INSTITUTO DE BIOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA PARASITOLOGIA VETERINÁRIA
C L A U D I A M A R I A L E A L B E V I L A Q U A
UNIVERSIDADE F E D E R A L RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE BIOLOGIA
C U R S O DE P Ó S - G R A D U A Ç Ã O EM M E D I C I N A V E T E R I N Á R I A P A R A S I T O L O G I A - V E T E R I N Á R I A
ESTUDO M O R F O L Ó G I C O E B I O M É T R I C O DAS LARVAS INFECTANTES DOS NEMATÓIDES (NEMATODA: STRONGYLIDAE)
INTESTINAIS DE E Q U I N O S
C L A U D I A M A R I A LEAL BEVILAQUA
SOB A ORIENTAÇÃO DA PROFESSORA: M A R I A DE LURDES DE A. RODRIGUES
Tese submetida como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Medicina ria - Parasitologia
Veteriná-ria
ITAGUAÍ, RIO DE JANEIRO D E Z E M B R O , 1988
ESTUDO MORFOLÓGICO E BIOMÉTRICO DAS LARVAS INFECTANTES DOS NEMATÓIDES (NEMATODA: STRONGYLIDAE)
INTESTINAIS DE EQÜINOS
AUTOR
CLAUDIA MARIA LEAL BEVILAQUA
i v..
A meus pais, Thiago e Carminho, que me ensinaram o caminho. A meu marido, Jerôme, que me
a-companha e a nossa filha Flo-ra que conosco aprende a
ca-m i n h a r .
"You see things as they are but I dream things that never were"
A G R A D E C I M E N T O S
Agradecemos a todos que, direta ou indiretamente, con-tribuíram para o desenvolvimento e conclusão deste trabalho, principalmente:
a Dra. MARIA DE LURDES DE A. RODRIGUES, professora ad-junta do Curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária, orien-tadora dessa tese, pelo incansável apoio, estímulo e amizade;
ao Dr. NICOLAU MAUÉS DA SERRA FREIRE, Coordenador do Curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária, pelo apoio cien-tífico e inestimáveis conselhos;
ao Dr. PEDRO PAULO DE OLIVEIRA, professor assistente do Instituto de Tecnologia de Alimentos, pela elaboração de meios de cultura;
a Dra. ANA MARGARIDA DE REZENDE, professora adjunta do Curso de Parasitologia e ao Dr. MARINUS ADRIANUS SLEUTJES, professor adjunto n o I n s t i t u t o de Zootecnia pela tradução de textos;
s e u s ensinamentos na área de imunoparasitologia;
ao Dr. MICHAEL R. HONER, pesquisador da EMBRAPA CNPGC por seus e n s i n a m e n t o s e iniciação na parasitologia;
ao Dr. AUGUSTO WILWERTH DA CUNHA, pelo material cole-tado e gentilmente cedido;
aos bolsistas do CNPq NILBEA REGINA SILVA e MARCELO SCHETTINI, aos estagiários GÓRDIO CAVALCANTE MARINHO e LUCIANO ANTUNES BARROS pelo apoio nas necropsias e colheita de mate-rial;
aos funcionários do Curso de Pós-graduação, especial-mente GILMAR MONTEIRO, WILSON MENDES, RAMINHO, IVAN e LEY.
ao Sr. GILMAR VITA pelo trabalho de datilografia. ao Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro através da aprovação do projeto "Estudo morfológico e biométrico das larvas de 1º e 3º estádios, de nematóides intestinais de equídeos, do Esta-do Esta-do Rio de Janeiro" (proc. nº 000402267/86).
a Policia Militar do Estado do Rio de Janeiro pela doação dos animais u t i l i z a d o s no presente trabalho.
ao Dr. DARCI DE CRIGNIS, diretor da ELEBRA SISTEMA pe-la utilização dos c o m p u t a d o r e s na c o n f e c ç ã o dos gráficos;
ao Dr. LUIS EDUARDO DE PAULA MACHADO, da Boavista- I-tatiaia pelo apoio técnico.
BIOGRAFIA
Claudia Maria Leal Bevilaqua, filha de Thiago Christia- no Bevilaqua e Maria do Carmo Leal Bevilaqua, nascida na cidade do Rio de Janeiro, cursou a P o n t i f í c i a U n i v e r s i d a d e C a t ó l i c a do Rio de Janeiro onde, em 1971, licenciou-se p r o f e s s o r a de Filo- sofia.
Foi professora colaboradora na Universidade Federal Ru-r a l do Rio de JaneiRu-ro, na cadeiRu-ra de Estudos de P Ru-r o b l e m a s BRu-rasi- leiros no ano de 1978.
Graduou-se M é d i c a V e t e r i n á r i a na U n i v e r s i d a d e Federal Rural do Rio de Janeiro em 1982. Foi b o l s i s t a do Conselho Nacio- nal de D e s e n v o l v i m e n t o C i e n t í f i c o (CNPq), na m o d a l i d a d e de Ini- ciação Científica, de 1980 a 1982, tendo publicado trabalho cien-tífico como r e s u l t a d o desse estágio.
Iniciou o curso de P ó s - G r a d u a ç ã o em M e d i c i n a V e t e r i n á - ria em 1983, sendo b o l s i s t a do Conselho N a c i o n a l de D e s e n v o l v i - mento Científico e T e c n o l ó g i c o (CNPq).
P á g s 1 3 1 5 15 15 15 16 16 16 17 1 8 1 9 20 20 1. INTRODUÇÃO 2. REVISÃO DE L I T E R A T U R A 3. M A T E R I A L E M É T O D O S 3.1. M a t e r i a l 3.1.1. L o c a l 3.1.2. A n i m a i s 3 2. M é t o d o s 3.2.1. C u l t u r a s m i s t a s
3.2.2. Culturas puras em meio líquido com
bacté-r i a s f e c a i s
3.2.3. Culturas puras em fezes de coelho
3.2.4. Estudo biométrico
3 . 2 . 5 . I m o b i l i z a ç ã o d a s l a r v a s
3 . 2 . 6 . F o t o g r a f i a s
4. RESULTADOS E D I S C U S S Ã O
X
Págs
26 37 75 76 4.2. C h a v e p a r a i d e n t i f i c a ç ã o d a s l a r v a s i n f e c t a n t e s d o s n e m a t ó i d e s i n t e s t i n a i s d e e q ü í d e o s 4 3 A n á l i s e d o s d a d o s b i o m é t r i c o s • •5. CONCLUSÕES
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS7 38 39 41 T A B E L A 1. D a d o s b i o m é t r i c o s das l a r v a s i n f e c t a n t e s de di- f e r e n t e s e s p é c i e s de C i a t o s t o m í n e o s , desenvolvi- das em c u l t u r a p u r a por L U C K E R T A B E L A 2. M é d i a e d e s v i o p a d r ã o das l a r v a s i n f e c t a n t e s de
S. vulgaris, S. edentatus, T. tenuicollis
e m cul- tura p u r a p a r a o p r e s e n t e t r a b a l h oT A B E L A 3. C o m p a r a ç ã o e n t r e os d a d o s b i o m é t r i c o s das lar- v a s i n f e c t a n t e s de
S. vulgaris,
o b t i d o s p o r d i - ferentes autores em diferentes meios de culturaT A B E L A 4. C o m p a r a ç ã o e n t r e os d a d o s b i o m é t r i c o s das lar- vas i n f e c t a n t e s de
S. edentatus
o b t i d o s p o r d i - ferentes autores em diferentes meios de culturaxii
T A B E L A 5. C o m p a r a ç ã o e n t r e os d a d o s b i o m é t r i c o s das lar- vas i n f e c t a n t e s de S. e q u i n u s o b t i d o s p o r di- ferentes autores em diferentes meios de cultura
T A B E L A 6. D a d o s b i o m é t r i c o s das l a r v a s i n f e c t a n t e s de T.
tenuicollis e Triodontophorus spp. desenvolvi-dos e m d i f e r e n t e s m e i o s de c u l t u r a
T A B E L A 7. M é d i a e d e s v i o p a d r ã o de l a r v a s i n f e c t a n t e s ob- tidas em cultura mista para o presente trabalho
T A B E L A 8. M é d i a o b t i d a p a r a dez l a r v a s i n f e c t a n t e s , d e - senvolvidas em culturas mista e pura, para o p r e s e n t e t r a b a l h o
Págs
42 46 48 493 0 3 1 3 2 - 3 3 3 4 - 3 5
P á g s
F I G U R A 1. L a r v a s i n f e c t a n t e s e d e t a l h e do i n t e s t i n o dePoteriostomum spp. (625X e 1875X
respectiva-m e n t e ) ; C i a t o s t o respectiva-m í n e o s (625 e 1 8 7 5 X respecti- vamente) e G. capitatus (desenho e 1875X res-p e c t i v a m e n t e ) F I G U R A 2. D e t a l h e s da L3 d eS. edentatus:
c a u d a da bai- nha (625X) e c a u d a da l a r v a (1875X);S. vul-
g a r i s , S. e d e n t a t u s e S. equinus:
c a u d a d a l a r v a F I G U R A 3 e 4. L a r v a s i n f e c t a n t e s e d e t a l h e s do i n t e s t i n o de Ciatostomíneos não identificados nos au-m e n t o s de 6 2 5 X e 1 8 7 5 X r e s p e c t i v a au-m e n t eFIGURA 5 e 6. Larvas infectantes de S. vulgaris, S.
