Estrutura de Nucleotídeos e
Ácidos Nucléicos
Profa Renata Canalle
Universidade Federal do Piauí
Campus Ministro Reis Velloso – Parnaíba
Curso Biomedicina
Sumário
Generalidades
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
Descoberta do DNA: experimentos clássicos Ácidos Nucléicos: Estrutura Molecular
Formas tridimensionais do DNA Estruturas não-usuais do DNA Estruturas secundárias do RNA Tipos de RNA
Generalidades
Os nucleotídeos possuem vários papéis no metabolismo celular :
“Moeda” energética (carregadores de energia) – ATP, GTP
Media resposta da célula a hormônios e outros estímulos celulares
(mensageiros químicos) – AMP cíclico, GTP cíclico
Cofatores de enzimas – FAD, NAD
Constituem o DNA e o RNA, os repositórios da informação genética
- monômeros dos ácidos nucléicos
Generalidades
Monômeros dos Ácidos Nucléicos
DNA e RNA: estrutura X função DNA: função única (desoxirribose)
- armazenar a informação genética
- transmitir a informação genética (replicação fiel) - expressar a informação genética (molde/RNAs)
RNA: funções múltiplas (ribose)
- tradução - estrutural
- splicing do RNA
Nucleotídeo Base nitrogenada Grupo fosfato Açucar de 5 carbonos
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
Nucleosídeo
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
RNA DNA Nucleotídeo Base nitrogenada Grupo fosfato Ribose Açucar de 5 carbonos Desoxirribose- Base nitrogenada: ligada ao carbono 1’ da pentose (ligação glicosídica)
- Um ou até 3 grupos fosfatos: ligados ao carbono 5’ da pentose
Desoxirribonucleotídeo Ribonucleotídeo
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
1 único anel de 6 átomos
2 anéis fundidos de 5 e 6 átomos
Nucleotídeo Pirimidinas Purinas Citosina (C) Uracila (U) Timina (T) Adenina (A) Guanina (G) Base nitrogenada Grupo fosfato Ribose Açucar de 5 carbonos Desoxirribose
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
Fosfato
P
O
O
-O
-O
-ADP, CDP, GDP, TDP
ATP, CTP, GTP, TTP
A
MP,
C
MP,
G
MP,
T
MP
α β γ 5’DNA: nucleotídeos monofosfatados Precursores para síntese: trifosfatados
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
A letra "d" é utilizada para indicar que o açúcar é a desoxirribose. Ex.:
dAMP (desoxiadenosina monofosfato), AMP (adenosina monofosfato)
dNTPs
= desoxirribonucleosídeos trifosfatados (PCR)
-UMP
uridilato
uridina
Uracil
dTMP
-timidilato
timidina
Timina
dCMP
CMP
citidilato
citidina
Citosina
dGMP
GMP
guanilato
guanosina
Guanina
dAMP
AMP
adenilato
adenosina
Adenina
DNA
RNA
Nucleotídeo
Nucleosídeo
Base
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
Ligação fosfodiéster
OH ligado ao C 3’
Nucleotídeo que será
incorporado a cadeia nascente
Extremidade 5’ da cadeia
polinucleotídica
Trifosfato
ligado ao C 5’
2 fosfatos são
liberados
Sentido da
síntese
5’
3’
DNA
RNA
5’
3’
5’
3’
Ácidos Nucléicos: Estrutura Química
Os ácidos nucléicos
5’3’
• Oligonucleotídeo : cadeia
pequena de nucleotídeos (<50 nt)
• Polinucleotídeo : cadeia acima de 50 nt
Primeiros estudos com o DNA
DNA como Fonte da Informação genética
Friederich Miescher (1869) – DNA material genético (nucleína) Griffith (1928) – O princípio transformante (transformação)
Avery, MacLeod e McCarty (1944) – O princípio transformante é o DNA Hershey e Chase (1952) – infecção de E. coli
Watson e Crick (1953) – modelo da dupla hélice
Chargaff e colaboradores (1948) – relação A=T/G=C
Primeiros estudos com o DNA
DNA como Fonte da Informação genética
Friederich Miescher (1869) : isolou uma substância contendo
fósforo no núcleo dos glóbulos brancos – a “nucleína”
DNA (ácido) + proteína (básica)
Primeiros estudos com o DNA
DNA como Fonte da Informação genética
Griffith (1928) – O princípio transformante
Bactérias encapsuladas (virulentas) - vivas
Bactérias não-encapsuladas (não-virulentas) - vivas
Bactérias virulentas –
mortas pelo calor
Bactérias virulentas – mortas + Bactérias não-virulentas - vivas
Griffith (1928) – O princípio transformante
Bactérias não virulentas foram transformadas em virulentas
DNA como Fonte da Informação genética
Avery, MacLeod e McCarty (1944) – O princípio transformante é o DNA
DNA como Fonte da Informação genética
Avery, MacLeod e McCarty (1944) – O princípio transformante é o DNA Remove lipídeos e carboidratos de uma solução de células S (virulenta) mortas pelo calor Separa a solução em três frascos e adiciona proteases no frasco 1, ribonuclease no frasco 2, desoxirribonuclease no frasco 3
Adiciona uma pequena
quantidade de cada amostra em outros frascos de cultura contendo células R (não virulenta) vivas
A transformação não pode ocorrer na ausência de DNA; dessa forma, o DNA é o material hereditário
DNA como Fonte da Informação genética
Do que são feitos os genes?
