Simplexa
™ Bordetella Universal Direct
REF MOL2775
Rev. A
Ensaio de reação em cadeia de polimerase
(PCR) para detecção de DNA de Bordetella
pertussis
e/ou Bordetella parapertussis
Uso diagnóstico in vitro
APLICAÇÃO
O ensaio SimplexaTM Bordetella Universal Direct da Focus Diagnostics destina-se a utilização no ciclador integrado 3M para detecção qualitativa e diferenciação entre Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis em swabs nasofaríngeos de pacientes humanos com sinais e sintomas de infecção bacteriana do trato respiratório. O teste é um método complementar para diagnóstico diferencial de infecções por Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis
O ensaio com Simplexa Bordetella Universal Direct deve ser realizado apenas em pacientes que atendam a critérios clínico-epidemiológicos para teste de amostras suspeitas. A Bordetella pertussis e a Bordetella parapertussis devem ser pesquisadas como parte de um processo de avaliação clinico-epidemiológica.
Um resultado negativo não descarta infecção por Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussis e não deve ser usado isoladamente para tomar decisões de tratamento ou de condutas médicas.
O ensaio não foi criado para uso como teste de triagem para detectar analitos em sangue ou hemoderivados. O ensaio destina-se exclusivamente a uso profissional.
RESUMO E EXPLICAÇÃO
A coqueluche, também chamada pertussis ou tosse comprida, é uma doença altamente contagiosa do trato respíratório causada por Bordetella pertussis e por Bordetella parapertussis, duas pequenas bactérias Gram-negativas. O quadro clínico consiste em tosse prolongada. Na apresentação clássica, o paciente apresenta episódios prolongados de tosse violenta, que podem ser seguidos de “guincho” e vômito. Em casos graves, que são mais comuns em crianças pequenas, esses sintomas podem causar hipóxia, lesão cerebral permanente ou morte. Em crianças mais velhas e adultos, sobretudo, se foram vacinadas ou expostas previamente à doença, o quadro pode ser mais brando e consistir apenas de tosse prolongada.
Na primeira metade do século XX, a coqueluche era altamente prevalente, e provavelmente afetava 1% da população por ano,1 e a maioria dos casos ocorria em crianças pequenas. Na década de 40, a introdução de vacinas contra coqueluche com células inteiras diminuiu dramaticamente a incidência da doença, mas ela continuou presente, embora com incidência baixa. Desde o final da década de 90, houve aumento acentuado do número de casos notificados de coqueluche em países desenvolvidos com altas taxas de vacinação. Em 2004, foram notificados 25.827 casos nos Estados Unidos, o maior número de casos notificados desde 19592. Houve aumentos semelhantes no Canadá e na Europa3. A Organização Mundial de Saúde estima que haja 50 milhões de casos de coqueluche por ano no mundo, com 350.000 mortes4. A coqueluche atinge todas as faixas etárias, incluindo recém-nascidos, crianças, adolescentes e adultos. A grande maioria dos casos é causada pela Bordetella pertussis, mas uma pequena porcentagem (3-35%) tem como agente etiológico a Bordetella parapertussis, que causa uma forma mais branda da doença5, 6.
Embora não se saiba exatamente por que a coqueluche causada Bordetella pertussis vem ressurgindo, acredita-se que a imunidade conferida pela vacina comece a diminuir após 7 a 10 anos da aplicação. Portanto, as crianças vacinadas podem se tornar novamente suscetíveis à doença na adolescência e transmitir a bactéria a crianças mais jovens no domicílio1, 4.
A coqueluche pode ser diagnosticada por vários métodos laboratoriais, como cultura, sorologia e PCR. O método de referência é a cultura, que apresenta especificidade de quase 100% mas é pouco sensível. A sensibilidade da cultura pode chegar a 56% no início da doença, mas diminui com o tempo e é menor em pacientes que receberam antimicrobianos ou que foram vacinados. O isolamento de B. pertussis em cultura requer meios especiais e pode levar de 7 a 14 dias para ser obtido; portanto, nem sempre é possível obter resultados em tempo hábil para tratar casos agudos da doença. A sorologia pareada com soros das fases aguda e convalescente não pode ser usada no diagnóstico inicial porque necessita de um intervalo de pelo menos quatro semanas entre as colheitas de amostras. Exames de sorologia com amostra única para IgG contra toxina anticoqueluche foram desenvolvidos para fins de pesquisa, mas precisam ser realizados pelo menos duas semanas após o início dos sintomas.
Acham-se também disponíveis comercialmente testes sorológicos para pertussis, os quais não foram ainda clinicamente validados e talvez não possam diferenciar casos de infecção anterior e vacinação10.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O teste consiste em um sistema de amplificação e detecção por reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real com um primer-sonda fluorescente bifuncional que detecta e diferencia o DNA da Bordetella pertussis e da Bordetella parapertussis em swabs nasofaríngeos. O ensaio foi validado por dois protocolos de ensaio diferentes. O protocolo de extração utiliza o DNA que foi obtido de amostras de pacientes, e o protocolo direto utiliza amostras não processadas. O DNA é amplificado por um primer com sonda fluorescente bifuncional acoplado a um primer reverso para cada analito e um controle interno de DNA. O ensaio produz dois resultados: a Bordetella pertussis (Bp) é identificada em amostras pelo segmento alvo IS481, e a Bordetella
parapertussis (Bpp) pelo IS1001. O processo de extração é monitorado por um controle interno de DNA (quando aplicável) e para detectar inibição de PCR.