edenta-tus, S. equinus
e
Triodontophorus
spp., au-m e n t a d a s 625X e 1 8 7 5 X r e s p e c t i v a au-m e n t exiv
P á g s
5 1 - 5 2 5 3 - 5 4 5 5 - 5 6 5 7 - 5 8 5 9 - 6 0 FIGURA 7 e 8. Distribuição da frequência das medidas decomprimento t o t a l de
S. vulgaris, S. equi-
"nus, S. edentatus, Triodontophorus spp.,
Poteriostomum s p p . e C y a t h o s t o m i n a e
FIGURA 9 e 10. Distribuição da frequência das medidas de comprimento da cauda da bainha de S.
vul-garis, S. equinus, S. edentatus,
Triodon-tophorus spp., Poteriostomum spp. e Cya-thostominae
FIGURA 11 e 12. Distribuíção da frequência das medidas de comprimento do esôfago de
S. vulgaris, S.
equinus, S . e d e n t a t u s ,
Triodontophotus
spp., Poteriostomum spp. e Cyathostomi-naeFIGURA 13 e 14. Distribuição da frequência das medidas de distância do primórdio genital à ponta da cauda da bainha de
S. vulgaris, S.
equi-
nus, S. edentatus, Triodontophorus spp.,
Poteriostomum spp. e Cyathostominae
FIGURA 15 e 16. Distribuição da frequência das medidas de comprimento do intestino de
S. vulgaris,
S. equinus, S. edentatus, Triodontophorus spp.,
Poteriostomum
spp. e CyathostominaeP á g s
61-62
63 a 68
69 a 74 FIGURA 17 e 18. D i s t r i b u i ç ã o da frequência das m e d i d a s
de largura de S. vulgaris, S. equinus,
S. edentatus, Triodontophorus spp.,Poteriostomum spp. e Cyathostominae
FIGURA 19 a 24. C o m p a r a ç ã o e n t r e média, amplitude e des- vio padrão das medidas de comprimento total, comprimento da cauda da bainha, c o m p r i m e n t o do esôfago, c o m p r i m e n t o do intestino, distância do primórdio geni-tal à ponta da cauda da bainha e largu-
ra, respectivamente, de S. vulgaris,
S. edentatus, S. equinus,Ciatostomí-neos, Poteriostomum spp. e
Triodonto-phorus
spp., em cultura m i s t aFIGURA 25 a 30. C o m p a r a ç ã o entre média, amplitude e desvio p a d r ã o das medidas de comprime n- to total de S. edentatus, Triodontopho-rus spp., T. tenuicollis e S. vulgaris em cultura mista e cultura pura respec-tivamente
R E S U M O
Estudos morfológicos e biométricos foram realizados pa-ra aprimopa-rar o d i a g n ó s t i c o d i f e r e n c i a l das larvas infectantes de Strongylus vulgaris, Strongylus edentatus, Strongylus equi-nus, Triodontophorus spp., Triodontophorus tenuicollis, Gyaloce-phalus Capitatus, Poteriostomum spp., Cylicocyclus radiatus, Cy-licocyclus nassatus, CyCy-licocyclus ashworthi, Cylicostephanus mi-nutus e Cylicostephanus poculatus.
Culturas puras foram r e a l i z a d a s a partir de ovos reti- rados do útero de fêmeas de helmintos obtidos do intestino gros-so de equinos por ocasião de seis necropsias. Culturas mistas foram efetuadas com fezes de equinos coletadas em três m u n i c í -
pios do Estado do Rio de Janeiro.
As seguintes características das larvas de terceiro es-t á d i o foram medidas: c o m p r i m e n es-t o es-toes-tal, comprimenes-to da cauda da
bainha, c o m p r i m e n t o do esôfago, c o m p r i m e n t o do intestino, dis- tância do primórdio genital à ponta da cauda da bainha e largu-ra.
Os dados obtidos foram comparados aos de outros auto-res. Chave para identificação das larvas infectantes é apresen-tada. Fotomicrografias das principais características morfoló-gicas e análise estatística gráfica são fornecidas.
SUMMARY
Morphological and biometrical studies were carried out to improve the differential diagnostic of infective larvae of Strongylus vulgaris, Strongylus equinus, Strongylus edentatus, Triodontophorus spp., Triodontophorus tenuicollis, Poteriostomum spp., Gyalocephalus capitatus, Cylicocyclus radiatus, Cylicocyclus nassatus, Cylicocyclus ashworthi, Cylicostephanus minutus e Cylicostephanus poculatus.
Pure cultures of larvae were obtained from eggs collected from adult female worms during necropsy of six naturally infected horses. Mixed cultures were obtained from feces of naturally infected horses from three counties of the State of Rio de Janeiro.
The following measurements as total length, sheath tail length, esophageal and intestinal length, distance of genital primordium to the tip of the tail and width were considered as the main measurements in the identification of the third stage larvae.
A pictorial key for identifing infective larvae well as photomicrographies of the morphological characteristics were given in this work.
1. INTRODUÇÃO
Os n e m a t ó i d e s da família S t r o n g y l i d a e p a r a s i t o s do ce- co e colo dos equinos são comumente referidos como e s t r o n g i l o s e pequenos estrongilídeos. No que se refere à patogenia os auto-res são unânimes ao afirmar que os p r i n c i p a i s danos são causa- dos pelos estádios larvares e suas e x t e n s i v a s m i g r a ç õ e s tissu- lares. Assim
Strongylus vulgaris, o
mais estudado, está associa-do a trombose e lesões nas p a r e d e s das artérias e s p e c i a l m e n t e a artéria mesentérica cranial, enquantoStrongylus equinus e
Strongylus edentatus durante sua fase migratória induzem a for-mação de nódulos na serosa do intestino grosso e invadem o fíga-do, podendo alcançar rins ou outros órgãos antes de voltar ao intestino. Os ciatostomíneos são considerados menos patogênicos pois seus estádios larvares restringem-se a invasão da mucosaintestinal. Grandes diferenças são observadas na patogenia, o que exige um perfeito d i a g n ó s t i c o dos parasitos.
As poucas informações d i s p o n í v e i s a t u a l m e n t e sobre pa- togenia, ciclo b i o l ó g i c o e controle dos p a r a s i t o s i n t e s t i n a i s
de equinos decorrem das dificuldades de diagnóstico preciso, tan-to das larvas como dos adultan-tos, principalmente das espécies da sub-família Cyathostominae.
Como técnica de diagnóstico, a obtenção das larvas in-fectantes através da larvacultura é a única capaz de diferenciar o p a r a s i t i s m o a nível de espécie.
O estudo morfológico apresentando fotomicrografias e e-laboração de chave para identificação das larvas de terceiro es-tádio, juntamente com os dados biométricos tem como objetivo a-primorar, facilitar o diagnóstico e fornecer informações necessá-rias às áreas de patogenia, controle e tratamento dessas infec-ções por nematóides em equinos.
2. R E V I S Ã O D E L I T E R A T U R A
ORTLEPP (1925) estudou o desenvolvimento de ovo à lar-va de quarto estádio (L4) de Triodontophorus tenuicollis Bou-langer, 1916, utilizando cultura pura a partir dos ovos reti-rados do útero de fêmeas, previamente identificadas. Como meio de cultura usou fezes de cavalo, tratadas por aquecimento a 65°C por meia hora e adicionadas de carvão. As culturas foram manti-das em temperatura de 26°C e, nessas condições, obteve as lar-vas de terceiro estádio (L3) ao final do quarto dia. Quando o carvão não foi adicionado poucas larvas alcançaram o terceiro e s t á d i o e essas a p e n a s no final do o i t a v o dia. O a u t o r r e l a -cionou os seguintes dados biométricos sem referir o número de espécimens medidos: comprimento da larva (excluindo a bainha) de 0,50 mm a 0,53 mm sendo a média de 0,52 mm; largura de 0,24 mm; c o m p r i m e n t o do e s ô f a g o de 0,117 mm.
