Caracterização da disfunção erétil em camundongos obesos tratados com dieta hiperlipídica

FÁBIO HENRIQUE DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO DA DISFUNÇÃO ERÉTIL EM CAMUNDONGOS

OBESOS TRATADOS COM DIETA HIPERLIPÍDICA

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

CARACTERIZAÇÃO DA DISFUNÇÃO ERÉTIL EM CAMUNDONGOS

OBESOS TRATADOS COM DIETA HIPERLIPÍDICA

FÁBIO HENRIQUE DA SILVA

Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP para obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Sob orientação do Prof. Dr. Edson Antunes

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Dedico este trabalho:

A Deus, por estar presente em minha vida...

Me iluminando e amparando...

Aos meus pais, João e Cacilda,

Os maiores responsáveis pela minha formação e por onde estou.

Obrigado pelo carinho, apoio e por sempre acreditar em mim.

Meu amor e minha gratidão por vocês serão eternos...

A minha irmã, Lenise

Pela alegria, amizade, carinho e amor...

Pelo incentivo nesta caminhada.

A minha namorada, Nádia

Pela presença constante, por seu amor e dedicação em todos os momentos...

Minha incentivadora... Minha amiga...

Minha vida...

Aos meus tios, Romilda e Adelcio,

Por nunca medirem esforços em me ajudar...

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Ao meu orientador,

Prof. Dr. Edson Antunes,

Agradeço imensamente pela confiança e por sua orientação. Agradeço por ter me

ensinado o caminho da pesquisa. Minha admiração e gratidão

Aos meus grandes amigos,

Haroldo Alfredo Flores Toque e Mário Angelo Claudino,

Meu agradecimento especial por terem me recebido com tanto empenho e por

todas as oportunidades que me ofereceram...

Aos pais de minha namorada,

José Sicardi (in memorian) e Vera, por terem me acolhido nesta cidade,

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Agradecimentos

Aos meus amigos, Raul Carli, Marcus Vinícius e Prof. Dr. Roni Antonio Mendes na

vinda para Campinas. Serei eternamente grato.

Aos amigos da cascata, Luiz Osório Silveira Leiria, André Arruda, Celso Saragossa

Filho, Maria Andréia Delbin, Julio Rojas, Fernando Báu, Samuel Barillas, Fernanda

Priviero, Fernanda Dell, Lorenzo Pincinatti, Paulo Gonzales, Rodrigo Capel, Fabiano

Calmasini, Marcy, Carmem, Marcovan Porto, pela amizade e companhia diária, pelo respeito

e ajuda indispensável para o desenvolvimento deste trabalho.

Aos amigos de laboratório Lineu Baldissera, Rafael Prada, Nádia, Marina Calixto,

Letícia Lintomen, Dalize Squebola, Priscila Monteiro, Gláucia Mello, Maria Elisa e Camila,

agradeço por toda a amizade e pela alegria compartilhada no dia-a-dia de trabalho.

Aos Professores do Departamento de Farmacologia, Dra. Sisi Marcondes, Dr.

Stephen Hyslop, Dr. Gabriel Forato Anhê, Dr. André Schenka e Dr. Heitor Moreno Junior,

pela atenção dispensada durante o cumprimento dos créditos.

Aos funcionários do Departamento de Farmacologia da UNICAMP, Elaine, Gildo,

Agnaldo, Antonio, Adílson e especialmente, agradeço ao Sr. Miguel Borges da Silva e Denise

pelo competente trabalho que realizam no cuidado diário dos animais de experimentação.

Um singelo agradecimento e o meu respeito aos camundongos, que, ainda que

involuntariamente, deram suas vidas à esta pesquisa.

Agradeço à Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão da bolsa de Mestrado Acadêmico.

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LISTA DE DROGAS E SAIS... xiv

LISTA DE ABREVIAÇÕES ... xvi

LISTA DE TABELAS... xviii

LISTA DE FIGURAS... xx

RESUMO... xxii

ABSTRACT... xxiv

1. INTRODUÇÃO... 26

1.1. Anatomia, inervação e hemodinâmica peniana... 27

1.2. Importância do óxido nítrico (NO) na ereção peniana... 31

1.3. Disfunção erétil... 1.4. Obesidade, resistência à insulina e disfunção erétil... 1.5. Sensibilizador de insulina: Metformina... 1.6. Modelos animais de obesidade... JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA... OBJETIVOS... 33 34 35 37 39 40 2. MATERIAIS E MÉTODOS... 41 2.1. Animais... 2.2. Preparo do corpo cavernoso isolado de rato... 42 43 2.3. Curvas concentração-resposta... 43

2.4. Estimulação elétrica... 44

2.5. Monitoramento da pressão intracavernosa (experimentos “in vivo”)... 45

xiii

2.7. Medida do perfil lipídico... 46

2.8. Teste de tolerância à insulina (ITT)... 46

2.9. Análise estatística... 47

3. RESULTADOS... 48

3.1. Características morfométricas, perfil lipídico e glicêmico dos animais controles e obesos... 49 3.2. Medidas de pressão intracavernosa... 51

3.3. Relaxamento dependente de endotélio (ACh) ... 52

3.4. Relaxamento induzido pelo doador de óxido nítrico (SNP)... 54

3.5. Relaxamento nitrérgico... 55

3.6. Contração neurogênica... 56

3.7. Contração induzida pela fenilefrina... 57

3.8. Contração induzida pela endotelina-1... 58

3.9. Determinação dos níveis de GMPc em corpo cavernoso...

3.10. Histomorfometria dos corpos cavernosos ...

59 60 3.11. Efeito do tratamento crônico com metformina na disfunção erétil... 3.11.1. Peso corporal, gordura epididimal e teste de tolerância à insulina... 3.11.2. Relaxamento dependente de endotélio... 3.11.3. Relaxamento induzido pelo doador de óxido nítrico (SNP)... 3.11.4. Relaxamento nitrérgico... 3.11.5. Contração de corpos cavernosos induzida pela fenilefrina...

4. DISCUSSÃO... 5. SUMÁRIO E CONCLUSÃO... 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 61 62 62 65 66 66 69 77 79

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LISTA DE DROGAS E SAIS

DROGAS PROCEDÊNCIA

Acetilcolina Sigma (St. Louis, EUA)

Atropina Sigma (St. Louis, EUA)

Cacl2 Merck (Darmstadt, Alemanha)

Endotelina-1 Sigma (St. Louis, EUA)

Fenilefrina Sigma (St. Louis, EUA)

Guanetidina Sigma (St. Louis, EUA)

HCl Merck (Darmstadt, Alemanha)

KCl Merck (Darmstadt, Alemanha)

KH2PO4 Merck (Darmstadt, Alemanha)

Metformina Sigma (St. Louis, EUA)

MgSO4 Merck (Darmstadt, Alemanha)

NaCl Merck (Darmstadt, Alemanha)

NaHCO3 Merck (Darmstadt, Alemanha)

Nω-nitro-L-arginina metil éster Sigma (St. Louis, EUA)

Nitroprussiato de sódio Sigma (St. Louis, EUA)

ODQ Sigma (St. Louis, EUA)

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LISTA DE ABREVIAÇÕES

ACh: acetilcolina

Ca2+: íon cálcio

CC: corpo cavernoso

EFS: estimulação elétrica de campo

Emax: resposta máxima

eNOS: óxido nítrico sintase endotelial E.P.M.: erro padrão da média

ET-1: endotelina-1

GCs: guanilato ciclase solúvel GDP: difosfato de guanosina

GMPc: monofosfato cíclico de guanosina GTP: trifosfato de guanosina

ICP: pressão intracavernosa L-Arg: L-arginina

L-NAME: Nω-nitro-L-arginina metil éster

mmHg: milímetros de mercúrio

NANC: não-adrenérgico não-colinérgico nNOS: óxido nítrico sintase neuronal NO: óxido nítrico

