Separação, Técnicas Electroanalítica e Espectroquímica

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Separação, Técnicas Electroanalítica e

Espectroquímica

Separação, Técnicas Electroanalítica e Espectroquímica

Elaborado por: Vincent MAKOKHA

Traduzido por: André Gulube

Universidade Virtual Africana

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Universidade Virtual africana

Índice

I. Separação, Técnicas Electroanalítica e Espectroquímica 3

II. Conhecimentos ou Cursos Prepedéuticos 3

III. Tempo 3 IV. Materiais 3 V. Módulo Racional 4 VI. Contéudo 4 6.1 Resumo 4 6.2 Esboço 5 6.3 Organização gráfica 7

VII. Objectivo geral 8

VIII. Objectivo(s) especifico (s) 8

IX. Actividades de Ensino e Aprendizagem 12

X. Conceitos chave 18

XI. Orientações para a Aprendizagem 23

XII. Leitura compulsória 24

XIII. Conecções úteis 26

XIV. Recursos Multimédia 34

XV. Actividades de Aprendizagem 36

XVI. Síntese do Módulo 106

XVII. Avaliação sumativa 108

XIII. Autor principal do Módulo 110

XIX. Referências 111

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I. Separação, Técnicas electroanalítica e

Espectroquímica

Por: Vincent Makokha

Traduzido por: Prof. Doutor André Gulube

II. Conhecimento Prévio

• Estrutura atómica e conceito de níveis de energia • Introdução às equações Redox

• Acerto de Equações Redox • Potencial Padrão de redução • Equação de Nernst • Conceitos de Sampling • Erros e estatísticas • Teorias de ligação • Electroquímica

III. Horas

• Separação,Técnicas cromatográficas 25 horas • Técnicas Electroquímicas 15 horas • Espectroscopia e Técnicas de Espectroscopia atómica 20 horas • Espectroscopia Molecular 1(UV e IR) 30 horas • Espetroscopia Molecular 2 (NMR) 15 horas • Espectrometria de Massas 15 horas

IV. Materiais

Serão necessários os seguintes materias e recursos para completar o módulo: • Computador, CD-ROM e uma biblioteca eletrónica;

• Aceder ao módulo, exames e outros materias relevantes, através de um computador; • Conecção à Internet para aceder ao módulo e a outros materiais sugeridos;

• Discussões interactivas/ sessões de conversas;

• Fichas de leitura recomendadas e materiais para ajudar no processo de aprendizagem e compreessão dos tópicos do módulo;

• Macromédia flash player. Universidade Virtual Africana 2

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V. Módulo Racional

A Separação, as técnicas Electroanalítica e Espectroscópica são bases duma análise instrumental aplicada na Indústria, Química, Bioquímica, Meio Ambiente e Escolas. Estas técnicas são baseadas nos princípios básicos da Química abordados nas escolas. Assim, neste módulo iremos estudar os princípios nos quais estas técnicas são básicas e requerem habilidades para o uso das mesmas.

Tendo conhecimentos profundos nesta área, irá ajudar o estudante a ensinar melhor na escola.

VI. Conteúdo

6.1 Resumo

Este módulo consiste na inter-relação de três áreas; separação e técnicas cromatográficas, técnicas electroanalíticas e métodos espectroscópicos.

Este módulo será abordado em seis unidades de aprendizagem reflectindo nos conceitos comuns e metodologias.

As unidades de técnicas de separacao e cromatográfica irão relembrar as técnicas de separação elementares que são sempre abordadas nas escolas seguido de discussões sobre as técnicas de cromatografia; estas são abrangidas na introdução das teorias gerais de cromatografia, seguido por suas aplicações em diferentes técnicas do plano e técnicas de colunas cromatográficas.

As técnicas electroanalíticas irão introduzir os princípios básicos para a Potenciometria,

elaborando as aplicações comuns de Potenciometria; mais adiante seguir-se-á a Voltametria (Voltametria cíclica e anódica) e as técnicas polarográficas.

A unidade sobre a espectroscopia e técnicas espectroscópicas irão relembrar os conceitos de energia, níveis de energia no átomo e moléculas e terminará com um debate sobre técnicas de espetroscopia atómica.

A Espectroscopia molecular-I começará com uma discussão sobre a teoria da espectroscopia UV-VIS, como ela é usada nas análises quantitativas e qualitativas e a sua instrumentação (Espectrofotómetro). Esta unidade termina com uma discussão sobre a Espectroscopia no Infravermelho (IR, do Inglês InfraRed), sua estrutura, os diferentes picos exibidos pelos grupos funcionais, assim como a sua aplicação na identificação de grupos funcionais e componentes. A Espectroscopia molecular-II irá introduzir fenómenos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN, do Inglês MNR), seguido da discussão protónica, a relação entre o deslocamento químico e ambiente químico do protão, assim como a aplicação do método na identificação dos grupos funcionais. Esta unidade termina com a discussão da RMN do carbono (C-MNR), a qual é complementar da RMN do Hidrogénio (MNR-H).

A última unidade de aprendizagem será a Espectrometria de Massas (MS), sua estrutura e como ela é usada na identificação de componentes orgânicos.

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Universidade Virtual Africana

6.2 Esboço

Unidade I: Separação e técnicas cromatográficas -25 Horas

•Técnicas de Separação: o Extração do solvente; o Destilação. •Cromatografia: o Teoria cromatográfica; o Desenvolvimento do processo. •Tipos de técnicas Cromatográficas:

o Cromatografia plana; o Cromatografia plana; o Cromatografia líquida; o Cromatografia gasosa.

Unidade II: Técnicas Electroanalíticas - 15 Horas

•Potenciometria:

o Eléctrodos de iões selectivos; o Eléctrodos de Vidro (pH); o Titrações potenciométricas; •Voltametria o Polarografia; o Pulso Polarográfico; o Voltametria cíclica; o Voltametria anódica.

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Unidade III:

Espectroscopia e Técnicas Espectroscópicas Atómicas- 20Horas

•Espectroscopia:

o Radiação Electromagnética; o Átomo e Espectrocopia atómica; o Lei de Beer.

•Técnicas espectroscópicas atómicas.

Unidade IV: Espectroscopia Molecular-I: UV-VIS e IR

30 Horas

•Espectroscopia UV-VIS:

o Transição Electrónica;

o Identificação de grupos funcionais; o Instrumentação.

•Espectroscopia IR:

o Vibração Molecular e Espectroscopia IR; o Energia relativa de absorção no IR; o Identificação de grupos funcionais.

Unidade V : Espectroscopia Molecular-II: Resonância Nuclear Magnética 15 Horas

•Espectroscopia NMR:

o Protão NMR;

o Deslocamento químico;

o Correlação do Protão (H-NMR) e estrutura. •Espectroscopia C-NMR.

Unidade VI: Espectrometria de Massas - 15 Horas

•Espectrometria de Massas:

oFragmentações;

o Espectro “Finger Print” (Impressão digital).

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VII. Objectivo Geral

Os objectivos gerais deste módulo são:

 Explicar os conceitos focalizando mais nas técnicas analíticas modernas;

 Dar ao estudante as habilidades básicas para aplicar os conceitos e resolver os problemas do mundo real e por fim, serem capazes de entender e usar as técnicas bem como os princípios químicos.