MATERIAIS FORNECIDOS
O ensaio Focus Diagnostics’ Simplexa™ Bordetella Universal Direct contém material suficiente para 1.000 reações (incluindo os controles). Ao recebê-lo, armazene todos os reagentes a temperaturas entre -10 e -30 ºC (não utilize congeladores do tipo frost-free). Os reagentes armazenados entre -10 e -30 °C permanecem estáveis até o fim do mês de validade indicado na embalagem do kit. Após serem usados pela primeira vez, os reagentes podem ser armazenados descongelados a temperaturas entre 2 e 8 °C por até 30 dias.
Descrição das instruções e componentes do kit
Kit Identificador
Focus Diagnostics
Teste universal direto Simplexa™ para Bordetella
(REF MOL2775)
INGLÊS REF SÍMBOLO CE
Simplexa™ Bordetella Primer Mix MOL2776 REAG A
Simplexa™ Master Mix MOL2007 REAG B
Simplexa™ Extraction and Amplification
Control DNA MOL9001 CONTROL IC
Simplexa™ Bordetella Positive Control MOL0221 CONTROL +
Componentes Nº. de tubos
por kit
Código de
cor Identificador
Simplexa™ Bordetella Primer Mix (Mistura de primers para Bordetella
Simplexa™) 10 Marrom REF MOL2776 Lote Validade
Simplexa™ Master Mix (Mistura de
reagentes Simplexa™) 10 Verde REF MOL2007 Lote Validade
Simplexa™ Extraction and Amplification Control DNA (SEAC)(DNA de controle da extração e amplificação Simplexa™)
2 Azul REF MOL9001 Lote Validade
Simplexa™ Bordetella Positive Control (PC)(Controle positivo para Bordetella Simplexa™ )
2 Vermelho REF MOL0221 Lote Validade
Descrição dos Componentes do Kit Componente do Kit
Reações por kit /frasco
Volume (µl) por
frasco Descrição do componente
Simplexa™ Bordetella Primer Mix( Mistura de primers para Bordetella Simplexa™ )
1000/100 100
Primer marcado com corante fluorescente específico para detecção de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e para controle interno de DNA.
Alvo Fluoróforo da sonda Excitação (nm) Emissão (nm) Gene- alvo Bp FAM 495 520 IS481 Bpp CFR610 590 610 IS1001
SEAC Q670 644 670 Não se aplica
Simplexa™ Master Mix( Mistura de reagentes Simplexa™)
1000/100 400 DNA polimerase, tampão e desoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) Simplexa™ Extraction and
Amplification Control (SEAC) (Controle para extração e amplificação Simplexa™)
Componente do Kit
Reações por kit /frasco
Volume (µl) por
frasco Descrição do componente
Simplexa™ Bordetella Positive Control (PC)( Controle positivo para Bordetella Simplexa™)
Variável 50 Amplicon de DNA para IS481 e IS1001
Simplexa™ Bordetella Universal Direct Barcode Card (Cartão com código de barras para controle do +teste direto universal Bordetella Simplexa™)
n/d n/d Parâmetros específicos do teste.
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Ciclador integrado com o programa Integrated Cycler Studio versão 3.0 ou superior 2. Universal Discs (Discos Universais) para uso com o ciclador integrado
3. Universal Disc Sealer (Selador de Discos Universais)
4. Micropipeta(s) individual(is) do tipo multicanal e/ou de repetição com exatidões entre 1-10 µl, 10-100 µl e 100-1.000 µl 5. Freezer (degelo manual) a temperaturas entre -10 e -30°C (para o armazenamento dos componentes congelados do kit) 6. Freezer (degelo manual) a temperaturas entre -10 e -30 °C (para o armazenamento das amostras congeladas)
7. Refrigerador a temperaturas entre 2 e 8 °C (para os componentes descongelados do kit) 8. Capela de biossegurança (fluxo laminar) para a extração e processamento de amostras 9. Microcentrífuga
10. Misturador de vórtex
11. Ponteiras para micropipetadores, estéreis, descartáveis, que não contenham RNase/DNase, com proteção contra aerossóis. 12. Estantes e tubos de polipropileno de 1,5 ml para microcentrífuga (tubos sem RNase/Dnase são recomendados mas não
obrigatórios)
13. Tubos cônicos de polipropileno de 15 ml e estantes
14. Água sem nuclease (sem RNase/DNase) para uso no controle No Template Control (NTC). 15. Luvas descartáveis sem talco
16. Estantes de resfriamento para tubos de microcentrífugas de 1,5 ml 17. Bloco frio em disco universal
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS – Para utilização no protocolo de extração.
1. Um TE (pH 8,0) livre de RNase/DNase para a preparação de controle molecular (apenas para o protocolo de extração) 2. Sistema Roche MagNA Pure LC e material de consumo associado.
3. MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (nº. cat. Roche 3038505001)
4. Simplexa Extraction and Amplification Control Set (Conjunto de extração e amplificação Simplexa) (REF MOL9000) Observação: Necessário quando realizar mais de 80 reações com o protocolo EXTRACTION
VALIDADE E MANUSEIO
1. Armazene os reagentes a temperaturas entre -10 e -30 ºC (não utilize congeladores do tipo frost-free). 2. Não utilize os kits nem os reagentes fora das datas de validade.