HUEBER (1926) mediu os ovos de Strongylus equinus Mue-ller, 1780 (= Sclerostoma quadridentatus Sticker, 1901), Stron-gylus vulgaris (Looss, 1900) Railliet & Henry,1909 (=
Scleros-toma bidentatum Sticker, 1901), Strongylus edentatus (Looss, 1900) Railliet & Henry, 1909 (= Sclerostoma edentatum Looss, 1900), Cyathostomum tetracanthum (Mehlis, 1831) Molin, 1861 in part, Looss, 1900 (= Sclerostoma tetracanthum (Mehlis, 1831) Diesing, 1851 in part), Cylicocyclus nassatus (Looss, 1900) Chaves, 1930 (= Cylicostomum nassatum ( Looss, 1900) Gedoelst, 1903), Cylicocyclus brevicapsulatus (Ihle, 1920) Ershov, 1939 (= Cylicostomum brevicapsulatum (Ihle, 1920) Cram, 1924), Cya-thostomum catinatam (Looss, 1900) Gedoelst , 1903 e Gyaloce-phalus capitatus Looss, 1900. Em fezes esterilizadas foram feitas culturas puras de S. vulgaris, S. edentatus e C. te-tracanthum.
McCOY (1929a eb, 1930) cultivou, de ovo à larva infec-tante, o nematóide Ancylostoma caninum (Ercolani, 1859) Hall, 1913, em agar inoculado com bactérias fecais existentes nas fezes do seu hospedeiro. Observou que os ovos colocados em agar sem bactérias liberaram larvas que sobreviviam, mas não evoluiam. O autor, relatou também, que nem todas as bactérias são adequadas à nutrição de larvas de primeiro e segundo está-dio (L1 e L2) de A. caninum, pois, o meio inoculado com Ba-cillus cereus, BaBa-cillus megatherium, BaBa-cillus pyocyaneus e Sarcina lactea, induzia o desenvolvimento lento das larvas ou não ocorria desenvolvimento. Outra observação foi a de que os nematóides não cresciam quando as bactérias eram mortas pelo calor e, somente um número insignificante, atingia L3 quando cultivadas em fezes esterelizadas.
5.
LAPAGE (1933) obteve larvas infectantes de nematóides de ovinos dos gêneros Trichostrongylus Looss, 1905, Ostertagia Ransom, 1907 e Chabertia Railliet & Henry, 1909, e de Graphi-dium strigosum (Dujardin, 1845) Railliet & Henry, 1909 e Tri-chostrongylus retortaeformis (Zeder, 1800) Railliet & Henry, 1909 parasitos de coelhos
com
uma cepa de Bacillus coli recupe-rada do intestino de algumas larvas filariformes. Em função des-ses resultados, o autor sugeriu que esdes-ses estádios normalmente alimentam-se de microrganismos do grupo coli, senão, do próprioB. c o l i .
LUCKER (1934) fez culturas axênicas de Poteriostomum ratzii Kotlan, 1919 e descreveu detalhadamente os estádios de ovo, L1, L2 e L3. O meio para O desenvolvimento foi água de torneira adicionada de extrato líquido fecal helmintologicamen-te estéril. As culturas foram mantidas à helmintologicamen-temperatura ambienhelmintologicamen-te (20° a 26°C). Nessas condições, foi necessário no mínimo cinco dias para o desenvolvimento de ovo à larva infectante. As mé-dias das medidas feitas em dez especimens estão apresentadas na Tabela 1. A larva de 3º estádio de P. ratzii foi descrita como fusiforme, cauda curta, com repentina constrição próxima à parte distal esôfago estrongiliforme; intestino com 16 célu-las, sendo que os limites destas são bastantes definidos; pri-mórdio-genital em posição ventral a 4ª e 5ª células.
LUCKER (1935) fez culturas axênicas para obtenção de larvas de 3º estádio de Cylicocyclus ultrajectinus (Ihle, 1920) Cram, 1924, em água contendo extrato fecal líquido
helmintolo-gicamente estéril. Nesse meio as larvas não perdiam a bainha após a 1ª ecdise e a larva infectante estava envolvida por duas bainhas. A não liberação da bainha de L1 foi atribuída ao meio de cultura liquido. Aproximadamente cinco dias após o início das culturas a 2ª ecdise estava completa em quase todas as larvas. As L3 de C. ultrajectinus mediam de 387 um a 565 um sendo que apenas dez especimens foram medidos. As larvas infectantes foram descritas como possuindo cauda cur-ta e arredondada na poncur-ta; tendo o intestino oito células. De acordo com desenho do autor as oito células intestinais estão distribuídas em duas fileiras. As médias obtidas estão a p r e s e n t a d a s na T a b e l a 1.
LUCKER (1936) fez estudo comparativo da morfologia e desenvolvimento das larvas infectantes de Cylicostephanus goldi Boulanger, 1917 (= Cylicocercus goldi (Boulanger, 1917) Cram, 1924), C. catinatum e G. capitatus. A larva L3 de C. catinatum foi descrita como tendo estrutura praticamente i-dêntica à larva infectante de C. goldi. O intestino com oito células e a cauda que diminui abruptamente terminando em ex-tremidade arredondada como um dedo. Os valores médios de bio-m e t r i a e s t ã o r e u n i d o s na T a b e l a 1.
Comparando as medidas obtidas, LUCKER (1936) con-cluiu que: embora as médias das medidas das L3 de C. catina-tum sejam menores e mais estreitas que as de C. goldi estas relações entre as duas espécies se superpõem e, assim sendo, não têm valor diferencial. O mesmo aconteceu quando comparou
T A B E L A 1. Dados biométricos das larvas infectantes de diferentes espécies de Ciatostomíneos, desen- volvidas em cultura pura por LUCKER.
essas duas espécies com C. ultrajectinus todas apresentando oi-to células intestinais. A diferença marcante entre as larvas de C. goldi e C. ultrajectinus estava na razão entre comprimen-to da larva e comprimencomprimen-to da cauda da bainha. Sendo aquela ra-zão de 1,5:1 a 1,8:1 para a larva L3 de C. goldi e de 2:1 a 2,7:1 para a larva L3 de C. ultrajectinus. A mesma razão para as larvas L3 de C. catinatum s e n d o de 1,6:1 a 2:1.
O autor descreveu pequenos detalhes morfológicos no vestíbulo das larvas L3 das três espécies em questão e rejei-tou a possibilidade de que esta diferença fosse causada por contração muscular durante fixação da larva. As larvas de G. capitatus t a m b é m r e t i v e r a m a c u t í c u l a de L1.
LUCKER (1938) desenvolveu em culturas axênicas, de ovo à L3, Cyathostomum pateratum (Yorke & Macfie, 1919) K'ung, 1964 (= Cylicocercus pateratus (Yorke & Macfie, 1919) Cram, 1924, Cylicocyclus insigne (Boulanger, 1917) Chaves, 1930 e Cylico-dontophorus bicoronatus ( Looss, 1900) Cram, 1924. Dessas cul-turas retirou material para estudar a biometria das larvas des-sas espécies, sobre dez larvas e comparou-as com a morfometria de outras larvas de estrongilídeos de cavalo. O autor concluiu que, baseando-se nas relações biométricas, as três espécies são indistintas. Ainda LUCKER (1938) constatou que as larvas infec-tantes de C. pateratum e C. insigne também não se diferencia-vam quanto a morfologia. As L3 de C. bicoronatus eram diferen-tes das larvas das outras duas espécies quanto a disposição das células do intestino. Em C. bicoronatus as células formavam
9.
duas fileiras de quatro células cada, sendo uma fileira dorsal e a outra ventral ao lume do intestino. Nas larvas de C. pate-ratum e C. insigne as cinco células posteriores estavam inva-riavelmente dispostas uma atrás da outra, numa única fileira de c é l u l a s .
Reestudando as L3 de C. ultrajectinus, C. goldi e C. catinatum LUCKER (1938) concluiu que as larvas, quanto a morfo-logia, se dividiam em dois grupos distintos. O primeiro grupo com as espécies C. bicoronatus e C. ultrajectinus (oito las intestinais distribuídas em duas fileiras de quatro célu-las cada) e o segundo grupo com C. pateratum, C. insigne, C. ca-tinatum e C. goldi (três células em dupla fileira e as cinco últimas dispostas uma atrás da outra, numa única fileira).
Ainda LUCKER (1938) sobre o estudo da morfologia cons-tatou que em Poteriostomum imparidentatum Quiel, 1919 as L3 eram similares às de P. ratzii diferindo somente quanto ao com-primento da cauda da bainha, que em P. imparidentatum tendia a ser maior. Esse autor comparou suas medidas para os estrongi-los e as obtidas por WETZEL (1931) e POLUSZYNSKI (1930). Entre os resultados dos autores havia concordância quanto ao número de células intestinais das larvas infectantes de S. vulgaris, S. equinus e S. edentatus mas discordavam quanto ao tamanho re-lativo das larvas dessas espécies. WETZEL (1931) afirmou que as larvas L3 de S. edentatus eram intermediárias em tamanho en-tre as duas outras espécies, enquanto as medidas obtidas por POLUSZYNSKI (1930) mostravam que as larvas de S. edentatus
e-ram as menores dentre as três espécies. As medidas obtidas por LUCKER (1938) em culturas axênicas das larvas dos Strongylus spp. identificavam-se as do trabalho de POLUSZYNSKI (1930). Os valores médios obtidos para as L3 de C. bicoronatus e C.
insig-ne e s t ã o a p r e s e n t a d o s na T a b e l a 1.