NOS: óxido nítrico sintase PKC: proteína quinase C PLC: fosfolipase C

PDE5: fosfodiesterase tipo 5 PE: fenilefrina

pEC50: antilog da concentração de droga necessária para produzir 50% do efeito máximo PI3K: fosfatidil-inositol 3-kinase

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição da dieta experimental ... 41 Tabela 2. Efeito da dieta hiperlipídica sobre os valores morfométricos, perfil lipídico e

glicê-micos de camundongos C57BL/6 após 10 semanas de tratamento... 49

Tabela 3. Valores de potência (pEC50) e resposta máxima (Emax) obtidos de curvas concentração-resposta à acetilcolina (ACh), nitroprussiato de sódio (SNP), fenilefrina (PE) e endotelina-1 (ET-1) em corpos cavernosos de camundongos obesos e controle...52

Tabela 4. Área de secção transversal, diâmetro máximo e densidade de músculo liso em

corpos cavernosos de animais controles e obesos... 59

Tabela 5. Efeito do tratamento crônico com metformina sobre os valores morfométricos e

tolerância à insulina... 60

Tabela 6. Valores de potência (pEC50) e resposta máxima (Emax) obtidos de curvas concentração-resposta à acetilcolina, nitroprussiato de sódio (SNP), fenilefrina (PE) e endotelina-1 (ET-1) em corpos cavernosos de camundongos... 61

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Teste de tolerância oral à insulina em camundongos... 49

Figura 2. Avaliação da resposta erétil in vivo... 50

Figura 3. Curvas concentração-efeito à acetilcolina em corpos cavernosos de camundongos... 51

Figura 4. Curvas concentração-efeito ao nitroprussiato de sódio... 53

Figura 5. Relaxamentos de corpos cavernosos de camundongos induzidos por EFS... 54

Figura 6. Contrações de corpos cavernosos de camundongos induzidas por EFS... 55

Figura 7. Curvas concentração-efeito à fenilefrina em corpos cavernosos de camundongos... 56

Figura 8. Curvas concentração-efeito à endotelina-1 em corpos cavernosos de camundongos... 57

Figura 9. Níveis de GMPc em homogenatos de corpos cavernosos... 58

Figura 10. Efeito do tratamento crônico com metformina no peso corporal (g) dos animais contro- les e obesos... ₆₀

Figura 11. Curvas concentração-efeito à acetilcolina em corpos cavernosos de camundongos trata- dos com metformina... ₆₂

Figura 12. Curvas concentração-efeito ao nitroprussiato de sódio em corpos cavernosos de ca- mundongos tratados com metformina... 63

Figura 13. Efeito da metformina sobre o relaxamento de corpo cavernoso de camundongos induzi- do por EFS... ₆₅

Figura 14. Curvas concentração-efeito à fenilefrina em corpos cavernosos de camundongos trata- dos com metformina... ₆₆

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A prevalência de obesidade vem aumentando a cada ano, sendo um dos principais problemas de saúde pública. A obesidade é considerada importante fator de risco para o surgimento de resistência à insulina, dislipidemia, diabetes tipo 2 e hipertensão arterial. Estes fatores podem atuar de maneira sinérgica no desenvolvimento da disfunção erétil. Entretanto, até o momento, poucos estudos procuraram avaliar os mecanismos envolvidos na disfunção erétil causada pela obesidade. Por isso, utilizando o modelo de obesidade induzida por dieta hiperlipídica em camundongos, o presente trabalho procurou caracterizar a disfunção erétil nestes animais. Para tanto, utilizamos experimentos funcionais in vivo e in vitro, assim como ensaios bioquímicos e morfológicos. Especificamente, realizamos os seguintes experimentos nos corpos cavernosos dos camundongos controles e tratados com dieta hiperlipídica por 10 semanas: 1) curvas concentração-efeito in vitro a agentes relaxantes dependente (acetilcolina) e doador de óxido nítrico (nitroprussiato de sódio), assim como à estimulação elétrica (relaxamento nitrérgico); 2) curvas concentração-efeito in vitro a agentes contráteis como fenilefrina (agonista α1-adrenérgico) e endotelina-1, assim como a estimulação elétrica (contração neurogênica); 3) medida da pressão intracavernosa in vivo; 4) determinação dos níveis de GMPc; e 5) análise histomorfométrica. Os animais tratados com dieta hiperlipídica apresentaram aumento do peso corporal, da gordura epididimal, dos níveis séricos de colesterol total e LDL, e resistência à insulina. Os animais tratados com dieta hiperlipídica apresentaram redução da pressão intracavernosa (in vivo). Os relaxamentos nitrérgico e dependente de endotélio foram menores nos corpos cavernosos dos camundongos obesos. Por outro lado, as respostas contrateis induzidas pela fenilefrina, endotelina-1 e estimulação elétrica foram maiores nestes animais. Os níveis de GMPc nos corpos cavernosos dos animais tratados com dieta hiperlipídica foram significantemente menores do que nos tecidos de animais controles. Os corpos cavernosos dos animais tratados com dieta hiperlipídica não sofreram alterações histomorfométricas. Para investigar o efeito da resistência à insulina na função erétil, tratamos os animais com o sensibilizador de insulina, metformina, por 14 dias (300 mg/Kg/dia). O tratamento com metformina restaurou o relaxamento nitrérgico, o relaxa- mento dependente de endotélio, e o aumento da resposta contrátil à fenilefrina dos corpos cavernosos dos animais tratados com dieta hiperlipídica, sem alterar o peso corporal e a gordura epididimal. Em suma, nossos resultados mostram que o tratamento com dieta hiperlipídica por 10 semanas causa redução da pressão intracavernosa, assim como do relaxamento nitrérgico e dependente de endotélio e, concomitantemente, aumento da resposta contrátil in vitro. O tratamento com metformina reverteu a sensibilidade à insulina e o quadro de disfunção erétil, sugerindo que a disfunção erétil nos camundongos tratados com dieta hiperlipídica é resultante da resistência à insulina associada à obesidade.

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The prevalence of obesity is increasing every year, and a becoming a major public health problem. Obesity is considered an important risk factor for development of insulin resistance, dyslipidemia, diabetes mellitus type 2 and arterial hypertension. These are risk factors that act synergistically in the development of erectile dysfunction. However, so far few studies have investigated the mechanisms involved in erectile dysfunction caused by obesity. Therefore, using a model of obesity induced high-fat diet in mice, the present study searched to characterize erectile dysfunction in these animals. Thus, we used functional experiments in vivo and in vitro, biochemical and morphological test. Specifically, the following experiments were performed in corpus cavernosum of control and high-fat fed mice. 1) concentration response curves in vitro to relaxing agents endothelium-dependent (acetylcholine) and NO donor (sodium nitroprusside), as well as to electrical-field stimulation (EFS) (nitrergic relaxations); 2) Concentration-response curves in vitro to the contractile agents phenylephrine (α-1 adrenergic receptor agonist) and endothelin-1, as well as to EFS (neurogenic contraction; 3) measurement of intracavernous pressure in vivo; 4) determination of cGMP levels; 5) hystomorfometric measurement. Mice treated with high-fat diet showed increased body weight, epididimal fat, total choles-terol and LDL, and insulin resistance. The corpus cavernosum of high-fat fed mice showed impaired intracavernous pressure. The endothelial and nitrergic relaxations were lower in corpus cavernosum of high-fat fed mice. Moreover, the contractile responses induced by phenylephrine, endothelin-1 and electrical stimulation were increase in this animals. The cGMP levels were lower in corpus cavernosum of high-fat fed mice in comparison with control mice. There were no morphological alterations in erectile tissue of mice treated with high-fat diet. To investigate the effect of insulin resistance in erectile function, we treated the animals with insulin sensitizer, metformin, for 14 days (300 mg /kg/day). Metformin treatment restored the impaired endothelium-dependent and nitrergic relaxations, and the enhanced contractile response to phenylephrine in the corpus cavernosum of high-fat fed mice, without affecting the body weight and epididymal fat. In conclusion, our data shows that treatment with high-fat diet for 10 weeks reduces the intracavernous pressure, as well as the endothelial and nitrergic cavernosal relaxations. Concomitantly, this treatment increases the contractile responses, in

vitro. Metformin treatment restored the insulin sensitivity and the erectile dysfunction,

suggesting that erectile dysfunction in high-fat fed mice is the result of insulin resistance associated with obesity.