3. Antes do uso, deixe os reagentes descongelarem à temperatura ambiente (entre 18 e 25 °C, aproximadamente).
4. Se a configuração da PCR não for realizada imediatamente após o preparo da mistura de reagentes, mantenha essa mistura a temperaturas entre 2 e 8 °C até que seja possível configurar a PCR. Use a Mistura de reagentes dentro de uma hora.
5. Após descongelar, armazene a mistura de primers, a mistura de reagentes, o controle positivo e o SEAC entre 2
e 8°C por um prazo máximo de 30 dias.
6. Não congele novamente a mistura de primers, a mistura de reagentes, o SEAC ou o controle positivo. 7. Não misture os reagentes de lotes diferentes de kits.
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
1. Siga as precauções padrão. Todas as amostras de pacientes e controles positivos devem ser considerados potencialmente infecciosos e devem ser manipulados como tal.
2. Ao lidar com os reagentes do kit, use equipamentos de proteção pessoal, tais como (mas não limitados a) luvas e aventais de laboratório. Ao terminar os testes, lave rigorosamente as mãos.
3. Não pipete com a boca.
4. Não fume, não beba, não coma, não manipule lentes de contato nem se maquile em áreas em que são usados os reagentes do kit e/ou amostras de seres humanos.
5. Descarte todos os reagentes do kit e as amostras provenientes de seres humanos que não foram utilizados, de acordo com as normas locais, estaduais e federais.
chegando até à área de amplificação/detecção. A sequência de eventos entre a extração da amostra e a amplificação por PCR em tempo real é a seguinte:
Extração da amostra, configuração do equipamento de PCR em tempo real, preparo dos reagentes e amplificação por PCR em tempo real.
Não utilize suprimentos e equipamentos nas áreas dedicadas a extração e ao preparo de amostras. Não é recomendável nenhum movimento cruzado entre as diferentes áreas.
Os suprimentos e equipamentos utilizados para o preparo de amostras não devem ser usados para atividades de preparação de reagentes nem para o processamento de DNA amplificado ou de outras fontes de ácido nucleico alvo. Todo o suprimento e equipamento para amplificação deve ser mantido o tempo todo na área destinada ao equipamento
para PCR em tempo real.
Os equipamentos de proteção pessoal, tais como aventais de laboratório e luvas descartáveis, devem ser específicos de cada área.
7. A contaminação de amostras de pacientes ou de reagentes pode originar resultados errados. Empregue técnicas assépticas. 8. Pipete e manuseie cuidadosamente os reagentes para evitar que haja a mistura de amostras entre os orifícios adjacentes. 9. Empregue técnicas de pipetagem apropriadas e mantenha sempre o mesmo padrão de pipetagem ao longo de todo o
procedimento para garantir valores exatos e reprodutíveis.
10. Não substitua nem misture reagentes de diferentes lotes do kit e nem com os de outros fabricantes.
11. Não troque as tampas dos tubos de reagentes. Isso pode causar contaminação e comprometer os resultados do teste. 12. Utilize exclusivamente o protocolo descrito neste folheto. Digressões do protocolo ou o uso de intervalos de tempo ou de
temperaturas que não os especificados podem originar resultados errados.
13. Os ensaios devem ser realizados sobre um bloco frio discóide de formato universal (cerca de 2 a 8 ºC). Enquanto estiver misturando os reagentes, mantenha as enzimas resfriadas, através do uso de um bloco de resfriamento.
14. Não reutilize os Universal Discs que já foram expostos a reagentes ou a amostras de pacientes. 15. Descarte o disco usado sem destacar nem remover a faixa de cobertura.
16. Se forem usados kits ou lotes Simplexa™ no mesmo disco, será preciso testar o controle positivo de cada kit e o No Template Control (água sem nuclease).
17. A mistura de reagentes contém 1-10% de glicerol, que pode causar irritação quando inalada ou em contato com a pele. Se ocorrer inalação ou contato com a pele, deve-se tomar medidas de primeiros socorros.
18. A armazenagem prolongada de amostras extraídas entre 2 ºC e 8 °C não é recomendada, pois não se sabe quais são os efeitos desse procedimento no desempenho do teste.
INSTRUÇÕES DE USO
PROTOCOLO DO ENSAIO PARA TESTE DIRETO DE AMOSTRAS (PROTOCOLO DIRETO) A. COLETA DE AMOSTRAS
Incluem-se entre os tipos de amostras aceitáveis os swabs nasofaríngeos em meio líquido de transporte viral (por exemplo UTM, VCM, M4). Use apenas swabs com ponta sintética (p.ex., Dacron, nylon ou rayon) e cabo de alumínio ou plástico. Não use swabs de alginato de cálcio, pois eles podem conter substâncias que inibam os exames de PCR. O meio de transporte líquido de Aimes não é compatível com o protocolo direto.
CONFIGURAÇÃO DO EQUIPAMENTO DE PCR EM TEMPO REAL
1. O manual do operador do ciclador integrado contém instruções sobre como configurar o programa Integrated Cycler Studio e incluir definições de ensaios, programar sequências no equipamento e analisar os resultados.
ÁREA DE PREPARO DOS REAGENTES
Área dedicada para o preparo da mistura de reação do Bordetella Universal Direct SimplexaTM .
1. Descongele a mistura de primers e a mistura de reagentes em temperatura ambiente (entre 18 e 25 °C, aproximadamente). Cada frasco de componente do kit contém quantidade suficiente de reagentes para 100 reações. Antes de cada utilização, misture suavemente os componentes da mistura de primer e da mistura de reagentes invertendo 6 a 8 vezes. Em seguida, centrifugue brevemente para decantar o conteúdo para o fundo do tubo.