VIII. Objectivos específicos

Unidade: 1. Separação e técnicas cromatográficas

Objectivos de Aprendizagem

No fim desta unidade o estudante deve ser capaz de: •Recordar o método de separação abordado na escola; •Explicar os princípios de extração do solvente;

•Resolver problemas numéricos hipotéticos de extração do solvente; •Desenhar e nomear a aparelhagem usada para a extração do solvente; •Nomear as colunas comuns e as técnicas cromatográficas planas;

•Explicar a teoria referente a cada coluna e as respectivas técnicas cromatográficas planas;

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Unidade: 2. Técnicas Electroanalíticas

Objectivos de Aprendizagem

No fim desta unidade o estudante deve ser capaz de: •Recordar as bases teóricas da potenciometria;

•Explicar a aplicação da potenciometria na medição do pH e titrações automáticas usando eléctrodos de iões selectivos;

•Recordar a teoria da Voltametria;

•Interpretar quantitativa e qualitativamentedados voltamétricos; • Explicar as bases da análise polorográfica;

• Interpretar dados polarográficos na identificação e quantificação de espécies químicas.

Unidade: 3. Introdução às Técnicas Espectroscópicas e

Espectroscopia atómica

Objectivos de Aprendizagem

No fim desta unidade o estudante deve ser capaz de: •Nomear as partes do espetro electromagnético;

•Recordar os efeitos da radiação nos átomos e moléculas; •Recordar a lei de Plank e aplicá-la na espectroscopia;

•Recordar os níveis de energia electrónica nos átomos e moléculas;

•Recorrer à lei de Beer e aplicá-la na resolução de problemas quantitativos;

•Explicar os níveis de energia electrónica e as transições causadas pela absorção da radiação; •Explicar as bases da AAS, AES, AFS;

•Recordar a instrumentação de AES, AFS e AAS;

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Unidade: 4. Espectroscopia molecular-I :UV- VIS

Objectivos de Aprendizagem

No fim desta unidade o estudante deve ser capaz de:

•Lembrar as transições electrónicas causadas pela absorção da radiação UV-VIS;

•Correlacionar a absorção das frequências da radiação UV-VIS com os grupos (moleculares) funcionais;

•Usar dados hipotéticos para determinar concentrações usando informação do UV; •Recordar as partes de um espectrofotómetro UV moderno e suas funções;

•Recordar as transições electrónicas causadas pela absorção da radiação IR;

•Correlacionar a absorção das frequências do IR específico com os grupos funcionais moleculares; •Correlacionar a absorção das frequências do IR específico com estruturas moleculares de substâncias orgânicas simples;

•Recordar as partes de um espectrofotómetro moderno IR e as suas funções.

Unidade: 5. Espectroscopia Molecular-II (NMR)

Objectivos de Aprendizagem

• Explicar o fenómeno da Ressonância Magnética Nuclear RMN (Inglês: MNR);

• Recordar os núcleos que apresentam Ressonância Magnética; • Explicar o fenómeno do protão RMN;

• Correlacionar a absorção de frequências H-NMR específicas com grupos funcionais moleculares;

• Correlacionar a absorção de frequências H-NMR com estruturas moleculares de substâncias orgânicas simples;

• Explicar as principais características do fenómeno da RMN do Carbono-13 (C-13 NMR); • Recordar a natureza de informação providenciada por C-13 NMR;

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Unidade: 6. Espectrometria de Massas

Objectivos de Aprendizagem

•Explicar o fenómeno da Espectrometria de Massas;

•Explicar as regras seguidas para a fragmentação na Espectrometria de Massas;

•Correlacionar o espectro de massa com estruturas específicas elementares da molécula; •Usar o espectro de massa para identificar espécies moleculares;

•Usar espectros de massa de alta resolução e cálculo molecular da massa para identificação estrutural dos elementos;

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IX. Exercícios práticos

1) Um átomo de berílio tem 4 protões, 5 neutrões e 4 electrões. Qual é o número de massa deste átomo?

a) 4 b) 9 c) 8 D) 7

2) O número quântico principal para um electrão é: a) 1 b) 0 c) 2 D) -1

3) Qual das afirmações concernente aos ácidos e às bases é correcta?

a) Os ácidos e bases não reagem entre si.

b) Os ácidos misturados com as bases neutralizam-se entre si. c) Os ácidos misturados com as bases formam bases fortes. d) Os ácidos misturados com as bases formam ácidos fortes. 4) As soluções neutras têm um pH de:

a) 0 b) 1 c) 7 d)10

5) Comparando a carga e a massa de um protão, o electrão tem: a) A mesma carga e massa menor.

b) A mesma carga e a mesma massa. c) Uma carga oposta e massa menor. d) Uma carga oposta e mesma massa.

6) Qual é a fórmula empírica do composto cuja fórmula molecular é P4 O10?

a) PO b) PO2 c) P2 O5 d) P8 O20

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7) Qual das seguintes conversões exige um agente oxidante? a) Mn 3+ _{→ Mn}2+

b) C2H4 → C2H6 c) (2CrO4)2 → (Cr2O7) 2-d) SO2 → SO3

8) Haletos de Hidrogénio são todas as moléculas polares que formam soluções ácidas. Qual das seguintes substâncias correspondem a um ácido muito fraco?

a) HI b) HF c) HBr d) HCl

9) Calcula a [H+_{] numa solução que apresenta um pH de 8,38.} a) 1.21 x 10-2

b) 3.8 x 10-8 c) 2.40 x 108 d) 4.17 x 109

10) Em todas as células electroquímicas, o processo que ocorre no ânodo é_______ e o processo que ocorre no cátodo é ____________.

a) oxidação, redução. b) redução, redução. c) redução, oxidação. d) oxidação, oxidação.

11) Qual é o estado de oxidação do S em H2SO3 ? a) +4

b) +2 c) 0 d) +6

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12) O eléctrodo padrão de hidrogénio tem um potencial de: a) -1.00 volts

b) 0.76 volts c) 0

d) 1.00 volts

13) A equação que representa uma reacção que nao é reacção redox é: a) Zn + CuSO4 → ZnSO4 + Cu

b) 2H2O2 → 2H2O + O2 c) H2O + CO2 → H2CO3 d) 2H2 + O2 → 2H2O

14) Um mole de Eletrões tem uma carga de 96,485 Coulombs por mole de electrões. Esta quantidade é conhecida pelos químicos como:

a) 1 watt b) 1 Ampere c) 1 joule d) 1 faraday

15) Qual das seguintes propriedades da água explica a sua habilidade para dissolver o ácido acético?

a) A elevada tensão superficial da água, que é usada na formação da ligação do hidrogénio entre moléculas da água.

b) A habilidade de servir como solução tampão, absorvendo o protão cedido pelo ácido acético. c) A habilidade de formar pontes de hidrogénio com o grupo carbonil e hidroxilo do ácido acético.

d) Nenhuma das alternativas. 16) Uma solução de pH é igual a:

a) Concentração iónica de hidrogénio [H+_] b) log [H+_]

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c) -log [H+_] d) ln [H+_] e) -ln [H+_]

17) Se a concentração de H+_{numa solução é 10}-3_{M, qual será a concentração de OH}-_{na mesma} solução a 25° C? a) 10-3 _M b) 10-11_M c) 1011_M d) 2 x 10-11_M e) 10-14_M

18) Quantos ml da solução 0.4 M HCl são necessários para levar o pH de 10 ml de uma solução de 0.4 M NaOH a 7.0 (pH neutro)? a) 4 b) 40 c) 10 d) 20 e) 2

19) Que átomo, dos seguintes elementos tem largas possibilidades de atrair electrões?

a) Silício b) Enxofre c) Nitrogénio d) Cloro

20) Qual dos elementos abaixo apresenta a primeira energia de ionização elevada? a) Alumínio

b) Sódio c) Cálcio d) Fósforo

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Respostas

1. b 2. a 3. b 4. c 5. a 6. c 7. d 8. b 9. d 10. a 11. a 12. c 13. c 14. d 15. c 16. c 17. b 18. c 19. d 20. d

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Comentário pedagógico para os estudantes

Menos que 30%

O estudante deverá rever muito antes de começar a usar o módulo. Entre 30-60%

O estudante está preparado para continuar com o módulo, mas deverá rever algumas áreas. Acima de 60%

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X. Glosário

Separação e cromatografia

Solvente: componente maioritário de uma solução (é o termo para a camada orgânica).

