendo o resultado expresso em porcentagem (Tessari et al., 2006).
3.2.6 Estatística
O experimento foi executado num delineamento inteiramente ao acaso, com tratamentos arranjados em esquema fatorial (dose de vacina e tempo após aplicação da vacina). Os dados de razão S/N obtidos foram analisados por meio da análise da variância do modelo contendo os efeitos de dose de vacina, tempo após aplicação da vacina e interação dos dois fatores. Para o detalhamento da análise sempre que o teste F detectou efeito significativo (p≤0,05) de dose da vacina, foram aplicados dois testes de Dunnett, um para comparar o tratamento sem vacina com os demais e outro para comparar o tratamento com a dose recomendada da vacina com os demais.
Devido à heterogeneidade de variâncias detectada, a análise foi realizada pelo método de mínimos quadrados ponderados pelo inverso da variância de cada combinação de dose de vacina e tempo após aplicação da vacina. A análise foi realizada por meio do procedimento GLM do software SAS (2012).
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Para avaliar o efeito das doses de vacina sobre os grupos, foi aplicado o teste Exato de Fisher, avaliando os dados dentro de cada tempo após a aplicação da vacina. Foi utilizado o procedimento FREQ do SAS (2012) para realizar essa análise.
Adicionalmente foi calculado o valor de CT da vacina que propicia a proteção de 90% das aves. Sendo realizada duas análises, uma considerando as variáveis grupo = 0 versus grupo > 0 e outra considerando as variáveis grupo < 3 versus grupo ≥ 3. Para realizar os cálculos foram ajustados modelos de regressão logística, tendo como resposta essas duas variáveis e como variável explicativa o CT da vacina. A partir das estimativas do modelo foi calculado CT da vacina que propicia as proteções de 80% e 90% das aves. Também foi estimado intervalo de confiança de 95% para o CT utilizando o método Delta, conforme Demétrio (2001).
3.3 Resultados
3.3.1 qPCR
As doses de vacina testadas no qPCR apresentaram resultado de CT (Cycle Threshold) conforme Tabela 6 e Figura 4.
Tabela 6: Resultado de CT por concentração de vacina na amostra
Concetração da Vacina CT Dose Fabricante 22,83 Dose 10-1 (1:10) 26,16 Dose 10-2 (1:100) 29,59 Dose 10-3 (1:1000) 32,03 Dose 10-4 (1:10000) 34,93
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Figura 4: Relação entre a diluição da vacina e o CT encontrado na análise de qPCR
3.3.2 Imunização X dose X dias
O teste F da análise da variância detectou efeito significativo, com nível descritivo de probabilidade <0,0001 para os três fatores avaliados (Dose de vacina, Tempo após aplicação da vacina e interação) no caso da Razão S/N. Somente a partir dos 14 dias ocorreu efeito da dose de vacina, sendo que o tratamento sem vacina diferiu significativamente pelo teste de Dunnett da dose recomendada pelo fabricante nos dias 21 e 28; da dose 10-1 nos dias 28 e 42 e da dose 10-3 no dia 28. Já, a dose recomendada pelo fabricante diferiu da dose 10-2 no dia 28, da dose 10-3 no dia 14 e da dose 10-4 nos dias 21 e 28 (Tabela 7 e Figura 4).
Na Tabela 8 é apresentada a frequência de aves por grupo de classificação no ELISA em função das doses de vacina e do tempo após a vacinação. Nota-se que o teste Exato de Fisher somente detectou efeito de dose da vacina nos dias 14, 21 e 28 após a vacinação. No dia 14 a dose recomendada pelo fabricante diferiu da dose 10-3, enquanto no dia 21 ela diferiu da dose 10-4 e no dia 28 notou-se diferença significativa com as doses 10-2, 10-4 e no Grupo não vacinado. No dia 28 o tratamento sem vacina também diferiu da dose 10-3.