2. Pipete o volume de cada componente, conforme indicado na tabela a seguir, para preparar o volume necessário da mistura de reagentes em um tubo de microcentrifugação de polipropileno e de tamanho adequado.
Volumes de reação para o protocolo direto
Reagente
Volumes de mistura de reagentes para uma reação
Volumes de mistura de reagentes para 10 reações
Simplexa™ Master Mix
(Mistura de reagentes Simplexa™) 4 40
Simplexa™ Bordetella Primer Mix (Mistura de
primers para Bordetella Simplexa™) 1 10
Nuclease Free Water (Água sem nuclease) 1,8 18
SEAC 0,2 2
3. Misture suavemente a mistura de reagentes por inversões ou por 8 a 10 pipetagens. 4. Centrifugue brevemente para decantar o conteúdo para o fundo do tubo.
5. Configure a PCR.
6. Após o preparo da mistura de reagentes, use-a em até uma hora. Se a configuração da PCR não for realizada imediatamente após o preparo da mistura de reagentes, mantenha essa mistura em temperaturas entre 2 e 8 °C até que seja possível configurar a PCR (em até uma hora)
ÁREA DE AMPLIFICAÇÃO DA PCR EM TEMPO REAL
Execute em área dedicada ao preparo do disco universal com 96 orifícios para o ensaio direto universal para Bordetella Simplexa™ . Use o bloco frio com o disco universal para aplicar amostras e a mistura de reagentes.
1. Degele o controle positivo em temperatura ambiente (intervalo aproximado de 18 a 25 °C). 2. Adicione em cada orifício 7,0 µl da mistura reativa.
3. Adicione 3,0 µl do controle positivo ao orifício “PC” do disco.
4. Adicione 3,0 µl da amostra do paciente ao orifício “S” apropriado do disco. 5. Adicione 3,0 µl do No Template Control (água sem nuclease) ao disco “NTC”.
6. Cubra o disco com a Universal Disc Cover Tape (Faixa de Cobertura do Disco Universal). 7. Coloque o disco universal selado no ciclador integrado e inicie a sequência.
PROTOCOLO DO ENSAIO PARA TESTE DE AMOSTRAS EXTRAÍDAS (PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO) A. COLETA DE AMOSTRAS
São consideradas amostras aceitáveis swabs nasofaríngeos em meio de transporte de Ames ou outro meio líquido para transporte viral (p.ex. UTM, VCM, M4). Use apenas swabs com ponta sintética (p.ex., Dacron, nylon ou rayon) e cabo de alumínio ou plástico. Não use swabs de alginato de cálcio, pois eles podem conter substâncias que inibam os exames de PCR.
B. ÁREA DE EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS
O DNA deve ser extraído das amostras em uma área separada. As amostras devem ser preparadas para extração em uma capela de biossegurança.
PREPARAÇÃO DE CONTROLE POSITIVO
Prepare o controle positivo adicionando 5 µl de controle positivo a 195 µl 1X TE (pH 8,0). Extração pelo método Roche MagNA Pure LC
1. Os ácidos nucleicos são extraídos de amostras de pacientes e de controles do ensaio com o Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation Kit e o Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Para obter informações sobre como utilizar o kit, consulte as instruções fornecidas pelo fabricante.
2. Na caixa de listagem “Protocol”(Protocolo), do MagNA Pure LC System, selecione “Total NA”( Ácido nucléico total) e depois “Total NA Variable_elution_volume.blk” na lista. As configurações apropriadas para a sequência serão carregadas.
3. O protocolo de amostra deve ser “Total NA Variable_elution_volume”.
4. O volume da amostra (Sample Volume) deve ser de 200 µl e o volume de eluição deve ser de 50 µl. 5. O volume de diluição deve ser zero para todas as amostras.
6. Verifique se o Post Elution Protocol está em “None”(Nenhum).
7. Verifique se as amostras e os controles estão posicionados corretamente no cartucho de amostra
8. Agite as amostras em vórtex por 2 a 4 segundos e centrifugue-as rapidamente para depositar o conteúdo na parte inferior do tubo.
9. Para cada conjunto de 16 amostras (amostras 1 a 16), pipete 100 µl de DNA SEAC em 6 ml de tampão de lise MagNA Pure em um tubo cônico. Agite brevemente em vórtex para misturar. Coloque-o na bandeja apropriada do equipamento de extração MagNA Pure.
Por exemplo, se houver 32 amostras extraídas, pipete 200 µl de DNA SEAC em 12 ml de tampão de lise MagNA Pure em um tubo cônico. Agite brevemente em vórtex para misturar. Coloque-o na bandeja apropriada do equipamento de extração MagNA Pure.
10. Pipete 200 µl de cada amostra do No Template Control (água sem nuclease) e do Positive Control(controle positivo) na posição correspondente do cartucho de amostra.
11. Inspecione visualmente os níveis das amostras e dos controles no cartucho de amostra para verificar se a(s) amostra(s) foram adicionadas.
12. Coloque o cartucho de amostra com as amostras no extrator MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid e inicie a sequência de extração.
13. Ao final da extração de ácidos nucleicos, o cartucho com as amostras extraídas pode ser retirado do MagNA Pure e ser selado. Armazene o DNA extraído entre 2 ºC e 8 ºC antes de usá-lo. Recomenda-se não armazenar os padrões
extraídos à esta temperatura por períodos prolongados. Mantenha as amostras de DNA extraído em um bloco de refrigeração enquanto carregar o disco.