Diluente: é um termo para um líquido inerte usado para dissolver um extracto e para diluir um sistema.

Extractante: é um termo para um agente de extração do metal. Refinado: é um termo para uma camada aquosa após a extração.

Purificação/friccionamento: é o termo usado para a extração reversa de um soluto indesejável

da fase orgânica.

Tiramento: é o termo usado para a extração reversa da fase orgânica.

Assimetria: factor que descreve a forma de um pico cromatográfico. Teoria que assume a forma Gaussiana como pico simétrico. O factor de assimetria do pico é a relação (a 10 por cento da altura do pico) da distância entre o ápice do pico e o lado da parte traseira da curva cromatográfica em relação à distância entre o ápice do pico e o lado dianteiro da curva cromatográfica. O valor >1 é um pico da parte traseira, enquanto o valor < 1 é um pico frontal.

Linha de base: a linha de base é a linha desenhada pelo sistema de dados quando o único sinal do detector é proveniente da fase móvel.

Cromatografia: técnica na qual as moléculas presentes na fase móvel são separadas devido às suas diferentes afinidades com a fase estaciocionária. Quanto maior a afinidade com a fase estacionária, mais tempo a molécula ficará retida.

Volume morto (V): o volume da fase móvel fora das partículas de gel numa coluna cromatográfica de exclusão molecular.

Detector: dispositivo electrónico que responde a alguma característica de um sistema em observação e converte esta resposta num sinal mensurável. Há diferentes tipos de detectores. Os comuns são: luz de absorvância no UV-VIS, índex diferencial refractiva, electroquímica, condutividade e fluorescência.

Cromatografia de deslocamento: um processo cromatográfico no qual a amostra é colocada sobre a ponta superior da coluna e é deslocado por um composto que é fortemente solvido nos compostos da mistura original. As amostras de moléculas são deslocadas uma por uma, através do componente fortemente solvido. As técnicas de deslocamento têm sido usadas principalmente em aplicações preparativas de EPLC.

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Padrões externos: uma amostra separada que contém quantidades conhecidas dos mesmos compostos de interesse. Padrões externos são principalmente usados para a identificação de picos comparando os tempos de eluição.

Hidrofílico: desiga frequentemente algo que gosta da água; que tem acção absorvente, em especial para a água. A maioria das colunas usadas para separar as proteínas são hidrofílicas por natureza e não devem desnaturar a proteína no ambiente aquoso.

Injector: um mecanismo para a injecção duma quantidade predeterminada de amostra com precisão no fluxo de fase móvel. O injector pode ser um dispositivo manual simples, ou um amostrador automático sofisticado que permite injecções automatizadas de muitas amostras diferentes numa operação não acompanhada.

Coeficiente de partição (K): a quantidade de soluto na fase estacionária relativa para com a quantidade de soluto na fase móvel. Também pode ser entendido como coeficiente de distribuição. Tempo de Retenção (tR '): o tempo, medido a partir da injeção, necessário para um soluto ser deluido de uma coluna cromatográfica.

Volume de Retenção (VR): volume de solvente necessário para deluir um soluto de uma coluna cromatográfica.

Fase estacionária: em Cromatografia, refere-se a um sólido ou líquido imobilizado no qual os analitos são distribuídos durante a passagem da fase móvel.

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Análise Electroquímica

Corrente do segundo plano: corrente que não resulta da reacção química do analito.

Corrente capacitiva: corrente secundária que resulta da acção do eléctrodo como condensador passando a ter carga.

Corrente de carregamento: vide corrente capacitiva.

Difusão: movimento aleatório das moléculas em um líquido ou gás (ou, muito lentamente, em um sólido).

Potencial de meia-onda (E1/2): potencial ( originalmente contra o ECS) no qual a corrente de uma onda voltamétrica equivale à metade da corrente-limite.

Eléctrodo indicador: eléctrodo cujo potencial está relacionado ao logarítmo da actividade de uma ou mais espécies que estejam em contacto com o electrodo.

Voltametria de varredura linear: método electroquímico que envolve a medida da corrente em uma célula quando o potencial é linearmente aumentado, ou diminuido, em função do tempo; é a base para a voltametria hidrodinâmica e polarográfica.

Migração: movimento de iões induzido electrostaticamente em uma solução sob a influência de um campo eléctrico.

Polarografia: Voltametria com eléctrodo gotejante de mercúrio.

Potencial (potencial electroquímico): referente à medição da energia numa reacção electroquímica. Janela de Potencial: faixa de potências para um determinado sistema de solvente/eléctrodo onde podem ser feitas medições analíticas.

Eléctrodo de referência: eléctrodo cujo potencial (potencial electroquímico constante) em relação ao eléctrodo padrão de hidrogénio é conhecido e contra o qual os potenciais de eléctrodos não conhecidos podem ser medidos; o potencial de um eléctrodo de referência é completamente independente da contração do analito.

Eléctrodo de Prata/Cloreto de Prata: eléctrodo de referência no qual um arame de prata é coberto com cloreto de prata e mergulhado numa solução aquosa saturada.

Espectroscopia

Espectroscopia de absorção: um tipo de espectroscopia onde se mede a absorção da quantidade de radiação, de um dado comprimento de onda duma amostra. O comprimento de onda que é absorvido depende da molécula, assim como das diferentes transições que ocorrem em comprimentos de onda diferentes.

Lei de LAMBERT e BEER: uma equação relativa à absorvância, ao comprimento, ao coeficiente molar de absorção e à concentração da amostra. A = ε c l

CROMÓFORO: grupo funcional responsável pela absorção, p.ex., um alqueno absorve a λmax= 177 nm; parte de uma molécula responsável pela absorção de luz de uma determinada frequência.

CONJUGAÇÃO: uma série alternada de ligações simples, duplas e triplas, que provocam a sobreposição de orbitais p. sistemas conjugados tendem a absorver na região do visível.

LIGAÇÃO DUPLA: uma ligação onde (p. ex. no carbono) a orbital s e duas orbitais p hibridizam, originando 3 orbitais sp2_{, formando ligações δ (p. ex. com o hidrogénio} _{ou carbono). A orbital p} restante forma a ligação π, com o outro carbono sp2_hibridizado.

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO: a faixa inteira de radiação electromagnética, incluindo luz visível, ondas de rádio, raios X etc. A faixa estende-se entre as ondas de rádio (105_{m) até 10}-14 _m (radiação gama,γ). Entre estes extremos encontram-se as regiões do infravermelho, visível, ultravioleta e raios-X.

Fluorescência: acontece quando um electrão é promovido do estado fundamental para o estado excitado. Quando se perde energia do electrão, este o faz perdendo-a em forma de calor através do relaxamento vibracional, distribuindo posteriormente a luz (fluorescendo) ao voltar ao estado fundamental.

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Orbital ocupada na molécula, onde o nível mais elevado de energia no electrão encontra-se ocupado no zero absoluto.