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1.1. Anatomia, Inervação e Hemodinâmica Peniana

A anatomia geral do pênis é semelhante em todas as espécies de mamíferos. O pênis humano consiste de três segmentos cilíndricos: os corpos cavernosos pareados localizados na parte dorsal e o corpo esponjoso na parte ventral, o qual circunda a uretra e forma a glande peniana na porção distal. Cada um dos corpos cavernosos é circundado por um tecido fibroso e compacto, a túnica albugínea, a qual é constituída em grande parte de fibras

de colágeno, bem como de algumas fibras de elastina (1). O tecido erétil dos corpos

cavernosos é composto de múltiplos espaços lacunares interconectados, revestidos por células endoteliais, além das trabéculas, que formam as paredes das lacunas e consistem de bandas espessas de músculo liso e de uma estrutura fibroelástica formada por fibroblastos,

colágeno e elastina (2). Os corpos cavernosos são divididos por um septo perfurado,

incompleto no humano, que os permite funcionar como uma unidade.

A parte proximal do pênis encontra-se ancorada ao osso pélvico, sendo esta região denominada crura dos corpos cavernosos, enquanto a parte proximal do corpo esponjoso forma o bulbo peniano. Tanto a crura quanto o bulbo estão conectados aos músculos estriados. O bulbo peniano está circundado pelo músculo bulbocavernoso (ou bulboesponjoso), ao passo que a crura peniana está circundada pelo músculo isquiocavernoso. A glande peniana apresenta uma aparência de esponja devido a um vasto plexo venoso com um grande número de anastomoses.

A inervação do pênis é autonômica (vias simpáticas e parassimpáticas) e somática (vias sensoriais e motoras). A partir da coluna espinhal e dos gânglios periféricos, as inervações simpáticas e parassimpáticas confluem, formando o nervo cavernoso, que adentra os corpos cavernosos e esponjosos para efetuar os eventos neurovasculares durante

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a ereção e detumescência. Os nervos somáticos são responsáveis pelas sensações e pela

contração dos músculos bulbo cavernoso e isquiocavernoso (3).

A via simpática origina-se do 11º segmento torácico e do 2º lombar, passando através do ramo ventral do nervo espinhal (ramo comunicante branco) para a cadeia ganglionar simpática. Algumas fibras dirigem-se através dos nervos esplânicos para os plexos hipogástrico superior e mesentérico inferior, através do nervo hipogástrico, em direção ao

plexo pélvico (3,4).

A via parassimpática surge de neurônios localizados do 2º ao 4º segmentos sacrais. As fibras pré-ganglionares passam pelo plexo hipogástrico superior pélvico para o plexo pélvico. Os nervos cavernosos então se ramificam do plexo pélvico em direção ao pênis. A estimulação do plexo pélvico e do nervo cavernoso induz ereção, enquanto que a

estimulação do tronco simpático causa detumescência (3).

A via somatosensorial origina-se de receptores sensoriais localizados na pele do pênis, da glande, da uretra e no interior do corpo cavernoso. Na glande do pênis humano há inúmeras terminações aferentes (terminações nervosas livres e receptores corpusculares) (3,5)

. As fibras nervosas que partem dos receptores convergem para o nervo dorsal do pênis que se unem a outros nervos formando o nervo pudendo. Este último adentra a coluna espinhal via segmentos S2 a S4 para terminais nos neurônios espinhais e interneurônios na

região cinzenta central do segmento lombo sacral (3). A ativação destes nervos sensoriais

envia mensagens de dor, temperatura e toque pelas vias espinotalâmicas e espinoreticular

para o tálamo e córtex sensorial desencadeando a percepção sensorial (3). O núcleo de Onuf,

do 2º ao 4º segmento sacral, é o centro da inervação somatomotora peniana. Estes nervos dirigem-se através dos nervos sacrais para o nervo pudendo para inervar os músculos

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ísquios e bulbo cavernosos. A contração do músculo isquiocavernoso participa da fase rígida da ereção, ao passo que a contração rítmica do músculo bulbo cavernosa é necessária

para a ejaculação (3).

O suprimento de sangue para o pênis deriva-se principalmente da artéria pudenda interna. Na maioria dos homens, esta artéria origina-se de uma das divisões do tronco isqueopudendo da artéria ilíaca interna ao nível da junção sacro-ilíaca. Após atravessar o tronco perineal no Canal de Alcock, a artéria pudenda interna origina a artéria peniana, a qual se subdivide na porção terminal em quatro ramos, designados artérias dorsal, uretral (esponjosa), cavernosa e bulbar. A artéria dorsal adentra o pênis, sendo responsável pela rigidez da glande peniana durante a ereção. A artéria esponjosa (ou uretral) corre longitudinalmente através do corpo esponjoso lateral até a uretra. Durante seu curso, ela abastece o corpo esponjoso, tecido uretral e glande peniana. A artéria cavernosa do pênis corresponde a um vaso bastante estreito que adentra o pênis juntamente com as veias e os nervos cavernosos. Após adentrar os corpos cavernosos, a artéria cavernosa divide-se em múltiplas ramificações terminais conhecidas como artérias helicinais, assim conhecidas devido ao seu aspecto espiralado durante o estado flácido. Estas artérias abastecem os espaços sinusoidais. A artéria bulbar adentra o bulbo do pênis logo após sua origem, e fornece sangue à glande e ao bulbo uretral proximal.

O pênis é drenado por três subdivisões de veias: superficiais, intermediárias e profundas. A drenagem venosa dos corpos cavernosos ocorre através das vênulas, localizadas entre a periferia do tecido erétil e a túnica albugínea. As vênulas se fundem para formar as veias emissárias maiores as quais rompem a túnica albugínea, e drenam em veias

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intermediárias emerge da glande peniana e forma o plexo retro coronal que drena na veia dorsal. Uma série de veias emissárias e circunflexas dos corpos cavernosos drena na veia dorsal profunda, a qual corre no sentido proximal na linha média entre os dois corpos cavernosos para esvaziar o plexo periprostático. O sistema venoso profundo drena tanto os corpos cavernosos quanto o corpo esponjoso. Os espaços cavernosos são drenados através de um conjunto de veias emissárias que rompem a túnica albugínea. Nas posições médias e distais, tais veias se fundem para formar as veias circunflexas, as quais se esvaziam na veia dorsal profunda. Na região proximal do pênis, as veias emissárias formam a veia cavernosa (veia profunda do corpo cavernoso), que atinge a veia pudenda interna. O corpo esponjoso drena através de um conjunto de veias uretrais e bulbares.

Os sinusóides são espaços formados irregularmente por trabéculas e consistem de bandas de músculo liso, fibras elásticas, colágeno e um tecido frouxo contendo numerosas arteríolas e nervos. Estes sinusóides contêm sangue, sendo considerados unidades contráteis intrinsecamente ativos sensíveis aos estímulos neurológicos; dessa maneira, possuem papel fundamental nos mecanismos de ereção e detumescência.

Durante o estado flácido, as arteríolas e os sinusóides estão contraídos, devido principalmente, à ativação de receptores α-adrenérgicos, exercendo resistência máxima ao influxo arterial. Neste estado, apenas pequena percentagem de sangue adentra os corpos

cavernosos com propósitos nutricionais (7). Ao mesmo tempo em que os sinusóides estão

contraídos, as veias drenam livremente para veias extra-penianas.