C. CONFIGURAÇÃO DO EQUIPAMENTO DE PCR EM TEMPO REAL
1. O manual do operador do ciclador integrado contém instruções sobre como configurar o programa Integrated Cycler Studio e incluir definições de ensaios, programar sequências no equipamento e analisar os resultados.
D. ÁREA DE PREPARO DOS REAGENTES
Área dedicada à preparação da mistura de reagentes do ensaio SimplexaTM Bordetella.
1. Descongele a mistura de primers e a mistura de reagentes em temperatura ambiente (entre 18 e 25 °C, aproximadamente). Cada frasco de componente do kit contém quantidade suficiente de reagentes para 100 reações. Antes de cada uso, misture suavemente, por meio de 6 a 8 inversões, os componentes da mistura de primers e da mistura de reagentes e centrifugue rapidamente para precipitar os conteúdos no fundo do tubo.
2. Pipete o volume de cada componente, conforme indicado na tabela a seguir, para preparar o volume necessário da mistura de reagentes em um tubo de microcentrifugação de polipropileno e de tamanho adequado.
Volumes de reação para o protocolo de extração Reagente
Volumes de mistura de reagentes para uma reação
Volumes de mistura de reagentes para 10 reações
Simplexa™ Master Mix
(Mistura de reagentes Simplexa™) 4,0 µl 40 µl
Simplexa™ Bordetella Primer Mix (Mistura de primers para Bordetella
Simplexa™)
1,0 µl 10 µl
Volume Total 5,0 µl 50 µl
3. Misture suavemente a mistura de reagentes por inversões ou por 8 a 10 pipetagens. 4. Centrifugue brevemente para decantar o conteúdo para o fundo do tubo.
5. Configure a PCR.
6. Após o preparo da mistura de reagentes, use-a em até uma hora. Se a configuração da PCR não for realizada imediatamente após o preparo da mistura de reagentes, mantenha essa mistura em temperaturas entre 2 e 8 °C até que seja possível configurar a PCR (em até uma hora)
E. ÁREA DE AMPLIFICAÇÃO DA PCR EM TEMPO REAL
Execute em área dedicada ao preparo do disco universal com 96 orifícios para o ensaio direto universal para Bordetella Simplexa™ Use o bloco frio com o disco universal para aplicar amostras e a mistura de reagentes.
Protocolo de extração
1. Adicione em cada orifício 5,0 µl da mistura reativa.
2. Adicione 5,0 µl do extrato do controle positivo ao orifício “PC” do disco.
3. Adicione 5,0 µl do extrato da amostra do paciente ao orifício “S” apropriado do disco.
4. Adicione 5.0 µl de No Template Control extraído (água sem nuclease) à cavidade do disco “NTC”. 5. Cubra o disco com a Universal Disc Cover Tape (Faixa de Cobertura do Disco Universal). 6. Coloque o disco universal selado no ciclador integrado e inicie a sequência.
COMO RELATAR OS RESULTADOS
O processo para relatar os resultados envolve três etapas.
1. Exame dos controles para determinar se a execução é válida. O programa Integrated Cycler Studio suprimirá a interpretação dos resultados do paciente se qualquer das amostras programadas, como no caso do controle, estiver inválida.
2. Exame da validade dos resultados da amostra do paciente.
3. Interpretação dos resultados do paciente. Se os controles não estiverem válidos, não será possível interpretar os resultados do paciente.
1. Determine se a sequência é válida, examinando o controle sem DNA, o controle positivo para Bordetella e o controle interno de DNA.
Critérios (simplificados) para um Controle Válido*
Controle Ct para Bp Ct para Bpp Ct para CI de DNA
No Template
Control (NTC) 0 0 ≤40, mas ≠0
Controle Positivo ≤40, mas ≠0 ≤40, mas ≠0 Não se aplica
a. Se o No Template Control for:
i. Positivo (Ct ≤40 mas ≠0para Bp ou Bpp), isto significa que as amostras podem ter sido contaminadas durante a preparação. O controle é inválido e todas as amostras dos pacientes devem ser testadas novamente.
ii. Bp e Bpp negativos (Ct = 0) significam que o controle é válido e aceitável.
iii. Se o DNA IC não for encontrado no controle sem DNA, o ensaio é inválido e todas as amostras dos pacientes devem ser testadas novamente.
iv. Se o DNA IC for encontrado no controle sem DNA, o ensaio será considerado válido e aceitável. b. Controle positivo
i. Se o Positive Control (Controle positivo) for Ct = 0 para Bp ou Bpp, o lote do ensaio será considerado inválido e rejeitado. Todas as amostras dos pacientes devem ser testadas novamente.
ii. Se os valores de Ct para Bp eBpp forem ≤40, mas ≠0 o ensaio é considerado válido e aceitável. 2. Exame dos resultados da amostra do paciente.
O exame dos resultados da amostra clínica deve ser realizado depois que os controles positivos e no template forem examinados para determinar se são válidos e aceitáveis. Os resultados para DNA de Bp, Bpp e devem ser examinados para cada amostra do paciente.
a. Os gráficos de amplificação devem ser examinados para todos os resultados em que houver alertas sobre a qualidade dos dados. Uma curva de amplificação válida exibe um crescimento exponencial progressivo. Curvas de amplificação lineares, não-exponenciais ou com picos de dados que ultrapassam o limiar podem não ser válidas. Se a curva permanecer válida após exame, o valor relatado de Ct pode ser usado para determinar se as metas de Bp ou Bpp forem detectadas, conforme mostrado abaixo na Seção 3. Ver abaixo exemplos de curvas válidas e não-válidas.
