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BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843

bioelisa anti-HBc

3000-1102 1 x 96 TESTS

ELISA test for the detection of total antibodies to hepatitis B core antigen (anti-HBc) in human serum or plasma. Summary

Hepatitis B is a disease produced by a viral infection during which many serological markers appear. One of these markers is the anti-HBc. The hepatitis B core antigen (HBcAg) is an internal component of hepatitis B virus which is antigenically distinct from hepatitis B surface antigen (HBsAg). HBcAg/anti-HBc antigen-antibody system was described by Almeida et al. in 1971.1 Antibodies to HBcAg (anti-HBc) are the first to be developed in the course of an acute hepatitis B infection and may persist for life. Anti-HBc can usually be detected in the blood just after the detection of HBsAg and before the onset of clinically apparent hepatitis. In acute hepatitis B with recovery, anti-HBc is the only serological marker of infection in the period between HBsAg clearance and the appearance of anti-HBs. Blood donations taken at this stage may be infectious and it has been suggested that screening for anti-HBc as well as for HBsAg might further reduce the incidence of post transfusion hepatitis B.4 On the other hand, the screening for anti-HBc should also be performed on any individual before the administration of hepatitis B vaccine to know the immune status in order to vaccinate only the anti-HBc negative individuals. Furthermore several reports have shown a correlation between the presence of anti-HBc in donated blood and the incidence of transfusion associated non-A non-B hepatitis (NANBH or hepatitis C).7,8,9 With the implementation of anti-HBc screening of blood donors, many of these cases could be prevented.

Principle

bioelisa anti-HBc is a competitive immunoenzymatic method for determination of antibodies to HBcAg in human serum. The assay is based on a competition between human antibodies present in the sample and rabbit IgG anti-HBc conjugated to peroxidase (HRP) when they are simultaneously incubated in a well coated with recombinant HBcAg. After incubation and washing to remove unbound material, an enzyme substrate solution containing a chromogen is added. This solution will develop a blue colour if the sample is negative. The blue colour changes to yellow after blocking the reaction with sulphuric acid. The presence of anti-HBc in the sample will reduce the development of colour proportionally to its concentration.

Components

1. MCPL MICROPLATE:

12 x 8 wells coated with recombinant HBcAg (E. coli). Individually separable wells.

2. CONJ CONJUGATE:

1 x 6 ml of rabbit IgG anti-HBc conjugated to peroxidase. Contains red dye, stabilisers protein, 0.02% thimerosal and 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use.

3. WASH SOLN 10x CONCENTRATE WASHING SOLUTION:

2 x 50 ml of concentrate phosphate buffer (10x) containing 1% Tween 20 and 0.01% thimerosal. To be diluted 1/10 in distilled or deionised water before use.

4. SUBS BUF SUBSTRATE BUFFER:

1 x 14 ml of citrate-acetate buffer containing hydrogen peroxide.

5. SOLN TMB CHROMOGEN:

1 x 1.5 ml of 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) dissolved in dimethylsulphoxide (DMSO).

6. CONTROL + POSITIVE CONTROL:

1 x 2 ml of rabbit IgG anti-HBc diluted in phosphate buffer. Contains stabilisers protein and 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use.

7. CONTROL – NEGATIVE CONTROL:

1 x 3.5 ml of human serum negative for all HBV markers containing 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use.

8. H2SO4 1N STOPPING SOLUTION:

1 x 12 ml of 1N sulphuric acid. Ready to use.

9. SEALS ADHESIVE SEALS:

To cover the microplate during incubations.

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10. BAG RESEALABLE BAG: For storage of unused strips.

Precautions

bioelisa anti-HBc is intended for IN VITRO diagnostic use. For professional use only.

WARNING: POTENTIALLY BIOHAZARDOUS MATERIAL.

All human source material used in the preparation of this product was found to be negative for the presence of HIV-1/HIV-2 and HCV antibodies, as well as for the hepatitis B surface antigen, using a commercial licensed method. Nevertheless, because no test method can offer complete assurance of the absence of infectious agents, this product should be handled with caution:

- Avoid contact of reagents with the eyes and skin. If that occurs, wash thoroughly with water. - Wear gloves.

- Do not pipette by mouth. - Do not smoke.

- Dispose all used materials in a suitable biohazardous waste container. Remains of samples, controls, aspirated reagents and pipette tips should be collected in a container for this purpose and autoclaved 1 hour at 121°C or treated with 10% sodium hypochlorite (final concentration) for 30 min before disposal. (Remains containing acid must be neutralised prior addition of sodium hypochlorite).

- Certain reagents in this kit contain sodium azide as preservative. Sodium azide may react with lead or copper pipes and plumbing creating highly explosive metal azides. Flush drains with water thoroughly after disposing of the remains of reagents.

Handling instructions:

- Adjust washer to the plate used (flat bottom) in order to wash properly. - Do not mix reagents from different lots.

- Do not use reagents after expiration date.

- Do not use the reagent if you observed any change in appearance of components included in the kit. - Extreme care should be taken to avoid microbial contamination and cross contamination of reagents. - Use a new pipette tip for each specimen and each reagent.

- It is very important to prepare the substrate-TMB solution just 5-10 minutes before use. Keep it in a well-sealed container and avoid light exposure.

- Soaps and/or oxidising agents remaining in containers used for preparation of substrate-TMB solution can interfere with the reaction. If glass containers are used to prepare the solution, they should be washed with 1N sulphuric or hydrochloric acid, rinsed well with distilled water and dried before use. We recommend using disposable plastic containers.