PETROV & GAGARIN (1937) estudaram a morfologia e bio-metria das L3 de S. vulgaris, S. edentatus, S. equinus, Trio-dontophorus serratus (LOOSS, 1900) LOOSS, 1902, Cylicocyclus radiatus (Looss, 1900) Chaves, 1930 (= Trichonema radiatum Lo-oss, 1900) LeRoux, 1924), C. Pateratum, C. bicoronatus e Cyli-costephanus longibursatus (Yorke & Macfie, 1918) Cram, 1924 (= Trichonema longibursatum (Yorke & Micfie) LeRoux, 1924) man-tidas em culturas puras de agar-agar com líquido fecal esté-ril. Os autores elaboraram chave para identificação e apresen-taram desenhos ilustrativos das L3. As medidas obtidas para o g ê n e r o Strongylus e s t ã o a p r e s e n t a d a s nas T a b e l a s 2, 3 e 4.
GLASER & STOLL (1938) descreveram várias tentativas, sem sucesso, de estudar o desenvolvimento de larvas infectantes de nematóides em culturas livres de bactérias, em fezes esteri-lizadas de ovinos. Os autores somente conseguiram o desenvolvi-mento de todos os estádios pré-parasíticos de Haemonchus con-tortus Rudolphi, 1803 no seguinte meio: agar inoculado com ex-trado de fígado adicionado de pedaços frescos e estéreis de rim de coelho e duas gotas de filtrado de levedura de pão. As larvas infectantes desenvolvidas nessas culturas estéreis eram em média menores do que os especimens típicos desenvolvidos em
11.
fezes. Entretanto essas larvas p r o d u z i r a m adultos normais em o- vinos susceptíveis.
KOPYRIN (1941) estudou a m o r f o l o g i a e biometria dos ovos, LI, L2, L3 dos seguintes nematóides: Dictyocaulus arnfiel-di Cobbold, 1884, Trichostrongylus colubriformis Giles, 1892, G. capitatus, P. imparidentatum, P. ratzii, Craterostomum acudi-caudatum (Kotlan, 1919) Ihle, 1920, Triodontophorus brevicauda
• . ,
Boulanger, 1916, C. nassatus, C. insigne, C. brevicapsulatus, Cylicodontophorus mettami (Leiper, 1913) Foster, 1936 (= Tricho-nema mettami (Leiper, 1913) Cram, 1924), C. catinatum, Cylicos-tephanus hybridus (Kotlan, 1920) Cram, 1924 (= Trichonema
hybri-dum
(Kotlan, 1920) LeRoux, 1924), Cyathostomum calicatum LOOSS, 1900 (= Trichonema calicatum (Looss, 1900) LeRoux, 1924), S.vulgaris, S. equinus, S. edentatus e T. tenuicollis. O autor elaborou um quadro para determinação dos estádios i n f e c t a n - tes. As culturas puras de ovo à L3 foram desenvolvidas em 0,85% de agar-agar aquoso com líquido fecal estéril. As culturas fo- ram mantidas a temperaturas de 25 a 30°C e 18 a 20°C.
HUMMELINCK (1947) cultivou S. edentatus, S. vulgaris e S. equinus de ovo à L3 em extrato fecal líquido e concluiu que as dimensões das larvas do gênero Strongylus podiam ser afeta-das pelas condições de cultivo. O autor usou o mesmo meio de cultivo e d i v e r s a s temperaturas, verificando variação nas medi- das obtidas para as L3. os resultados obtidos por HUMMELINCK (1947) estão a p r e s e n t a d o s nas Tabelas 2, 3 e 4.
LUCKER (1934, 1935, 1936 e 1938), PETROV & GAGARIN (1937) des-creveu suscintamente as L3 dos estrongilos e pequenos estron-gilideos, sendo que da sub-família Cyathostominae só diferen-ciou G. capitatus. RUSSELL (1948) mediu L3 não identificada e descreveu-a como larva grande, muito semeihante a S. vulgaris, em tamanho e forma, mas com 16 células intestinais grandes, b e m d e f i n i d a s e t r i a n g u l a r e s .
SELLA (1956) propos chave para identificação das lar-vas infectantes dos nematóides intestinais de equídeos. As L3 foram obtidas a partir de culturas mistas. O autor apresentou fotomicrografias de S. vulgaris, Trichonema spp., Trichostron-gylus axei (Cobbold, 1879) Railliet & Henry, 1909 e Triodonto-phorus spp. A larva infectante de Trichonema spp. descrita possuia oito células intestinais. Através da fotomicrografia apresentada constatou-se que as duas primeiras células estão em dupla fileira e as seis restantes estão dispostas em uma única f i l e i r a .
OGBOURNE (1971) desenvolveu em culturas puras larvas de 1º e 2º estádio de S. edentatus, S. vulgaris, S. equinus, C. nassatus e T. serratus. Os meios utilizados para a cultura foram: agar-fecal inoculado com bactérias fecais e extrato líquido helmintologicamente estéril. OGBOURNE (1971) discor-dou de PETROV & GAGARIN (1937) e de KOPYRIN (1941) os quais afirmaram que as diferenças estruturais das larvas em seus es-tádios pré-infectantes eram tão pequenas que não permitiam uma diferenciação específica. OGBOURNE (1971) dividiu as L1 das
13.
larvas por ele estudadas em dois grupos m o r f o l o g i c a m e n t e distin- tos e concluiu que as espécies do gênero Strongylus podem ser identificadas em culturas mistas. Já as outras espécies estuda-das, T. serratus, C. nassatus e C. catinatum considerou como sendo similares entre si.
VILAS (1973) idealizou chave para i d e n t i f i c a ç ã o das larvas de terceiro estádio dos nematóides intestinais comuns dos equídeos. Nessa chave, o gênero Trichonema foi descrito como possuindo n o v e células intestinais.
NURMIO, ROIRANEN, TUPAMÄKI (1973) e s t u d a n d o a microflo- ra fecal de cavalos com funções d i g e s t i v a s normais e n c o n t r o u os seguintes microrganismos: colibactérias, streptococos, lactoba- cilos, clostrideos, fungos e leveduras.
M c C R A W & S L O C O M B E (1974, 1985) o b t i v e r a m grandes quan- tidades de larvas infectantes de S. edentatus e S. equinus em culturas puras usando fezes esterilizadas de ovinos, umedecidas e adicionadas d e solução salina 0,85%. As larvas infectantes fo- ram inoculadas em equinos para o e s t u d o de seu d e s e n v o l v i m e n t o e efeitos patológicos,
RUPASINGHE & OGBOURNE (1978) d e s e n v o l v e r a m culturas pu- ras com S. vulgaris, S. edentatus, S. equinus, C. nassatus, C. longibursatus, C. goldi, C. catinatum e C. pateratum. Os ovos foram inoculados em placas contendo agar nutritivo previamente inoculado com Escherichia coli, fonte de alimento para as lar-vas em desenvolvimento. T a m b é m c u l t i v a r a m os estádios pré-parasí-
fe-zes de coelho livres de helmintos.
GEORGI (1980) apresentou fotomicrografias das larvas infectantes de C. catinatum, Poteriostomum spp., T. serratus, S. edentatus e S. vulgaris.
O
autor mencionou que a larva de T. serratus na fotomicrografia evidenciava apenas 16 células intestinais e no texto afirmou que as espécies de Triodonto-phorus a p r e s e n t a v a m 18 células intestinais.3 . MATERIAL E M É T O D O S
3.1. M A T E R I A L
3.1.1. Local
O trabalho foi realizado na Estação para Pesquisas Pa-rasitológicas W.O. Neitz, EPPWON na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, UFRRJ.
3.1.2. Animais
Seis equinos doados pela Polícia Militar de Estado do Rio de Janeiro foram mantidos em pastagem natural no setor Cam-po da EPPWON/UFRRJ Cam-por um período de 12 meses para Cam-possível a-quisição de infecção natural com helmintos e recuperação
des-ses durante a necrópsia dos hospedeiros.
De equinos de diversas propriedades rurais dos seguin-tes municípios do Estado do Rio de Janeiro: Itaguaí, Paracambi
e N o v a I g u a ç u f o r a m c o l h i d a s a m o s t r a s de fezes p a r a e x a m e m i - c r o s c ó p i c o .
3 . 2 . MÉTODOS
3.2.1. Culturas mistas
As c u l t u r a s m i s t a s p a r a o b t e n ç ã o de larvas i n f e c t a n - tes foram realizadas segundo técnica de ROBERT'S & O'SULLIVAN
(1950).