Neste estado, a musculatura lisa trabecular dos corpos cavernosos e das artérias cavernosas e helicinais se mantém em contração permanente. As trabéculas são drenadas pelas vênulas emissárias que se comunicam com as veias cavernosas. Neste estado flácido,

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a pO2 varia de 20 a 40 mmHg no pênis (8). Quando o bloqueio da atividade simpática se

instala, essas musculaturas relaxam (tumescência), permitindo o influxo arterial e aumento progressivo da pressão sangüínea intracavernosa. Assim, a dilatação das artérias cavernosa e helicinal levam ao aumento do fluxo sangüíneo nos espaços lacunares, ao mesmo tempo em que o relaxamento do músculo liso trabecular dilata os espaços lacunares causando

expansão do pênis. O influxo de sangue arterial está associado a aumento na pO2 (90-100

mmHg) durante o estado de tumescência (8). A elevação da pressão sangüínea ao nível das

artérias helicinais promove a expansão do músculo liso trabecular contra a túnica albugínea. Este evento comprime o plexo de vênulas sub-túnicas, reduzindo o efluxo venoso no espaço lacunar; dessa forma, o pênis é mantido rígido através do mecanismo de

oclusão venosa (2,9).

1.2. Importância do óxido nítrico (NO) na ereção peniana

O NO é o principal neurotransmissor de um sistema de transdução de sinais que atua

no pênis para mediar a resposta erétil (10,11). As enzimas responsáveis pela formação do NO

são conhecidas como óxido nítrico sintases (NOS), encontradas nas fibras nitrérgicas (nNOS) e células endoteliais (eNOS). Essas enzimas catalisam o metabolismo da L-arginina, formando NO e L-citrulina em duas etapas, com a formação do produto

intermediário Nω-hidroxi-L-arginina (12). No rato (13), camundongo (14) e no homem (15), a

nNOS está localizada no plexo pélvico, nervos cavernosos e seus terminais nervosos no tecido erétil, além de nervos penianos dorsais e plexos nervosos na adventícia de artérias cavernosa e dorsal. Além disso, o endotélio também libera NO em resposta à acetilcolina

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(ACh), bradicinina e força de cisalhamento (16, 17, 18). Observou se que a vasodilatação das

artérias helicinais causada pela despolarização do nervo cavernoso leva à liberação de NO

do endotélio sinusóide, como conseqüência do aumento do fluxo sangüíneo (19). Desta

forma, a regulação da função erétil parece não ser mediada exclusivamente pelo NO oriundo de fibras nitrérgicas. O aumento da força de cisalhamento evocado durante a resposta erétil estimula a fosfatidil-inositol 3-kinase (PI3K), fosforilando a proteína quinase B que, por sua vez, fosforila a eNOS levando à geração do NO no endotélio. Assim, acredita-se atualmente que a enzima nNOS inicia a resposta erétil enquanto que a eNOS

ajuda na manutenção do estado erétil (18).

Diversos estudos mostraram que inibidores da NOS têm a capacidade de bloquear o relaxamento do músculo liso do corpo cavernoso induzido por estimulação elétrica das

terminações NANC em espécies animais como coelho (20, 21,), cão (2), cavalo (23), macaco (24),

rato (13), camundongo (14) e humanos (15, 21, 25, 26, 28). Após a estimulação elétrica do corpo

cavernoso, observaram-se níveis aumentados de nitritos, nitratos e citrulina em coelho e

humanos (15, 20, 29,). O NO, bem como doadores de NO, relaxam preparações de tecido erétil

de humanos e coelhos (29, 30, 30, 31) e causa tumescência em cães, gatos, macacos e humanos

(32, 33) .

Sabe-se que quando liberado de fibras nitrérgicas ou do endotélio, o NO se difunde para células musculares lisas adjacentes e se liga ao seu receptor fisiológico intracelular, a guanilil ciclase solúvel (GCs). Esta ligação ocorre diretamente no grupo heme formando um complexo heme-ferrosonitrosil. A ligação do NO promove a quebra da ligação entre a

His105 axial e o ferro, resultando em um anel onde o NO está presente na quinta posição,

33

desta enzima pelo NO leva à conversão de guanosina trifosfato (GTP) no segundo-mensageiro, monofosfato cíclico de guanosina (GMPc). O GMPc ativa a proteína quinase dependente de GMPc (PKG), levando à redução da concentração de cálcio intracelular, causando o relaxamento da musculatura lisa e, conseqüentemente, ereção peniana. O GMPc é hidrolisado a GMP pela ação da fosfodiesterase tipo 5 (PDE5), cessando assim a resposta

erétil (10, 34). Atualmente, a principal terapia para a disfunção erétil envolve o tratamento

oral com inibidores de PDE5 (35, 36). O primeiro inibidor de PDE5 aprovado pela Food Drug

Administration (FDA) foi o sildenafil (Viagra™), seguido do vardenafil (Levitra™) e

tadalafil (Cialis™).

1.3. Disfunção erétil

A etiologia da disfunção erétil é multifatorial, podendo ser de origem orgânica, neurogênica, ou a associação de ambas. Pacientes que apresentam doença vascular estão

predispostos a desenvolver disfunção erétil vasculogênica (37, 38, 39). As alterações da

reatividade da musculatura lisa cavernosa estão associadas à diminuição da biodisponibilidade do NO e da contratilidade da musculatura lisa. Além disso, tem sido sugerido que o diagnóstico de disfunção erétil em “indivíduos sadios” possa indicar alterações precoces no sistema vascular. Dessa forma, a disfunção erétil pode ser considerada um marcador importante no diagnóstico de doenças cardiovasculares

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1.4. Obesidade, resistência à insulina e disfunção erétil

A obesidade é atualmente considerada um dos principais problemas de saúde pública. Nas últimas três décadas a prevalência da obesidade alcançou proporções epidêmicas nos

Estados Unidos e na Europa (41). No Brasil, a obesidade atinge mais de 12% das crianças

entre 5 e 9 anos de idade, cerca de 5% da população entre 10 e 19 anos, 16,9% das

mulheres e 12,4% dos homens acima de 20 anos de idade (42).

Dentre as principais causas da obesidade, se destacam o crescente consumo de alimentos hipercalóricos ricos em gordura saturada e açúcares, e redução da atividade física (43)

. Além disso, a predisposição genética parece ser fator determinante na suscetibilidade à

obesidade (44). A obesidade pode ser detectada através do índice da massa corporal (IMC)

acima ou igual a 30 quilo-gramas por m2, calculado pela razão do peso em quilogramas

dividido pelo quadrado da altura em metros (45). É considerada importante fator de risco

para o surgimento de resistência à insulina, dislipidemia, diabetes tipo 2, hipertensão arterial e hipogonadismo. Estes são fatores de risco que podem atuar de maneira sinérgica no desenvolvimento da disfunção erétil vasculogênica.

