UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES MECÂNICAS, FISICO-QUÍMICAS E
DA CITOCOMPATIBILIDADE DE COMPÓSITOS RESTAURADORES
HÍBRIDOS EXPERIMENTAIS COM PARTÍCULAS DE CARGA
POROSAS
Niterói 2014
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES MECÂNICAS, FISICO-QUÍMICAS E
DA CITOCOMPATIBILIDADE DE COMPÓSITOS RESTAURADORES
HÍBRIDOS EXPERIMENTAIS COM PARTÍCULAS DE CARGA
POROSAS
JAIME DUTRA NORONHA FILHO
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Dentística
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva
Niterói 2014
N852 Noronha Filho, Jaime Dutra
Avaliação de propriedades mecânicas, físico-químicas e da citocompatibilidade de compósitos restauradores híbridos experimentais com partículas de carga porosa /Jaime Dutra Noronha Filho ;orientador: Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva – Niterói: [s.n.], 2014.
50 f. : il.
Inclui gráficos e tabelas
Tese (Doutorado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2014.
Bibliografia: f. 46-50
1.Resina composta 2.Partículas porosa 3.Propriedades mecânicas I.Silva, Eduardo Moreira da [orien.] III.Título CDD 617.695
Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________ Prof(a). Dr(a). Laiza Tatiana Poskus
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Evandro Piva
Instituição: Universidade Federal de Pelotas
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Hélio Rodrigues Sampaio Filho
Instituição: Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Marcos Hahlbohm D'Oliveira Schroeder Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro
Aos meus pais Rosangela e Jaime, pelo apoio e confiança em todas as etapas da vida, sempre ao meu lado, incentivando e torcendo pelas minhas conquistas.
À minha esposa Alessandra, por compartilhar comigo todos os momentos, bons e ruins, mas sempre apostando nos meus sonhos e me fazendo acreditar que sou capaz de vencer todos os obstáculos.
À minha irmã Raquel, por mesmo de longe, me fazer sentir que está sempre por perto vibrando com meus avanços e minhas conquistas.
À minha sobrinha Emília, por alegrar sempre meus dias com suas visitas.
Aos meus avós Amélia, Letícia e Alberto por, mesmo sem entender muito bem, sempre apoiarem meus planos e anseios profissionais.
Ao meu orientador, Prof. Eduardo Moreira da Silva, por toda a dedicação e orientação, não só durante o mestrado e doutorado, mas em toda a minha trajetória profissional, pelo exemplo de profissional dedicado e por todas as oportunidades dadas a mim. Tenho certeza de que foram fundamentais para o meu amadurecimento profissional.
Aos Professores da Disciplina de Dentística da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, José Guilherme, Laiza, Alexandre, Glauco, Cristiane, Luis Felipe e Larissa, pela convivência harmoniosa e extremamente proveitosa durante todos esses anos, pelo exemplo de profissionalismo e de trabalho em equipe. Tenho certeza de que fiz amigos lá!
À colega CD Monique Luiza Braga Garcia, que na época, como aluna de iniciação científica, participou da elaboração desta tese de forma dedicada e brilhante, e com certeza tem grande influência no sucesso desta pesquisa.
A todos os colegas e amigos da Pós-Gradução pelos momentos de companheirismo, amizade e trabalho.
Às funcionárias Cleide e Damiana, que sempre estiveram presentes para nos ajudar em tudo que precisávamos.
Noronha Filho JD. Avaliação de propriedades mecânicas, físico-químicas e da citocompatibilidade de compósitos restauradores híbridos experimentais com partículas de carga porosas.[tese]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2014.
Atualmente os compósitos restauradores são constituídos de uma matriz orgânica baseada em monômeros metacrílicos como o Bisfenol A-glicidil metacrilato GMA), o Uretano dimetacrilato (UDMA), Bisfenol A-glicidiletoxi metacrilato (Bis-EMA), Trietilenoglicolmetacrilato (TEGDMA), partículas inorgânicas de carga (vidros sintéticos e alótropos da sílica) e de um agente de união organo-silano que estabelece ligações químicas entre a matriz e as partículas de carga.
Ambas as fases (matriz polimérica e sistemas de cargas inorgânicas) podem influenciar as propriedades mecânicas e físico-químicas de compósitos restauradores. Por um lado, os monômeros presentes na matriz podem afetar aspectos como o grau de conversão monomérica e as tensões geradas durante a contração de polimerização; enquanto que o tipo e a concentração das partículas de carga irão refletir em propriedades como a dureza, o módulo de elasticidade e a resistência à flexão. Com base nestes aspectos, e com o objetivo de maximizar o desempenho desta classe de material restaurador, estudos recentes têm investigado a influência de diferentes tipos de partículas inorgânicas nas propriedades de compósitos experimentais bem como os diferentes tipos de tratamento da partícula de carga. Neste estudo foram analisados quatro compósitos experimentais e o compósito comercial Filtek Z250 3M ESPE de cor incisal. A matriz polimérica de todos os materiais foi composta de 70 % p/p de Bis-GMA e 30 % p/p de TEGDMA. Para permitir a fotoativação das matrizes, foram incorporados 0,5% p/p de canforoquinona e 1% p/p de EDMAB. Em seguida, foi realizada a incorporação de um sistema de cargas inorgânicas composto de partículas de bário-boro-silicato com diâmetro médio de 7,5 µm e nanocargas de óxido de silício com 40 nm, misturadas na proporção de 15:1 (%p/p). O objetivo deste estudo foi avaliar se o tratamento prévio das partículas de carga com ácido fluorídrico a 10% poderia aumentar a rugosidade das partículas de carga, promovendo a união destas à matriz orgânica por embricamento mecânico e permitindo uma relaxação das tensões na fase
pós-degradação hidrolítica e aos efeitos citotóxicos do condicionamento ácido. As seguintes propriedades mecânicas e físico-químicas foram avaliadas: grau de conversão monomérico, resistência flexural, módulo de elasticidade, microdureza, análise topográfica, rugosidade, absorção, solubilidade e citocompatibilidade. Nenhum compósito analisado apresentou potencial citotóxico. Os cinco compósitos analisados apresentaram valores similares de grau de conversão. O grupo E4 que foi condicionado pelo ácido e silanizado apresentou o maior valor de absorção. De forma geral, os grupos nos quais as partículas foram condicionadas pelo ácido apresentaram os piores valores em relação às propriedades mecânicas. No entanto, estes apresentaram valores favoráveis à tensão de contração e solubilidade.
Palavras-chave: compósitos restauradores, partículas porosas, propriedades mecânicas e fisico-químicas, citocompatibilidade.
Noronha Filho JD. Influence of surface treatment of the inorganic filler system on biocompatibility, chemical and physical properties of experimental restorative composites. [thesis]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2014.