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Tabela 7: Médias e erros-padrão da razão S/N em função da dose da vacina e do tempo de aplicação da vacina
Fabricante: 100 10-1 10-2 10-3 10-4 Sem Vacina
0 1.043±0.0334 0.920±0.0698 1.037±0.0514 0.981±0.0953 0.963±0.0582 1.031±0.0779 0.5917 7 0.884±0.0512 0.825±0.0649 0.953±0.0509 0.837±0.0488 0.978±0.0650 0.951±0.0625 0.2851 14 0.932±0.0360 0.776±0.0465 0.820±0.0623 0.699±0.0485 b 0.798±0.0267 0.876±0.0513 0.0030 21 0.359±0.1382 a 0.510±0.0775 0.653±0.1188 0.473±0.1005 0.898±0.0571 b 0.751±0.0215 b <0.0001 28 0.211±0.0451 a 0.534±0.1519 a 0.781±0.1452 b 0.193±0.0300 a 0.836±0.0271 b 0.998±0.0620 b <0.0001 35 0.251±0.0476 0.181±0.0304 0.157±0.0130 0.265±0.0402 0.154±0.0397 0.247±0.0711 0.0566 42 0.319±0.0923 0.122±0.0116 a 0.185±0.0389 0.188±0.0522 0.216±0.0383 0.210±0.0187 0.0005 Dose da Vacina Dias Pr>F
aDifere significativamente (p≤0,05) do tratamento sem vacina pelo teste de Dunnett e bDifere
significativamente (p≤0,05) da dose de vacina recomendada pelo fabricante pelo teste de Dunnett.
Figura 5: Médias aritméticas da razão S/N em função da dose de vacina e do tempo após aplicação da vacina.
Obs.: Ao lado direito do gráfico estão indicados os grupos relacionados ao teste ELISA (IDEXX) conforme os valores da Razão S/N (eixo Y).
Tabela 8: Frequência de aves por grupo de classificação de ELISA em função das doses de vacina e do tempo após a vacinação.
0 1 2 3 4 0,1457 n 6 0 % 100.00 0.00 n 3 3 % 50.00 50.00 n 6 0 % 100.00 0.00 10/fev - - - 6 - - 6 P 0 dias pós-vacinação Fabricante: 100 - - - 6
Dose da vacina Grupo Total
-32 0 1 2 3 4 n 5 1 % 83.33 16.67 n 5 1 % 83.33 16.67 n 5 0 % 100.00 0.00 0,0895 n 5 1 % 83.33 16.67 n 2 4 % 33.33 66.67 n 6 0 % 100.00 0.00 n 4 2 % 66.67 33.33 n 5 1 % 83.33 16.67 n 5 0 % 100.00 0.00 0,0322 n 6 0 0 % 100.00 0.00 0.00 n 3 3 0 % 50.00 50.00 0.00 n 4 1 1 % 66.67 16.67 16.67 n 1 5 0 % 16.67 83.33 0.00 n 5 1 0 % 83.33 16.67 0.00 n 4 1 0 % 80.00 20.00 0.00 0.0277 n 1 1 0 1 3 % 16.67 16.67 0.00 16.67 50.00 n 0 3 2 0 1 % 0.00 50.00 33.33 0.00 16.67 n 2 3 0 0 1 % 33.33 50.00 0.00 0.00 16.67 n 0 3 2 0 1 % 0.00 50.00 33.33 0.00 16.67 n 5 1 0 0 0 % 83.33 16.67 0.00 0.00 0.00
Dose da vacina Grupo Total P
10/mar 6 10-4 b 6 10/jan 6 10/fev 6 Fabricante: 100 6 21 dias pós-vacinação Sem Vacina - - 5 10/abr - - 6 10-3 b - - 6 10/fev - - 6 6 10/jan - - 6 14 dias pós-vacinação Fabricante: 100 - -6 Sem Vacina - - - 5 10/abr - - -6 10/mar - - - 6 10/fev - - -6 10/jan - - - 6 7 dias pós-vacinação Fabricante: 100 - - -Sem Vacina - - - 5 10/abr - - - 6 10/mar - - - 6