3.2.2. Culturas puras em meio líquido com bactérias fecais
Da n e c r ó p s i a dos seis e q u i n o s o b t e v e - s e do i n t e s t i n o grosso fêmeas grávidas de nematóides. Essas fêmeas foram disse-cadas i n d i v i d u a l m e n t e em p l a c a s de P e t r i 50 x 2 0 c o m á g u a de torneira, r e t i r a n d o - s e os ovos d o útero. As e x t r e m i d a d e s a n t e - rior e posterior do nematóide eram separadas para identificação do espécimem segundo classificação de LICHTENFELS (1975, 1980) e L A N F R E D I (1984). As p l a c a s c o n t e n d o os ovos f o r a m m a n t i d a s em e s t u f a a a p r o x i m a d a m e n t e 28°C. V i n t e e q u a t r o h o r a s após o iní- cio da i n c u b a ç ã o o b s e r v o u - s e a p r e s e n ç a de larvas de 1º e s t á d i o e c l o d i d a s dos ovos i n c u b a d o s . E s t a era a o c a s i ã o p a r a se i n o c u - lar uma a l í q u o t a da c u l t u r a de b a c t é r i a s fecais. D e c o r r i d o s seis d i a s as larvas já h a v i a m a t i n g i d o o e s t á d i o i n f e c t a n t e sendo m a n t i d a s a t e m p e r a t u r a de 4°C.
17.
Amostras de fezes recém eliminadas, com aproximadamen-te 100 g de fezes de equinos foram umedecidas com água de tor-neira e pressionadas através de gaze de algodão com 20 malhas/ m m com 8 dobras para retirada do líquido fecal. Este foi aque-
cido em banho-maria por dez minutos a 60°C. Um mililitro dessa suspensão foi inoculada em dez m i l i l i t r o s de caldo v e r d e bri- lhante lactose bile a 2% (SPECK, 1976), e incubado por 24 horas a 35°C. Uma alíquota dessa cultura foi repicada em Agar Plate Count (SPECK, 1976) e incubada por 24 horas a 35ºC.
3.2.3. Culturas puras em fezes de coelho
Fezes de coelho negativas para ovos de helmintos pela técnica McMaster (GORDON & WHITLOCK, 1939) foram maceradas e colocadas diretamente sobre os ovos obtidos a partir da disse-cação de fêmeas dos nematóides. As culturas assim produzidas foram mantidas a temperatura ambiente. Oito dias após, as lar-vas foram coletadas segundo técnica de B A E R M A N N (1917).
3.2.4. Estudo biométrico
Com o uso de m i c r o s c ó p i o Leitz SM-Lux equipado com lentes oculares micrométricas foram medidas nas larvas de 3º es-tádio as seguintes características: c o m p r i m e n t o total da larva (incluindo a bainha), comprimento do esôfago, comprimento do
larva na região do bulbo esofageano (incluindo a bainha), dis-tância do primórdio genital à ponta da cauda da bainha, e com-primento da cauda da bainha.
Os seguintes nematóides foram cultivados de ovo à L3 em meio líquido com bactérias fecais: S. edentatus. T. tenui-collis, C. nassatus e C. radiatus. Utilizando-se fezes de coe-lho como meio de cultivo desenvolveram-se culturas axênicas de ovo à L3 dos seguintes nematóides: S. vulgaris, S. edenta-tus, C. ashworthi, C. minutus e C. poculatus.
O
desenvolvimen-to de ovo à L3 em culturas mistas foi conseguido com os se-guintes nematóides: S. vulgaris, S. edentatus, S. equinus, Triodontophorus spp., Poteriostomum spp. e Ciatostomíneos.Cem exemplares de cada espécie foram medidos, com ex-ceção de: S. equinus em que foram mensurados 40 espécimens e C. ashworthi, C. nassatus, C. radiatus, C. poculatus, C. minu-tus dos quais apenas 10 exemplares foram medidos.
3.2.5. Imobilização das larvas
O método escolhido para imobilização das larvas fectantes foi o calor. Uma gota de líquido contendo larvas in-fectantes foi colocada entre lâmina (26 x 76) e lamínula (22 x 40). A lâmina era rapidamente aquecida com chama de isquei-ro apenas para ressecar o líquido não matando as larvas.
19.
3.2.6. Fotografias
As fotomicrografias foram tomadas com auxílio de mi-croscópio ótico Leitz Dialux 20 EB, com filme Fujichrome 35 mm e filtro azul.
4.1. M O R F O L O G I A DAS L A R V A S I N F E C T A N T E S
As larvas infectantes ou de 3º estádio dos nematói-des das sub-famílias Strongylinae e Cyathostominae possuem corpo fusiforme sendo que a parte mais larga está ao nível da região do bulbo esofageano. As larvas estão inteiramente envolvidas pela cutícula do estádio anterior a qual está ín-timamente aderida ao corpo da larva propriamente dita. Essa bainha estreita-se abruptamente após a cauda da larva e ter-mina em longa cauda filamentosa. O trato digestivo inicia-se com formação da boca que é terminal, seguindo-se o esôfago filariforme. O esôfago, ao nível do istmo, está envolvido pe-lo anel nervoso. Segue-se o intestino que se divide em in-testino propriamente dito (células intestinais) e reto, ter-minando no ânus. O primórdio genital, que nas larvas vivas é transparente, está localizado na face ventral da larva va-riando de posição em relação ao comprimento total da larva.
•
2
1
.As principais características para o diagnóstico das larvas infectantes são:
a) S. vulgaris: as maiores larvas encontradas tanto em culturas mistas quanto puras, com comprimento total osci-lando entre 700,0 um e 1050,0 um, com média de 911,9 um; lar-gura variando entre 23,7 um a 39,5 um, com média de 32,8 um; esôfago curto proporcionalmente ao seu comprimento total, is-to é, o esôfago representa 1/6 do comprimenis-to is-total; intesti-no longo, média de 450,9 um com 28 a 32 células retangulares, bem definidas, escuras e em dupla fileira;
b) S.edentatus: larvas pequenas, com comprimento to-tal entre 750,1 um e 824,0 um, com média de 787,1 um; larvas finas com largura entre 19,7 um e 28,5 um, com média de 23,8 um; comprimento do esôfago representando 1/5 do comprimento total da larva; comprimento médio do intestino de 282,2 um, com 18 a 20 células claras e mal definidas no intestino, dispostas em dupla fileira; ponta da cauda da larva romba; e m c u l -turas mistas e puras alguns espécimens apresentam a cauda da bainha bifurcada;
c) S. equinus: larvas longas, com comprimento varian-do entre 770'0 um e 926,0 um, com média de 860,3 um; largura entre 17,5 um e 25,6 um, com média de 21,2 um sendo, portanto bastante finas; esôfago longo ocupando 1/4 do comprimento
to-tal; intestino bastante longo com média de 340,3 um, com 16 cé-lulas intestinais mal definidas, escuras e em dupla fileira; a p r e s e n t a m processo trilobado na ponta da cauda da larva;
d) Triodontophorus spp.: larvas de tamanho médio, com comprimento total entre 778,0 um e 882,0 um e média de 802,2 um; largura variando entre 23,2 um e 38,0 um com média de 28,2 um; esôfago representando 1/5 do comprimento total da larva; comprimento médio do intestino de 286,0 um, com 20 células in-testinais retangulares bem definidas em dupla fileira;
e) Poteriostomum spp.: larvas de tamanho médio, com comprimento total entre 758,0 um e 886,2 um, com média de 796,8 um; esôfago ocupando 1/5 do comprimento total da larva; compri-mento médio do intestino de 264,2 um, possuindo 16 células in-testinais retangulares bem definidas em dupla fileira;
f) G. capitatus: larvas pequenas, com comprimento to-tal médio de 749,3 um; largura média de 26,6 um; esôfago ocu-pando 1/4 do comprimento total da larva; comprimento médio do intestino de 224,4 um constituído por 12 células bem definidas em dupla fileira;
g) C. poculatus, C. nassatus, C. radiatus, C. ashwor-thi e C. minutus: larvas morfologicamente semelhantes que se-rão denominadas Ciatostomíneos típicos pois acredita-se
esta-23.
rem incluídos nesse grupo várias espécies da sub-família Cya-thostominae: larvas pequenas com comprimento total da larva en-tre 683,3 um a 840,0 um e média de 760,5 um; largura variando ntre 18,6 um e 36,1 um, e média de 26,8 um; esôfago longo ocu-pando 1/4 do comprimento total da larva; comprimento médio do intestino de 218,2 um, com oito células intestinais bem defini-das sendo as duas primeiras em dupla fileira e as seis restan-tes em fila única.
POLUSZYNSKI (1930), PETROV & GAGARIN (1937) e HUMME-LINCK (1947) concordam quanto à morfologia geral das L3 dos Strongylus spp., embora PETROV & GAGARIN (1937) apresentem de-senhos das L3 de S. equinus e S. vulgaris que não concordam com as medidas obtidas pelos próprios autores, ou seja, a larva di-ta como S. equinus é ligeiramente maior, mais larga e com esô-fago mais curto do que a apresentada como S. vulgaris. A mesma inversão de desenhos ou legenda ocorre no trabalho de KOPYRIN
(1941).