Currently restorative composites consist in a polymer matrix based on methacrylic monomers such as bisphenylglycidyl dimethacrylate (BisGMA), urethane dimethacrylate (UDMA), ethoxylated bisphenol-A dimethacrylate (BisEMA), triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA), inorganic filler particles and a silane coupling agent to establishing chemical bonding between the organic matrix and filler particles. Both phases (polymer matrix and inorganic filler systems) can influence the mechanical and chemical properties of composite restorative. On one hand, the monomers present in the matrix can affect aspects such as the degree of conversion and the stresses generated during polymerization shrinkage, whereas the type and concentration of filler particles will be reflected in such properties as hardness, Young’s modulus and flexural strength. Based on these aspects, and aiming to maximize the performance of this class of restorative material, recent studies have investigated the influence of different types of inorganic particles on the properties of experimental composites as well as the different types of treatment of the filler particles. In this study, four experimental composites and commercial available composite Filtek Z250 3M ESPE incisal color were analyzed. The polymeric matrix of all materials consisted of 70 wt.% of BisGMA and 30 wt.% of TEGDMA. To allow curing of the matrices were incorporated 0.5 wt.% camphorquinone and 1 wt.% of EDMAB. Then, the incorporation of a system of inorganic filler particles consist of barium-boron-silicate with an average diameter of 7.5 µm and a nanofiller with 40 nm of silicon oxide, mixed at a ratio of 15:1 wt.% was performed. This study aimed to assess whether pretreatment of the filler particles with hydrofluoric acid 10 % could increase the surface energy of the filler particles, promoting a better union of these two phases by mechanical interlocking and allowing a dissipation of tensions after polymerization reaction and to verify the harmful effects of silane layer with respect to hydrolytic degradation and cytotoxic effects of the acid etching of the fillers. The following mechanical and physicochemical properties were evaluated: degree of
roughness, absorption, solubility and cytocompatibility. Composites analyzed showed no cytotoxicity potential. The five analyzed composites showed similar values of degree of conversion. The E4 group that was conditioned by acid and silanized showed the highest absorption. In general, the groups in which the particles were acid conditioned presented the worst values in relation to the mechanical properties. However, they showed favorable values to shrinkage stress and solubility.
Keywords: resin-based composites, porous filler, physical-mechanical properties, cytotoxicity.
1 - INTRODUÇÃO
Desde que o conceito de compósito restaurador foi introduzido no campo da odontologia [31], o emprego deste tipo de material na prática clínica vem aumentando de forma exponencial. No entanto, trabalhos publicados demonstram que restaurações posteriores confeccionadas com compósitos ainda apresentam taxas de sobrevivência inferiores a restaurações de amálgama de prata [9,34]. Desta forma, estudos direcionados à melhora e ao desenvolvimento de novos materiais que possam aumentar a longevidade de restaurações compósitas se revestem de grande relevância científica. Basicamente, compósitos restauradores são constituídos de uma matriz polimérica baseada em monômeros metacrílicos como o Bisfenol A-glicidil metacrilato (Bis-GMA), o Uretano dimetacrilato (UDMA), Bisfenol A-glicidiletoxi metacrilato (Bis-EMA), Trietilenoglicolmetacrilato (TEGDMA), partículas inorgânicas de carga (vidros sintéticos e alótropos da sílica) e de um agente de união organo-silano que estabelece ligações químicas entre a matriz e as partículas de carga. A reação de polimerização destes materiais é desencadeada por substâncias fotoiniciadoras que absorvem fótons, entram em um estágio excitado e quebram as ligações C=C das terminações metacrílicas dos monômeros, iniciando uma reação de copolimerização por radicais livres [40]. O fotoiniciador mais utilizado atualmente é a canforoquinona, uma -1,2 di-cetona, que possui pico de absorção em 468nm.
Ambas as fases (matriz polimérica e sistemas de cargas inorgânicas) podem influenciar as propriedades mecânicas e físico-químicas de compósitos restauradores. Por um lado, os monômeros presentes na matriz podem afetar aspectos como o grau de conversão monomérica [6,7] e as tensões geradas durante a contração de polimerização [4]; enquanto que o tipo e a concentração das partículas de carga irão refletir em propriedades como a dureza [3], o módulo de elasticidade e a resistência à flexão [39]. Com base nestes aspectos, e com o objetivo de maximizar o desempenho desta classe de material restaurador, alguns estudos têm investigado a influência de diferentes tipos de partículas inorgânicas nas propriedades de compósitos experimentais [48,41,44].
Independente do tipo de matriz polimérica e do sistema de cargas inorgânicas utilizados na produção do compósito, a interação entre estes, através da interface,
irá influenciar diretamente o desempenho do material. A silanização prévia das partículas de carga é o mecanismo mais utilizado neste sentido. O mecanismo de ação do organo-silano se dá através do estabelecimento de ligações covalentes com os grupamentos -C=C- das terminações metacrílicas da matriz polimérica e com a formação de ligações silânicas (-Si-O-Si-) com a superfície das partículas de carga. Esta efetiva ligação pode diminuir a degradação do material [33], aumentar a resistência à fratura das partículas de carga [36], bem como melhorar a transmissão de tensões entre a matriz polimérica e as partículas de carga [35]. No entanto, trabalhos publicados mostram que a difusão de fluidos através de compósitos fotoativáveis pode provocar a hidrólise das ligações silânicas e a perda das partículas de carga, diminuindo as propriedades fisico-químicas dos compósitos em função do tempo. Este é um aspecto fundamental do ponto de vista clínico. Aliado a isto, trabalhos recentes demonstram que compósitos com partículas não silanizadas apresentaram resultados positivos em relação a diversas propriedades mecânicas. Musanje & Ferracane, 2004 [38] não encontraram diferenças entre os valores de resistência flexural, módulo de elasticidade e dureza Knoop de compósitos com partículas silanizadas e não silanizadas. Na mesma linha, Luo et al., 1998 [46] não encontraram diferenças entre o desgaste superficial de compósitos com partículas silanizadas e não silanizadas. Mais ainda, estes autores também demonstraram forte correlação positiva entre a porosidade superficial das partículas de carga e a resistência ao desgaste, independente da silanização prévia.
Com base nestes aspectos e no estudo clássico de Bowen & Red, 1976 [8], que propuseram que a produção de poros na superfície de partículas de vidro poderia aumentar a interação com a matriz resinosa através da interpenetração entre as fases orgânicas e inorgânicas de compósitos, trabalhos recentes têm investigado a influência de partículas porosas nas propriedades de compósitos experimentais, com resultados positivos em relação à resistência à flexão [8], à resistência à compressão e ao módulo de elasticidade, bem como à resistência ao desgaste. Partículas porosas podem ser produzidas através de processos complexos de síntese ou através do condicionamento seletivo da matriz vítrea de partículas de vidros cerâmicos [8].
Os resultados de Samuel et al., 2009 [11], onde compósitos híbridos experimentais produzidos com misturas não silanizadas de partículas porosas e nanopartículas esféricas de SiO2 (500 nm) apresentaram maior módulo compressivo
do que compósito com partículas de SiO2 silanizadas, aliados a ausência na
literatura de dados sobre o desempenho de compósitos com partículas porosas em relação a propriedades ligadas à degradação (solubilidade e absorção salivar) e principalmente às tensões geradas durante a contração de polimerização, propriedades extremamente influenciadas pela interface matriz polimérica-partículas de carga e com grande relevância no desempenho clínico de restaurações compósitas, amparam o presente estudo, onde foram produzidos e analisados compósitos híbridos experimentais com partículas porosas de vidro de bário-boro-silicato e nanocargas de óxido de silício (SiO2 – 40 nm).
As partículas de carga inorgânicas são utilizadas nos compósitos odontológicos com o principal objetivo de aumentar a resistência do material [5,43]. Materiais como quartzo, sílica coloidal, sílica de vidro contendo bário, estrôncio e zircônia e outros [38] têm sido comumente utilizados nos compósitos como diferentes tipos de partículas de carga inorgânicas. Diversos são os tipos, formas e tamanhos de carga utilizados em produtos comerciais e esses fatores podem afetar as propriedades do material, como a dureza [32,46] o coeficiente de expansão térmica, a retenção de brilho [37], a absorção de água [30], a tenacidade à fratura [45] e o módulo de elasticidade [11].
Para que as partículas de carga inorgânicas possam atuar efetivamente no aumento da resistência do compósito, é necessário que estejam quimicamente unidas à matriz [1,48]. Assim, a formação de uma forte ligação covalente entre a carga inorgânica e a matriz orgânica é essencial para se obter boas propriedades mecânicas nos compósitos odontológicos, e a união destas duas fases é alcançada pelo revestimento da carga com um agente de união de silano denominado como interface [38,42,12].