Até o momento, poucos estudos experimentais avaliaram o efeito da obesidade

na função erétil. Recentemente, Carneiro et al. (106) relataram que corpos cavernosos de

camundongos obesos e diabéticos tipo II (db/db) apresentam redução no relaxamento

endotelial e nitrérgico. Kim et al. (71) mostraram que dieta hiperlipídica associada à

obesidade em ratos causa redução na expressão da eNOS e nNOS no tecido erétil. Estudos com camundongos knockout para apolipoproteína E, tratados com dieta hiperlipídica, apresentaram hipercolesterolemia e redução no relaxamento dependente de endotélio nos

35

corpos cavernosos (107, 108), sem apresentar obesidade (109). Estudos com corpos cavernosos

de coelhos tratados com dieta hiperlipídica apresentaram síndrome metabólica e redução da

expressão da eNOS, sem apresentar alteração do peso corporal(110). Entretanto, nenhum

estudo investigou o efeito da resistência à insulina associada à obesidade na função erétil. A resistência à insulina é um estado de desregulação da homeostase glicose-insulina em que a capacidade da glicose-insulina de estimular a captação de glicose nos tecidos

periféricos (músculo esquelético e tecido adiposo) está reduzida (46). A resistência à in-

sulina é altamente prevalente em homens com disfunção erétil (47). Afeta 25% dos adultos

nos E.U.A. e essa prevalência sobe para 60% em indivíduos acima do peso (48, 49). Estudos

mostram que a resistência à insulina está fortemente associada à disfunção endotelial,

podendo causar alterações na via intracelular de sinalização do NO (46). A insulina, atuando

através de seu receptor, promove a liberação de NO, tanto através da via de sinalização dependente da PI3K, como pela capacidade de induzir o aumento da expressão e ativação

da nNOS e eNOS (50, 51, 52). Portanto, o quadro de resistência à insulina parece comprometer

o efeito vasodilatador da insulina por reduzir a biodisponibilidade e/ou a reatividade do NO

endógeno, concomitantemente com declínio na produção basal deste mediador (51, 53).

1.5. Sensibilizador de insulina: Metformina

A metformina é uma biguanida, e atua como sensibilizador de insulina, sendo utilizada clinicamente para reduzir a glicemia e a resistência à insulina. A metformina inibe a produção hepática de glicose, aumenta o efeito da insulina de promover a captação de

36 55, 56, 57)

. A metformina também atua na redução do perfil lipídico (58,59). O mecanismo por

qual a metformina melhora a sensibilidade à insulina não está totalmente esclarecido, mas um notável mecanismo é por meio da ativação da proteína quinase ativada por AMP

(AMPK) (60, 61). Fisiologicamente, a AMPK é ativada pelo aumento da razão AMP/ATP

(62)

. Outros estudos mostraram que a metformina age melhorando a função vascular, tanto

em animais quanto em humanos (63, 64, 65, 66, 67). Estudos anteriores relataram que a

metformina tem ação anti-hipertensiva (68, 69, 70) e que o uso crônico aumenta a atividade e

expressão da NOS em artéria mesentérica e corpo cavernoso (66, 71). Em cultura de células

endoteliais bovinas, a metformina promoveu aumento da produção de GMPc através da ativação da AMPK, que, uma vez ativada, fosforila o sítio serina-1179 da eNOS. Dessa

forma, aumenta a atividade da enzima e a biodisponibilidade de NO (72). A metformina

também exerce efeito cardioprotetor através da ativação da via AMPK-eNOS (serina-1177) (73, 74, 75)

. Em preparações vasculares, incluindo aorta e artéria mesentérica de ratos, a

metformina produz relaxamento concentração-dependente (63, 76). A pré-incubação com

L-NAME (inibidor de NOS) apenas bloqueou o relaxamento da metformina nas concentrações iniciais, sem alterar a resposta máxima. O relaxamento foi bloqueado apenas na presença do inibidor de canais de potássio voltagem-dependente, 4-aminopiridina, e do

inibidor dos canais de potássio ativados por cálcio, tetraetilamônio (76). Recentemente,

demonstrou-se que o tratamento crônico com metformina reduz a produção de ânion superôxido e restaura o relaxamento dependente de endotélio em aorta de ratos diabéticos (78)

. Estudos anteriores mostram que a metformina exerce efeito na via de sinalização da insulina. A metformina aumenta a fosforilação em tirosina do receptor de insulina, a

37

1.6. Modelos animais de obesidade

A obesidade e doenças associadas, como resistência a insulina, diabetes do tipo 2, dislipidemia e esteatose hepática, condição atualmente conhecida como síndrome metabólica, são um dos maiores desafios para a pesquisa básica e clínica. É evidente que o desenvolvimento de modelos animais apropriados é crucial para os estudos da patogênese e

terapia desta complexa desordem metabólica (81). Por essa razão, diversos estudos vêm

utilizando dietas enriquecidas com gordura, conhecidas como dietas hiperlipídicas, para produzir modelos de obesidade em roedores. A primeira descrição desta intervenção nutricional data da década de 40. Estudos subseqüentes revelaram que as dietas

hiperlipídicas promovem hiperglicemia e resistência à insulina (82, 83, 84).

A alimentação prolongada com dieta hiperlipídica promove um aumento no peso corporal, em animais suscetíveis, na proporção de 10 a 20% acima dos controles alimentados com dieta padrão para roedores. A indução da obesidade torna-se mais efetiva

quando a dieta tem início nos animais jovens e perdura por diversas semanas (85). O ganho

de peso durante o período de alimentação com a dieta é gradual, porém, já pode ser observado após duas semanas, tornando-se mais evidente quando o tratamento é realizado

com dieta hiperlipídica por mais de quatro semanas (81).

Estudos recentes mostraram que animais suscetíveis à obesidade são hiperfágicos, e este fenômeno ocorre provavelmente devido a uma resistência central a ação anorexígena

da insulina (86) e redução na expressão hipotalâmica de peptídeos anorexígenos (87). Ratos

que se mantêm magros quando submetidos à dieta hiperlipídica comem a mesma

38

animais resistentes à obesidade induzida por dieta podem tornar-se um importante modelo para o estudo da base genética do ganho de peso.

Ao analisar os dados registrados na literatura fica óbvio que os efeitos da dieta não dependem somente da composição da mesma, mas também do tipo de roedor e da sua

linhagem (89, 90). A análise da suscetibilidade à dieta dependente da linhagem e tem sido

extensivamente estudada em camundongos. Por isso, sabe-se que camundongos C57BL/6J,

AKR/J e DBA/2J são mais suscetíveis a desenvolver obesidade e resistência à insulina (90,

91, 92, 93, 94) .

Dentre estas linhagens, os camundongos C57BL/6J são os mais utilizados como

modelo de síndrome metabólica e resistência à insulina (95). A predisposição desta linhagem

para desenvolver obesidade tem sido explicada pelo aumento na resistência à leptina

39

JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA

A disfunção erétil constitui um problema de saúde pública pela sua prevalência, impacto negativo na qualidade de vida do homem e pelo fato de estar associada a várias comorbidades clínicas. Estudos recentes vêm sugerindo que a disfunção erétil possa ser uma manifestação precoce de doenças cardiovasculares extra-peniana. A prevalência de obesidade vem aumentando a cada ano, sendo um dos principais fatores de risco para a disfunção erétil. Entretanto, até o momento, poucos estudos avaliaram os mecanismos envolvidos na disfunção erétil causada pela obesidade associada a resistência à insulina. Assim, propusemos a hipótese que a obesidade associada a resistência à insulina prejudica a função erétil por reduzir a biodisponibilidade de NO e consequentemente a síntese de GMPc. Acreditamos que o modelo proposto neste trabalho, de obesidade induzida por dieta hiperlipídica em camundongos, nos possibilitará avançar na compreensão da fisiopatologia da disfunção erétil resultante de obesidade.

40 OBJETIVOS

Objetivo geral

1. Investigar as alterações fisiopatológicas do corpo cavernoso resultantes da obesi- dade induzida por dieta hiperlipídica em camundongos.

2. Avaliar a influência do tratamento com o sensibilizador de insulina, metformina, nas alterações fisiopatológicas do corpo cavernoso resultantes da obesidade induzida por dieta hiperlipídica em camundongos.