Storage and stability

The components will remain stable through the expiration date shown on the label if stored between 2-8°C. The bag containing the microplate should be brought to room temperature before opening to avoid condensation in the wells. Once opened the bag, microplate strips are stable for 3 months at 2-8°C in the plastic bag tightly sealed, with the silicagel. Once diluted, the washing solution is stable for two weeks if stored between 2-8°C. Store the chromogen in the dark. As the substrate-TMB solution is not stable once prepared, instructions for its use should be closely followed.

Material required not provided - Distilled or deionised water.

- Multichannel pipettes and micropipettes (50 µl, 100 µl) and disposable tips. - Incubator at 37°C ± 1°C.

- Timer.

- Microplate reader with a 450 nm filter. Reference filter of 620 or 630 nm is advisable. - Manual or automated wash system.

Sample collection

Use fresh serum or plasma (citrate/EDTA). Other anticoagulants should be evaluated before use. Samples can be stored at 2-8°C for 3 days. For longer periods, samples should be frozen (-20°C). Avoid repeated freezing and thawing. Samples showing visible particulate matter should be clarified by centrifugation. Serum or plasma samples should not be heat inactivated, since that may cause incorrect results. Samples should not contain sodium azide.

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Automatic processing

Automated or semi-automated assay may be used with different instruments. It is very important to validate any automated system to demonstrate that results obtained for samples are equivalent to the ones obtained using manual assay. It is recommended that the user validate periodically the instrument. If there is any difficulty in the setting of Biokit automatic processors, please contact your distributor.

PROCEDURE (See procedural flow chart) Previous operations

Allow all the reagents to reach room temperature (20-25°C) before running the assay. Gently mix all liquid reagents before use.

Dilute the concentrate washing solution 1/10 with distilled or deionised water. For one plate, mix 50 ml of the concentrate solution with 450 ml of water. If less than a whole plate is used, prepare the proportional volume of solution.

Assay procedure

1. Use only the number of strips required for the test. Reserve 7 wells for blank and controls. Transfer 50 µl of negative control to 4 wells and 50 µl of positive control to 2 wells. Leave a well empty for the substrate blank.

2. Transfer 50 µl of each sample to be tested into the appropriate wells.

3. Add 50 µl of conjugate solution into each well, except the one reserved for substrate blank.

4. Cover the plate with the adhesive seal, mix gently and incubate for 1 hour at 37°C.

5. During the last 5-10 minutes of this incubation prepare the substrate-chromogen solution. If the entire plate is used add 280 µl of chromogen (TMB) to the bottle containing the substrate buffer (14 ml) and mix well. If the entire plate is not used, follow table 1. The final solution should be colourless; discard if it becomes blue.

TABLE 1

Strips required 1 2 4 6 8 10 12

Substrate buffer ml 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

Chromogen (TMB) µl 20 40 80 120 160 200 240

NOTE: The TMB is dissolved in DMSO. As the melting point of the DMSO is 18°C, the chromogen solution should be allowed to reach a temperature of 20-25°C, and be well mixed before use. A yellowish colour is normal for the chromogen solution.

6. Remove and discard the adhesive seal. Aspirate the contents of the wells and fill them completely (approximately 350 µl) with the diluted washing solution. Repeat the process of aspiration and washing 3 more times. Ensure that each column of wells soaks for at least 15 seconds before the next aspiration cycle. After the last washing blot the microplate on absorbent tissue to remove any excess liquid from the wells.

7. Add 100 µl of substrate-TMB solution to each well, including the blank.

8. Incubate for 30 minutes at room temperature (20-25°C).

9. Stop the reaction by adding 100 µl of stopping solution in the same sequence and time intervals as for the substrate-TMB.

10. Blank the reader at 450 nm with the blank well and read the absorbance of each well, within 30 minutes. It is recommended to read in bichromatic mode using a 620 - 630 nm reference filter.

Quality control

Results of an assay are valid if the following criteria are accomplished:

1. Substrate blank: absorbance value must be less than or equal to 0.100.

2. Negative control: each of the individual absorbance values must not differ more than 20% of the mean of the four values. The mean absorbance must be equal to or higher than 0.600 after subtracting the blank.

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Results

1. Calculate the cut-off value by adding the mean absorbance of the negative control to the mean absorbance of the positive control and multiplying this result by 0.4.

Cut-off = (NCx + PCx) x 0.4

2. Divide the sample absorbance by the cut-off value.

Positive: ratio absorbance/cut-off ≤ 1.0 Negative: ratio absorbance/cut-off > 1.1 Equivocal: ratio absorbance/cut-off > 1.0 ≤ 1.1 Interpretation of the results

A positive result for anti-HBc means that the individual has been infected by the hepatitis B virus. It is not a marker of immunity. A negative result indicates that the sample evaluated doesn’t contain anti-HBc or contains it in a concentration lower than the analytical sensitivity of the kit. To evaluate the general state of a patient concerning hepatitis B, additional tests to other serological markers should be performed.

Limitations of the procedure

As with other serological tests, the results obtained with bioelisa anti-HBc serve only as an aid to diagnosis and should be interpreted taking into consideration the patients’ clinical history.

Optimal assay performance requires strict adherence to the assay procedure described. Deviation from the procedure may lead to aberrant results.

Specimens with an anti-HBc concentration lower than 1.5 U/ml (PEI or WHO standard) may not be detected. Any positive or equivocal sample should be retested and should be investigated for other serological markers of HBV.