O silano mais frequentemente utilizado na formulação de compósitos odontológicos é o MPTS (-metacriloxipropil-1-trimetoxisilano). Além de evitar a agregação das partículas de carga, o MPTS promove uma união entre as partículas de carga inorgânicas e a matriz orgânica, por meio da copolimerização, através de ligações covalentes e pontes de hidrogênio [12].
No entanto, esta forte união entre as partículas de carga inorgânica micrométricas e a matriz orgânica pode, de certa forma, impedir a dissipação das tensões geradas durante a reação de polimerização. Estas tensões, em longo prazo, podem levar ao insucesso da restauração.
Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se o tratamento prévio das partículas de carga com ácido fluorídrico a 10% poderia aumentar a energia de superfície das partículas de carga, promovendo a união destas à matriz orgânica por embricamento mecânico e permitindo uma relaxação das tensões na fase pós-gel, além de verificar efeitos prejudiciais da camada silânica no que diz respeito à degradação hidrolítica e aos efeitos citotóxicos do condicionamento ácido.
2 - METODOLOGIA
2.1) Produção dos Compósitos Experimentais
Foram analisados quatro compósitos experimentais e o compósito comercial Filtek Z250 3M ESPE de cor incisal (Quadro 1). A matriz polimérica de todos os materiais foi composta de 70 % p/p de Bis-GMA e 30 % p/p de TEGDMA, sendo os monômeros utilizados como recebidos (Aldrich Chemical, Inc., Milwaukee, WI, EUA) e sem purificação. Para permitir a fotoativação das matrizes, foram incorporados 0,5% p/p de canforoquinona e 1% p/p de etil N,N-dimetil-4aminobenzoato (EDMAB) para atuarem, respectivamente, como fotoiniciador e agente de redução (Aldrich Chemical, Inc., Milwaukee, WI, EUA). Após a incorporação de um sistema de cargas inorgânicas composto de partículas de bário-boro-silicato com diâmetro médio de 7,5 µm e nanocargas de óxido de silício com 40 nm, misturadas na proporção de 15:1 (%p/p), os compósitos experimentais foram centrifugados em uma centrífuga DAC 150.1 FVZ SpeedMixer (FlackTek Inc., Herrliberg, Germany). Com o objetivo de produzir misturas homogêneas, a centrifugação foi feita em três ciclos com duração de 1 min a 1300 rpm.
Compósito Tratamento superficial das partículas de bário-boro-silicato
E1 Sem tratamento superficial
E2 Silanização
E3 Condicionamento com ácido hidrofluorídrico a 10% durante 2 min E4 Condicionamento com ácido hidrofluorídrico a 10% durante 2 min
+ silanização
E5 Compósito comercial Filtek Z250 incisal Quadro .1 - Composição dos compósitos experimentais.
Nos grupos E3 e E4 as partículas de bário-boro-silicato foram condicionadas com ácido hidrofluorídrico a 10% (v/v) durante 2 min e lavadas em água deionizada durante 1 hora. Em seguida, as partículas foram lavadas com uma solução de hidróxido de sódio a 50% e monitoradas com um pHmetro (HI3220 Hanna instruments, USA) até que se atingisse o pH neutro. Após este procedimento,
as partículas foram secas à temperatura ambiente. Nos grupos E2 e E4 as partículas de carga foram silanizadas com -metacriloxipropil-1-trimetoxisilano (-MPS), sendo que a silanização no grupo E4 foi feita após o condicionamento ácido descrito acima. A silanização das partículas foi realizada de acordo com a metodologia de Chen & Brauer, 1982 [13]. A quantidade de silano mínima para cobrir as partículas de carga (X) foi calculada através da seguinte equação:
X
A
f
Onde, A é a área de superfície de 1g da partícula de bário-boro-silicato (com diâmetro médio de 7,5 µm = 1,76x10-6 m2), ω é a área de superfície de cobertura por grama do silano (MPTS = 2525 m2g-1), e f é a quantidade de partículas de bário-boro-silicato com diâmetro médio de 7,5 µm, em gramas.
Com o cálculo da massa de uma partícula de carga através da fórmula da densidade, que é um dado fornecido pelo fabricante, foi possível chegar ao valor de A, que é de 0,913 m2g-1. Desta forma foi possível calcular a quantidade de silano ideal para uma determinada quantidade desta partícula em questão.
As partículas de bário-boro-silicato com diâmetro médio de 7,5 µm, o silano MPTS, o solvente (cyclohexano, 100 mL) e n-propylamina (0.1 ± 0.01 g) foram misturados em temperatura ambiente por 30 minutos, e em seguida a uma temperatura de 60 ± 5 ºC por mais 30 minutos no agitador magnético (Modelo Q261A11 – Quimis, Rio de Janeiro, Brasil). A mistura foi então colocada em um evaporador rotativo (Modelo G344B1 – Quimis, Rio de Janeiro, Brasil) para remoção do solvente e volatilização dos subprodutos com temperatura de 60 ± 5 ºC. O pó resultante foi então aquecido a 95 ± 5 ºC por 1 hora no evaporador rotativo e finalmente seco em estufa de secagem (Modelo Q317M-22 – Quimis, Rio de Janeiro, Brasil) a 50ºC por 48 horas.
Após todos estes processos foram obtidos então quatro grupos distintos de partículas de carga. As partículas sem tratamento de superfície foram adicionadas à mistura monomérica formando o grupo denominado E1. As partículas apenas silanizadas foram adicionadas à mistura monomérica formando o grupo denominado E2. Já o grupo E3 foi formado pela adição das partículas condicionadas pelo ácido
hidrofluorídrico à mistura monomérica enquanto que o quarto e último grupo E4 foi formado pela adição das partículas condicionadas pelo ácido e silanizadas à mistura monomérica.
2.2) Ensaio Multiparamétrico de Citotoxicidade
2.2.1) Cultura de Células
Para este estudo foram utilizadas linhagens primárias de fibroblastos humanos, obtidos e manipulados na coleção de células da Unidade de Pesquisa Clínica do Hospital Universitário Antônio Pedro – UPC/HUAP/UFF, a fim de que os testes de citocompatibilidade se aproximassem ao máximo das condições finais de aplicação clínica dos biomateriais.
As células foram cultivadas, em meio Alfa-MEM (Cultilab, Brasil) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e três antibióticos (Penicilina 10.000 U.I./ml, Estreptomicina 10 mg/ml e Sulfato de Gentamicina 50 mg/ml) em frascos (garrafa) de cultura de células de poliestireno de 25 cm2 (Corning; New Jersey, EUA) e mantidas em estufa a 37°C, sob atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% de CO2. A troca do meio foi feita a cada 48 horas.
Após 30 dias, as células em confluência foram replicadas através de tratamento com tripsina/EDTA (Gibco®, Grand Island, NY, USA) e transferidas posteriormente para placa de cultura de 96 poços, incubadas em meio Alfa MEM e mantidas em estufa a 37°C, sob atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% de CO2.
Após as células atingirem confluência, foi removido da garrafa o meio de cultura Alfa-MEM e adicionado BSS (Balanced salt solution) para lavagem por três vezes, em seguida foram adicionados 2 ml de tripsina/EDTA (Gibco®, Grand Island, NY, USA) por 2 minutos ou até que todas as células estivessem desprendidas. Posteriormente foi adicionado meio Alfa-MEM às células para cessar a ação da tripsina. Após este tempo, todo o conteúdo da garrafa foi transferido para um tubo Falcon de 15 mL, o qual foi centrifugado por 10.000 rpm por 3 min. O sobrenadante foi desprezado e ao pellet foi adicionado novo meio Alfa-MEM com 10% de SFB com os três antibióticos anteriormente mencionados, sendo, em seguida, ressuspendido. O conteúdo suspendido foi transferido, após contagem em Câmara de Neubauer,
para placa de cultura de 96 poços que foi mantida em estufa a 37°C, sob atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% de CO2 por 24 horas.