33 0 1 2 3 4 n 1 4 0 0 0 % 20.00 80.00 0.00 0.00 0.00 0.0001 n 0 0 1 1 4 % 0.00 0.00 16.67 16.67 66.67 n 3 0 0 1 2 % 50.00 0.00 0.00 16.67 33.33 n 5 0 0 0 1 % 83.33 0.00 0.00 0.00 16.67 n 0 0 0 4 2 % 0.00 0.00 0.00 66.67 33.33 n 5 1 0 0 0 % 83.33 16.67 0.00 0.00 0.00 n 5 0 0 0 0 % 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0,4812 n 1 1 4 % 16.67 16.67 66.67 n 0 2 4 % 0.00 33.33 66.67 n 0 0 6 % 0.00 0.00 100.00 n 1 3 2 % 16.67 50.00 33.33 n 0 1 5 % 0.00 16.67 83.33 n 1 1 3 % 20.00 20.00 60.00 0,2861 n 1 2 0 3 % 16.67 33.33 0.00 50.00 n 0 0 0 6 % 0.00 0.00 0.00 100.00 n 0 0 3 3 % 0.00 0.00 50.00 50.00 n 0 1 2 3 % 0.00 16.67 33.33 50.00 n 0 1 1 4 % 0.00 16.67 16.67 66.67 n 0 0 2 3 % 0.00 0.00 40.00 60.00
Dose da vacina Grupo Total P
10/abr - 6 Sem Vacina - 5 10/fev - 6 10/mar - 6 Fabricante: 100 - 6 10/jan - 6 Sem Vacina - - 5 42 dias pós-vacinação 10/mar - - 6 10/abr - - 6 10/jan - - 6 10/fev - - 6 35 dias pós-vacinação Fabricante: 100 - - 6 10-4 b 6 Sem Vacina b 5 10-3 a 6 10-2 b 6 Fabricante: 100 a 6 10/jan 6 Sem Vacina 5 28 dias pós-vacinação
P: Nível descritivo de probabilidade do teste Exato de Fisher; a: Difere significativamente (p≤0,05) do tratamento sem vacina pelo teste Exato de Fisher e b: Difere significativamente (p≤0,05) da dose de vacina recomendada pelo fabricante pelo teste Exato de Fisher.
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3.3.3 CT X Imunização
Conforme apresentado na Figura 6 a análise de regressão logística, para avaliar o efeito do CT da vacina sobre a proteção vacinal, mostrou que para cada aumento de 1 unidade no CT, ocorre redução de 26% na probabilidade de ocorrência de aves nos grupos 3 e 4 e de 24% na ocorrência de aves nos grupos vacinais 1 a 4. Para que 90% das aves estejam pelo menos no grupo 1 é necessário um CT = 25,96 ±5,86; IC = 95%, enquanto para que 90% das aves estejam nos grupos 3 e 4 é necessário CT = 16,63 ±9,33; IC = 95%. Para a proteção de 80% das aves os valores de CT são, respectivamente, 28,87 ±3,88; IC = 95% e 19,29 ±7,17; IC = 95%.
Figura 6: Porcentagens estimadas de aves protegidas em função do CT da vacina: (a) grupos vacinais 3 e 4 e (b) grupos vacinais > 0.
3.3.4 Imunização X doença
Os resultados das análises de hematócrito (Figura 7 e Tabela 9) não apresentaram quedas significativas entre a primeira coleta (28 dias pós vacinação) quando os animais ainda não haviam sido desafiados com a cepa virulenta e a terceira coleta (14 dias pós-desafio). A média geral de valores dos grupos nas três coletas foi de 34,7% na primeira coleta, 35,4% na segunda e 35,0% na terceira.
Dos grupos desafiados, apenas o GC (Sem vacina) e o G1 (Dose Fabricante) apresentaram queda quando comparados os valores entre a primeira e a terceira coleta, sendo que somente o G1 apresentou diferença estatística entre os valores (Figura 7). As quedas foram de 2,2 e 5 pontos percentuais respectivamente. Os resultados obtidos na última coleta inclusive mostraram-se mais homegeneos e próximos entre os grupos do que os da primeira coleta.