Expected results

Anti-HBc antibody is the most frequent marker of hepatitis B virus infection and is found in acute, chronic or resolved infection. The prevalence of anti-HBc and other markers of Hepatitis B infection vary widely in the world, from high (70-90%, Africa, Asia and Western Pacific) to intermediate (20-55%, Southern and Eastern Europe) and low (4-6%, Western Europe, North America and parts of South America). Different studies reported a prevalence ranging from 0.53% to 2.16% on blood donors from United Kingdom.2,5,6

Performance characteristics

Analytical sensitivity

The limit of detection of the bioelisa anti-HBc kit is 1.5 units/ml using the anti-HBc reference serum from Paul Ehrlich Institute (PEI), Germany. According to internal studies 1.0 PEI-U/ml is equivalent to approximately 1.0 IU/ml of the WHO First International Standard for anti-HBc (NIBSC code 95/522).

Evaluations

The performance of bioelisa anti-HBc was evaluated in comparative studies with other commercial assays.

- In an internal evaluation, 233 samples that were anti-HBc positive with another commercial assay (76 of which were also positive for HBsAg) were tested with the bioelisa anti-HBc. 227 gave positive result (including the 76 HBsAg positive) and 6 were negative. The 6 discrepant samples were tested with a third commercial assay and results were also negative.

- In an external evaluation in comparison with other commercial assay, 175 samples were tested. 31 were positive and 141 were negative with both assays. An overall agreement of 98.3% (172/175) was obtained. Eliminating 2 equivocal samples from calculations, relative sensitivity was 100% (31/31) and relative specificity was 99.2%.

- In another external evaluation, 251 HBsAg positive samples were tested. 247 (98.4%) were reactive with the bioelisa anti-HBc, from which 245 were also reactive with the alternative routine anti-HBc test. 4 samples were anti-HBc negative with the bioelisa and with the routine test and 2 were positive only with the bioelisa. Therefore, the relative sensitivity of bioelisa was 100% (245/245) and the overall agreement between both methods was 99.2% (249/251).

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- In another external evaluation, 5058 samples from consecutive routine blood donors were tested in parallel with the bioelisa and the routine method. From these samples, 6 were reactive with both the bioelisa and the routine test, 5 of which were confirmed as past infection after further tests for other HBV markers while 1 was positive for anti-HBc only. Other 3 samples were repeatedly positive with the bioelisa and negative with the routine test, 2 of which were considered as false positives and 1 was inconclusive after additional tests. Considering as true positives only the samples confirmed as being of past infection, the specificity found was 99.92% (5049/5053).

- Another external evaluation concerning end-point sensitivity and performance comparing to other commercial assays is in Bibliography.3

Precision

Intra-assay reproducibility:

The coefficient of variation obtained for the absorbance values of a negative sample assayed in 48 replicates were 4.34%, 4.19% and 3.66% in three lots studied.

Inter-assay reproducibility:

Three negative samples were tested in 3 different assays. The coefficients of variation obtained for the ratios absorbance/cut-off of the 3 samples were 4.9%, 7.0% and 8.2% respectively.

Interferences

To study possible interferences, samples with potential risk of producing cross reaction were tested, including sera positive for Rheumatoid Factor (RF), anti-nuclear antibodies (ANA), heterophiles antibodies, anti-HAV IgM, anti-E. coli and from pregnant women. No evidences of interference were observed.

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bioelisa: Troubleshooting guide

Problem Possible

causes

Solution

1. Controls out of validation.

1a. Incorrect temperature, incubation or pipetting.

Check procedure. Repeat assay.

1b. Improper preparation of reagents, error of dilution, reagents not well mixed.

1c. Cross-contamination of

controls.

Pipette carefully. Do not interchange caps. Repeat assay.

1d. Incorrect reading filter. Check that the wavelength of the filter used is 450 nm. If no reference filter of 620-630 nm is used, absorbance

increases approximately 0.050.

1e. Interference in the optical pathway.

Check the reader. Clean or dry the bottom of wells. Check for air bubbles. Repeat reading.

1f. Used components from different lots.

Do not use components from different lots as they are adjusted for each batch released.

1g. Expired reagents. Check the kit expiration date. Use a non-expired kit.

2. No colour or only a light colour developed at the end of the assay.

2a. One or more reagents not added or added in wrong sequence.

2b. Inactive conjugate: improper conservation.

Check for contamination. Check procedure. Repeat assay.

2c. Inactive microplate:

improper conservation.

Always keep unused strips in the bag very well closed, with the desiccant inside. Repeat assay.

2d. Inactive substrate:

improper conservation or dilution, the container used affects substrate stability, cross-contamination with the stopping solution.

Always use a freshly prepared dilution of TMB in substrate buffer. Use disposable containers or wash with acid or ethanol and rinse with deionised water before re-use. Recheck procedure. Repeat assay.

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bioelisa: Troubleshooting guide

Problem Possible

causes

Solution

3. Too much colour in all microplate wells.

3a. Contaminated, oxidised or improperly prepared substrate.

Check that substrate is colourless, discard if blue. Make sure that TMB is

completely liquid before using. Make sure that TMB is well mixed in the substrate buffer. Use acid or ethanol washed or disposable vials or containers. Repeat assay.

3b. Contaminated or

improperly prepared reagents.

Check for contamination: turbid aspect. Check dilutions. Repeat assay.

3c. Contaminated washing

solution (1x).

Check the quality of distilled or deionised water used for dilution. Repeat assay.

3d. Insufficient washing or washing not consistent: filling volume and/or aspiration insufficient or not uniform. Insufficient number of washing cycles, contaminated washer.

Check the washer. Fill wells with washing solution close to the top, aspirate completely. Increase the number of wash cycles. After washing, blot the inverted microplate on tissue paper. Repeat assay.

3e. Using of a washing solution from other manufacturer.

Use only biokit washing solution.

4. Poor reproducibility or high number of non-repeatable

reactive samples.

4a. Washing problems. See 3c, 3d, 3e.

4b. Uncalibrated pipettes or tips not well fitted. Improper pipetting.