Curva de Amplificação Válida Curva de Amplificação Válida Curva de Amplificação Inválida b. Se a curva de amplificação para Bp ou Bpp for válida, não será necessário usar o DNA IC para detectar um
resultado positivo. 3. Interpretação dos Resultados
Interpretação dos Resultados
Exemplo Bp IC de DNA Bpp IC de DNA Valor de Ct para IC de DNA Interpretação 1 0 0 ≤40, ≠0 Bp e Bpp não detectados
2 ≤40, ≠0 0 Não se aplica Bp detectado
3 0 ≤40, ≠0 Não se aplica Bpp detectado
4 ≤40, ≠0 ≤40, ≠0 Não se aplica Bp e Bpp detectados
Ct = limiar do ciclo. Detectado ocorre quando um Ct ≤40 e ≠0. Não detectado ocorre quando Ct = 0. A detecção do Simplexa™ DNA Internal Control (Controle interno de DNA do Simplexa™) não é necessária para que o resultado seja positivo.
LIMITAÇÕES
1. Para uso diagnóstico in vitro. 2. Apenas para exportação.
3. Os analistas devem ser treinados e ficarem familiarizados com os procedimentos do teste e a interpretação dos resultados antes de executarem o teste.
4. Todos os resultados deste e de outros testes devem ser usados em conjunto com o histórico clínico, dados epidemiológicos e outros dados disponíveis para a avaliação do paciente pelo clínico.
5. A prevalência da infecção afeta o valor preditivo do teste.
6. Como ocorre com outros testes, os resultados negativos não excluem a presença de infecções por Bp ou Bpp.
7. Os resultados falso-negativos podem ocorrer quando o organismo infectante apresenta mutações, inserções, deleções, rearranjos genômicos ou quando o teste for realizado em fases muito precoces da doença.
8. Os resultados falso-negativos podem ocorrer se o número de microorganismos presentes na amostra for inadequado em virtude de coleta, transporte ou manuseio inadequados.
9. Como acontece com outros testes, podem ocorrer resultados falso-positivos. Em algumas circunstâncias, poderá ser indicada a repetição do teste ou a execução do teste com outro dispositivo.
10. Este é um teste qualitativo e não fornece um valor quantitativo da presença do organismo detectado.
11. O desempenho deste ensaio não foi estabelecido para pacientes sem sintomas de infecção por Bordetella pertussis ou
Bordetella parapertussis.
12. O desempenho deste ensaio não foi estabelecido para monitorar o tratamento de infecções por Bordetella pertussis ou
Bordetella parapertussis.
13. O desempenho deste ensaio não foi estabelecido para a triagem de sangue ou hemoderivados quanto à presença de
Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussis.
14. Este teste não exclui a presença de doenças causadas por outros patógenos bacterianos ou virais. 15. Pode ocorrer a infecção dupla por Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis6,7,8.
16. É possível que o teste não possa distinguir as infecções por Bordetella pertussis das causadas por Bordetella holmesii. Esses dois organismos contêm o gene IS481. Foi relatado que a incidência de Bordetella holmesii em amostras clínicas é muito baixa (<0,5%), mas ainda não se sabe se a Bordetella holmesii pode causar infecção respiratória em indivíduos saudáveis9.
17. É possível que o exame não possa distinguir entre a infecção por Bordetella pertussis e a causada por Bordetella
bronchiseptica. A B. pertussis e algumas cepas de B. bronchiseptica contêm o gene IS481. Embora raras, foram descritas infecções por B. bronchiseptica em bebês e em indivíduos imunocomprometidos11.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
SENSIBILIDADE ANALÍTICA E LIMITE DE DETECÇÃO
O limite de detecção é a concentração que proporciona uma taxa de detecção ≥ 95%.
O limite de detecção (LD) do ensaio Simplexa™ foi avaliado em Bordetella pertussis A639, Bordetella pertussis ATCC 8467, Bordetella parapertussis A747 e Bordetella parapertussis E595. O LD para Bordetella pertussis A639 foi confirmado em 2,5 ufc/ml no protocolo de extração (20/20 detectados) e 250 ufc/ml no protocolo direto (20/20 detectados). O LD para Bordetella parapertussis A747 foi confirmado em 10 ufc/ml no protocolo de extração (19/20 detectados) e 1000 ufc/ml no protocolo direto (19/20 detectados). A Bordetella pertussis ATCC 8467 e E595 foram detectadas por ambos os protocolos.
REPRODUTIBILIDADE
Dois ensaios diferentes de reprodutibilidade foram realizados. Os estudos de reprodutibilidade do protocolo de extração foram realizados por dois operadores, cada um dos quais usou um instrumento diferente. Cada operador realizou uma única extração em cada painel de reprodutibilidade e duas sequências de PCR por dia durante 5 dias, totalizando 20 sequências. Em cada sequência, foram testadas três réplicas de cada amostra e de controle positivo.