LUMO: Orbital Molecular mais Baixa Desocupada, do inglês, Low Unoccupied Molecular Orbital. Orbital de baixa energia, a qual se encontra desocupada no electrão no zero absoluto.

COEFICIENTE MOLAR DE ABSORÇÃO: Medida da quantidade de radiação absorvida por unidade de concentração da amostra, rearranjando assim a equação para: ε = A / c l (Lei de Lambert e Beer). Este valor é constante para cada tipo de substância.

ORBITAIS MOLECULARES: descrevem a distribuição do electrão na molécula. Orbitais que resultam da interação das orbitais atómicas durante a formação de ligações. As orbitais de ligação apresentam baixa energia em relação às orbitais atómicas orginais. As orbitais anti-ligantes e não ligantes apresentam elevada energia.

ESPECTROSCOPIA: Método de produção e análise de dados que permitam a determinação de estruturas moleculares.

TRANSMITÂNCIA: Quantidade de radiação que passa através da amostra, isto é, que não é absorvida. Fracção da Quantidade de radiação que entra, e da quantidade de radiação que atravessa a amostra. Quando esta fracção é multiplicada por 100, o valor obtido é a percentagem da transmissão.

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REGIÃO ULTRAVIOLETA: A região do espectro electromagnético que apresenta comprimentos de onda entre 400 nm a 4 nm. A região no UV distribui-se por três zonas: UV PRÓXIMO (400-300 nm), UV DISTANTE/LONGÍQUO (300-200 nm) e UV EXTREMO/VÁCUO (menos que 200 nm). A última é conhecida como a região do UV do vácuo ( região vazia de UV) como a radiação é absorvida pelo oxigénio. Isto significa que se a radiação no UV vazio estiver em uso, então a aparelhagem deve ser evacuada.

REGIÃO VISÍVEL: A região do espectro eletromagnético (700-400 nm), a qual o olho humano é sensível à luz e vê-la como branca e a cores.

COMPRIMENTO DE ONDA: A medição das ondas de um pico para o outro, p.ex., ondas de rádio tem o comprimento de onda de até 10 km, enquanto a radiação gama γ, tem comprimentos de onda curtos de 10-14_m.

Espectrometria de Massas

Espectrometria de Massas: esta é uma técnica na qual um instrumento é usado para produzir iões a partir de átomos ou moléculas (a fonte), os quais são separados e detectados de acordo com a razão entre a massa e a carga (vide m/z) (o analisador).

Foco Duplo: uma combinação de campos electrostáticos (E) e magnético (B), usada para compensar a variação de energias dos iões formados na fonte e por conseguinte melhorar a resolução (qv) do analisador (vide também geometria frontal e reversa).

Voltagem de Aceleração: A voltagem aplicada à fonte para acelerar os iões formados no analisador. Unidade de Massa Atómica: unidade de massa baseada em 1/12 da massa do isotopo de carbono mais abundante, 12_{C=12 u exactamente; m/z é a razão massa e carga do ião detectado. Z é} normalmente uma unidade, mas pode ser um número inteiro maior especialmente na ESI-MS.

Ião Molecular: o ião formado a partir da molécula original na fonte. Ião Radical: um ião contendo iões desemparelhados.

Massa média ou relativa (Mr): a massa de uma partícula ou molécula de determinada fórmula empírica, calculada usando pesos atómicos para cada elemento.

Massa Exacta: os isotopos têm massas únicas e precisas e como consequência disto, a composição elementar de qualquer molécula ou fragmento, pode ser calculada a partir da sua massa, se esta tiver sido suficientemente calculada com precisão.

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XI. Recomendações

O material neste módulo é apresentado em ordem crescente de complexidade dos contéudos. Assim aconselha-se ao estudante que faça o seu estudo duma forma sequencial até ao fim de cada unidade. Deve também orientar-se com rigor ao horário proposto para a unidade.

Há quatro fontes principais a citar, respectivamente, o módulo à disposição, as referências on-line, as referências bibliográficas e a avaliação formativa.

O estudante dever usar o material apresentado como a primeira ferramenta de aprendizagem - cobrindo uma unidade completa antes de recorrer aos livros e fontes on-line.

Ao longo do módulo está identificado o local onde o estudante pode recorrer às fontes on-line. As avaliações formativas estão inclusas no módulo para reforçar a compreensão dos

conceitos fundamentais e das habilidades.

Estes devem ser tratados imediatamente depois do estudo da secção e usados como exercícios práticos.

A Avaliação sumativa examina a compreensão de conceitos e retenção de factos de uma determinada unidade de aprendizagem.

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XII. Leitura obrigatória

Referência 1

Título: Métodos Espectrométricos de identificação de Compostos orgânicos. Autores: Robert M Silverstein; Francis X Webster; David J Kiemle.

Editora: Wiley; 7ª Edição, 2005.

Abstrato: este livro providencia uma introdução completa das três áreas da Espectrometria, usadas amplamente na identificação espectrométrica: Espectrometria de massa, Espectroscopia no infra-vermelho e na Ressonância Magnética Nuclear. O texto usa o método de resolução de problema, com grande ênfase nas tabelas e gráficos. Oferece vários exercícios, típicos para um químico praticante.

Raciocínio: esta referência dá ao estudante oportunidade para aquisição de habilidades na interpretação de espectros. O estudante é aconselhado a usar este livro para a prática asim como para aprimorar as técnicas espectroscópicas. Partindo do domínio de dois a três problemas em cada técnica, estar-se-á na iminência de alcançar o domínio das outras técnicas de Espectroscopia.

Este livro é a referência primária para as Espectroscopias UV, IR, NMR e Espectrometria de Massa

Referência 2

Título: Princípios de Análise Instrumental.

Autores: Douglas A. Skoog, F. James Holler, e Stanley R. Crouch. Editora: Brooks Cole; 6ª edição 2006.

Abstrato: este livro dá mais ênfase às bases teóricas de cada tipo de instrumento, sua óptima área de aplicação, sua sensibilidade, sua precisão e suas limitações.

Raciocínio: este livro dá cobertura a todos os aspectos do módulo, de um modo muito simplificado, mas é a referência primária das técnicas Electro-analíticas bem como dos métodos cromatográficos.

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Referência 3

Título: Guia Essencial de Química Analítica. Autor: Georg Schewdt.

Editora: John Wiley e Filhos 2ª Edição 1997.

Abstrato: este livro é escrito como uma referência rápida para este módulo, e todo o material é abordado de forma compacta. Apresenta diagramas coloridos o que torna o texto mais conciso e fácil de encontrar informação relevante. Os diagramas são claros e os esquemas ilustram procedimentos e instrumentação duma forma simples.

Raciocínio: este livro é tido como a referência final para “polir” a compreensão do módulo para os estudantes; não deve ser usado para aprendizagem inicial dos tópicos.

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XIII. “Links” úteis

http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/carey/student/olc/ch13ir,html

Resumo: este “Link” é parte do curso de química, contudo para os propósitos deste módulo, o estudante é exigido a ler apenas o capítulo 13. Apresenta o material abordado no módulo de um modo simples e compreensível. Esta referência prevê métodos alternativos para o estudo do módulo, com tutorias de conceitos teóricos.

Justificação: os exemplos nesta referência providenciam exercícios práticos associados ao módulo e reforçam a compreensão dos conceitos.

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http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Spectrophotometry /

Resumo: este “site” contém notas resumidas dos conceitos abordados no módulo.

Justificação: devem-se criar facilidades ao estudante para recordar factos e conceitos importantes tratados no módulo.

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http://www.nd.edu/~smithgrp/structure/workbook.html

Resumo: este “site” contém uma colecção de problemas práticos.