Use only calibrated pipettes, with well fitted tips and pipette carefully, without bubbles and splashing. Repeat assay.

4c. Reagents and sera not at room temperature or not well mixed before using.

Equilibrate reagents and samples to room temperature and mix thoroughly before using.

4d. Air currents over the microplate during incubations.

Keep the microplate protected from air currents.

4e. Too long time for addition of samples and/or

reagents. Inconsistency in time intervals. Air

bubbles.

Develop consistent and uniform technique.

4f. Interference in the optical pathway.

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BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843

bioelisa anti-HBc

3000-1102 1 x 96 TESTS

Test de ELISA para la detección de anticuerpos totales contra el antígeno core de la hepatitis B (anti-HBc) en suero o plasma humano.

Sumario

La hepatitis B es una enfermedad causada por una infección vírica. A lo largo de la infección aparecen varios marcadores serológicos entre los cuales está el anti-HBc. El antígeno "core" de la hepatitis B (HBcAg) es un componente interno del virus de la hepatitis B antigénicamente distinto al antígeno de superficie (HBsAg). Este sistema antígeno-anticuerpo HBcAg/anti-HBc fue descrito por Almeida y col. en 1971.1 El anti-HBc es el primer anticuerpo detectable en el curso de una hepatitis B aguda y puede persistir durante toda la vida. El anti-HBc suele detectarse en sangre inmediatamente después de la detección de HBsAg y justo antes de la aparición de las manifestaciones clínicas de la enfermedad. En casos de hepatitis B aguda con recuperación, el anti-HBc es el único marcador de la infección detectable en el período entre la desaparición de HBsAg y la aparición de anti-HBs. La sangre extraída de un individuo durante este período puede ser infectiva y se ha sugerido que el cribado para anti-HBc además del cribado para HBsAg en donantes, permitiría reducir la incidencia de hepatitis B postransfusionales.4 Por otra parte, la detección de anti-HBc es útil en exámenes prevacunales ya que sólo es necesario que se vacunen contra la hepatitis B aquellos individuos negativos para anti-HBc. Varios estudios han demostrado una correlación entre la presencia de anti-HBc en donaciones sanguíneas con la aparición de hepatitis no A no B (NANBH o hepatitis C) postransfusional.7,8,9 La implementación del cribado para anti-HBc en donantes de sangre podría prevenir muchos de estos casos.

Principio

bioelisa anti-HBc es un método inmunoenzimático competitivo para la determinación de anticuerpos contra el HBcAg en suero humano. El ensayo está basado en la competencia entre anticuerpos humanos presentes en la muestra y anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa cuando se incuban simultáneamente en los pocillos de una microplaca recubierta con HBcAg recombinante. Después de la incubación se efectúa un lavado para eliminar el material no fijado y a continuación se añade una solución de sustrato enzimático y cromógeno. Esta solución desarrollará un color azul cuando la muestra sea negativa. El color azul cambia a amarillo después de parar la reacción con ácido sulfúrico La presencia de anti-HBc en la muestra reduce el desarrollo de color de forma proporcional a su concentración.

Componentes

1. MCPL MICROPLACA:

12 x 8 pocillos recubiertos con antígeno recombinante HBcAg (E. coli). Pocillos separables individualmente.

2. CONJ CONJUGADO:

1 x 6 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa. Contiene colorante rojo, proteínas estabilizadoras, mertiolato sódico al 0,02% y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar.

3. WASH SOLN 10x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA:

2 x 50 ml de tampón fosfato concentrado (10x) que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sódico al 0,01%. A diluir 1/10 con agua destilada o desionizada antes de utilizarse.

4. SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO:

1 x 14 ml de tampón citrato-acetato que contiene peróxido de hidrógeno.

5. SOLN TMB CROMÓGENO:

1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO).

6. CONTROL + CONTROL POSITIVO:

1 x 2 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc diluidos en tampón fosfato. Contiene proteínas estabilizadoras y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar.

7. CONTROL – CONTROL NEGATIVO:

1 x 3,5 ml de suero humano negativo para todos los marcadores de la hepatitis B. Contiene sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar.

8. H2SO4 1N SOLUCIÓN DE PARADA:

1 x 12 ml de ácido sulfúrico 1N. Listo para usar.

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9. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS:

Para cubrir la microplaca durante las incubaciones.

10. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar las tiras sin usar.

Precauciones

bioelisa anti-HBc es para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales.

ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO.

Todo el material de origen humano utilizado en la preparación de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un método comercial autorizado. Sin embargo, dado que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaución:

- No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante cantidad de agua.

- Usar guantes.

- No pipetear ningún reactivo con la boca. - No fumar.

- Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121°C, o tratarse con hipoclorito sódico a una concentración final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan ácido deben ser neutralizados antes de añadir el hipoclorito sódico).

- Algunos reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante.

Precauciones de manejo:

- Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado. - No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes.

- No usar los reactivos una vez hayan caducado.

- No utilice el reactivo si observa algún cambio de apariencia en cualquier componente incluido en el kit. - Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminación cruzada entre

los reactivos.

- Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo.

- Es muy importante preparar la solución de sustrato-TMB justo 5-10 minutos antes de ser empleada. Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz.

- Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación de la solución sustrato-TMB, pueden interferir en la reacción. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es conveniente lavarlos con ácido sulfúrico o clorhídrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos antes de usarlos. Usar preferiblemente material plástico desechable.

Conservación y estabilidad

Los componentes permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8°C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar condensación en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8°C en la bolsa de plástico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante dos semanas si se conserva entre 2-8°C. Guardar el cromógeno al abrigo de la luz. La solución sustrato-TMB una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su utilización.

Material necesario no incluido - Agua destilada o desionizada.