2.2.2) Preparação do Extratos
Os extratos dos compósitos e dos controles foram preparados segundo a norma ISO 10993-5 [14], onde se mantém a proporção de 2g de material para 10mL de solução, no caso, meio de cultura não suplementado. A extração ocorreu por incubação dos materiais, nestas condições, a 37°C e atmosfera de 5% CO2, por 24
horas. Extratos de poliestireno e de fragmentos de látex foram também preparados como controles negativo e positivo de toxicidade, respectivamente.
2.2.3) Ensaio de Citotoxicidade
A fim de obter maiores informações sobre a biocompatibilidade do biomaterial deste estudo, este também foi avaliado em testes in vitro, onde foi feito um teste multiparamétrico de citotoxicidade.
Possíveis efeitos citotóxicos dos compósitos experimentais foram avaliados de acordo com as recomendações contidas na norma ISO 7405, referente à avaliação de materiais odontológicos. A viabilidade celular foi mensurada através de método multiparamétrico, que permitiu a análise de diferentes parâmetros de sobrevivência em uma mesma amostra: atividade mitocondrial (XTT), integridade membranar (vermelho neutro) e densidade de células (cristal violeta). Para estes testes, foram utilizados kits de citotoxicidade In Cytotox (Xenometrix, Allschwil, Suiça).
Após a preparação dos extratos, os mesmos foram adicionados à cultura de fibroblastos humanos em placa de 96 poços, na densidade de 104 células por poço. Estas células foram incubadas na presença dos extratos por 24h a 37ºC e 5% CO2.
Ao término da incubação, as células foram lavadas com PBS e os testes de viabilidade foram realizados.
2.2.3.1) Teste de Atividade Mitocondrial – XTT
O teste do XTT baseia-se na habilidade das enzimas desidrogenases mitocondriais converterem o sal tetrazólio hidrossolúvel XTT (cor amarela) em compostos de formazana (cor laranja). Após incubação com o reagente (XTT) por períodos de 2 horas a 37ºC e 5% CO2, a absorbância a 480 nm foi mensurada em
um leitor de microplacas Sinergy II (BioTek Instruments, EUA).
2.2.3.2) Teste de Integridade Membranar- Vermelho Neutro
O vermelho neutro é um teste de sobrevivência/viabilidade baseado na habilidade de células viáveis incorporarem o corante vermelho neutro pelos lisossomos, que se acumula na sua membrana íntegra. A quantidade de corante incorporado pode ser mensurada pela absorbância a 540 nm. Para este teste, as células expostas ao XTT foram lavadas em solução NRI (Xenometrix, Allschwil, Suíça) e expostas por 2 horas a 37ºC e 5% CO2 ao corante vermelho neutro. Após
este período, as células foram fixadas por 1 minuto com solução NRII. Em seguida as células foram lavadas com uma última solução NRIII, para remoção de excessos do corante. A absorbância foi mensurada em um leitor de microplacas Sinergy II (BioTek Instruments, EUA).
2.2.3.3) Teste de Densidade Celular – Cristal Violeta
O cristal violeta é um ensaio simples, que avalia a densidade celular por coloração do DNA; após eliminação do excesso do corante. A absorbância a 540 nm é proporcional à quantidade de células no poço. Neste método, as células fixadas no teste do vermelho neutro foram lavadas, tratadas com o corante cristal violeta por 10 minutos, lavadas exaustivamente com água destilada e em seguida expostas a uma solução de metanol e ácido acético, proveniente do kit In-Citotox (Xenometrix, Allschwil, Suíça). Esta solução solubilizou o corante e, após agitação, permitiu mensuração da densidade celular por meio da leitura da absorbância a 540 nm, em leitor de microplacas.
2.3) Análise da Topografia dos Compósitos Experimentais e Rugosidade.
Utilizando uma matriz metálica ( = 3 mm e altura = 2 mm) foram confeccionados cinco espécimes para cada compósito analisado. Após a inserção dos compósitos em incremento único, a remoção de excessos e o posicionamento de uma matriz de poliéster e uma lâmina de vidro de 0,7mm de espessura sobre a matriz, os espécimes foram fotoativados por 30s, com irradiância de 650 mW/cm2, com a ponta do fotoativador apoiada sobre a lamínula de vidro. Após a fotoativação, as superfícies não-irradiadas foram marcadas com uma lâmina de bisturi e os grupos experimentais armazenados, individualmente, em recipientes plásticos de cor preta para evitar sobre-exposição à luz. As superfícies irradiadas dos compósitos foram observadas em microscópio confocal a laser (LEXT OLS4000, Olympus, Tokyo, Japão). Além das imagens, os valores de rugosidade linear (Ra) e de área (Sa) foram obtidos a partir de ferramentas do software do equipamento. Além das superfícies dos compósitos, as partículas de bário-boro-silicato também foram analisadas no microscópio confocal, antes e depois do condicionamento ácido.
2.4) Dureza
Utilizando uma matriz metálica ( = 3 mm, altura = 2 mm) foram confeccionados cinco espécimes para cada compósito experimental. Após a inserção dos compósitos em incremento único, a remoção de excessos e o posicionamento de uma matriz de poliéster e uma lâmina de vidro de 0,7mm de espessura sobre a matriz, os espécimes foram fotoativados por 30s com irradiância de 650 mW/cm2, com a ponta do fotoativador apoiada sobre a lamínula de vidro. Após a fotoativação, as superfícies não-irradiadas foram marcadas com uma lâmina de bisturi e os grupos experimentais armazenados, individualmente, em recipientes plásticos de cor preta para evitar sobre-exposição à luz.
Após 24h, os grupos foram embutidos, individualmente, em resina epóxica quimicamente ativada, dentro de cilindros de PVC, com as fases irradiadas apoiadas em uma placa de vidro. Após a polimerização da resina de embutimento, as superfícies irradiadas foram polidas, sequencialmente, em politriz com polidor automático com lixas de carbeto de silício nº 600, 1200 e 4000 sob refrigeração (250rpm/60s em cada lixa). Após armazenagem durante 24h em ambiente escuro,
foi avaliada a dureza Knoop nas superfícies irradiadas. Foram realizadas cinco indentações (carga de 50g/15 segundos) em pontos espaçados de aproximadamente 500µm.
2.5) Resistência à Flexão (RF) e Módulo de Elasticidade (ME)
Para os ensaios de resistência à flexão e módulo de elasticidade foram confeccionados dez espécimes para cada compósito experimental. Os compósitos foram inseridos, em incremento único, em uma matriz metálica bipartida (1x2x10 mm) posicionada sobre uma lâmina de vidro. Com o objetivo de evitar porosidades internas nos espécimes, uma lamínula de vidro de 0,3 mm de espessura foi posicionada sobre a matriz e um dispositivo com uma massa de 0,5 kg foi posicionado sobre esta durante 20s. Como a ponta do fotoativador possui um diâmetro de 8,0 mm, os espécimes foram fotoativados por 30s com irradiância de 650 mW/cm2, com duas sobreposições a partir das extremidades, pelos dois lados (superior e inferior). Após a confecção, todos os espécimes foram observados com aumento de 40 x (SZ61TR, Olympus, EUA) com o objetivo de descartar os que apresentassem imperfeições. Após armazenagem em água destilada a 37 1°C por 24 h, os espécimes foram submetidos a ensaio de flexão, empregando-se o método de três pontos, em uma máquina de ensaios mecânicos (EMIC DL 2000, com célula de carga de 50 N e velocidade de deslocamento de 1,0 mm/min). A distância entre os dois pontos inferiores foi de 6,0 mm. O módulo de elasticidade (GPa) foi obtido com base na porção retilínea da curva tensão-deformação e a resistência à flexão (MPa) com base na carga final no momento da ruptura dos espécimes, de acordo com as equações abaixo:
ME= l 3F 4wh3d 2 2 3 wh lF RF
onde l é a distancia (mm) entre os pontos inferiores, F a carga (N) aplicada no momento da ruptura do espécime, h a altura (mm) do espécime, w a largura do
espécime e d a deflexão (mm) do espécime, sobre a carga F, durante o regime elástico.