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Figura 7: Resultados de hematócrito por grupo e por coleta
Tabela 9: Resultado do hematócrito
Grupo Amostra Coleta 1 (28 d) Coleta 2 (35 d) Coleta 3 (42 d) GC (Sem Vacina) 1 40 35 38 2 39 35 36 3 36 34 37 4 38 36 34 5 38 37 35 G1 (Dose Fabricante) 1 40 40 30 2 39 39 33 3 39 39 35 4 37 38 37 5 38 36 33 G2 (10-1) 1 34 39 38 2 35 38 36 3 31 37 34 4 36 38 39 5 34 37 40 G3 (10-2) 1 36 33 35 2 36 34 34 3 35 34 40 4 35 34 36 5 35 36 38 G4 (10-3) 1 30 30 32 2 33 29 36
36 3 36 33 33 4 37 36 38 5 31 30 31 G5 (10-4) 1 28 33 30 2 27 35 32 3 30 34 35 4 29 36 33 5 29 38 31 3.4 Discussão
O vírus da Anemia Infecciosa das Galinhas, devido à sua característica morfológica de não possuir envelope, tem uma capacidade considerável de sobreviver no meio ambiente, além de ser transmitido facilmente tanto na forma vertical, como na horizontal (Pringle, 1999). Essas, entre outras características, fazem com que o CAV seja bastante difundido e esteja circulante na grande maioria dos plantéis avícola ao redor do mundo, com casos relatados em todos os continentes (Yuasa et al., 1979; Lucio et al., 1990; Hussein et al., 2002; Toro et al., 2006; Craig et al., 2009; Bidin et al., 2010; Oluwayelu, 2010; Bhatt et al., 2011; Eltahir et al., 2011; Rios et al., 2012; Snoeck et al., 2012; Gowthaman et al., 2014; Sharma et al., 2014). Apesar de apenas animais jovens apresentarem sinais clínicos e sofrerem complicações mais graves devido à infecção, estima-se que a doença subclínica seja tão ou mais prejudicial, principalmente no quesito financeiro (Yuasa et al., 1979; Von Bulow, 1991). Estudos recentes comprovam que plantéis de frango de corte com anticorpos anti-CAV, apresentam em média, uma produção 13% abaixo dos planteis não infectados, além de terem mais propensão à adquirirem doenças secundárias, indicando que infeções subclínicas por CAV, podem ser parte de um número de doenças imunossupressoras importantes e que devem ser monitoradas (Simionatto et al., 2005).
As únicas formas de controle seriam biosseguridade e programas consistentes de vacinação, porém como o vírus já está disseminado, a biosseguridade não é tão eficiente nesse caso, restando apenas a segunda opção (Back, 2019). As empresas vêm investindo muito em vacinação, visto as vantagens da utilização da mesma, porém tão importante quanto vacinar, é acompanhar a resposta dos animais perante a esse desafio. Para garantir uma efetividade de cobertura vacinal, monitorias periódicas são feitas nos plantéis com o intuito de avaliar falhas no processo e no produto, por isso é muito importante prever qual
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será a resposta imune das aves perante a quantidade de antígeno que está sendo ofertado para elas.
Devido à dificuldade de se realizar a titulação do CAV, a vacina da anemia não passa por nenhum processo de aferição do titulo da carga viral presente no insumo por parte da maioria das empresas compradoras, diferente de outras vacinas como bronquite ou gumboro, por exemplo. Essa falta de verificação deixa as indústrias vulneráveis e dependentes da informação do fornecedor, o que pode causar grandes prejuízos, haja visto o montante que é gasto periodicamente com esse material. Além disso, a quantidade de antígeno presente na vacina é uma das características que podem interferir na estimulação das células de defesa e consequentemente na resposta imune das aves e, portanto, a dose a ser administrada deve ser ajustada conforme a titulação real da partida da vacina.
Conhecer o que está presente dentro da vacina e poder estipular qual será a resposta dos animais perante a mesma, ou mesmo poder calcular uma dose de aplicação baseado na titulação de anticorpos esperada pode ser considerado um avanço significativo, uma vez que a quantidade de doses de vacina compradas e o valor que essa operação envolve geralmente são muito elevados.
Dessa forma, no presente trabalho o resultado da análise de qPCR de cada diluição da vacina demonstrou (Figura 4) uma relação inversamente proporcional entre o CT e a concentração da vacina, o que já foi demonstrado anteriormente por Stowers et al. (2010) e comprova que o parâmetro de CT pode, devido à sua linearidade, ser utilizado como ferramenta para quantificação de material genético em uma amostra. Yamaguchi et al. (2000) também realizou uma quantificação de material genético, porém, através de PCR competitiva, tendo também encontrado valores que validam a utilização de técnicas de biologia molecular como ferramenta para quantificação viral.