Justificação: estes problemas são importantes para entender a espectroscopia molecular e espectrometria de massa.

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http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/spectro.htm#contnt

Resumo: este “site” providencia o curso compreensivo de Química orgânica.

Justificação: o método usado neste curso pode providenciar uma compreensão profunda do abordado no módulo.

(32)

http://www.chromatography-online.org/topics/gas/chromatography/detectors. html

Resumo: este é um dos sites mais compreensivos da cromatografia.

Justificação: a profundidade do tratamento deste módulo está um pouco acima do que é exigido, daí que este deve servir de referência.

(33)

http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/bnmr.htm

Resumo: este site oferece um tratamento profundo da Espectroscopia de RMN do Carbono-13, com explicações acompanhadas de espectros.

Justificação: a abordagem vai de acordo com os requisitos do módulo, contudo aconselha-se ao estudante a usá-lo apenas como referência.

(34)

http://weather.nmsu.edu/Teaching_Material/soil698/Student_Reports/ Spectroscopy/report.htm

Resumo: este é o relatório de um estudante sobre a Espectroscopia de Absorção Atómica (EAA). Justificação: esta página apresenta a EAA de forma simplificada.

(35)

http://www.chemguide.co.uk/index.html#top

Resumo: este site foi originalmente criado para responder às necessidades dos estudantes de Química de “Nível A” do Reino Unido, mas também tem sido usado para abordar matérias de outros níveis, tais como IB, sistema Escocês avançado e o Cambridge internacional. De facto, agora tem sido usado para cursos equivalentes e por estudantes universitários dos primeiros anos.

(36)

XIV. Recursos Multi Media

http://www.colby.edu/chemistry/NMR/H1pred.html

Resumo: uma excelente colecção de aplicações para a interpretação de espectros de RMN, IV e de Massas. Criado pelo Colégio de Colby.

.

Justificação: este site providencia muitos instrumentos multimedia para reforçar a aprendizagem nesta unidade.

(37)

http://www.shsu.edu/~chemistry/primers/primers.html

Resumo: este site apresenta uma vasta colecção de recursos multimedia de todos os temas abordados no módulo.

(38)

XV. Actividades de Aprendizagem

Unidade I

Separação e Técnicas Cromatográficas

Resumo das actividades

No final desta unidade o estudante deve ser capaz de:

• Recordar os métodos de separação abordados na escola; • Explicar os princípios de extração de solvente;

• Resolver problemas numéricos e hipotéticos referentes à extração do solvente; • Desenhar e nomear a instrumentação usada para a extração de solvente;

• Nomear colunas comuns e técnicas cromatográficas planas;

• Explicar a teoria básica da técnica de cada coluna e da cromatografia plana; • Recordar a instrumentação para as cromatografias plana e de coluna.

Leituras recomendadas

Separação: http://en.wikipedia.org/wiki/Separation_process http://en.wikipedia.org/wiki/Distillation#Laboratory_scale_distillation http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquid_extraction http://en.wikipedia.org/wiki/Separating_funnel http://en.wikipedia.org/wiki/Distillation Cromatografia: http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC http://en.wikipedia.org/wiki/Chromatography http://hplc.chem.shu.edu/HPLC/index.html http://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/column.html#top

Lista de sites relevantes:

http://www.chromatography-online.org/Principles/Introduction/rs1.html http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/matter/chromatography.shtml

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http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatogrmenu.html#top http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html#top http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm http://www.forumsci.co.il/HPLC/modes/modes3.htm http://www.chem.ubc.ca/courseware/121/tutorials/exp3A/columnchrom/ http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm2.htm

Técnicas de Separação

Extração do Solvente

Extração líquido-líquido, também conhecida como extração solvente e partição, é um método usado para separar componentes, baseado nas suas solubilidades relativas em dois diferentes líquidos não miscíveis, normalmente água e um solvente orgânico. É uma extração de uma substância de uma fase líquida em outra fase líquida. Nesta técnica uma solução (normalmente aquosa) contendo um soluto ou solutos entra em contacto com um segundo solvente (normalmente orgânico) com a finalidade de transferir um ou mais solutos da solução para o segundo solvente. A solução é agitada para estabelecer um contacto com o solvente. A Aparelhagem deve se encontrar na posição vertical para permitir separar as fases.

Coeficiente de Partição

Partição ou coeficiente de distribuição (KD) é a relação de concentrações de um composto em duas fases de uma mistura de dois solventes não miscíveis em equilíbrio e consequentemente estes coeficientes são uma medida da diferença de solubilidade do composto entre estes solventes.

Normalmente um dos solventes escolhido é água, enquanto o segundo é hidrofóbico como p.ex. octanol. Consequentemente ambos, a partição e o coeficiente de distribuição, são medidas de quão uma substância química é Hidrofílica (amiga da água) ou Hidrofóbica (inimiga da água).

Factores que afectam a Extração do Solvente

Polaridade do soluto e do solvente: em geral o solvente polar é distribuído no solvente mais polar, enquanto os solutos apolares dissolvem-se facilmente em solventes orgânicos, a não ser que estes incorporem número suficiente de grupos funcionais hidrofílicos como hidroxilo, sulfónico.

Geralmente não se espera que os compostos iónicos se extraiam em orgânicos, apenas pode-se esperar que estes possam se extrair reagindo-os com “agentes complexantes” formando identidades apolares neutras.

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Destilação

A destilação é o modo de separação baseado no fenómeno de equilíbrio líquido-vapor de misturas. Em termos práticos, quando temos duas ou mais substâncias formando uma mistura líquida, a destilação pode ser um método adequado para purificá-las. Simplificando, a destilação é um processo no qual duas substâncias são separadas através do aquecimento. Ex.: solução de água e sal. Aquecendo a solução, quando a água entrar em ebulição (vapor de água) e passar pelo condensador, sairá como água líquida, enquanto o sal ficará no primeiro recipiente; separando assim a água destilada e o sal.

Destilação simples

Em destilação simples, todos os vapores quentes produzidos são imediatamente canalizados para um condensador onde são esfriados e condensados. Assim, o destilado não será puro - sua composição será idêntica à composição dos vapores a determinada temperatura e pressão, e pode ser avaliada a partir da lei de Raoult. A destilação simples é um processo que permite a separação de um líquido de uma substância não volátil (tal como um sólido, p.ex.) ou de outro(s) liquído(s) que possue(m) uma diferença no ponto de ebulição maior do que cerca de 80 °C. É um método rápido de destilação, e deve ser usado sempre que possível – é uma técnica rápida, fácil e, se respeitado seus limites, eficaz.

Destilação fraccionária

Este processo consite no aquecimento de uma mistura de mais de dois líquidos que possuam pontos de ebulição diferentes. Assim, a solução é aquecida e separa-se inicialmente o líquido com menor ponto de ebulição e, em seguida, o líquido com o ponto de ebulição maior.

A destilação fracionária é usada para separar os componentes por ciclos de vaporização-condensação

repetidos dentro de uma coluna fraccionária.

Os derivados de petróleo são separados por destilação fraccionada, onde cada componente é destilado em uma temperatura diferente: baixas temperaturas separam a gasolina e o querosene, já na temperatura em torno de 300 ° C, são destilados os óleos e as parafinas.

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http://en.wikipedia.org/wiki/Fractional_distillation

A quantidade de placas teóricas leva a melhores separações. Um sistema de destilação de banda de fiação usa uma faixa de giro de teflon ou metal para a força de vapores em contacto

com o condensado descendente, aumentando deste modo o número de pratos teóricos.