2.6) Grau de Conversão Monomérica (GC%)
O grau de conversão monomérica foi avaliado através de espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier (ALPHA-P FT-IR Spectrometer, Bruker Optics, Ettlingen, Alemanha), utilizando a técnica de refletância total atenuada – ATR – [Platinum Single Reflection Diamond Accessory (Bruker Optics, Ettlingen, Alemanha)]. Incrementos dos compósitos experimentais foram comprimidos com o auxílio de uma lamina de vidro diretamente sobre a janela de leitura do equipamento e. fotoativados durante 30s, com irradiância de 650 mW/cm2 (19,5 J/cm2), com a ponta do fotoativador encostada na lamínula de vidro. Foram obtidos espectros com 60 varreduras e resolução de 4 cm-1, em temperatura controlada de 25 1ºC. Os espectros dos compósitos não polimerizados foram obtidos nas mesmas condições. Na análise dos espectros FT-IR, foi considerado o intervalo entre 1800 e 1600 cm-1, para a observação dos sinais em 1609 e 1639 cm-1, correspondentes, respectivamente, às ligações vinílicas aromáticas do bisfenol A e alifáticas do grupamento funcional metacrilato.
O grau de conversão (GC%) de cada compósito experimental foi calculado utilizando a razão entre a altura do sinal em 1639 cm-1 e em 1609 cm-1 dos filmes polimerizados e não polimerizados, de acordo com a seguinte equação:
GC% = 100 x {1-(R filme polimerizado / R filme não polimerizado)},
onde R = altura da banda em 1639 cm-1 / altura da banda em 1609 cm-1
2.7) Tensão de Contração de Polimerização
Para a avaliação do desenvolvimento das tensões de contração, incrementos cilíndricos dos compósitos com 2,0 mm de diâmetro e 4,0 mm de altura foram aderidos às extremidades de cilindros de vidro com 5,0 mm de diâmetro, retificados no último milímetro até alcançar o diâmetro de 2,1 mm. As superfícies dos cilindros de vidro foram previamente lixadas com lixa de carbeto de silício nº 180, jateadas
(10s) com óxido de alumínio, condicionadas com ácido fluorídrico a 10% v/v (Dentsply, Rio de Janeiro, Brasil) por 30s, lavadas com água, secas com jato de ar e silanizadas (Silano, Dentsply, Rio de Janeiro, Brasil) seguindo as orientações do fabricante. O adesivo Single Bond (3M-ESPE) foi aplicado e fotoativado imediatamente antes da aplicação dos compósitos. Através de mandris, um dos cilindros de vidro foi fixado na base inferior de uma máquina de ensaios mecânicos (DL 2000 - EMIC, São José dos Pinhais, Paraná, Brasil) e o outro diretamente na célula de carga (50 N), mantendo-se uma distância de 4,0 mm entre as superfícies silanizadas. Posteriormente, os incrementos cilíndricos dos compósitos, obtidos com o auxílio de uma ponta da seringa Centrix (DFL Ind. e Com LTDA, Rio de Janeiro, Brasil) com 2,0 mm de diâmetro, foram adaptados entre os dispositivos de vidro fixados à máquina de ensaios. Para a manutenção da distância constante entre as duas superfícies vítreas, as extremidades de um extensômetro (EE10 – EMIC, São José dos Pinhais, Paraná, Brasil) foram fixadas aos dois dispositivos de vidro, mantendo uma distância de 25 mm entre si. Desta forma, o cilindro de compósito permaneceu em uma região compreendida entre as extremidades do extensômetro. Os cilindros de compósito foram fotoativados durante 30 s, com irradiância de 650 mW/cm2, a uma distância padronizada e perpendicularmente ao seu eixo maior. Em função da ação do extensômetro, a célula de carga da máquina de ensaios registrou a força desenvolvida pela contração dos compósitos durante 15 min, a partir do inicio da fotoativação. Cinco espécimes foram confeccionados para cada compósito experimental.
2.8) Solubilidade (S), Absorção (A)
Utilizando uma matriz bipartida de teflon ( = 6 mm, altura = 1 mm), foram confeccionados cinco espécimes para cada compósito estudado. A matriz bipartida foi colocada sobre uma lamínula de vidro de 1 mm de espessura e preenchida com os materiais. Após a colocação de uma tira de poliéster e de outra lamínula de vidro, com 0,3 mm de espessura sobre a matriz de teflon o espécime foi comprimido com carga constante de 0,5 kg até o total extravasamento do excesso e eliminação de porosidades. Após a remoção da carga de 0,5 Kg, os espécimes foram fotoativados por 30 s com irradiância de 650 mW/cm2 (Radii Cal, SDI, Bayswater, Australia). Após a confecção, todos os espécimes foram observados com aumento de 40 x (SZ61TR,
Olympus, EUA) com o objetivo de descartar os que apresentassem imperfeições (porosidade interna e externa). Após, os espécimes foram colocados em um dessecador com sílica gel azul e mantidos em estufa a 37 1ºC (Q316B15, Quimis, Rio de Janeiro, Brasil) durante 24 h. Os espécimes foram pesados em balança analítica com precisão de 0,00001 g (AUW 220D, Shimadzu, Japão), em intervalos de 24 h, até a obtenção de uma massa constante (variação menor que ± 0,1 mg - m1). Após a secagem, o diâmetro e a espessura dos espécimes foram mensurados
com um paquímetro digital (MPI/E-101, Mytutoyo, Tokyo, Japão). O diâmetro foi mensurado em quatro pontos equidistantes e a espessura no centro e em quatro pontos espaçados na circunferência do espécime. Com os valores obtidos foram calculados os volumes (V) dos espécimes em mm3.
Após as medições, os espécimes foram colocados individualmente em ependorfs, imersos em 10 mL de água destilada (Q42B5L, Quimis, Rio de Janeiro, Brasil) e colocados em estufa a 37 1ºC. Durante o primeiro dia de imersão, os espécimes foram pesados após 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 80, 160, 320 e 640 min. Após o primeiro dia, os espécimes foram pesados a cada 24h até que a massa mensurada apresentasse equilíbrio (variação menor que ± 0,1 mg – m2). Antes de
cada pesagem, os espécimes foram secos com papel absorvente. Os 10 mL de água foram trocados a cada período de 24h. Após, os espécimes foram submetidos ao mesmo processo de secagem descrito para m1, até a obtenção de nova massa
constante (variação menor que ± 0,1 mg - m3).
Para os cálculos da solubilidade (S) e da absorção (A) (g/mm3
) foram utilizadas as seguintes equações, onde V é o volume individual de cada espécime:
S = V m m1 3 A = V m m2 3
3 - ARTIGO PRODUZIDO
Influence of surface treatment of the inorganic filler system on biocompatibility, chemical and physical properties of experimental restorative composites.
JaimeDutra Noronha Filho
Eduardo Moreira da Silva,Associate professor1
Analitical Laboratory of Restorative Biomaterials – LABiom-R, School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
*Corresponding author: Dr. Eduardo Moreira da Silva – Universidade Federal Fluminense / Faculdade de Odontologia - Rua Mário Santos Braga, nº 30 - Campus Valonguinho, Centro, Niterói, RJ, Brazil - CEP 24040-110 - Phone: 55 21 2629-9832 - Fax: 55 21 2622-5739 - e-mail: emsilva@vm.uff.br
Keywords: resin-based composites, porous filler, physical-mechanical properties, citotoxicity.