- Pipetas multicanal y micropipetas (50 µl, 100 µl) y puntas desechables. - Incubador a 37°C ± 1°C.

- Cronómetro.

- Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 o 630 nm. - Sistema de lavado manual o automático.

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Recolección de la muestra

Usar suero fresco o plasma (citrato/EDTA). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las muestras pueden ser conservadas durante 3 días entre 2-8°C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-20°C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente. Partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. No utilizar muestras que contengan azida sódica.

Procesamiento automático

Esta prueba permite su uso de modo automático o semi-automático en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a los obtenidos empleándose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide periódicamente el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programación y ajuste de los procesadores automáticos de Biokit, por favor contacte con su distribuidor.

PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25°C) antes de empezar el ensayo. Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos.

Diluir la solución de lavado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada. Para una placa mezclar 50 ml de solución de lavado concentrada con 450 ml de agua. En caso de no utilizar una placa completa preparar el volumen proporcional de solución.

Realización de la prueba

1. Utilizar solamente el número de tiras necesario para el test. Reservar 7 pocillos para blanco y controles. Transferir 50 µl de control negativo a 4 pocillos y 50 µl de control positivo a 2 pocillos. Dejar vacío un pocillo para el blanco de sustrato.

2. Transferir 50 µl de cada una de las muestras a analizar a los pocillos correspondientes.

3. Añadir 50 µl de conjugado a cada pocillo, a excepción del pocillo para el blanco de sustrato.

4. Cubrir la placa con una lámina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 1 hora a 37°C.

5. Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación, preparar la solución de sustrato-cromógeno. Para una placa añadir 280 µl de la solución de cromógeno (TMB) a un vial de tampón sustrato (14 ml) y mezclar bien. Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria según indica la tabla 1. La solución final debe ser incolora, descartar en caso de que se vuelva azul.

TABLA 1

Tiras requeridas 1 2 4 6 8 10 12

Tampón sustrato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

Cromógeno (TMB) µl 20 40 80 120 160 200 240

NOTA: El TMB está disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusión del DMSO es de 18°C, el cromógeno debe alcanzar una temperatura de 20-25°C y agitarse bien antes de usarlo. Es normal que el cromógeno presente un color amarillento.

6. Desechar la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente (aproximadamente 350 µl) con solución de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiración lavado 3 veces más. Asegurarse de que cada columna de pocillos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiración. Después del último lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos.

7. Añadir 100 µl de sustrato-TMB a todos los pocillos, incluso el blanco.

8. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).

9. Añadir 100 µl de solución de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos intervalos observados en la adición del sustrato-TMB.

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10. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos en el plazo máximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromática utilizando filtro de referencia de 620 - 630 nm.

Control de calidad

Los resultados de un ensayo son válidos si se cumplen los siguientes criterios:

1. Blanco del sustrato: el valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0,100.

2. Control negativo: cada uno de los valores individuales de absorbancia no debe variar más del 20% de la media de los cuatro valores. La media de las absorbancias deber ser igual o mayor que 0,600 después de restar el blanco.

3. Control positivo: la media de las absorbancias debe ser igual o menor que 0,100 después de restar el blanco.

Resultados

1. Calcular el valor umbral sumando el valor promedio de absorbancias del control negativo y el del control positivo y multiplicando el resultado de esta suma por 0,4.

Valor umbral = (CNx + CPx) x 0,4

2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral.

Positivo: ratio absorbancia/valor umbral ≤ 1,0 Negativo: ratio absorbancia/valor umbral > 1,1 Dudoso: ratio absorbancia/valor umbral > 1,0 ≤ 1,1 Interpretación de los resultados

Un resultado positivo para anti-HBc significa que el paciente ha contraído la hepatitis B alguna vez previamente. No es un marcador de inmunidad. Un resultado negativo significa que la muestra analizada no contiene anti-HBc o lo contiene por debajo del límite de detección del kit. Para evaluar la situación de un paciente respecto a la hepatitis B deben practicarse los tests para los demás marcadores serológicos de la hepatitis B.

Limitaciones del procedimiento

Como ocurre con otras pruebas serológicas, los resultados obtenidos con el bioelisa anti-HBc sirven solamente como ayuda al diagnóstico y deben interpretarse teniendo en cuenta la historia clínica del paciente.

Para el correcto funcionamiento del kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier desviación puede dar origen a resultados aberrantes.

Muestras con una concentración de anticuerpos anti-HBc inferior a 1,5 U/ml (estándar PEI o WHO) pueden no detectarse.

Todas las muestras positivas o dudosas se deberían repetir y probarse para otros marcadores serológicos del HBV.

Resultados esperados

El anticuerpo anti-HBc es el marcador más frecuente de infección por el virus de la hepatitis B y se detecta tanto en la infección aguda como en la crónica y en la infección pasada con recuperación. La prevalencia de anti-HBc y de otros marcadores de la hepatitis B varía ampliamente en el mundo, de alta (70-90%, ej., África, Asia y Pacífico Oeste) a intermediaria (20-55%, ej., sur y este Europeo) y baja (4-6%, ej., Europa occidental, América del Norte y partes de América del Sur). Diferentes estudios han descrito una prevalencia del 0,53 al 2,16% en donantes de sangre del Reino Unido.2,5,6

Características funcionales

Sensibilidad analítica

El límite de detección del bioelisa anti-HBc es 1,5 unidad/ml utilizando el suero de referencia anti-HBc del Paul Ehrlich Institute (PEI), Alemania. Según estudios internos, 1,0 PEI-U/mL equivale a aproximadamente 1,0 UI/mL del primer Estándar Internacional de la OMS para anti-HBc (código NIBSC 95/522).