Segundo os resultados obtidos, percebemos que houve um aumento médio de três pontos de CT para cada log de concentração menor da vacina, o que era esperado, uma vez que não houve multiplicação do vírus após a hidratação e a concentração do material genético vai diminuindo conforme a vacina é diluída.
O início da soroconversão ocorreu entre o 7º e o 14º dia pós-vacinação, bem próximo do tempo de 10 dias encontrado por Van Santen et al. (2004) e 7 dias relatado por Hussein et al. (2002), porém a diferenciação estatística entre os grupos ocorreu apenas no 21º dia pós vacinação, onde o grupo vacinado com a dose recomendada pelo fabricante apresentou
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uma produção de anticorpos maior do que as demais, porém não muito distante dos grupos que receberam as diluições 10-1, 10-2 e 10-3. Já o grupo vacinado com a diluição 10-4 teve uma soroconversão estatisticamente menor do que os primeiros quatro grupos e semelhante ao grupo controle que não recebeu a vacina, sendo o único grupo vacinado a ficar no grupo 0 no histograma do ELISA, demonstrando que uma dose de vacina nessa concentração é ineficaz para a imunização das aves, apesar de ter conseguido desafiar o sistema imune dos animais.
Os títulos só se equalizaram no 35º dia pós-vacinação, que corresponde ao 14º dia pós-desafio, mostrando que os animais foram infectados com a cepa não atenuada e soroconverteram nos mesmos 14 dias como ocorreu com a vacinação. Entretanto, os níveis do hematócrito apresentaram-se próximos aos valores de referência para a espécie animal que são de 30,6 - 55% (Bounous & Stedman, 2000; Cardoso & Tessari, 2003) e acima do padrão de animais doentes (Yuasa et al., 1979; Hussein et al., 2002; Wani et al., 2015). As médias dos valores dos grupos ficaram entre 28,6% e 38,6% e nenhum grupo ou ave apresentou um decréscimo muito acentuado ou um valor muito baixo do padrão de hematócrito, como encontrado por Lucio et al. (1990) ou Tongkamsai et al. (2019) que pudesse ser caracterizado como anemia, confirmando o que foi relatado por Yuasa et al. (1979) de que animais adultos, com mais de 3 semanas de idade, podem se infectar, porém não apresentam sinais clínicos ou lesões e contrapondo Wani et al. (2015) que encontrou em seus estudos uma diminuição do hematócrito e Smyth et al. (2006) que identificou lesões no timo mesmo em animais desafiados com 6 semanas de idade.
Conforme McNulty et al. (1990) e Tongkamsai et al. (2019) previamente sugeriram, o grau de doença causado pelo CAV está diretamente relacionado à dose infectante, assim, a diferença mencionada logo acima pode ser explicada pelo volume e concentração maiores de antígeno utilizados por Smyth et al. (2006) para o desafio dos animais, uma vez que neste trabalho foram utilizados 500µL contendo 104.5 DICT
50, enquanto no presente estudo foram utilizados 500µL com 103,75DICT
50.
O teste de eficiência da vacina baseou-se em dois cenários distintos, tendo como referência o trabalho de Malo & Weingarten (1995) aonde os autores separam os títulos encontrados na sorologia para CAV em 5 grupos (0 a 4), conforme Tabela 5. O objetivo era inferir em quanto a variação do CT da vacina interfere na migração dos animais entre esses grupos e qual seria um CT ideal.
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No primeiro cenário avaliou-se a hipótese de termos animais apenas nos grupos 3 e 4, o que garantiria que as aves estariam protegidas e repassando os anticorpos para a progênie. No segundo cenário, considerou-se apenas ter animais fora do grupo 0, ou seja, animais com títulos moderados ou altos, que segundo Malo e Weingarten (1995), poderíamos considerar que, caso contaminados, não iriam eliminar o vírus pelas fezes, descartando o risco de transmissão vertical.
Ainda se levou em conta mais duas variáveis, aonde teríamos 90 ou 80% dos animais imunizados. Visto que o vírus da anemia tem uma distribuição horizontal rápida e está bastante difundido nos plantéis, uma cobertura de 80% dos animais pode ser considerada eficaz e suficiente para a imunização do lote.