As L3 de G. capitatus são descritas por LUCKER (1936) como possuindo pequeno processo bulboso na ponta da causa da larva. Essa estrutura não foi observada no presente trabalho e na figura 1 observa-se a ponta da cauda da larva de G. capita-tus t e r m i n a n d o em p o n t a aguda.
A ponta da cauda trilobada da larva de S. equinus foi descrita pela primeira vez por WETZEL (1931) e é apresentada na figura 2. Essa particularidade pode ser observada ao
micros-dorsal ou ventral da larva poderá ou não estar bastante visível. A ponta da cauda da larva de S. edentatus é bastante característica e foi descrita por POLUSZYNSKI (1930) como arre-dondada. Este detalhe está apresentado na figura 2 e pode ser observado ao microscópio com um aumento de i00 vezes. VILAS
(1973) discorda desse caráter e descreve a ponta da cauda de S. edentatus c o m o p o n t i a g u d a .
A cauda da bainha bifurcada das L3 de S. edentatus fo-ram mais frequentes em culturas puras. HUMMELINCK (1947) foi o único autor a descrever este detalhe pouco frequente em co-p r o c u l t u r a s (Fig. 2).
No presente estudo observou-se 20 células intestinais em Triodontophorus spp. como em T. tenuicollis, o que concor-da com os trabalhos de ORTLEPP (1925), SELLA (1956), PETROV & GAGARIN (1937) e KOPYRIN (1941) e do qual discorda GEORGI (1980) ao afirmar que esse gênero apresenta 18 células. Algu-mas dúvidas podem surgir na contagem das células intestinais pois as duas últimas células são pequenas diferindo das demais. POLUSZYNSKI (1930), RUSSELL (1948) e SELLA (1956) en-globam as larvas do gênero Trichonema num único grupo semelhan-te morfologicamensemelhan-te. As L3 do gênero Trichonema são descritas como l a r v a s p e q u e n a s c o m e s ô f a g o e c a u d a da b a i n h a l o n g o s e in- testino constituído por oito células. A L3 do gênero Trichone-ma d e s c r i t a por P O L U S Z Y N S K I (1930) é s e m e l h a n t e à d e s c r i t a nes- te trabalho como do grupo ciatostomíneos típicos. VILAS (1973)
25.
discorda dos demais autores ao apresentar as L3 do gênero Tri-chonema como tendo nove células intestinais. SELLA (1956) mos-tra em seu mos-trabalho fotomicrografia da L3 do gênero Trichonema semelhante à da figura 1 que r e p r e s e n t a os c i a t o s t o m í n e o s típi- cos porém no texto as larvas são descritas como possuindo as quatro primeiras células paralelas e quatro células contí-guas.
Nas coproculturas com fezes de equinos provenientes de outros municípios foi possível encontrar alguns exemplares de L3 com morfologia diferente ao que se refere à disposição das células intestinais. Alguns espécimens como o da figura 3C e D assemelham-se aos descritos por LUCKER (1935, 1938) como assemelham-sendo C. ultrajec-tinus e C. bicoronatus
e por KOPYRIN (1941) como C. ultrajectinus.
A L3 denominada Ciatostomíneo típico (Fig. 1) corresponde a des-crição de KOPYRIN (1941) para as L3 de C. insigne. No mesmo tra-balho representando as L3 de C. nassatus, C. brevicapsulatus com intestino constituído por oito células em dupla fileira porém sen-do mais finas sen-do que as de C. ultrajectinus. Os desenhos de KO-PYRIN (1941) para as L3 de C. hybridus, C. longibursatus e C. cali- catum correspondem à figura 3A e B, apresentam oito célulasin-testinais sendo as quatro p r i m e i r a s em d u p l a fileira. As L3 de C. pateratus, C. insigne e C. goldi representadas por LUCKER (1938) possuem intestino constituído por oito células sendo as três primeiras agrupadas em dupla fileira e cinco em fila única.
Essas larvas não foram observadas durante o presente estudo. As larvas infectantes de Oesophagodontus robustus e
C. acudicaudatum n ã o f o r a m a p r e s e n t a d a s n e s t e e s t u d o , p o i s n e - nhum espécimem adulto foi encontrado à necrópsia e nem larvas em culturas mistas com fezes de equinos. LANFREDI (1984) necrop-siando dez equinos provenientes do Estado do Rio de Janeiro en-controu O. robustus em apenas um animal e C. acudicaudatum em seis cavalos. As L3 de O. robustus são descritas nas chaves pa-ra identificação de VILAS (1973) e SELLA (1956) como larvas grandes, largas com 16 células intestinais triangulares e bem definidas. Essa descrição assemelha-se aquela feita por RUSSELL (1948) para larva não identificada onde as medidas feitas pela autora mostram que a L3 não identificada é maior e mais larga do que as de S. vulgaris.
4.2 CHAVE PARA IDENTIFICAÇÃO DAS LARVAS INFECTANTES DOS
NEMA-TÓIDES INTESTINAIS DE EQUINOS
1. a. Esôfago rhabditiforme ... Nematóides de vida livre b. Esôfago filariforme ... 2
2. a. S e m b a i n h a , e s ô f a g o o c u p a n d o quase a metade do corpo da
larva... Strongyloides westeri b. C o m bainha, e s ô f a g o o c u p a n d o
no máximo 1/4 do comprimento total da larva . .... . ... 3
27.
3. a. L a r v a s p e q u e n a s c o m o i t o cé- l u l a s i n t e s t i n a i s . . . 4 b. L a r v a s p e q u e n a s c o m m a i s de
oito células intestinais .. 5
4. a. L a r v a s p e q u e n a s ( c o m p r i m e n - to t o t a l m é d i o de 7 6 0 , 5 um) oito células intestinais sen- do as d u a s p r i m e i r a s e m d u - p l a f i l e i r a e as s e i s r e s - t a n t e s e m u m a ú n i c a f i l e i r a
(Fig. 1) ... Ciatostomíneos típicos b. L a r v a s p e q u e n a s c é l u l a s in-
t e s t i n a i s d i s p o s t a s de d i - f e r e n t e s f o r m a s (Figs. 3 e
5. a. Larvas pequenas (comprimen- to total médio de 749,3 um) 12 c é l u l a s i n t e s t i n a i s b e m d e f i n i d a s e m d u p l a f i l e i r a (Fig. 1) ... G. capitatus b. L a r v a s c o m 16 ou m a i s c é l u - las i n t e s t i n a i s . . . 6 6. a. L a r v a s g r a n d e s c o m 16 c é - l u l a s i n t e s t i n a i s e c a u d a
4) ... Ciatostomíneos não iden- tificados
da bainha curta e cônica ... Trichostrongylus axei b. Larvas com cauda da b a i n h a
longa e f i l a m e n t o s a ... 7
7. a. L a r v a s com 16 células intes-
tinais ... 8 b. L a r v a s com mais de 16 célu-
las i n t e s t i n a i s ... 9
8. a. L a r v a s m é d i a s (comprimento total médio de 796,8 um) lar-gas (largura m é d i a de 2 8 , 0 um) células p e n t a g o n a i s e bem
definidas (Fig. 1) ... Poteriostomum spp. b. Larvas longas (comprimento
total m é d i o de 860,3 um) fi- nas (largura média de 2 1 , 2
um) e p e q u e n o p r o c e s s o trilo- bado na p o n t a da cauda da
lar-va (Figs. 2, 5 e 6) ... S. equinus
9. a . Larvas p e q u e n a s (comprimento total m é d i o de 787,1 um), fi- nas (largura média de 23,8
um), 18 a 20 células intesti- nais mal d e f i n i d a s e p o n t a da cauda romba (Figs. l; 2 e
29.
b. Larvas médias ou longas com 20 células ou mais bem defi- nidas e ponta da cauda da
larva pontiaguda ... 10
10. a. Larvas médias (comprimento total médio de 802,2 um), lar-gas (largura média de 28,2 um), 20 células retangulares
(Figs. 5 e 6) ... Triodontophorus spp.
b. Larvas longas ( c o m p r i m e n t o total médio de 911,9 um), lar-gas (largura m é d i a de 3 2 , 8 um), com 28 a 32 células re-
tangulares (Figs. 2, 5 e 6) .. S. vulgaris
As medidas das larvas apresentadas na chave para identi-ficação representam larvas infectantes obtidas em culturas mis-tas.
Nesta chave para identificação incluiu-se a descrição dos gêneros Strongyloides e Trichostrongylus, além de nematóides de vida livre, pois esses nematóides são encontrados rotineira-mente nos exames de fezes de equinos, quando estas não são
cole-tadas do reto.
No diagnóstico laboratorial a primeira dificuldade en-contrada no exame das larvas infectantes dos nematóides
parasi-FIGURA 1. Larvas infectantes e detalhes do intestino de: A. Po- t e r i o s t o m u m spp., 625X; B. Poteriostomum spp., 1 8 7 5 X ; C. Ciatostomíneo, 625X; D. Ciatostomíneo, 1875X; E.