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Evaluaciones

El funcionamiento del bioelisa anti-HBc se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales.

- En una evaluación interna se probaron 233 muestras que eran positivas de anti-HBc con otro ensayo comercial (76 de ellas eran también positivas de HBsAg). 227 presentaron resultado positivo (incluso las 76 positivas de HBsAg) y 6 presentaron resultado negativo. Las 6 muestras discrepantes se probaron con un tercero ensayo comercial y los resultados fueron también negativos.

- En una evaluación externa en comparación con otro ensayo comercial, se probaron 175 muestras. 31 fueron positivas y 141 fueron negativas con ambos ensayos. Se obtuvo una concordancia global del 98,3% (172/175). Eliminándose 2 muestras dudosas de los cálculos, la sensibilidad relativa fue del 100% (31/31) y la especificidad relativa fue del 99,2%.

- En otra evaluación externa, se probaron 251 muestras positivas de HBsAg. 247 (98,4%) fueron reactivas con el bioelisa anti-HBc, de las cuales 245 fueron reactivas también con el método alternativo utilizado en rutina para anti-HBc. 4 muestras fueron anti-HBc negativas con el bioelisa y con el método en rutina y 2 fueron positivas solamente con el bioelisa. Por tanto, la sensibilidad relativa del bioelisa fue del 100% (245/245) y la concordancia global entre ambos métodos fue del 99,2% (249/251).

- En una otra evaluación externa, 5058 muestras consecutivas de donantes de sangre habituales se probaron en paralelo con el bioelisa y con el método en rutina. De estas muestras, 6 fueron reactivas tanto con el bioelisa como con el método en rutina, 5 de las cuales se confirmaron 5 como de infección pasada después de realizarse tests adicionales para otros marcadores de HBV. mientras que 1 era positiva solamente para anti-HBc. Otras 3 muestras fueron repetidamente positivas con el bioelisa y negativas con el test en rutina siendo 2 de ellas consideradas como falsamente positivas y 1 de resultado inconclusivo después de realizar tests adicionales. Considerando como positivas verdaderas solamente las muestras confirmadas como de infección pasada, la especificidad encontrada fue del 99,92% (5049/5053).

- Otra evaluación externa de sensibilidad a punto final y funcionamiento comparando con otros ensayos comerciales se encuentra en la bibliografía.3

Precisión

Reproducibilidad intra-ensayo:

Los coeficientes de variación obtenidos para los valores de absorbancia de 48 replicados de una muestra negativa fueron del 4,34%, 4,19% e 3,66% en tres lotes estudiados.

Reproducibilidad inter-ensayo:

Tres muestras negativas se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos para los ratios absorbancia/valor umbral de las 3 muestras fueron del 4,9%, 7,0% y 8,2% respectivamente.

Interferencias

Para estudiar posibles interferencias, se probaron muestras con un riesgo potencial de producir reacciones cruzadas, tales como sueros positivos de factor reumatoide (RF), anticuerpos anti-nucleares (ANA), anticuerpos heterófilos, IgM anti-HAV, anti-E. coli y de mujeres embarazadas. No se observaron evidencias de interferencia.

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bioelisa: Guía de problemas

Problema Posibles

causas

Solución

1. Controles fuera de validación.

1a. Temperatura, incubación o pipeteo incorrecto.

Comprobar procedimiento. Repetir el ensayo.

1b. Preparación incorrecta de reactivos, error en las diluciones. Reactivos no mezclados correctamente. Comprobar procedimiento. Repetir el ensayo. 1c. Contaminación cruzada entre controles. Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Repetir el ensayo.

1d. Filtro de lectura incorrecto.

Comprobar que el filtro de lectura sea de 450 nm. Si no se usa filtro de referencia de 620 o 630 nm, las

absorbancias aumentan aproximadamente 50 miliunidades.

1e. Interferencia en el camino óptico.

Comprobar el lector. Limpiar o secar el fondo de los pocillos. Comprobar que no haya burbujas de aire. Repetir la lectura.

1f. Se han utilizado componentes de lotes diferentes.

No utilizar componentes de lotes diferentes puesto que están ajustados para cada lote en particular.

1g. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del kit. No utilizar un kit

caducado.

2. Sin color o poco color al final del ensayo.

2a. Uno o más reactivos no añadidos o añadidos en secuencia equivocada. Comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. 2b. Conjugado inactivo: conservación incorrecta. Comprobar si ha habido contaminación, comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. 2c. Microplaca inactiva: conservación incorrecta.

Mantener siempre las tiras no utilizadas en la bolsa minigrip, bien cerrada, con el

desecante dentro. Repetir el ensayo.

2d. Sustrato inactivo:

conservación o dilución incorrecta, el contenedor utilizado afecta la estabilidad del sustrato, contaminación cruzada con la solución de parada.

Utilizar siempre una dilución fresca de TMB en tampón sustrato. Usar contenedores desechables o lavados con ácido o etanol y enjuagados con agua desionizada. Comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo.

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bioelisa: Guía de problemas

Problema Posibles

causas

Solución

3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca.

3a. Sustrato contaminado, oxidado o preparado incorrectamente.

Comprobar que el sustrato preparado sea incoloro, descártelo si está azul. Asegúrese que el TMB está completamente líquido antes de utilizarlo. Asegurar la correcta mezcla del TMB en el tampón sustrato. Utilizar viales o contenedores desechables o lavados con solución ácida o etanol. Repetir el ensayo.

3b. Reactivos contaminados

o preparados incorrectamente.

Comprobar contaminación (aspecto turbio). Comprobar diluciones. Repetir el ensayo.

3c. Solución de lavado (1x) contaminada.

Comprobar la calidad del agua destilada/desionizada utilizada para preparar la dilución. Repetir el ensayo.