Reprodutibilidade do protocolo de extração – Bp
Intra e interensaio Interequipamento
ID da amostra n Ct média DP intraensaio %CV Intraensaio DP
interensaio %CV interensaio Ct média DP Intraensaio
BP-Med 60 29,5 1,01 3,4 0,70 2,4 29,5 0,00 0,0
BP-Low 60 32,7 0,92 2,8 0,72 2,2 32,7 0,00 0,0
BPP-Med 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0
BPP-Low 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0
Reprodutibilidade do protocolo de extração (Bpp)
Intra e interensaio Interequipamento
ID da amostra n Ct média DP intraensaio %CV Intraensaio DP
interensaio %CV interensaio Ct média DP Intraensaio
BPP-Med 60 31,1 0,43 1,4 0,28 0,9 31,1 0,41 1,3
BPP-Low 60 34,7 0,77 2,2 0,00 0,0 34,7 0,71 2,0
BP-Med 60 39,9 0,45 1,1 0,00 0,0 39,9 0,00 0,0
BP-Low 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0
Negative 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0
O estudo de reprodutibilidade do protocolo direto foi realizado por dois operadores; cada operador realizou 15 sequências (uma sequência em cada um dos três instrumentos por dia, durante 5 dias, totalizando 30 sequências (n=30). Em cada sequência, foram testadas três réplicas de cada amostra e de controle positivo.
Reprodutibilidade do protocolo direto (Bp)
Interequipamento Interoperador Intersequência/dia Intrasequência Total
Categoria N Ct média DP % CV DP % CV DP % CV DP %CV DP % CV Positive Control (PC) 90 30,0 0,58 1,9 0,05 0,2 1,40 4,7 0,37 1,2 1,55 5,2 BP Medium Positive 89* 32,3 0,98 3,0 0,00 0,0 0,46 1,4 0,72 2,2 1,30 4,0 BP Low Positive 90 33,2 1,16 3,5 0,00 0,0 0,24 0,7 1,11 3,3 1,63 4,9
Reprodutibilidade do protocolo direto (Bpp)
Interequipamento Interoperador Intersequência/dia Intrasequência Total
Categoria N Ct média DP % CV DP % CV DP % CV DP % CV DP % CV Positive Control (PC) 90 27,7 0,67 2,4 0,05 0,2 1,45 5,2 0,38 1,4 1,65 5,9 BPP Medium Positive 89* 31,5 0,95 3,0 0,20 0,6 0,39 1,2 0,57 1,8 1,19 3,8 BPP Low Positive 90 34,6 1,15 3,3 0,14 0,4 0,25 0,7 0,96 2,8 1,52 4,4
* Uma repetição da amostra foi classificada como inválida.
REATIVIDADE ANALÍTICA/ REATIVIDADE CRUZADA
Dezessete (17) microorganismos foram testados quanto a potencial reatividade cruzada com Bordetella pertussis e
parapertussis. Os resultados dos exames são descritos nas tabelas a seguir:
Reatividade analítica / Reatividade cruzada (Bp)
Resultados do protocolo de extração Resultados do protocolo direto Potencial agente de reação cruzada Sequência inicial, sequência de
conformação Nº de detecções/total
Sequência inicial, sequência de conformação Nº de detecções/total Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3 Corynebacterium diptheria 2/3; 0/5 0/3 Haemophilus influenzae 1/3; 0/5 0/3
Resultados do protocolo de extração Resultados do protocolo direto Potencial agente de reação cruzada Sequência inicial, sequência de
conformação Nº de detecções/total
Sequência inicial, sequência de conformação
Nº de detecções/total
Haemophilus parainfluenzae 0/3 2/3; 1/5*
Influenza A/Ilhas Salomão/03/06 H1 0/3 1/3; 0/5
Influenza B/Flórida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitidis 0/3 0/3 VSR B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 1/3; 0/5 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 1/3; 3/5** 0/3 Streptococcus pyogenes 0/3 0/3
*Análise da sequência não demonstrou homologia significativa entre a estrutura do ensaio para Bp e o genoma do H.
parainfluenzae.
** Não foram repetidos os resultados positivos obtidos com o S. pneumoniae em testes subsequentes.
Reatividade analítica / Reatividade cruzada (Bpp)
Resultados do protocolo de extração Resultados do protocolo direto Possível agente de reação cruzada Sequência inicial, sequência de
conformação Nº. de detecções/total
Sequência inicial, sequência de conformação Nº. de detecções/total Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3 Corynebacterium diptheria 0/3 0/3 Haemophilus influenzae 0/3 0/3 Haemophilus parainfluenzae 0/3 0/3
Influenza A/Ilhas Salomão/03/06 H1 0/3 0/3
Influenza B/Flórida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitidis 0/3 0/3 VSR B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 0/3 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 0/3 0/3
Resultados do protocolo de extração Resultados do protocolo direto Possível agente de reação cruzada Sequência inicial, sequência de
conformação Nº. de detecções/total
Sequência inicial, sequência de conformação
Nº. de detecções/total
Streptococcus pyogenes 0/3 0/3
INTERFERÊNCIAS
Quinze (15) substâncias endógenas e exógenas foram repicadas em amostras fracamente positivas para Bordetella pertussis e
parapertussis e foram realizados testes para possível interferência na detecção de Bp/Bpp. No protocolo de extração, a cepa A639 de Bordetella pertussis foi testada em uma concentração de 25 ufc/ml e a cepa Bordetella parapertusiss A747 foi testada em uma concentração de 50 ufc/ml. No protocolo direto, a cepa A639 de Bordetella pertussis foi testada em uma concentração de 1250 ufc/ml e a cepa A747 de Bordetella parapertusiss foi testada à concentração de 12500 ufc/ml. A tabela abaixo resume os resultados dos testes de interferência.