G. capitatus (reprodução do desenho de KOPYRIN, 1941);
31.
A B C
F I G U R A 2. Detalhes das larvas infectantes: A. cauda da bainha de
S. edentatus,
625x; B. cauda da larva deS. eden-
tatus,
1875X; C. cauda das larvas deS. vulgaris,
cima,
S. edentatus
no meioe S. equinus
abaixo (re-FIGURA 3. Larvas infectantes e detalhes do intestino de Cia-tostomíneos não identificados: A. 625X; B. 1875X; C. 625X; D. 1875X.
33.
F I G U R A 4. L a r v a s i n f e c t a n t e s e d e t a l h e s do i n t e s t i n o de C i a - t o s t o m í n e o s não i d e n t i f i c a d o s : A. 625X; B. 1875X; C. 625X; D. 1875X.
F I G U R A 5. Larvas i n f e c t a n t e s de: A. S. vulgaris; B. S. edenta-
tus; C. S. equinus (reprodução do desenho de
35.
FIGURA 6. Larvas infectantes de: A. S. vulgaris, 750X; B. S.
edentatus, 1875X; C. S. equinus (reprodução do
de-senho de KOPYRIN, 1941); D. Triodontophorus spp., 1875X.
tos do ceco e colo de equinos, está na imobilização dos espéci-mens. As larvas infectantes dos nematóides gastrointestinais de ruminantes são identificados principalmente por caracterís-ticas morfológicas externas tais como cauda da bainha e compri-mento total. Essas larvas são fixadas através de aquecimen-to ou lugol. Esses méaquecimen-todos quando utilizados nas L3 estudadas nesse trabalho deformam as células intestinais, principal ca-racterística até então utilizada no diagnóstico diferencial des-sas larvas. Até o presente momento não foi descrito método ou substância totalmente eficiente na imobilização das L3 dos ne-matóides intestinais de equinos sem afetar a morfologia de suas células intestinais. Por essa razão as características biomé-tricas tornam-se essenciais no diagnóstico.
Outro fator a ser considerado é o tempo de conserva-ção das larvas para sua perfeita utilizaconserva-ção no diagnóstico. Segundo LUCKER (1934) os limites das células intestinais são bem definidos quando a larva é jovem mas tornam-se indistintos com a exaustão da reserva alimentar. OGBOURNE & DUNCAN (1985) relacionaram o tempo de sobrevivência das larvas a sua ativida-de. As larvas conservam-se por mais tempo sob refrigeração (±
4°C). A prática a d q u i r i d a na execução deste trabalho indica que as L3 d e v e m ser examinadas no m á x i m o uma semana após a t i n g i r e m esse estádio.
Quando as larvas infectantes que p o s s u e m dupla filei- ra de células intestinais são visualizadas lateralmente, as cé-lulas a p r e s e n t a m - s e s u p e r p o s t a s e c o n s e q u e n t e m e n t e não é possí-
37.
vel identificá-las através da morfologia do intestino. Este fato ocor-re com focor-requência demonstrando a necessidade da utilização de ou-tros parâmeou-tros na identificação das larvas dos estrongilideos.
4.3. A N Á L I S E DOS D A D O S B I O M É T R I C O S
As amostras dos seguintes Ciatostomíneos: G. capita-tus, C. radiacapita-tus, C. nassacapita-tus, C. ashworthi, C. minutus e C. poculatus não foram submetidas a análise estatística devido ao pequeno número de exemplares disponíveis.
As distribuições das frequências das medidas de compri-mento total, compricompri-mento da cauda da bainha, compricompri-mento do esô-fago, distância do primórdio genital à ponta da cauda da bai-nha, comprimento do intestino e largura estão representadas em gráficos em barra (Figs. 7 a 18). Os limites de variação, as médias e desvios padrões das medidas referentes aos parâmetros acima m e n c i o n a d o s são a p r e s e n t a d o s nas figuras 19 a 30.
Analisando os dados obtidos para as L3 de S. vulgaris na tabela 3 verificamos que os resultados publicados por POLUS-ZYNSKI (1930) apresentam as medidas com maíores dimensões para o comprimento total e para o comprimento da larvas. Os dados obti-dos pelo presente trabalho em coprocultura apresentam dimensões menores do que as referidas por POLUSZYNSKI (1930), no entanto maiores que as divulgadas por PETROV & GAGARIN (1937) e HUMME-LINCK (1947). HUMMEHUMME-LINCK (1947) que obteve maior média nas me-didas de comprimento da cauda da bainha, apresentou menores
TABELA 3. Comparação entre os dados biométricos das larvas infectantes de S. vulgaris, ob-tidos por diferentes autores em diferentes meios de cultura.
dias para comprimento total e comprimento da larva quando com-parados seus resultados com os de POLUSZYNSKI (1930), PETROV & GAGARIN (1937) e o das larvas em coprocultura do presente t r a b a l h o .
Excluindo-se a bainha, as larvas de S. vulgaris, de-senvolvidas em fezes de coelho são maiores do que as obtidas em líquido fecal por HUMMELINCK (1947). As L3 de S. vulgaris desenvolvidas em culturas axênicas apresentaram maiores médias e amplitude para comprimento do esôfago e de largura quando comparadas às culturas puras em agar-fecal obtidas por PETROV & G A G A R I N (1937).
Com auxílio dos gráficos (Figs. 7, 8 e 19) pode-se de monstrar em relação ao comprimento total que as L3 podem ser listadas em ordem decrescente na seguinte sequência: S. vulga-ris, S. equinus, Triodontophorus spp., Poteriostomum spp., S. edentatus e Ciatostomíneos. Esses resultados concordam com os de POLUSZYNSKI (1930), PETROV & GAGARIN (1937) e HUMMELINCK
(1947), p a r a Strongylus spp.
A comparação dos dados biométricos obtidos por POLUS-ZYNSKI (1930), PETROV & GAGARIN (1937), HUMMELINCK (1947) e o presente trabalho para S. vulgaris são válidas para S. edenta-tus e S. equinus (Tabs. 4 e 5), com exceção do comprimento da larva em que as L3 de S. edentatus obtidas em meio líquido com bactérias fecais apresentam menores dimensões do que as desen-volvidas em líquido fecal no estudo de HUMMELINCK (1947).
T A B E L A 4. C o m p a r a ç ã o e n t r e os dados b i o m é t r i c o s d a s larvas infectantes de S. edentatus ob- tidos por d i f e r e n t e s autores em diferentes m e i o s de cultura.
43.
no parâmetro comprimento total apresentaram maior amplitude e menor desvio padrão demonstrando que a amostra estudada con-centra-se em torno da média encontrada, sendo portanto, bas-tante homogênea.
Pelas figuras 9, 10 e 20, evidencia-se que as medi-das para comprimento da cauda da bainha de tomedi-das as L3 estuda-das apresentaram-se dispersas, demonstrando grande variação nas amostras. Várias hipóteses podem explicar o fato, como por exemplo: erros na medição, pois a cauda filamentosa e fi-na dificulta a visualização de seu ponto termifi-nal; no caso de Triodontophorus spp. e Poteriostomum spp. onde várias espé-cies estão incluídas, pode haver variação específica. Sobre este aspecto os resultados de LUCKER (1938) com as L3 de P. imparidentatum que tendiam a apresentar cauda da bainha maior do que as L3 de P. ratzii, são um fato inquestionável.
As medidas de comprimento do esôfago em S. vulgaris são as mais homogêneas, apresentando apenas quatro classes (Figs. 11, 12 e 21), sendo que 45% das medidas numa única
clas-se.
A maior variação tanto no desvio padrão quanto na am-plitude, para o parâmetro comprimento do esôfago aparece nos Ciatostomíneos; considerando a homogeneidade das amostras em relação ao comprimento do esôfago, o caráter deve ser observa-do no diagnóstico diferencial. As L3 segunobserva-do as medidas de comprimento do esôfago ficaram assim ordenadas:, S. equinus, Ciatostomíneos, Triodontophorus spp., Poteriostomum spp., S.
edentatus e S. vulgaris, em o r d e m decrescente.
As medidas feitas a partir do primórdio genital à pon-ta da cauda da bainha, incluem parte do intestino, em geral a metade e a cauda da bainha. Pelas figuras 13 e 14, demonstra-se que esse caráter tem distribuição unimodal em S. vulgaris, S. edentatus, Poteriostomum spp. e Triodontophorus spp. Nos Cia-tostomíneos o desvio padrão fica próximo à amplitude (Fig. 23).
Quanto ao comprimento do intestino, poderia se espe-rar que estivesse relacionado ao número de células. Essa hipó-tese não é verdadeira pois S. equinus com 16 células intesti-nais apresenta-se com maiores dimensões que Triodontophorus spp. com 20 células (Figs. 15, 16 e 22). Esse parâmetro apre-senta as menores amplitudes pára todas as L3 estudadas.