ABSTRACT
This study analyzed the influence of the surface treatments of the inorganic filler system on the physical and mechanical properties, and in vitro biological response of experimental photoactivable composites. Four hybrid composites with barium borosilicate (7.5 µm) and silicium oxide (40 nm), incorporated in 15/1 proportion wt.% were analyzed. The organic phase of the materials was a polymer matrix with 70% of BisGMA and 30% of TEGDMA (wt.%). In each matrix 0.5 wt.% of camphorquinone and 1 wt.% of ethyl N,N-dymethil-4aminobenzoate (EDMAB) were added to act as photoinitiating system. The barium borosilicate particles were conditioned with 10% hydrofluoridric acid and silanized with -methacryloxypropyl trimethoxy silane (-MPS). The follow chemical-mechanical properties were evaluated: degree of conversion (DC%), flexural strength (FS), Young’s modulus (YM), hardness (KHN), sorption and solubility. All of the groups analyzed did not present a cytotoxicity potential. The five composites presented similar DC%. The group E4 that was treated by acid and silanized presented higher value of sorption (24,69 μgmm-3
). In general, the groups E3 and E4, which the fillers were treated by acid, presented the worse
mechanical properties. However, interesting results about polymerization stress was found for these groups.
INTRODUCTION
Ever since the concept of restorative composite was introduced in dentistry [1] there has been an exponential increase in the use of this material in the clinical practice. Earlier published studies, however, suggest that restorations made with composites still present lower survival rates when compared with silver amalgam restorations [2,3]. Based on this, studies on the improvement and development of new materials that may increase the longevity of composite restorations are of great relevance.
Regardless of polymer matrix type and the inorganic filler system used to produce the composite, the interaction that takes place between them as a result of their interface will directly influence its performance. Silanization of filler particles is the most used mechanism to produce composites [4, 5]. The silanization mechanism results from the establishment of covalent –C=C bonds between the organic site of silane and the methacrylic terminations of the polymer matrix and the formation of silanol bonds (-Si-O-Si-) with the surface of the filler particles. This mechanism may reduce degradation of the material [6], increase the fracture resistance of filler particles [7], and improve the stress transmission between the polymer matrix and filler particles [7].
Based on these findings and on the classical study by Bowen & Red, 1976 [8], who proposed that the production of pores on the surface of glass particles might increase the interaction with the polymeric matrix by interpenetration between the organic and inorganic composite phases, recent studies have investigated the influence of porous particles as regards flexural strength [9,10], compression resistance and Young’s modulus [11], as well as resistance to wear [12]. Porous particles may be produced by complex synthesis processes [11] or by means of selective conditioning of the vitreous matrix of ceramic glass particles [9,10,12].
The results of Samuel et al., 2009 [11] who showed that experimental hybrid composites produced with non-silanized mixtures of porous particles and spherical nanoparticles of SiO2 (500 nm) presented a greater compressive modulus than a
composite with silanized SiO2 particles, and the lack of data on the performance of
composites with porous particles in relation to properties linked with degradation process (solubility and sorption), and particularly to the stress created during
polymerization contraction that are influenced by the interface between filler polymer-particle matrix, properties that are of great relevance in the clinical performance of composite restorations leaded to development of the present project. Therefore, the purpose of this study was to analyze the influence of different treatments of inorganic filler system on citotoxicity and chemical-mechanical properties of experimental composites.
MATERIAL AND METHODS
Production of Experimental Composites
Four experimental composites were analyzed in the present study (Table 1). The polymer matrix for all materials was composed of 70 wt.% of Bis-GMA and 30 wt.% of TEGDMA. Monomers were used as received (ESSTHEC, Inc. Essington, PA, USA). To enable matrix photoactivation 0.5 wt.% of camphorquinone and 1 wt.% of ethyl N,N-dymethyl-4 aminobenzoate (EDMAB) were incorporated to act as photoinitiator and reducing agent (Aldrich Chemical, Inc., Milwaukee, WI, EUA), respectively. After the incorporation of an inorganic filler system composed of barium-borosilicate with 7.5 µm average diameter and silicon oxide nanofillers of 40 nm, mixed at a 15:1 proportion (wt.%), experimental composites were centrifuged in a DAC 150.1 FVZ SpeedMixer centrifuge (FlackTek Inc., Herrliberg, Germany). In order to obtain homogenous mixtures, centrifugation was performed in three one-minute cycles at 1300 rpm. A commercial available resin composite was used as control (Table 1).
All the composite specimens used in the experimental protocol were light activated with a led-light unit (Radii Cal, SDI, Bayswater, Australia) using an irradiance of 650 mW/cm2 for 30s.
Table 1 – Composition of experimental composites.
Composite Superficial Treatment of barium borosilicate particles E1 No surface treatment
E2 Silanization
E3 Conditioning with 10% hydrofluoridric acid for 2 min
E4 Conditioning with 10% hydrofluoridric acid for 2 min + silanization E5 Filtek Z250 – Incisal shade
In E3 and E4 groups, the barium borosilicate particles were conditioned with 10% hydrofluoridric acid for 2 min and rinsed with deionized water for one hour.
Particles were then rinsed with a 50% sodium hydroxide solution and monitored with a pHmeter (HI3220, Hanna instruments, USA) until neutral pH was obtained ( 1 week). After this, particles were dried at room temperature. In E2 and E4 groups, filler particles were silanized with α-methacryloxypropyl-1-trimethoxysilane (α-MPS). Silanization in E4 group was performed after the acid conditioning described above. Silanization of particles used the Chen & Brauer (1982) methodology [13]. The minimum amount of silane used to cover filler particles (X) was calculated according to the following equation:
X
A
f
Where A is the surface area of 1g of the barium borosilicate particle (with 7.5 µm = 1.76x10-6 m2average diameter), ω is the surface area of coverage per 1g of silane (MPTS = 2525 m2g-1), and f is the amount of barium borosilicate particles with 7.5 µm average diameter in grams. By calculating the mass of a filler particle using the density formula, which is informed by the manufacturer, it is possible to obtain A value, which is 0.913 m2g-1. Then, the ideal amount of silane for a given amount of this particular particle can be calculated.
The barium borosilicate particles with 7.5 µm average diameter, the silane, the solvent (cyclohexane, 100 mL) and n-propylamine (0.1 ± 0.01 g) were mixed at room temperature for 30 minutes, and then at a temperature of 60 ± 5ºC for more 30 minutes in the magnetic stirrer (Model Q261A11 – Quimis, Rio de Janeiro, Brazil). This mixture was placed in a rotating evaporator (Model G344B1 – Quimis, Rio de Janeiro, Brazil) to remove the solvent and to volatize the byproducts at a temperature of 60 ± 5ºC. The resulting powder was heated at 95 ± 5ºC for 1 hour in the rotating evaporator and finally dried in a dryer (Model Q317M-22 – Quimis, Rio de Janeiro, Brazil) at 50ºC for 48 hours.
Human fibroblasts in primary culture were obtained from the collection of the Clinical Research Unit of the Antônio Pedro University Hospital –Federal Fluminense University. Cells were cultivated in Alfa-MEM (Cultilab, Brazil) medium, supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and three antibiotics (Penicilin 10.000 U.I.ml-1, Streptomycin 10 mg ml-1 and Gentamicin Sulfate 50 mg ml-1) and maintained in an incubator at 37°C, in a moist atmosphere composed of 95% air and 5% CO2. Medium was changed every 48 hours.