A análise estatística revelou que para cada aumento de 1 unidade no CT ocorre redução de 26% na probabilidade de ocorrência de aves nos grupos vacinais 3 e 4 e de 24% na ocorrência de aves nos grupos vacinais 1 a 4. Um número expressivo que mostra a importância que a titulação de vírus na vacina tem perante a resposta imune dos animais e que o CT, por ser obtido a partir de uma técnica facilmente executada, com alta reprodutibilidade torna-se um parâmetro com a robustez necessária podendo ser utilizado na avaliação da eficácia da vacina.
Pensando em um número ideal, que possa servir de parâmetro para a aprovação ou reprovação de uma vacina, chegou-se aos valores de CT de 25,96 e 28,87 para que respectivamente 90% e 80% dos animais não estejam no grupo 0 e 16,63 e 19,29 para que as aves estejam nos grupos 3 e 4.
Esses números são validados estatisticamente e podem ser utilizados como parâmetro. É importante ressaltar, porém, o baixo número de animais avaliados no presente estudo. Tal deveu-se ao fato de que optamos por manter os animais em isoladores com ambiente controlado, para evitar que se contaminassem de forma natural ou que estivessem expostos a qualquer outro tipo de interferência, para que tivéssemos um intervalo de confiança de 95%. Ainda assim, embora o baixo número de aves amostradas, o presente trabalho trata-se de uma avaliação essencial para ser utilizada como base em futuras análises, uma vez que, através do presente estudo foi possível a validação da metodologia de trabalho e de análise que serão utilizados futuramente sob condições de campo que ampliarão os resultados ora obtidos dando maior precisão e confiabilidade aos resultados obtidos no presente trabalho.
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3.5 Conclusão
Os dados desse trabalho demonstraram que é possível e viável utilizar-se da PCR em tempo real para realizar a titulação de vacina viva de Anemia Infecciosa das Galinhas e que existe, estatisticamente, uma correlação positiva entre o CT encontrado na vacina e o título de anticorpos no soro das aves.
Levando-se em conta vacinas via oral compostas pela cepa Cux-1, o CT ideal para proteger 80% das aves vacinadas é de 19,29 (12,12 – 26,46) e o aumento de 1 unidade no CT diminui em 26% a probabilidade de termos aves nos grupos 3 e 4 e 24% de termos aves nos grupos 1 a 4.
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Através da execução do presente trabalho foi possível realizar a titulação de vacinas comerciais para o CAV além de sugerir a existência de uma correlação entre o valor obtido na técnica de qPCR (CT) e o nível de anticorpos detectados pela técnica de ELISA em aves previamente imunizadas.
A presença de DNA inviável dentro da vacina foi uma preocupação recorrente durante todo o trabalho e várias tentativas de eliminá-los foram aplicadas, porém sem sucesso. Tentou-se tratar previamente a vacina com dnase para eliminar o material genético que estivesse exposto no meio, ou seja, fora do vírus, além disso, foi tentado tratamento térmico aliado à enzima. Outra tentativa utilizada foi a passagem das amostras em ovos embrionados com leitura de vários tempos pós inoculação. Apesar desses esforços, nenhuma técnica foi eficiente e os resultados de qPCR permaneceram inalterados após os mesmos, quando comparadas as amostras antes e pós tratamento, por isso foi decidido assumir essa variável no processo e tratá-la como comum para todas as amostras, deixando com que os resultados dos testes de imunização in vivo revelassem se esse fator seria determinante ou não.
A comparação simples entre o CT da qPCR e a titulação da vacina por método convencional, que traria muito mais confiabilidade ao trabalho, também foi uma possibilidade levantada durante a execução, porém a dificuldade em realizar a técnica de titulação fez com que a ideia fosse descartada. Várias tentativas de realizar o cultivo das células MSB1 e a titulação, tanto da vacina, quanto de alguns vírus de campo, foram conduzidas com o auxílio de profissionais altamente capacitados da Embrapa, porém as mesmas não foram bem-sucedidas.
Além disso, esse trabalho trata-se um uma avaliação inicial, um experimento altamente controlado que servirá de base para próximos estudos realizados à campo, abrangendo um número de animais maior onde espera-se obter uma avaliação mais robusta dos resultados ora encontrados.
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