3d. Lavado insuficiente o no consistente: llenado o aspiración insuficiente o no uniforme, número de ciclos de lavado insuficiente. Lavador contaminado.

Comprobar el lavador. Llenar los pocillos hasta el tope y aspirar completamente. Incrementar el número de ciclos de lavado. Golpear la placa invertida contra papel absorbente. Repetir el ensayo.

3e. Se ha utilizado solución de lavado de otro fabricante.

Utilizar sólo la solución de lavado de biokit.

4. Reproducibilidad pobre o elevado número de muestras reactivas que no se repiten.

4a. Problemas de lavado. Ver apartados 3c, 3d, 3e.

4b. Pipetas mal calibradas o puntas mal encajadas. Técnica de pipeteo incorrecta.

Utilizar pipetas calibradas con puntas bien ajustadas. Pipetear cuidadosamente sin burbujas ni salpicaduras. Repetir el ensayo.

4c. Reactivos y muestra no a temperatura ambiente o no correctamente mezclados antes de usar.

Atemperar muestras y reactivos y mezclarlos bien antes de utilizarlos.

4d. Corrientes de aire sobre la microplaca durante las incubaciones.

Mantener la microplaca protegida de las corrientes de aire.

4e. Demasiado tiempo en la adición de muestras y/o reactivos. Inconsistencia en los intervalos de tiempo, burbujas de aire.

Desarrollar una técnica uniforme y consistente.

4f. Interferencia en el camino óptico.

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BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843

bioelisa anti-HBc

3000-1102 1 x 96 TESTS

ELISA-Test zur Bestimmung der Gesamtantikörper gegen das Kernantigen der Hepatitis B (anti-HBc) in Humanserum oder –plasma.

Zusammenfassung

Die Hepatitis B ist eine Krankheit, die durch eine Virusinfektion verursacht wird. Im Verlauf der Infektion treten verschiedene serologische Marker u.a. der Anti-HBc auf. Das „Kern“-Antigen der Hepatitis B (HBcAg) ist ein interner Bestandteil des Hepatitis B-Virus, das sich unter antigenetischem Gesichtspunkt von dem Oberflächen-Antigen (HBsAg) unterscheidet. Dieses HBcAg/Anti-HBc-Antigen-Antikörper-System wurde 1971 von Almeida und Kol.1 beschrieben. Der Anti-HBc ist der erste im Verlauf einer akuten Hepatitis B nachweisbare Antikörper und kann lebenslang weiterbestehen. Der Anti-HBc-Antikörper lässt sich in der Regel unmittelbar nach dem Nachweis von HBsAg und genau vor dem Auftreten der klinischen Manifestationen der Krankheit im Blut nachweisen. In Fällen akuter Hepatitis B mit Erholung ist der Anti-HBc der einzige im Zeitraum zwischen dem Verschwinden des HBsAg und dem Auftreten des Anti-HBs nachweisbare Infektionsmarker. Das einer Person in diesem Zeitraum abgenommene Blut kann infektiös sein und es ist vorgeschlagen worden, dass die zusätzliche Sichtung auf Anti-HBc neben HBsAg bei Spendern das Vorkommen von posttransfusionaler Hepatitis B senken würde.4 Der Nachweis von Anti-HBc erweist sich zudem bei Untersuchungen vor Impfungen als nützlich, da nur diejenigen Personen geimpft werden müssen, deren Anti-HBc-Befund negativ ausfällt. Verschiedene Studien haben einen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Anti-HBc in Blutspenden und dem Auftreten von Hepatitis weder A noch B (NANBH oder Hepatitis C) nach Transfusionen gezeigt.7,8,9 Die Einführung der Sichtung der Anti-HBc bei Blutspendern könnte vielen dieser Fälle vorbeugen.

Prinzip

bioelisa anti-HBc ist eine kompetitive enzymimmune Methode, um die HBcAg-Antikörper im Humanserum zu bestimmen. Der Versuch basiert auf dem Wettbewerb zwischen in der Probe vorhandenen menschlichen Antikörpern und mit Peroxidase konjugierten IgG-Kaninchenantikörpern Anti-HBc, wenn sie gleichzeitig in den Vertiefungen eines mit rekombinanten HBcAg beschichteten Mikrotiters inkubiert werden. Nach der Inkubation wird ausgewaschen, um das ungebundene Material zu beseitigen und anschließend wird ein Enzymsubstrat, das zu einem Farbumschlag führt, hinzugegeben. Diese Lösung wird sich bei einer negativen Probe blau verfärben. Die blaue Farbe wird gelb, nachdem die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt worden ist. Das Vorhandensein von Anti-HBc in der Probe mindert die Verfärbung direkt proportional zu seiner Konzentration.

Bestandteile

1. MCPL MIKROTITERPLATTE:

12 x 8 Vertiefungen, beschichtet mit rekombinantem HBcAg Antigen (E. coli). Einzeln trennbare Vertiefungen. 2. CONJ KONJUGAT:

1 x 6 ml Peroxidase konjugierte IgG- Kaninchen-HBc-Antikörper. Enthält roten Farbstoff, stabilisierende Proteine, Thimerosal 0,02% und 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig.

3. WASH SOLN 10x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG:

2 x 50 ml konzentrierter Phosphatpuffer (10x), der 1% Tween 20 und 0,01% Thimerosal enthält. Vor Gebrauch mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1/10 verdünnen.

4. SUBS BUF SUBSTRATPUFFER:

1 x 14 ml Zitrat/Azetat-Puffer mit Wasserstoffperoxid. 5. SOLN TMB CHROMOGEN:

1 x 1,5 ml 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO). Enthält roten Farbstoff. 6. CONTROL + POSITIVE KONTROLLE:

1 x 2 ml in Phosphatpuffer gelöste IgG-Kaninchen-HBc-Antikörper. Enthält stabilisierende Proteine und 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig.