Objetivos Específicos

 Realizar curvas concentração-efeito in vitro a agentes relaxantes dependente (acetilcolina) e independente de endotélio (nitroprussiato de sódio), assim como à estimulação elétrica (relaxamento nitrérgico) em corpos cavernosos de camundongos controle e obesos, pré-contraídos com fenilefrina;

 Realizar curvas concentração-efeito in vitro a agentes contráteis como fenilefrina (agonista α1-adrenérgico) e endotelina-1, assim como a estimulação elétrica (contração neurogênica), em corpos cavernosos de camundongos controle e obesos;  Avaliar a pressão intracavernosa (ICP) dos animais controle e obesos;

 Quantificar os níveis de GMPc nos corpos cavernosos de camundongos controle e obesos;

 Caracterizar as alterações estruturais dos corpos cavernosos dos animais controle e obesos.

 Avaliar o efeito do tratamento crônico com metformina sobre as respostas relaxantes e contráteis dos corpos cavernosos de animais controles e obesos;

41

42 2.1 Animais

Foram utilizados camundongos machos com 4 semanas de idade, da linhagem C57BL6. A obesidade foi induzida através da substituição da dieta padrão por dieta AIN-93G, modificada para hiperlipídica, a qual consiste em 35 % do peso de lipídeos (Tabela 1),

durante 10 semanas (98). Os grupos controles receberam dieta comercial padrão para

roedores de acordo com o AIN-93G, da marca NUVILAB. As dietas e a água foram oferecidas ad libtum. Os animais foram mantidos em estantes apropriadas, com temperatura controlada em torno de 22 ºC ± 1 ºC, além da regulação de fotoperíodo em 12 horas claro/escuro. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA-IB/UNICAMP), protocolo n° 1496-1.

Tabela 1: Composição da dieta experimental

Ingredientes

AIN-93

AIN-93 modificada

g/100g g/100g Amido de milho 39,8 11,8 Caseína 20,0 20,0 Dextrina 13,2 13,2 Sacarose 10 10 Óleo de soja 7,0 4 Banha de porco 0 31

Celulose microfina (fibra) Mix de minerais 5,0 3,5 5,0 3,5 Mix de Viataminas L-cistina Bitartarato de colina TOTAL 1 0,30 0,25 100,0 1 0,30 0,25 100,0 Reeves et al., 1993. American Institution of Nutrition-93 G

43

2.2. Preparo do corpo cavernoso isolado de camundongo

Para isolamento do corpo cavernoso, os camundongos foram anestesiados com uretana (1,2 g/kg i.p.), após o qual foi coletado o sangue para análises. O pênis foi retirado na região de inserção da crura e imediatamente colocado em solução de Krebs-Ringer com

a seguinte composição em mM: NaCl, 118; NaHCO3, 25; glicose, 5,6; KCl, 4,7; KH2PO4,

1,2; MgSO4.7H2O, 1,17 e CaCl2.6H2O, 2,5. Após remoção dos tecidos conectivos, o tecido cavernoso foi dissecado e isolado. Cada pênis forneceu dois segmentos de corpos cavernosos dissecados (aproximadamente 1,0 x 0,2 x 0,2 cm), os quais foram montados em câmaras de incubação para órgão isolado (10 ml) preenchidas com solução

Krebs-Henseleit, e continuamente gaseificadas com O2:CO2 (95:5 %), à temperatura de 37° C (pH

7,4). Os segmentos de corpos cavernosos foram suspensos entre um transdutor de força de unidade fixa. A tensão aplicada aos tecidos (2,5 mN) foi periodicamente ajustada até obter-se a estabilização dos mesmos (60 min). As alterações de tensão foram medidas usando-obter-se transdutores isométricos (AD Instruments, Austrália) e registradas em sistema PowerLab™ de aquisição de dados (Software versão 7.0, AD Instruments, Austrália).

2.3. Curvas concentração-resposta

Após o período de estabilização, a viabilidade e integridade dos tecidos foram testadas utilizando-se solução de Krebs modificada ao banho, em que 80 mM NaCl foi substituído de forma equimolar por KCl. Em seguida, respostas relaxantes ao agonista muscarínico, acetilcolina (ACh, 1 nM -10 µM) e ao doador de NO, nitroprussiato de sódio

44

(SNP, 10 nM -100 µM) foram obtidas em corpos cavernosos pré-contraídos com fenilefrina (10 μM). Avaliou-se também a resposta contrátil construindo-se curvas concentração-resposta à fenilefrina (10 nM - 100 μM) e endotelina-1 (100 pM – 100 nM). As curvas concentração-resposta foram obtidas através do aumento cumulativo das concentrações das drogas em questão em meia unidade logarítmica. A análise de regressão não-linear para

determinar os parâmetros de Emax e log EC50 (pEC50) foi obtida com o programa GraphPad

Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

2.4. Estimulação elétrica

Para o estudo da estimulação elétrica (EFS), os corpos cavernosos foram montados entre dois eletrodos de platina dispostos de forma paralela. Os tecidos foram estimulados eletricamente a uma voltagem de 50 V, com duração dos pulsos de 1 milisegundo, intervalo entre os pulsos de 0,2 ms, duração da estimulação de 10 segundos nas freqüências de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 Hz com intervalo de 3 minutos entre os estímulos, conforme nossa experiência

prévia (17).

As respostas relaxantes à estimulação elétrica (EFS, 1-32 Hz) foram obtidas em tecidos previamente tratados por 30 min. com guanetidina (30 μM) para depletar os estoques de noradrenalina, e atropina (1 μM) para bloquear a resposta muscarínica. Em seguida, os tecidos foram pré-contraídos com fenilefrina (10 μM) para construção da curva frequência-resposta (1-32 Hz). A resposta contrátil induzida pela estimulação elétrica foi avaliada em tecidos previamente tratados por 30 min. com L-NAME (100 μM, inibidor não seletivo da NOS) e atropina (1 μM, antagonista de receptor muscarínico).

45

2.5. Monitoramento da pressão intracavernosa (experimentos “in vivo”)

Os animais foram anestesiados com uretana (1,2g / kg) por via intraperitoneal. Uma cânula provida de agulha 26G foi inserida no corpo cavernoso esquerdo para registro da pressão intracavernosa (ICP), usando-se transdutores de pressão (Grass, Astro-Med Industrial Park, EUA). A cavidade abdominal foi aberta expondo-se o nervo cavernoso esquerdo, localizado na região dorso-lateral da próstata. Um eletrodo bipolar de platina conectado a um estimulador (Grass S48, Quincy, MA, EUA) foi posicionado sobre o nervo cavernoso. Foram aplicadas estimulações elétricas do nervo cavernoso (pulso de 1 ms, 45 s, 6 V) a diferentes freqüências (4, 6, 8, 10 e 12 Hz). As alterações da ICP foram registradas em sistema PowerLab™ de aquisição de dados (Software versão 7.0, AD Instruments, MA, EUA).

2.6. Determinação dos níveis de GMPc

Para determinação dos níveis de GMPc em homogenatos de corpos cavernosos de camundongos, os tecidos foram equilibrados durante 20 min em solução de Krebs continuamente oxigenada à 37ºC. Os tecidos foram então estimulados por 10 min com SNP (100 nM). Alguns tecidos foram incubados com ODQ (10 μM) por 10 min antes da adição de SNP. Em seguida, os tecidos foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido, pulverizados, homogeneizados em ácido tricloroacético (TCA, 5%) e centrifugados à 1500 g por 10 min à 4 ºC. O TCA foi extraído das amostras através de três lavagens com solução de éter saturado com água. A preparação do tracer, amostras, padrões e incubação com

46

anticorpo foram feitas conforme descrito no kit disponível comercialmente (Cayman Chemical Cyclic GMP EIA kit, Ann Arbor, MI, EUA). Os ensaios foram realizados em duplicata.

2.7. Medida do perfil lipídico

As dosagens de colesterol total, LDL, HDL e triglicerídeos foram realizadas ao final da décima semana de tratamento com dieta hiperlipídica através de kits comerciais (Katal Biotecnológica Indústria e Comércio Ltda, Belo Horizonte - Brasil).