Destilação a vapor

Figura 2: destilação a vapor:

http://en.wikipedia.org/wiki/Steam_distillation acessed March 2008 Como funciona a Destilação a vapor

A destilação a vapor é uma destilação de mistura de substâncias imiscíveis de compostos orgânicos e água (vapor) e baseia-se no facto de a pressão total de vapor de uma mistura de líquidos imiscíveis ser igual à soma das pressões de vapor de cada componente, individualmente. Misturas imiscíveis não se comportam como soluções. Os componentes de uma mistura imiscível evaporam a temperaturas menores do que os pontos de ebulição dos componentes individuais, por isso, uma mistura de compostos de alto ponto de ebulição e água poderá ser destilada à temperatura menor que 100 °C (ponto de ebulição da água). A pressão total de vapor da mistura torna-se igual à pressão atmosférica (e a mistura pode ebulir) numa temperatura menor que o ponto de ebulição de qualquer um dos componentes.

A destilação a vapor pode ser utilizada nos seguintes casos:

1. Quando se deseja separar ou purificar uma substância cujo ponto de ebulição é alto e/ou apresente risco de decomposição;

2. Para separar ou purificar substâncias contaminadas com impurezas resinosas;

3. Para retirar solventes com elevado ponto de ebulição, quando em solução existe uma substância não volátil;

4. Para separar substâncias pouco miscíveis em água cuja pressão de vapor seja próxima a da água a 100 °C, o que é muito importante para as substâncias que se decompõem nestas temperaturas.

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Destilação a Vácuo

Figura 3: Aparelho de destilação a vácuo

Destilação a vácuo

Destilação que se realiza numa coluna de fraccionamento a uma pressão inferior à pressão atmosférica. À destilação no vácuo são submetidos os resíduos (fracção mais pesada) obtidos por destilação atmosférica. A redução da pressão baixa o ponto de ebulição das fracções pesadas permite-lhes separá-las dos resíduos a uma temperatura que não corre o risco de os decompor. Aplica-se, por exemplo, no início da cadeia de fabrico dos óleos base.

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Cromatografia

Teoria de Cromatografia

Cromatografia é um processo de separação que é alcançado distribuindo os componentes de uma mistura entre duas fases, uma fase estacionária e outra fase móvel.

Estes componentes são retidos preferencialmente na fase estacionária mais tempo no sistema do que esses que são distribuídos selectivamente na fase móvel. Como consequência, os solutos são eluados do sistema em tempos diferentes de acordo com a ordem crescente dos coeficientes de distribuição. As amostras podem ser gasosas, líquidas ou sólidas e podem variar na complexidade de uma mistura simples de dois enantiomeros para uma mistura multivariada de componentes contendo espécies químicas muito diferentes. Além disso, a análise pode ser levada a cabo, a um extremo, num instrumento muito caro e complexo, e no outro, num simples prato. Cromatografia é a base de um elevado número de técnicas analíticas. Esta unidade apresenta as técnicas cromatográficas mais comuns e suas aplicações.

O Processo de Desenvolvimento

Desenvolvimento é o termo usado para descrever como os componentes são separados durante o

processo cromatográfico.

Existem três métodos básicos de desenvolvimento cromatográfico; frontal, deslocamento,

e desenvolvimento por eluição. A maior parte do desenvolvimento analítico de cromatografia é

feito pelo desenvolvimento de eluição

Desenvolvimento por eluição

Desenvolvimento de eluição é melhor descrito como uma série de processos de extração e absorção que são contínuas desde o tempo em que a amostra é injectada no sistema até ao momento da saída de analitos. O processo de eluição é ilustrado na figura abaixo.

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Figura 4: Desenvolvimento por Eluição

Quando o soluto entra no sistema cromatográfico na fase móvel sua concentração é maior que a concentração de equilíbrio para distribuição na fase estacionária, o que permite a sua entrada imediata para a fase estacionária.

Assim a concentração da fase móvel alcançará a da fase estacionária, continuando esta a aumentar até se atingir o equilíbrio. Alcançado o equilíbrio das concentrações, observa-se então a Desorpção para a fase móvel, onde é transportado para uma novo local na fase estacionária.

A fase móvel deslocará o perfil de concentração do soluto continuamente a dentro. Este deslocamento causa excesso de concentração de equilíbrio do soluto na fase móvel à frente do pico, em relação à fase estacionária. Como consequência, uma certa quantidade de soluto na parte dianteira do pico, continua eluindo a fase estacionária a partir da fase móvel, na tentativa de restabelecer o equilíbrio. Na parte traseira do pico, acontece o inverso. Com o avanço do perfil de concentração do soluto na fase estacionária, observa-se assim um excesso de concentração de equilíbrio na parte traseira do pico.

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__ Universidade Virtual Africana

A quantidade líquida de soluto deve agora sair da fase estacionária e entrar na fase móvel para re-estabelecer o equilíbrio. Assim, o soluto move-se através do sistema cromatográfico como resultado da entrada de solutos na fase móvel na parte traseira do pico e retorna para a fase estacionária à frente do pico. No entanto, o soluto é sempre transferido entre as duas fases ao longo de todo o pico, na tentativa de atingir ou manter o equilíbrio termodinâmico. No entanto, a banda de soluto progride através do sistema como resultado de uma transferência líquida de soluto a partir da fase móvel para a fase estacionária na frente da metade do pico. Esta transferência líquida de solutos é compensada pela passagem de soluto da fase estacionária para a fase móvel a metade traseira do pico.

Eficiência de Separações Cromatográficas

A distribuição de analitos entre fases pode ser descrita frequentemente de forma bastante simples. Um analito está em equilíbrio entre as duas fases:

Móvel

↔

Estacionária

A constante de equilíbrio, K, chama-se, na cromatografia, por coeficiente de partição; e é definido como o quociente da concentração molar do analito na fase estacionária e da concentração do analito na fase móvel.

O tempo necessário (para cada componente), a partir da injecção da mistura na coluna, para que o componente alcance o detector, chama-se tempo de retenção (tR).

Cada analito numa amostra terá um tempo de retenção diferente. O tempo que a fase móvel leva a percorrer a coluna é o tempo nulo (tM).

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O termo factor de retenção, k ', é usado frequentemente para descrever a velocidade de migração de um analito numa coluna. Também é designado por factor de capacidade. O factor de retenção de um analito A, é definido com:

k’A = t R - tM / tM

Os valores de tR e tM são obtidos geralmente a partir de um cromatograma.

Quando o factor de retenção do analito é menor que um, a eluição é tão rápida, dificultando desta forma a determinação exacta do tempo de retenção. Factores de alta Retenção (maiores que 20) indicam uma eluição demorada (eluição leva muito tempo). O ideal para um analito está entre um e cinco.

Para além das grandezas acima descritas, existe também o factor de selectividade,  que descreve a separação de duas espécies (A e B) na coluna;

= k ‘B / k ‘A

Ao calcular o factor de selectividade, deve tomar em consideração que a espécie A, elui mais rápido que a espécie B. O factor de selectividade é sempre maior que um.

Banda de Ampliação e Eficiência de Coluna

Para a obtenção de óptimas separações, é necessário que os picos cromatográficos sejam nítidos e simétricos. Isso pressupõe que o alargamento da banda seja limitado, o que também é benéfico para a medição da eficiência da coluna.

Modelo de Prato Teórico de Cromatografia

O modelo de pratos teóricos supõe que a coluna cromatográfica é formada por muitas camadas separadas, tidas teoricamente por pratos teóricos. É nestes pratos onde ocorrem as separações das amostras entre a fase estacionária e móvel.