Interferência Potencial interferente Concentração do potencial interferente Resultados do protocolo de extração Resultados do protocolo direto Nº de detecções/total Nº de detecções/total Bp Bpp Bp Bpp Ampicilina 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Azitromicina 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3
Beclometasona 10% (v/v) 3/3 3/3 Não se aplica Não se aplica
Beclometasona 25 mg/ml Não se aplica Não se aplica 3/3 3/3
Sangue 2% (v/v) 3/3 3/3 3/3 3/3
Ciprofloxacin 25 mg/ml 3/3 3/3 Não se aplica Não se aplica
Ciprofloxacin 250 µg/ml Não se aplica Não se aplica 3/3 3/3
Eritromicina 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Fluticasona 10% (v/v) 3/3 3/3 3/3 3/3 Quaifenesin/ dextromethorphan 10% (v/v) 3/3 3/3 3/3 3/3 Mucina 60 µg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Mupirocin 25 mg/ml 3/3 6/81 3/3 3/3 Oximetazolina 10% (v/v) 3/3 3/3 3/3 3/3
Fenol Chloraseptic (spray analgésico) 10% (v/v) 3/3 3/3 3/3 3/3
Fenilefrina 10% (v/v) 3/3 3/3 3/3 3/3
Rifampicina 25 mg/ml 3/3 7/82 Não se aplica Não se aplica
Rifampicina 250 µg/ml Não se aplica Não se aplica 3/3 3/3
Cloreto de sódio 10% (v/v) 3/3 7/82 3/3 3/3
1 Bpp não foi detectada em uma das três repetições iniciais e em uma de cinco repetições adicionais (usadas para confirmar possível interferência)..
2 Uma das três repetições iniciais não detectou Bpp; entretanto, Bpp foi detectada em cinco repetições adicionais (usadas para confirmar possível interferência)..
CONCORDÂNCIA CLÍNICA
Foram testadas no total de 222 amostras, incluindo amostras negativas e positivas para Bordetella pertussis (repicada e endógena), amostras positivas para Bordetella parapertussis (repicada e endógena), por meio do Focus Diagnostics Bordetella kit (kit para Bordetella da Focus Diagnostics) (MOL0200) e o Simplexa Bordetella Universal Direct kit ( kit direto universal para Bordetella Simplexa) usando o protocolo de extração (MOL2700 / MOL2775).Os resultados da comparação entre métodos são mostrados na tabela abaixo.
Concordância clínica Resultados para Bp Predicate (MOL0200) Simplexa Bordetella (MOL2700) n Detectado Não detectado Indeterminado % Concordância(Observado/Esperado) IC95% Detectado 66 65 1 0 IC 95%: 91,9-99,7% 98,5%(65/66) Não detectado 156 5 151 0 96,8%(151/156) IC 95%: 92,7-98,6% Resultados para Bpp Predicate (MOL0200) Simplexa Bordetella (MOL2700) n Detectado Não Detectado Indeterminado % Concordância (Observado/Esperado)
IC 95%
Detectado 71 71 0 0 IC 95%:94,9-100% 100%(71/71) Não Detectado 151 3 148 0 IC98%(148/151)95%:94,3-99,3%Comparação dos métodos utilizados nos protocolos direto e de extração
Para demonstrar a relação entre os resultados obtidos com os protocolos direto e de extração, foi realizada uma análise comparativa dos resultados de Ct obtidos a partir de uma combinação de repiques e amostras endógenas positivas. Os valores de Ct das amostras que foram positivas com o protocolo de extração foram comparadas com os valores de Ct obtidos com as mesmas amostras, usando-se o protocolo direto. A inclinação da reta de regressão para Bordetella pertussis foi de 0.98 e a intercepção foi de 2,89. A inclinação da reta de regressão para Bordetella parapertussis foi de 1,04 e a intercepção foi de 0,56. Nos dois casos, a inclinação da reta de regressão indicou boa correlação entre os dois protocolos.
Figura 2: Regressão de Passing-Bablok - Bordetella parapertussis
CONTAMINAÇÃO POR TRANSPORTE DURANTE A AMPLIFICAÇÃO
A contaminação por transporte durante a amplificação através do disco universal e da fita de cobertura do disco universal foi avaliada para outros ensaios Simplexa e ela não depende do ensaio.
REFERÊNCIAS
1. Mattoo & Cherry. Clin Microbiol Rev. 2005. 18:326-82.
2. Centers for Disease Control Data available at: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5414a1.htm
3. National Consensus Conference on Pertussis. Available at: http://www.phac-aspc.gc.ca/publicat/ccdr-rmtc/03vol29/29s3/29s3_le.html
4. Kerr et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000.19:77-88. 5. Linneman et al., Am J Dis Child. 1977. 131:560-563. 6. Mertsola, J. Eur J Clin Microbiol. 1985. 4:123-128. 7. Hoppe, J.E. Pediatr Infect Dis 1999. 18:375-381. 8. Iwatta et al. Dev Biol Stand. 1991. 73:333-341. 9. Loeffelholz, M.J et al. J. Clin Microbiol. 2000. 38:467.
10. Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity Mortality Weekly Report (MMWR) 2007 Aug 24; 56:837. 11. Register, J.B. and Sanden, G.N., Journal of Clinical Microbiology, Dec 2006, p. 4577-4583.
O uso de sondas Scorpions® em testes diagnósticos in vitro para seres humanos está coberto por uma autorização da DxS Ltd para a Focus Diagnostics.Os corantes
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