Composites and control extracts were prepared according to ISO 10993-5 [14] regulation, where a proportion of 2g of material for 10mL of solution is maintained - in this case non-supplemented culture medium - and incubated under these conditions at 37°C and atmosphere of 5% CO2 for 24 hours. Polystyrene extracts and latex
fragments were also prepared as negative and positive toxicity controls, respectively. After preparation, extracts were added to human fibroblast culture in a 96-well plate at a density of 104 cells per well. These cells were incubated in the presence of extracts for 24h at 37ºC and 5% CO2. At the end of incubation, cells were rinsed with
FBS and viability assays were performed.
XTT test is based on the capacity of mitochondrial dehydrogenase enzymes to convert water-soluble tetrazolium salt XTT (yellow-colored) in formazan compounds (orange-colored). After incubation with the reagent for a period of 2 hours, absorbance at 480 nm was measured in a microplate reader Sinergy II (BioTek Instruments, USA).
Neutral red is a survival/viability test based on the capacity of viable cells to incorporate neutral red dye by lysosomes, which accumulates in their whole membrane. The amount of dye incorporated can be measured by its absorbance at 540 nm. For this assay, cells exposed to XTT were rinsed in NRI solution (Xenometrix, Allschwil, Switzerland) and exposed for 2 hours to red neutral dye. After this period, cells were fixed for one minute with NRII solution and the red neutral diluted in an appropriate NRIII solution. Absorbance was read in a Sinergy II microplate reader (BioTek Instruments, USA).
CVDE (Crystal Violet Dye Elution) is an assay which evaluates cell density by DNA coloring, after excess of dye is eliminated. Absorbance at 540 nm is proportional to the quantity of cells in the well. In this method, cells fixed in the neutral red test were rinsed, treated with violet crystal dye for 10 minutes, rinsed exhaustively with distilled water and then exposed to a methanol and acetic acid
solution, from the In-Citotox kit (Xenometrix, Allschwil, Switzerland). This solution solubilizes the dye and, after stirring, cell density could be measured by reading the absorbance at 540 nm in a microplate reader.
Analysis of Topography of Experimental Composites and Roughness.
Five specimens were manufactured for each experimental composite using a metallic matrix (diameter = 3 mm, height = 2 mm). After composites were inserted in a single increment, excess was removed and a polyester matrix and, in sequence, a glass slide of 0.7 mm thickness were placed on the matrix. Then, specimens were photoactivated with the photoactivator tip placed on the glass slide. After photoactivation, non-irradiated surfaces were marked with a surgical blade and experimental groups were individually stored in black vials in order to avoid overexposure to light. Composite irradiated surfaces were observed under a confocal laser microscope – CLM - (LEXT OLS4000, Olympus, Tokyo, Japan). Besides images, the values of linear roughness (Ra) and 3-D Sa parameter were obtained using the instrument’s software tools. Besides composite surface, the barium borosilicate particles were also analyzed under the confocal microscope, before and after acid conditioning.
Microhardness
Disc-shaped specimens (n = 5) were built up by filling a Teflon split mold measuring 3 mm in diameter and 2 mm in height. The mold was covered with a polyester strip and a glass slide and the polymeric matrixes were light activated. After 24 h of dry storage at 37ºC, the photoactivated surfaces of the specimens were wet ground in a polishing machine (DPU-10, Struers, Copenhagen, Denmark), using 1200 and 4000 grit SiC paper. Five Knoop indentations (50 g/15 s), spaced 500 m apart, were made on the irradiated surfaces of each specimen (Micromet 5104, Buehler, Lake Bluff, IL, USA).
Bar-shaped specimens (n = 10) were built up by filling a steel split mold (10 x 2 x 1 mm) positioned over a polyester strip. After filling the mold to excess, the material surface was covered with a polyester strip and a glass slide and compressed with a device (500 g) for 20 s to avoid porosities. The specimens were then photoactivated from the top by two overlapping footprints. All specimens were observed at 40x magnification (SZ61TR, Olympus, USA) in order to discard those with imperfections. After 24 h of dry storage at 37 ºC, the specimens were submitted to a three-point bending test in a universal testing machine, with an 8 mm span between the supports, at a crosshead speed of 0.5 mm/min and a 50 N load cell (DL 10000, Emic, Curitiba, PR, Brazil). The Young’s modulus (YM) was calculated from the linear portion of the load/deflection curve and the flexural strength (FS) from the load at fracture, using the following standard equations:
YM = l
3F
4wh3d
FS= 3lF 2wh2
where l is the support span length (mm), F is the load (N) at fracture, w is the specimen width (mm), h is the specimen height and d is the deflection (mm) at load F.
Degree of Conversion (DC%)
Increments of each polymeric matrix were inserted in a teflon mold (0.785 mm3) that was positioned on an ATR crystal of an FT-IR spectrometer (Alpha-P/Platinum ATR Module, BRUKER OPTIK GmbH, Ettlingen, Germany). The spectra between 1600 and 1700 cm-1 were recorded by the spectrometer operating with 40 scans and at a resolution of 4 cm-1. Afterwards, the increments were photoactivated and the spectra were recorded exactly as performed for the unpolymerized increments. The DC% was calculated from the ratio between the integrated area of absorption bands of the aliphatic C=C bond (1638 cm-1) to the aromatic C=C bond (1608 cm-1) obtained from
the polymerized and unpolymerized increments, using the following equation:
GC% = 100 x {1-(R cured / R uncured)},
where R = peak at 1639 cm-1/ peak at 1609 cm-1
Polymerization stress
The polymerization stress was analyzed in a universal testing machine equipped with a load cell of 50N (DL 2000 - EMIC, São José dos Pinhais, Paraná, Brazil). Two glass cylinders of 5.0 mm in diameter and 25 mm in length were connected to the testing machine being one of them in the load cell and the other to the lower limit of the testing machine. The extremities of the glass cylinders were previously treated with silicon carbide sandpaper #180, blasted with Al2O3 (10s), conditioned with 10%
hydrofluoridric acid for 30s, rinsed with water, air-spray dried and silanized (Silano, Dentsply, Rio de Janeiro, Brazil) according to manufacturer’s instructions. Single Bond adhesive system (3M-ESPE) was applied and immediately photoactivated (10s / 650 mW/cm2) before composite application. After that, cylindrical increments of composites with 4.0 mm in height, obtained with the aid of a 2.0 mm-diameter Centrix syringe tip (DFL Ind. e Com LTDA, Rio de Janeiro, Brazil), were inserted between the glass cylinders. In order to maintain a constant distance of 4 mm between glass cylinders extremities, an extensometer (EE10 – EMIC, São José dos Pinhais, Paraná, Brazil) was fixed to both glass cylinders. After that, the composite cylinder was photoactivated at a standard distance and perpendicularly to its longer axis. Because of the extensometer’s action, the load cell of the testing machine recorded the stresses (MPa) developed by composite contraction during 15 min (N = 5).