O analito atravessa a coluna pela transferência equilibrada da fase móvel de um prato para o próximo.

Figura 6: Conceito Teórico de Prato

Prato é um conceito teórico para medir a eficiência da coluna, considerando ou, o número de pratos teóricos numa coluna, N (o melhor), ou a altura do prato; A Altura Equivalente de um Prato Teórico, em Inglês HETP, (quanto menor, melhor).

Se o cumprimento da coluna for L, então o HETP é

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O número de pratos teóricos que uma coluna real possui, pode-se encontrar examinando o pico cromatográfico após a eluição;

Onde w1/2 é a largura do pico à meia altura do prato.

Como pode ser visto a partir desta equação, as colunas comportam-se como se elas tivessem diferentes números de pratos para solutos diferentes numa mistura.

Teoria de velocidade na Cromatografia

A descrição mais realística dos processos cromatográficos no interior da coluna basea-se no tempo que o soluto leva a atingir o equilíbrio entre a fase estacionária e móvel (diferentemente do modelo de pratos que assume que o equilíbrio é infinitamente rápido).

A Banda resultante do pico cromatográfico é então afectada pela velocidade de eluição. Também é afectada pelas diferentes vias desponíveis de que as moléculas do soluto percorrem até a fase estacionária. Considerando os vários mecanismos que contribuem para o alargando, chega-se a equação de Van Deemter para altura de prato:

HETP = A + B / u + C u

Onde, u é a velocidade média da fase móvel. A, B, e C são factores que contribuem para o alargamento da Banda.

A- difusão de Eddy

A fase móvel movimenta-se pela coluna a qual é previamente empacotada com a fase estacionária. As Moléculas de soluto seguem ao acaso caminhos diferentes pela fase estacionária. Isto causará o alargando da faixa de soluto, pois os caminhos percorridos são de diferentes comprimentos.

B - difusão Longitudinal

A concentração do analito é menor nas extremidades da faixa em relação ao centro. Esta dispersão causa o alargamento da banda. Se a velocidade da fase móvel for alta, então o analito gasta menos tempo na coluna, levando assim à diminuição dos efeitos de difusão longitudinal.

C - Resistência à transferência de massa

O analito leva um certo tempo a equilibrar-se entre a fase estacionária e a fase móvel. Se a velocidade da fase móvel for alta, e o analito tiver uma forte afinidade com a fase estacionária, então o analito na fase móvel mover-se-á para frente do analito na fase estacionária. A banda do analito nestas condições é alargada. Quanto maior for a velocidade da fase móvel, menor será o alargamento.

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Curvas de Van Deemter

Representação gráfica da altura de prato vs velocidade média linear da fase móvel.

Figura 7: Curva deVan Deemeter

Tais curvas são de uso considerável na determinação do fluxo óptimo da velocidade da fase móvel. Resolução

Embora o factor de selectividade a descreva a separação dos centros da banda, ele não influencia na largura do pico. Outra medida de como as espécies foram bem separadas, é dada pela Resolução. A Resolução de duas espécies, A e B, é definida como:

A linha de base da Resolução é alcançada quando R = 1.5.

É útil relacionar a Resolução ao número de pratos na coluna, ao factor de seletividade e ao factor de retenção dos dois solutos;

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e do número de pratos teóricos, alonga a coluna, o que leva ao aumento do tempo de retenção, possibilitando assim o aumento da banda – o que pode não ser desejável. Ao invés de aumentar o número de pratos, a altura equivalente a um prato teórico pode ser reduzido, reduzindo o tamanho das partículas da fase estacionária.

Pensa-se que controlando o factor de capacidade, k', as separações podem ser melhoradas substancialmente. Isto pode ser alcançado alterando a temperatura (em Cromatografia Gasosa) ou a composição da fase móvel (em Cromatografia Líquida).

O factor de selectividade a, também pode ser manipulado para melhorar as separações. Quando a, está próximo da unidade, a optimização de k' e o aumento de N não oferecem boas separações em tempo útil. Nestes casos, optimiza-se primeiro o k', e depois o a, e observar-se-á o aumento seguindo um dos seguintes procedimentos:

Mudando a composição da fase móvel; Variar a Temperatura da coluna;

Variar a composição da fase estacionária;

Uso de efeitos químicos especiais (incorporação de espécies cujos complexos apresentam um dos solutos na fase estacionária).

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Tipos de Técnicas Cromatográficas

Cromatografia plana

Cromatografia Planar é uma técnica de separação na qual a fase estacionária apresenta-se na forma plana. A forma planar pode ser um papel, que serve de fase estacionária (Cromatografia de Papel) ou uma camada fina de partículas sólidas numa placa (Cromatografia de Camada Fina).

Cromatografia de papel

Esta técnica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura, a migração diferencial sobre a superfície de um papel de filtro de qualidade especial (fase estacionária). A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de solventes. Este método é muito útil para separar substâncias muito polares, como açúcares e aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se cromatografar poucas quantidades de substância de cada vez. As cubas deverão ser perfeitamente fechadas para permitir a saturação interna. A cromatografia pode ser ascendente ou descendente, sendo que esta última é mais rápida e consome menos eluente. Apenas 2cm de altura de eluente na cuba é suficiente para a cromatografia ascendente.

Cromatografia da camada fina

Cromatografia de camada fina (em inglês TLC) é semelhante à cromatografia de papel. Porém, em vez de se usar papel como fase estacionária, envolve-se uma fase estacionária de uma camada fina de adsorvente como gel de silica, alumina, ou celulose num substrato inerte, usualmente material de vidro ou plástico. Esta técnica é vantajosa comparada à cromatografia de papel, pois é rápida, eficiente e permite o uso de diversos adsorventes. Diferentes compostos na mesma mistura apresentam distâncias diferentes de acordo com a sua interacção com o

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o adsorvente. Isto permite calcular o valor de Rf, o qual pode ser comparado à substâncias padrão, possibilitando desta forma a identificação de compostos desconhecidos.

Figura 8: Desenvolvimento de uma separação de TLC: fonte http://www.waters.com/water - sdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH

Aparelhagem para a cromatografia de camada fina e de papel

Preparação da placa

A cromatografia de camada fina apresenta uma variedade de materiais para a sua execução, contudo o gel de silica é que se usa com maior frequência. As camadas finas de celulose são preparadas espalhando a massa aquosa de pó celuloso sobre aplicadores previamente preparados e que se encontram à venda no mercado. A massa aquosa de pó celuloso prepa-se misturando aproximadamente 15 g desta em 90 cm3_{de água destilada, passando posteriormente à dispersão} durante 1 minuto com ajuda de um liquidificador. O pó celuloso usado para TLC inorgânico é de natureza micro cristalina. Para a cromatografia de partição existe uma gama de absorventes que estão previamente preparados. Existem também no mercado folhas plásticas impregnadas com celulose (que incorporam também material fluorescente), que são muito convenientes para os trabalhos de cromatografia de camada fina para compostos inorgânicos, e podem ser cortados para os tamanhos preferidos.

Aplicação da amostra.

A amostra a ser aplicada deve ser neutra ou apresentar uma acidez fraca e sua composição deve estar entre 0.1 e 10mg do catião por cm3 _{; desta solução apenas se usa 1µl. A calibração dos cromatopratos} não é necessária.