Pelas figuras 17, 18 e 24 demonstra-se a dispersão das medidas obtidas para largura, a distribuição dessas medi-das para Triodontophorus spp., Poteriostomum spp. , Ciatostomí-neos e S. edentatus é unimodal com t e n d ê n c i a central.
As L3 de S. edentatus já foram desenvolvidas em seis diferentes meios de cultura por diversos autores ; os valores de biometria obtidos estão próximos entre si. GLASER & STOLL (1938) afirmaram que ao aprimorarem o meio de cultura no que se refere à alimentação das larvas conseguiram larvas infectan-tes com maiores dimensões. Em todos os meios utilizados a ali-mentação foi com colibactérias, streptococos, lactobacilos, clostrídeos, fungos e leveduras (NURMIO, ROIRANEN, TUPAMÄKI, 1973).
45.
As figuras de 25 a 30 comparam as medidas obtidas pa-ra S. vulgaris, S. edentatus e Triodontophorus spp. em cultupa-ra pura e mista, demonstram que apesar dos espécimens obtidos a par-tir de culturas puras serem menores, as figuras formadas são se-melhantes. A exceção está em Triodontophorus spp. e T. tenui- collis quanto ao comprimento do esôfago e largura do corpo. Os espécimens de T. tenuicollis (cultura pura) apresentam compri-mento médio de esôfago de 169,0 um e os de Triodontophorus spp. de 168,1 um. Quanto a largura média de T. tenuicollis é de 30,9
um e a mesma média para Triodontophorus spp. é de 28,2 um. Nas culturas mistas as L3 do gênero Triodontophorus spp. não se di-f e r e n c i a m e s p e c i di-f i c a m e n t e q u a n t o a m o r di-f o l o g i a (KOPYRIN, 1941, LUCKER, 1938). Um estudo biométrico das diferentes espécies des-se g ê n e r o p o d e r á d e m o n s t r a r d i f e r e n ç a s e s p e c í f i c a s .
Na t a b e l a 6 e s t ã o c o m p a r a d o s os d a d o s o b t i d o s p a r a T. tenuicollis desenvolvidos em dois tipos de cultura e para Trio-dontophorus spp. em cultura mista. PETROV & GAGARIN (1937) obti-vetam maiores índices biométricos em todos os parâmetros quando
c o m p a r a d o s ao p r e s e n t e t r a b a l h o , e x c e t o p a r a l a r g u r a . E s s e s r e - sultados diferem quando a comparação e feita entre os dados de T. tenuicollis obtidos por PETROV & GAGARIN (1937) e os do pre-sente trabalho para Triodontophorus spp. A partir desse confron-to verificamos que o comprimenconfron-to confron-total de Triodonconfron-tophorus spp. é maior e a largura idêntica nos dois tipos de cultura. Nos ou-tros caracteres estudados os dados para T. tenuicollis (PETROV & GAGARIN, 1937) desenvolvidos em agar-fecal são maiores do que
47.
os de Triodontophorus spp. em cultura mista.
Analisando os dados médios para P. ratzii nas tabelas 1 e 7 concluímos que os de LUCKER (1934) são menores que as mé-dias desse estudo em coprocultura.
Através da comparação das tabelas 1 e 8 verificou-se que os diferentes gêneros e espécies da sub-família Cyathosto-minae estudados por LUCKER (1935, 1936, 1938) e o presente
es-tudo assemelham-se.
As larvas do grupo dos Ciatostomíneos obtidas a par-tir de cultura pura também apresentam medidas similares, dife-rindo apenas quanto ao comprimento da cauda da bainha, onde as e s p é c i e s estudadas por L U C K E R (1935, 1936, 1938) a p r e s e n t a m mé- dias inferiores ao desvio padrão do grupo. Somente C. pateratum a p r e s e n t o u o c o m p r i m e n t o m é d i o da cauda da bainha d e n t r o dos limites dos desvios padrões encontrados para os Ciatostomíneos.
Visando a diferenciação específica dos nematóides in-testinais através do estudo biométrico dos ovos dos estrongi-los e pequenos estrongilídeos, HUEBER (1926) e KOPYRIN (1941) concluíram que não é possível fornecer um diagnóstico pela o-voscopia. BIRD (1971) afirma que os ovos dos nematóides são morfologicamente similares e que o tamanho do ovo não tem rela-ção com o parasito adulto.
WHITLOCK (1959) e RODRIGUES & HONER (1985) descreve-ram técnicas para diagnosticar o parasitismo por nematóides gastrintestinais de ovinos e bovinos, pelas larvas de primeiro estádio, concluindo pela eficiência desse método. Estudos
seme-TABELA 8. Média obtida para dez larvas infectantes, desenvolvidas em culturas mista e pura, para o pre-sente trabalho.
lhantes executados por HUEBER (1926), KOPYRIN (1941) e PETROV & GAGARIN (1937) para nematóides intestinais de equinos, concluí-ram que as diferenças estruturais das larvas nos estádios pré-infectantes, eram insuficientes para permitirem uma diferencia-ção específica. No entanto OGBOURNE (1971) em seu trabalho sobre morfologia das L1, afirma, que com a sua experiência pessoal po-de ipo-dentificar as espécies po-de strongylus com base na morfologia das larvas de primeiro estádio.
Até então os pequenos estrongilídeos eram considerados pouco patogênicos. Estudos recentes de CHIEJINA & MASON (1977), ARUNDEL (1985), GILE, URQUHART & LOGSTAFFE (1985) demonstra-ram a patogenicidade desses, e a comprovada resistência dos
Cia-tostomíneos aos benzimidazóis dá outra dimensão da importância desse grupo (ROUND, 1974; DRUDGE, LYONS & TOLLIVER, 1977; BATIS- TA NETO, GRISI & LANFREDI, 1987; GRIFFIN et al., 1983).
A grande variedade de espécies das sub-famílias Strongy- linae (14 espécies descritas) e Cyathostominae (41 espécies critas) exige estudos detalhados para um diagnóstico preciso des-ses nematóides.
51.
FIGURA 7. Distribuição da frequência das medidas de compri-
mento total.
FIGURA 8. Distribuição da frequência das medidas de compri- m e n t o total.
53.
.FIGURA 9. Distribuição da frequência d a s medidas de compri-
mento da cauda da bainha.
F I G U R A 10. Distribuição da frequência das medidas de compri- mento da cauda da bainha.
55.
• °
F I G U R A 11. D i s t r i b u i ç ã o da f r e q u ê n c i a das m e d i d a s de c o m p r i - m e n t o do esôfago.
FIGURA 12. Distribuição da frequência das medidas de compri-
mento do esôfago.
57.
F I G U R A 13. D i s t r i b u i ç ã o da f r e q u ê n c i a das m e d i d a s de distân- cia do primórdio genital à ponta da cauda da bainha.
FIGURA 14 Distribuição d a frequência d a s medidas da distân- cia do primórdio genital à ponta da cauda da bainha.
59.
FIGURA 15. Distribuição da frequência das medidas de compri- mento do intestino.
FIGURA 16. Distribuição da frequência d a s medidas de compri- m e n t o do intestino.
61.
63
F I G U R A 19. C o m p a r a ç ã o e n t r e as m é d i a s , a m p l i t u d e e des- vio padrão das medidas de comprimento total ob-tidas em culturas mistas de: A. S. vulgaris, B. S.
edentatus, C. S. equinus, D. Ciatostomíneo, E.
F I G U R A 20. C o m p a r a ç ã o e n t r e as m é d i a s , a m p l i t u d e e d e s - vio padrão das medidas de comprimento da cauda da bainha, obtidas em culturas mistas de: A. S. vulga-ris, B. S. edentatus, C. S. equinus, D. Ciatostomí-n e o s , E . P o t e r i o s t o m u m s p p . , F . T r i o d o n t o p h o r u s s p p .
65.
F I G U R A 21. C o m p a r a ç ã o e n t r e as m é d i a s , a m p l i t u d e e d e s v i o p a d r ã o das m e d i d a s de c o m p r i m e n t o de e s ó f a g o , o b t i d a s em c u l t u r a s m i s t a s de: A. S. vul-
garis, B. S. edentatus, C. S. equinus, D. Ciatos-tomíneos, E. Poteriostomum spp., F.
Triodontopho-rus
spp.FIGURA 22. Comparação entre as médias, amplitude e des-v i o p a d r ã o _ d a s m e d i d a s de c o m p r i m e n t o do intes-
tino, obtidas em culturas mistas de: A. S. vulga-ris, B. S. edentatus, C. S. equinus, D. Ciatostomí-neos, E. Poteriostomum spp., F. Triodontophorus spp.
67.
F I G U R A 23. Comparação entre as médias , a m p l i t u d e e de s- vio padrão das medidas de distância do primór-d i o genital à ponta primór-da cauprimór-da primór-da bainha, obtiprimór-das em culturas mistas de: A. S.