Solubility (S) and Sorption (Sr)
Disc-shaped specimens were built up by filling an aluminum mold (6 mm in diameter and 1 mm in thickness). After filling the mold to excess, the surface was covered with a polyester strip and a glass slide, compressed with a device (500 g) for 20 s to avoid porosities, and then light-activated (n = 5). The discs were placed in a desiccator containing freshly dried silica gel, and transferred to an oven at 37ºC. After every 24
h period, the discs were weighed using an analytical balance (AUW 220, Shimadzu, Tokyo, Japan) until a constant mass (m1) was attained, i.e., disc mass variation was
less than± 0.01 mg in any 24h period. The thickness and the diameter of the discs were measured using a digital caliper (MPI/E-101,Mitutoyo, Tokyo, Japan), and the volume (V) was calculated in mm3. After measurements, specimens were individually placed on eppendorfs, immersed in distilled water (Q42B5L, Quimis, Rio de Janeiro, Brazil) and placed in an oven at 37 ±1ºC. During the first day of immersion, specimens were weighed after 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 80, 160, 320 and 640 min. After the first day, the specimens were weighed every 24h until sorption equilibrium was reached (mass variation less than ± 0.1 mg – m2). Before being
weighed, specimens were dried with absorbent paper. The distilled water was changed every 24h. After this, specimens were submitted to the same drying process described for m1 until a new constant mass was obtained (variation less than ± 0,1
mg - m3). The following equations were used to calculate solubility (S) and sorption
(Sr) (g/mm3 ): S = V m m1 3 Sr = V m m2 3 Statistical analysis:
The obtained data were analyzed using Statgraphics Centurion XVI software (STATPOINT Technologies, Inc, USA). Initially, the normal distribution of errors and the homogeneity of variances were checked by Shapiro-Wilk’s test and Levene’s test. Based on these preliminary analyses, the data for each variable was separately analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) and Tukey’s HSD post hoc test. All analyses were performed at a significance level of α = 0.05. The CLM images were qualitatively analyzed.
RESULTS
Figure 1 presents cytocompatibility values obtained from mitochondrial mensuration tests (XTT), neutral red (NR) and violet crystal (CVDE). It can be observed that all composites presented survival cell levels higher than 70%, which characterizes the materials as cytocompatible. Data are validated by polystyrene negative control and by latex positive control, which presented survival rates compatible with those expected.
Figure 1 - Cytocompatibility results obtained with XTT, neutral red and violet crystal assays (rate of cell survival - %).
Figure 2 shows barium borosilicate primary particles before (1) and after (2) etching with of 10% hydrofluoridric acid. It is possible to observe the increasing in roughness after acid etching (2).
Figure 2 – Scanning electron microscope images of barium borosilicate particles before and after acid conditioning, respectively, at 3000x magnification. (1) before and (2) after the acid conditioning.
As can be observed in Figure 3, the particles conditioned with acid showed an average roughness value of 1.380µm, a little over 50% in relation to the roughness value of the non-conditioned particle, which was 0.958 µm. The result of t-Student test showed that this difference in roughness was statistically significant (p=0,108).
Figure 3 –Graph comparing barium borosilicate particle roughness before and after acid conditioning (µm).
The Figure 4 shows representative CLM images of the analyzed composites. It can be noted that composites E3 an E4 presented a visible greater surface irregularity. On the contrary, the E1 and E5 composite presented a more homogeneous distribution of inorganic particles.
Figure 4 – Confocal laser images of composites analyzed. (FP represents filler particles and V represents voids suggesting dislodgement of filler particles)
Table 2 displays the values for linear roughness (Ra) and 3-D Sa parameter (Sa). It can be noted that the composites E1, E3 and E4 presented statistically lower roughness (p < 0.05) than the other materials. (p < 0.05)
Table 2 – Mean values for linear roughness (Ra) and superficial roughness (Sa) (µm).
Parameter E1 E2 E3 E4 E5
Ra 0.110b(0.017) 0.221a(0.032) 0.099b(0.015) 0.104b(0.023) 0.234a(0.021) Sa 0.231b(0.032) 0.328b(0.043) 0.137a(0.019) 0.144a(0.027) 0.314b(0.037)
Table 3 presents results for FS, YM, KHN, DC% and PS. Flexural strength values presented significant statistical difference (p < 0.05). It can be observed that the composite E3 presented the lowest FS. As regards Young’s modulus, it was also observed statistically significant difference (p= 0,0002). The value for composite E3 was also lower than those of other composites. The commercial composite presented the highest value, followed by the composite E2. Composites E1 and E4 presented values statistically similar to each other.
The values for Knoop microhardness also presented statistical difference (p < 0.05). It can be observed that the KHN of composite E3 was lower than those of the other materials. Composite E5 presented the highest KHN, followed by composites E2 and E1, which were not submitted to 10% hydrofluoridric acid.
The p value for DC% was 0.0095. The composite E2 presented the lower DC%, followed by E1, E3, E4 and E5 without statistical difference among them. With regards polymerization stress, ANOVA detected statistical significance (p < 0.05). The result of Tukey’s test showed that non-silanized composites (E1 and E3) displayed the lowest tension values. All silanized composites showed higher values of polymerization stress.
Regarding PS, values also presented statistical difference (p < 0.05). It can be noted that E1 and E3 composites showed the lowest values followed by composites E2 and E4. The commercial composite available E5 showed the highest value for this variable.
Table 3 – Mean values for mechanical properties. Parameter E1 E2 E3 E4 E5 DC (%) 72.61 ab (7.34) 70.36a (10.87) 77,.31b (11.73) 75.2b (6.75) 74.48b (6,60) Flexural Strengh – FS (MPa) 84.32b (5.43) 97.76c (9.45) 64.56a (7.43) 112.87cd (9,21) 102.32cd (11.21)
Young’s Modulus -YM (GPa) 12.40b (2.34) 28.40c (3.45) 5.6a (0.99) 12.98b (2.19) 32.98c (5.56) Microhardness (KHN) 72.01 c (10.57) 87.77d (11.23) 19.58a (2.90) 51.58b (6.78) 97.73d (9,65) Polymerization stress – PS (MPa) 2.98c (0.07) 4.02b (0.05) 3.01c (0.25) 4.12b (0.12) 4.45a (0.21)
The Figure 5 presents the results for solubility. The highest solubility was presented by E4, followed by E2 (p < 0.05). The other composites (E1, E3 and E5) presented the lowest values of solubility, without difference to each other.
Figure 5 - Solubility results for a 15-day period (μg /mm3
Figure 6 shows sorption values for 15 days of immersion in distilled water. It can be observed that the composites displayed similar behavior until 320 minutes of immersion. After this period, the graph shows a tendency of greater sorption for composites E3 and E4, both of which contain particles treated with 10% hydrofluoridric acid. After 15 days, composite E5 showed the lowest absorption value, followed by composite E1 and E2.
Figure 6 - Sorption results for a 15-day period (μg/mm3
DISCUSSION
Resin composites are the most widespread worldwide dental restorative material. However, they still have some deficiency when applied in the oral environment. For this reason, the research and development of new materials and adhesion mechanisms that can increasingly improve the properties of this class of materials are of great relevance. In this field, there are many published studies that have been proposed innovations such as synthesis of new monomers, and application of different techniques of filler particle treatments [4,11,27]. However, to the best of our knowledge, none of these studies have firstly analyzed the cytotoxicity response of these modifications. This is a health concern. Based on this, the first investigation in the present study involved the analysis of the experimental composites cytotoxicity. The rationale to this was that if the materials presented negative cell response, it did not make sense to evaluate the other properties.
The cytotoxicity assay was validated by the control groups. In other words, the positive control (latex), which caused significant cell death, and the negative control (polystyrene), which behaved like the control group without biomaterial extract. In the present study, all the composites presented cell viability over 70% comparing to the negative control. Considering the limits of ISO 10993-5 [14], this result leads to conclude that the protocols for silanization and acid conditioning of inorganic particles added to experimental groups do not seem to have caused cytotoxicity effect. Based on this, it is reasonable to infer that the composites analyzed here could be applied in the human organism.
According to Franz et al., 2009 [15], biocompatibility of resin composites directly depends on the formulation of these materials, especially with respect to the monomer composition. On the other hand, filler particles are considered to be almost inert in relation to biological response. Because monomers released from the polymer chain exert toxicity, altering permeability in the lipid layer of fibroblasts [16,17], the monomer degree of conversion and the amount of leached monomers seem to be crucial to determine cytotoxicity of these materials.
In the present study, monomer degree conversion values were closely similar (Table 3). This can be explained by the fact that monomer composition of