Hershey e Chase (1952) – Os genes de bacteriófagos T2 são feitos de DNA
Capa protéica tinha enxofre, mas não fósforo
DNA continha fósforo, mas não enxofre
Do que são feitos os genes?
Hershey e Chase (1952) – Os genes de bacteriófagos são feitos de DNA
Do que são feitos os genes?
Hershey e Chase (1952) – Os genes de bacteriófagos são feitos de DNA
Fago T2
Maioria da
radioatividade
encontrada nas
cápsulas
Maioria da
radioatividade
dentro da
bactéria
35S
32P
Cápsula
(proteína)
DNA
Ácidos Nucléicos: Estrutura Molecular
Erwin Chargaff Pareamento das bases
A=T
e
C=G
logo
A+G = T+C
Duas pontes de hidrogênio Três pontes de hidrogênio
Concentração de purinas sempre igual à concentração de pirimidinas Proporção de A+T/C+G variava amplamente nos DNA de espécies diferentes
açucar açucar açucar açucar ceto (C=O): T e U amino (C-NH2): A ceto e amino: C e G
Ácidos Nucléicos: Estrutura Molecular
Rosalind Franklin Maurice Wilkins
DNA é helicoidal (hélice), bifilamentar
Padrões de difração de raios X
3,4 Å 34 Å
Possui 2 periodicidades : Primária : a cada 3,4 Å Secundária : a cada 34 Å Feixe raio X Raios difratados Molécula cristalizada Filme
James Watson
Francis Crick
Ácidos Nucléicos: Estrutura Molecular
“Molecular Structure of Nucleic Acids: A struture for Deoxyribose Nucleic Acid”. Nature, 1953.
Ácidos Nucléicos: Estrutura Molecular
Sulco menor Par de bases Arcabouço açucar-fosfato Sulco maior 3’ 5’ 5’ 3’ 34Å 3,4Å Ác. Desoxirribonucléico Citosina Guanina Adenina Timina Polaridade: 5’ → 3’ Watson e Crick propuseram 10A Dupla Hélice
Fosfatos na porção externa -carga negativa Cadeias antiparalelas Ligação entre nucleotídeos : ligação fosfodiéster – liga o 5’-fosfato e o 3’-OH dos nucleotídeos vizinhosPareamento de bases é específico : A-T e C-G (
devido às pontes de hidrogênio
)
As fitas são
complementares
Ligação entre as bases : pontes H
5’
5’
3’
3’
Único em estocar e transmitir a informação genética -Permite reparos -Replicação -Transcrição -Hibridação (desnaturação renaturação) Polaridade: 5’ → 3’Formas Tridimensionais do DNA: estruturas secundárias
DNA B: proposta por Watson e Crick, forma mais abundante em condições fisiológicas, gira para a direita, 3,4 nm.
DNA A: curta e larga, giro direita, 2,6 nm por volta, 11 pb por volta
(desidratados, conteúdo de sal diminuído). Híbridos DNA/RNA na transcrição, RNA/RNA.
DNA Z: açúcar e base do mesmo lado, gira para a esquerda, 4,56 nm, C e G.