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__ African Virtual University

Desenvolvimento na placa. O cromatograma normalmente é desenvolvido na forma ascendente, técnicas na qual a placa emerge no solvente em desenvolvimento numa profundidade de 0.5cm. A câmara usada deve estar forrada com papel de filtro que deve também emergir no solvente na base da câmara, isto permite assegurar a saturação da câmara com o vapor do solvente. É permitido Proceder o desenvolvimento até que a frente solvente alcance a distância requerida (normalmente 10-15cm), a placa é então afastada da câmara e a frente solvente imediatamente marcada com uma linha de lápis.

Identificação de Analito em Cromatografia de camada fina e em Papel

As Substâncias coloridas podem ser vistas directamente quando observadas contra a fase estacionária, enquanto as espécies incolores normalmente podem ser detectadas pulverizando a placa com um reagente apropriado que produz áreas coloridas nas regiões que eles ocupam.

Algumas substâncias apresentam fluorescência na presença da luz ultravioleta e podem ser localizadas facilmente. Alternativamente se o material fluorescente é incorporado no absorvente, o soluto pode ser observado como uma mancha escura num fundo fluorescente usando a luz ultravioleta, (Quando localizamos zonas usando este método os olhos devem estar protegidos, usando óculos de protecção.) As manchas localizadas por este método podem ser delineadas marcando com uma agulha.

Cromatografia de coluna

Cromatografia de coluna é uma técnica de separação na qual a cama estacionária é colocada dentro de um tubo.

Figura 9: Aparelho Cromatográfico de coluna

A fase estacionária consiste em partículas muito pequenas ou partículas cobertas com um líquido na qual os sólidos agem como suporte colocado numa coluna. As partículas da fase estacionária podem ser sólidas e normalmente enchem todo o volume do tubo (coluna compacta) ou concentradas no interior do tubo ao longo da parede, deixando um espaço aberto, para a fase móvel (coluna tubular aberta).

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Cromatografia líquida

A cromatografia líquida (LC) é um tipo de cromatografia de coluna na qual a fase móvel

é um líquido. Cromatografia líquida pode ser levada a cabo numa coluna ou no plano . Hoje em dia a cromatografia líquida que geralmente utiliza pequenas partículas empacotadas sob pressão relativamente alta, daí a designação de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE; do Inglês: High Perfomance/Pressur Liquid Chromatograhy, HPLC).

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma técnica cromatográfica. Se distingue por usar a fase móvel à alta pressão (daí o "pressure" da sigla em inglês).

O uso de pressões elevadas permite uma redução no diâmetro das partículas da fase estacionária, localizada no interior da coluna cromatográfica. O uso de partículas menores (na ordem de 5,0 µm) no recheio da coluna resulta em uma área superficial, o sítio de absorção, maior (geralmente da ordem de centenas de metros quadrados por grama de fase estacionária), o que promove uma separação mais eficiente dos componentes da amostra. Essa "miniaturização" das partículas da coluna permite o uso de colunas menores, volumes menores de amostras e um gasto menor de fase móvel. Assim sendo, em cromatografia líquida de alta eficiência trabalha-se na faixa dos microlitros (µL).

O advento dessa técnica analítica só foi possível graças à produção de cromatógrafos líquidos totalmente automatizados (embora mesmo hoje ainda existam cromatógrafos que não oferecem opção de injecção automática de amostragem). Nesses cromatógrafos as bombas de fase móvel permitem o trabalho geralmente na faixa média de 2.500 psi. Hoje em dia são oferecidos, também as máquinas da chamada CLUE - Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (Em inglês, UPLC), que funcionam com partículas de colunas ainda menores (até 0,01 µm) e pressões ultra-elevadas (da ordem de 15.000 psi).

Componentes de um HPLC

Figura 10: Componentes de um HPLC

O Sistema de recepção do solvente empurra o fluxo do solvente pelo instrumento a uma velocidade constante de fluxo.

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Coluna - um tubo inoxidável de aço empacotado com contas de silicone que separam o que se procura (p.ex. a cafeína) de outras substâncias (p.ex. açúcar).

Detector - um sensor óptico (normalmente) que detecta as mudanças nas características do fluxo do solvente.

Sistema de dados – média de controlo dos componentes do sistema de armanezamento, processamento e exibição dos dados.

Uma bomba de alta pressão é necessária para forçar a fase móvel pela coluna nas típicas velocidades de fluxo de 0.1-2 ml/min. A amostra a ser separada é introduzida na fase móvel através de dispositivo de injecção, manual ou automaticamente, antes da coluna.

Escala Cromatografica:

HPLC aplica-se para vários propósitos;

Analítico - só para Dados de alta Sensibilidade;

Semi-Preparativo – dados e pequenas quantidades de analitos purificados (grama);

Preparativo - quantidades enormes de analitos purificados (Quilogramas) [Alta Capacidade]. Modos de Separação de HPLC

A Separação de analitos está baseada em vários mecanismos e cada um destes mecanismos resultam no modo diferente de aplicação de HPLC.

Cromatografia de fase normal

A separação de analitos na fase normal de HPLC basea-se na polaridade. Este método usa fase estacionária polar e fase móvel apolar e é usado quando o analito de interesse é bastante polar na natureza. O analito polar associado é retido pela fase estacionária polar. As Forças de absorção aumentam em função do aumento da polaridade do analito, e a interacção entre o analito polar e a fase estacionária polar (relativo a fase móvel) aumenta o tempo de eluição.

Cromatografia de fase reversa

A HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste numa fase estacionária apolar e uma fase móvel aquosa, moderadamente polar. A fase estacionária comum é de silica tratada (banhada) com

RMe2 SiCl, onde R é um alquilo de cadeia recta como C18H37 ou C8H17. O tempo de retenção é então mais longo para moléculas que são mais apolares na natureza, permitindo assim a eluição de moléculas polares. O tempo de retenção aumenta com a adição de solvente polar à fase móvel e descresce pela adição de solvente hidrofóbico.

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Tamanho de cromatografia de exclusão

A Cromatografia de Exclusão por Tamanho (CET, do inglês SEC), também conhecida como cromatografia de permeação de gel ou cromatografia de filtração de gel, separa partículas na base de tamanho. É geralmente uma cromatografia de baixa resolução, e é frequentemente reservada para o passo de purificação no polimento final. Também é útil para determinar a estrutura terciária e quaternária para purificar proteínas , e é a técnica primária para determinar o peso molecular médio de polímeros naturais e sintéticos.

Cromatografia de troca íonica

Na cromatografia de troca íonica, a retenção basea-se na atração entre os iões do soluto e de cargas locais da fase estacionária. Os iões da mesma carga são excluídos. Alguns tipos de trocadores de iões incluem: (1) Resinas de Poliestireno - permitem o acoplamento cruzado, o qual aumenta a estabilidade da cadeia. O alto Acoplamento cruzado reduz o desvio e aumenta o tempo de equilíbrio e consequentemente melhora a selectividade. (2) Celulose e trocadores de iões Dextrin (geis ) -estes possuem poros maiores e baixa densidade de cargas, criando assim condições satisfatórias para a separação protéica. (3) Vidro temperado ou sílica porosa.

Cromatografia de bio-afinidade

Este processo cromatográfico confia na propriedade de substâncias biologicamente activas de formação de complexos estáveis, específicos e reversíveis. A formação destes complexos envolve a participação de forças moleculares comuns como, as forças de Van der Waal, interação electrostática, interação dipolo-dipolo, interação hidrofóbica e a ligação ponte de hidrogénio. Uma ligação bio-específica eficiente é formada por uma acção simultânea e combinada destas forças nas ligações complementares.

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Cromatografia Líquida Formativa e Exercícios de HPLC i) Nomear componentes principais de um HPLC;

ii) Nomear três sub-técnicas de HPLC;