2.8. Teste de tolerância à insulina (ITT)

Para investigar a taxa de desaparecimento da glicose (Kitt), os camundongos foram

submetidos ao teste de tolerância à insulina. Após jejum de 12/h, os animais receberam injeção intraperitoneal de insulina (1 UI/Kg de peso). Amostras de sangue foram coletadas através de incisão na cauda do animal, nos tempos 0, 15, 30, 60 minutos, para determinação da glicemia. A concentração de glicose em sangue total foi realizada por método

enzimático/fotométrico utilizando-se um glicosímetro automático Accu-Chek Go® (Roche

Diagnóstica, Brasil) e fitas apropriadas.

A constante de desaparecimento da glicose foi calculada aplicando-se a fórmula

0,693/t1/2. O t1/2 da glicose foi calculado a partir da inclinação da curva de regressão

47 2.9. Análise estatística

A resposta contrátil dos corpos cavernosos foi calculada em relação à contração máxima produzida pelo KCl (80 mM). A resposta relaxante foi calculada em relação à contração máxima produzida pela fenilefrina (10 µM), a qual foi tomada como 100%.

Valores de EC50 foram apresentados como o logaritmo negativo (pEC50) calculados pelo

programa GraphPad Prism. Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão das médias (E.P.M.) de n experimentos indicados em cada caso. Para comparações múltiplas de variáveis independentes foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey. Teste t de Student não pareado foi utilizado para alguns experimentos. O programa InStat (GraphPad Software) foi utilizado para as análises estatísticas. Valores de P < 0.05 foram considerados significativos.

48

49

3.1. Características morfométricas, perfil lipídico e glicêmico dos animais controles e obesos

A Tabela 2 mostra a média do ganho ponderal dos animais que se tornaram obesos através da alimentação com dieta hiperlipídica durante 10 semanas e seus respectivos controles alimentados com dieta padrão. Os animais alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram aumento de 26% no peso corporal e de 241% no peso do tecido epididimal, confirmando aumento de adiposidade visceral. Os camundongos obesos também apresentaram aumento significativo nos níveis de colesterol total e LDL em relação ao grupo controle. Os níveis de HDL e triglicerídeos não diferiram significativamente entre os grupos controle e obeso.

A sensibilidade à insulina foi avaliada pelo teste de intolerância à insulina. A ta-xa

de desaparecimento de glicose (Kitt) foi significativamente menor no grupo obeso em

comparação com o grupo controle, indicando resistência à insulina (Tabela 2; Figura 1). Os níveis de glicose em jejum não diferiram significativamente entre o grupo controle e obeso (Tabela 2).

50

Tabela 2: Efeito da dieta hiperlipídica sobre os valores morfométricos, perfil lipídico e

glicêmicos de camundongos C57BL/6 após 10 semanas de tratamento.

Controle Obeso Peso corporal (g) 31 ± 0,2 39 ± 0,32* Gordura epididimal (g) 0,41 ± 0,02 1,4 ± 0,2* Colesterol total (mg/dl) 88 ± 5 142 ± 4* LDL (mg/dl) 44 ± 12 73 ± 34* HDL (mg/dl) 39 ± 6 52 ± 4 Triglicerídeos (mg/ml) 132 ± 20 103 ± 14 Kitt (min-1)% 4 ± 1 2 ± 0,18* Glicemia (mg/dL) 158 ± 3 169 ± 5

Os dados representam média ± erro padrão da média para 9 camundongos. *P <0,05 comparado com o controle.

Figura 1: Teste de tolerância oral à insulina em camundongos após 10 semanas de

tratamento com dieta hiperlipídica. Os valores representam as médias ± erro padrão da média de 6 animais. *P<0,05; **P<0,01 quando comparado com o controle.

0 15 30 45 60 0 50 100 150 200 250 Controle Obeso

**

*

Tempo (min)

G

li

ce

m

ia

(

m

g

/d

l)

51 3.2. Medidas de pressão intracavernosa

As estimulações elétricas do nervo cavernoso produziram aumento da pressão intracavernosa (ICP) dependentes da frequência, as quais foram significativamente menores no grupo obeso para as frequências de 6, 8, 10 e 12 Hz (Figura 2).

4 6 8 10 12 0 25 50 75 _Controle Obeso

**

*

**

**

Frequência: Hz

Figura 2. Avaliação da resposta erétil in vivo pela estimulação do nervo cavernoso de

camundongos obesos e controle. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média de 5 animais. *P<0,05; **P<0,01 comparado com os respectivos grupos controle.

52

3.3. Relaxamento dependente de endotélio (ACh)

O relaxamento dependente de endotélio foi avaliado através da construção de curvas concentração-efeito à ACh (10 nM – 10 μM) em corpos cavernosos de camundongos pré-contraídos com fenilefrina (10 μM). Notamos redução significativa (P < 0,001) da potência

(pEC50) e da resposta máxima da ACh nos animais obesos (Figura 3; Tabela 3). A

pré-incubação com L-NAME (100 μM) levou à inibição completa do relaxamento induzido pela ACh em ambos os grupos experimentais.

-9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100

Controle

Obeso

Controle + L-NAME

Obeso + L-NAME

Log [ACh]: M

R

el

a

xam

e

n

to

(%

)

***

Figura 3. Curvas concentração-efeito à acetilcolina (ACh) em corpos cavernosos de

camundongos. O relaxamento foi calculado como porcentagem da contração induzida pela fenilefrina (10 μM), que foi tomada como 100%. Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 7-9 experimentos. ***P<0,001; comparado com o grupo controle.

53

Tabela 3: Valores de potência (pEC50) e resposta máxima (Emax) obtidos de curvas concentração-resposta à acetilcolina (ACh), nitroprussiato de sódio (SNP), fenilefrina (PE) e endotelina-1 (ET-1) em corpos cavernosos de camundongos obesos e controle.

Grupo pEC50 Emax (%)

ACh Controle 7,38 ± 0,04 80 ± 3 Obeso 6,81 ± 0,06*** 53 ± 6*** SNP Controle 6,49 ± 0,06 77 ± 7 Obeso 6,37 ± 0,04 77 ± 5 PE Controle 5,33 ± 0,02 101 ± 7 Obeso 5,30 ± 0,05 127 ± 6 * ET-1 Controle 6,88 ± 0,20 32 ± 4 Obeso 7,72 ± 0,20** 51 ± 8

O relaxamento foi calculado como porcentagem da contração induzida pela fenilefrina (10 μM), que foi tomada como 100%. As contrações foram calculadas como porcentagem da contração induzida pelo KCl (80 mM), que foi tomada como 100%. Os dados representam media ± erro padrão da média para 5 - 9 animais.*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 em relação ao grupo controle.

54

3.4. Relaxamento induzido pelo doador de óxido nítrico (SNP)

O relaxamento foi avaliado através da construção de curvas concentração-efeito ao nitroprussiato de sódio (SNP), em corpos cavernosos de camundongos pré-contraídos com fenilefrina 10 μM. Nem a potência, nem a resposta máxima do SNP foi alterada nos corpos cavernosos dos animais obesos (Tabela 3; Figura 4).

Figura 4. Curvas concentração-efeito ao nitroprussiato de sódio (SNP; 10 nM – 100 μM)

em corpos cavernosos de camundongos. O relaxamento foi calculado como porcentagem da contração induzida pela fenilefrina (10 μM), que foi tomada como 100%. Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 5 experimentos.

-8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 Controle Obeso

Log [SNP]: M

R

e

laxa

m

en

to

(

%

)

55 3.5. Relaxamento nitrérgico

Os relaxamentos nitrérgicos foram avaliados em corpos cavernosos pré-contraídos com fenilefrina (10 μM), pré-tratados com guanetidina (30 μM) e atropina (1 μM) . A estimulação elétrica da preparação induziu relaxamentos frequência-dependentes (1-32 Hz). Os relaxamentos nitrérgicos foram significativamente menores nos tecidos de animais obesos, em todas as freqüências estudadas. A pré-incubação com L-NAME (100 μM) inibiu completamente o relaxamento nitrérgico em ambos os grupos experimentais (Figura 5).