12 pb por giro 10 pb
por giro
Tipos de DNA
Não alteram a informação da seq. de bases, mas podem facilitar ou dificultar a interação com proteínas
11 pb por giro
Estruturas não-usuais de certas seqüências de DNA
Curvatura ou dobras
- longas cadeias de DNA: regiões mais suscetíveis à curvatura - pontos importantes que controlam: replicação, transcrição e
recombinação
- Ligação de proteínas: histonas, fatores de transcrição, DNA-girase - condensar e empacotar o DNA: nucleossomos
- Aproximar sítios de ligação distantes no DNA linear - Estruturas especiais proteína/DNA
Estruturas não-usuais de certas seqüências de DNA
grampo
cruciforme Seqüências no DNA com
simetria: repetidas e invertidas
Ácidos Nucléicos: Estrutura Molecular
Ác. Desoxirribonucléico Ác. Ribonucléico Bases nitrogenadas Bases nitrogenadas Uracila Adenina Guanina Citosina Citosina Guanina Adenina TiminaÁcidos Nucléicos: RNA
Fita simples
Mais reativo do que o DNA (OH), instável
Não apresenta estrutura secundária simples e regular
Várias estruturas são possíveis
Pareamento de bases, estrutura 2a: G≡C
A=U
G=U → estruturas terciárias
Ácidos Nucléicos: RNA
Estruturas secundárias da molécula RNA
Grampo
Alça interna
Saliência
Fita simples
Tipos de RNA
RNA heterogêneo nuclear (hnRNA) ou transcrito primário
RNA mensageiro (mRNA) – molde para a síntese protéica (taxa de renovação rápida; perda da cauda poli A) – 1 a 5% do RNA total da célula
RNA transportador (tRNA) – leva aminoácidos para o ribossomo – 10-15% RNA total RNA ribossômico (rRNA) – principal componente dos ribossomos – 75% do RNA total Pequenos RNA nucleares (snRNA) – processamento (splicing) do mRNA e tRNA
(complexados a proteínas, snRNPs/ribozimas)
Pequeno RNA nucleolar (snoRNA) – processamento do rRNA Pequeno RNA citoplasmático (scRNA)
Micro RNA (miRNA) ou RNAs de interferência - regulatórios
Propriedades químicas dos ácidos nucléicos
DNA dupla hélice
Denaturação
Reassociação (annealing)
DNA parcialmente
denaturado
Separação das
fitas
Fitas de DNA separadas estruturam-se
casualmente em espirais
Associação das fitas por
pareamento de bases
↑ To ou ▲pH (< 3,0 ou > 10,0) Formamida, DMSO
Ruptura das pontes de H
Denaturação e renaturação
Fusão e reanelamentoPropriedades químicas dos ácidos nucléicos
Temperatura denaturaçãoTemperatura média de fusão
Metade das moléculas de DNA estão denaturadas
Varia de acordo com o tamanho e a composição das moléculas :
Temperatura de melting (Tm)
Quanto maior a molécula
Quanto maior o conteúdo GC
Temperaturas mais elevadas, pH mais alcalino
Propriedades químicas dos ácidos nucléicos
Temperatura denaturaçãoTemperatura média de fusão Temperatura de melting (Tm)
Tm para iniciadores = 2(A+T) + 4(G+C)
temperatura na qual se obtém o equilíbrio entre a formação e dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos complementares: 50% dos iniciadores estão anelados, e 50% encontram-se dissociados do molde
iniciadores (primers)
5 oC-10 oC abaixo do valor Tm
Tm (oC) = 69,3 + 0,41 (GC%)
AT% = 1 – (GC%) Cálculo para conteúdo de GC ou AT de
Propriedades químicas dos ácidos nucléicos
Hibridação :
ácidos nucléicos de origem diferente podem se associar
Amostra 1
Amostra 2
Dúplex
híbrido
- Amplitude de hibridação: similaridade dos ácidos nucléicos de duas fontes diferentes - Correlações evolutivas
- Localizar genes
O anelamento ou hibridação: ocorre normalmente a 25 oC
Cinética de Renaturação de DNA: detecção de sequências repetidas
Primeiro detalhamento da frequência e da complexidade das sequências repetidas de DNA em eucariotos resultou de estudos das velocidades de
renaturação do DNA – a 100oC desnaturação de DNA
Velocidade de renaturação dependerá:
(1) concentração de DNA na solução: quanto mais alta a concentração de filamentos únicos na solução, maior a chance de uma colisão entre quaisquer dois deles (complementares)
(2) da complexidade do DNA: é o tamanho total de sequências de pares de nucleotídeos não repetidos no genoma. À medida que a complexidade do DNA aumenta, a proporção de colisões aleatórias entre filamentos únicos de DNA que estão entre filamentos únicos complementares diminuirá → taxa de
renaturação ↓
Grandes genomas (eucariotos) → aumenta número de genes → renaturação lenta
C
0t
Cinética de Renaturação de DNA: detecção de sequências repetidas
Surpreendentemente, algumas sequências de DNA nos genomas complexos de eucariotos renaturam-se muito rapidamente
Sequências repetidas muitas vezes no genoma (1 milhão de vezes ou
mais): presente em concentração maior que uma sequência de cópia única durante renaturação → ↑ velocidade de renaturação / ↓ C0t
Velocidade de renaturação do DNA é diretamente proporcional ao número de cópias
Hibridação in situ → também usado para localizar sequências diferentes de DNA (principalmente tipos diferentes de sequências de DNA repetitivo em genomas eucarióticos)
Sequências de DNA de Cópia única e repetitivas em Genomas Eucarióticos
As sequências de DNA presentes em eucariotos são comumente agrupadas
em três classes:
1. Sequências únicas, ou de uma só cópia, de DNA – 1 a 10 cópias por
genoma haplóide (maioria dos genes que codificam proteínas) - ↑ C0t (reassociam-se mais lentamente; componente lento)
2. Sequências de DNA moderadamente repetitivas – 10 a 105 cópias
por genoma haplóide (proteína ribossômica/rRNA, proteínas musculares actina e miosina; que são necessárias em grandes quantidades, e cada uma delas é codificada por vários genes) –
componente intermediário
3. Sequências de DNA altamente repetitivas – mais de 105 cópias por
genoma haplóide (não codificam proteínas/nunca foram transcritas: centrômeros, transposons, VNTRs, STRs) - ↓ C0t (reassociam-se mais rápido; componente rápido)