Figura 5. Relaxamentos de corpos cavernosos de camundongos induzidos por estimu-

lações elétricas (1 – 32 Hz). Os relaxamentos foram calculados como porcentagem da contração induzida pela fenilefrina (10 μM), que foi tomada como 100%. Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 6-7 experimentos. **P<0,01; ***P<0,001 comparado com o grupo controle.

1 2 4 8 16 32 0 25 50 75 100 Controle Obeso

***

***

**

**

**

_***

Frequência [Hz]

R

e

laxa

m

en

to

(

%

)

56 3.6. Contração neurogênica

Em preparação pré-tratadas com L-NAME (100 µM) e atropina (1 µM), a estimulação elétrica produziu contrações frequência-dependentes nos corpos cavernosos (1 – 32 Hz). Nos animais obesos, a resposta contrátil neurogênica foi maior do que nos animais controles nas frequências de 2, 4 e 8 Hz (Figura 6).

Figura 6. Contrações de corpos cavernosos de camundongos obesos e controle induzidas

pela estimulação elétrica. As contrações foram calculadas como porcentagem da contração induzida pelo KCl (80 mM), que foi tomado como 100%. Os dados são expressos como

média ± erro padrão da média de 5 animais. *P<0,05; ٭* P<0,01 comparado com o

respectivo grupo controle.

1 2 4 8 16 32 0 25 50 75 Controle Obeso

[Hz]

*

**

*

Frequência

C

o

nt

ra

çã

o

(%

)

57 3.7. Contração induzida pela fenilefrina

A contração à fenilefrina foi avaliada através da construção de curvas concentração-efeito a este agonista (10 nM – 100 μM) em corpos cavernosos de camundongos controles e obesos. A resposta máxima à fenilefrina foi significativamente maior (P < 0.05) nos corpos cavernosos do grupo obeso em comparação com o grupo controle (Figura 7). Não houve alteração significativa na potência a este agonista (tabela 3).

Figura 7. Curvas concentração-efeito à fenilefrina em corpos cavernosos de camundongos

obesos e controle. A contração foi calculada como porcentagem da contração induzida pelo KCl (80 mM), que foi tomado como 100%. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média de 7 animais. *P<0,05; comparado com o respectivo grupo controle.

-9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 100 150

_Controle

Obeso

*

Log [Fenilefrina]: M

C

o

n

tr

aç

ã

o (

%

)

58 3.8. Contração induzida pela endotelina-1 (ET-1)

A contração à ET-1 foi avaliada através da construção de curvas concentração-efeito a este agonista (100 pM – 300 nM) em corpos cavernosos de camundongos controles e obesos. A potência da ET-1 foi significativamente maior (P < 0.05) nos corpos cavernosos do grupo obeso em comparação com o grupo controle (Tabela 3; Figura 8).

-10 -9 -8 -7 -6 0 25 50 75

_Controle

Obeso

Log [ET-1]: M

C

o

n

tr

aç

ã

o (

%

)

Figura 8. Curvas concentração-efeito à endotelina-1 (ET-1) em corpos cavernosos de

camundongos obesos e controle. A contração foi calculada como porcentagem da contração induzida pelo KCl (80 mM), que foi tomado como 100%. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média de 5 animais.

59

3.9. Determinação dos níveis de GMPc em corpo cavernoso

Os níveis basais de GMPc nos corpos cavernosos foram 47% menor no grupo obeso em comparação com o grupo controle (Figura 9). O tratamento prévio com o ODQ (10 μM) reduziu significativamente (P<0,01) os níveis de GMPc nos corpos cavernosos do grupo controle, mas não no grupo obeso. A incubação dos tecidos com SNP (100 nM) produziu aumentos significativos (P<0,001) nos níveis de GMPc em ambos os grupos. O tratamento prévio dos tecidos com ODQ (10 μM) aboliu as elevações de GMPc pelo SNP (Figura 9).

Basal 0.0 0.4 0.8 1.8 2.0 2.2 2.4 SD HFD ODQ SNP

**

**

***

***

#

Figura 9. Níveis de GMPc em homogenatos de corpos cavernosos de camundongos obesos

e controle. Os tecidos foram incubados com nitroprussiato de sódio (SNP; 100 nM) na ausência e na presença de ODQ ( 10 μM). Os níveis de GMPc são expressos como média ± erro padrão da média de 4 animais. **P<0,01; ***P<0,001 comparado com o respectivo controle. # P < 0,01 comparado com o respectivo basal.

60

3.10. Histomorfometria dos corpos cavernosos

A análise morfométrica mostrou que o tratamento com dieta hiperlipídica não altera de modo significativo a área de secção transversal, diâmetro máximo e densidade de músculo liso dos corpos cavernosos dos camundongos (Tabela 4).

Tabela 4: Área de secção transversal, diâmetro máximo e densidade de músculo liso em

corpos cavernosos de animais controles e obesos.

Controle Obeso

Área de secção transversal (µm2) 1,19 ± 0,11 x 106 1,12 ± 0.13 x 106

Diâmetro máximo (µm2) 1867 ± 74 1464 ± 491

Densidade de músculo liso (µm2) 0,07 ± 0,02 0,07 ± 0,001

Os dados representam média ± E.P.M. para corpos cavernosos de 3 animais para cada grupo.

3.11. Efeito do tratamento crônico com metformina na disfunção erétil

Os animais controles e obesos foram tratados por gavagem com metformina (300 mg/Kg/dia) por 14 dias, a partir da 8ª semana de tratamento com dieta hiperlipídica. Ao fim do qual foram submetidos aos protocolos descritos abaixo.

61

3.11.1. Peso corporal, gordura epididimal e teste de tolerância à insulina

O tratamento crônico com metformina não alterou o peso corpóreo dos animais e nem o peso da gordura epididimal, para ambos os grupos (Figura 10). A taxa de

desaparecimento da glicose (Kitt) não foi alterada pelo tratamento no grupo controle;

entretanto, foi restaurada no grupo obeso (Tabela 5).

25 30 35 40 45 50 Controle Obeso Controle + Metformina Obeso + Metformina Dias 0 7 14

*

_*

*

*

*

*

Figura 10. Efeito do tratamento crônico com metformina no peso corporal (g) dos animais

controles e obesos. Os valores representam as médias ± E.P.M de 7 animais. *P<0,05 comparado com o grupo controle.

Tabela 5: Efeito do tratamento crônico com metformina sobre os valores morfométricos e

tolerância à insulina.

Controle Controle + Met. Obeso Obeso + Met. Peso corporal (g) 31 ± 0,6 30 ± 0,7 43 ± 2* 42 ± 1* Gordura epididimal (mg) 0,32 ± 0,06 0,39 ± 0,02 1,89 ± 0,13* 1,86 ± 0,1

Kitt (min

-1

)% 4 ± 1 4,6 ± 1,2 2 ± 0,1* 5,7 ± 0,3 #

Os dados representam média ± erro padrão para 7 animais. *P < 0,05 comparado com os respectivos grupos controles. # P < 0,05 comparado com o grupo obeso.

62

3.11.2. Relaxamento dependente de endotélio (ACh)

Os animais controles e obesos foram tratados com metformina (300 mg/Kg) por 15

dias. No grupo controle, a potência (pEC50) da ACh não foi afetada pelo tratamento com

metformina, ao passo que no grupo obeso, a potência foi significativamente restaurada pelo tratamento (P<0,05; Tabela 6). A resposta máxima da ACh do grupo controle não foi alterada pelo tratamento com metformina; entretanto, a resposta máxima do grupo obeso foi significativamente restaurada (Tabela 6; Figura 11).