7. CONTROL – NEGATIVE KONTROLLE:

1 x 3,5 ml für alle Hepatitis-B-Marker negatives Humanserum. Enthält 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig. 8. H2SO4 1N STOPPLÖSUNG:

1 x 12 ml 1N Schwefelsäure. Gebrauchsfertig.

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9. SEALS HAFTFOLIE:

Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationsphasen. 10. BAG FOLIENBEUTEL:

Zur Aufbewahrung der nicht verwendeten Streifen. Vorsichtsmassnahmen

bioelisa anti-HBc ist ausschliesslich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal.

ACHTUNG: BIOLOGISCH GEFÄHRLICHES MATERIAL.

Das gesamte zur Herstellung dieses Produkts verwendete Humanmaterial ist unter Verwendung eines zugelassenen kommerziellen Verfahrens auf die Anwesenheit von HBsAg, HIV-1/HIV-2 und HCV Antikörpern getestet und für negativ befunden worden. Da kein Nachweisverfahren die Abwesenheit von infektiösen Agenzien garantieren kann, ist dieses Produkt mit entsprechenden Vorsichtsmassnahmen zu handhaben:

- Eine Berührung der Reagenzien mit Haut oder Augen vermeiden; bei Berührung mit reichlich Wasser auswaschen.

- Handschuhe verwenden.

- Die Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. - Nicht rauchen.

- Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Die Reste von Proben, Kontrollen, aspirierte Reagenzien und Pipettenspitzen müssen in einem dafür vorgesehenen Behälter gesammelt werden und eine Stunde bei 121°C autoklaviert werden oder mit Natriumhypochlorit in einer Endkonzentration von 10% 30 Minuten lang behandelt werden. (Die Reste, die Säure enthalten können, müssen vor Zugabe des Natriumhypochlorit neutralisiert werden).

- Einige Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann auf Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und –Abflüsse reagieren und zu hochexplosiven Metallaziden führen. Beim Entfernen der Reagenzreste muss mit genügend Wasser nachgespült werden.

Hinweise für die Handhabung:

- Für sachgemäßes Auswaschen den Wascher auf den Mikrotiterplattentyp einstellen (flacher Grund). - Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen nicht mischen.

- Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.

- Verwenden Sie das Reagenz nicht, wenn Sie an irgendeinem zu dem Kit gehörenden Bestandteil irgendeine Änderung des Erscheinungsbilds beobachten.

- Es ist besondere Sorgfalt aufzuwenden, um eine Kontamination mit Bakterien und eine Kreuzkontamination zwischen den Reagenzien zu vermeiden.

- Zur Pipettierung jeder Probe und jedes Reagenz ist eine neue Einweg-Pipettenspitze zu verwenden.

- Reste von Seifen und/oder Oxidationsmitteln, die in den zur Herstellung der TMB-Substratlösung verwendeten Gefässe zurückgeblieben sind, können die Reaktion beeinflussen. Bei Verwendung von Glasgefäßen sollten diese darum mit 1N Schwefelsäure oder Salzsäure ausgewaschen, mit reichlich destilliertem Wasser ausgespült und vor Gebrauch getrocknet werden. Vorzugsweise sind Einweggefäße aus Kunststoff zu verwenden.

Lagerung und Stabilität

Bei einer Lagerungstemperatur von 2-8°C bleiben die Bestandteile bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Der Beutel mit der Mikrotiterplatte muss vor dem Öffnen auf Raumtemperatur gebracht werden, um eine Kondensationsbildung in den Vertiefungen zu vermeiden. Nach dem Öffnen des Beutels ist die Mikrotiterplatte bei Lagerung zwischen 2 und 8°C im gut verschlossenen Kunststoffbeutel mit dem Silicagelbeutel 3 Monate haltbar. Die Waschlösung bleibt nach Verdünnung zwei Wochen haltbar, wenn sie bei 2-8°C gelagert wird. Das Chromogen vor direktem Licht schützen. Die TMB-Substratlösung ist nach Zubereitung nicht stabil, deshalb sind die Gebrauchsanweisungen sorgfältig zu befolgen.

Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material - Destilliertes oder deionisiertes Wasser.

- Mehrkanalpipetten und Mikropipetten (50 µl, 100 µl) und Einwegspitzen. - Inkubator bei 37°C ± 1°C.

- Stoppuhr.

- Mikrotiterplattenmessgerät mit Filter 450 nm. Empfohlen wird ein Referenzfilter 620 oder 630 nm. - Manuelles oder automatisiertes Waschsystem.

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Probenmaterial

Frisches Serum oder Plasma (Zitrat/EDTA) benutzen. Andere Antikoagulantien müssen zuvor evaluiert werden. Die Proben können 3 Tage lang bei 2-8°C gelagert werden. Bei längerer Lagerung müssen die Proben eingefroren werden (-20°C). Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden. Sichtbare suspendierte Partikel sind durch Zentrifugieren zu entfernen. Die Seren oder Plasmen dürfen nicht hitzinaktiviert werden, da es sonst zu falschen Ergebnissen kommen kann. Keine Proben verwenden, die Natriumazid enthalten.

Automatische Verarbeitung

Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler in Verbindung. DURCHFÜHRUNG (Siehe schematischer Ablauf)

Vorbereitung

Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur gebracht worden sein (20-25°C). Flüssige Reagenzien müssen vor Gebrauch vorsichtig gemischt werden.

Die konzentrierte Waschlösung ist mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 1/10 zu verdünnen. Für eine Platte 50 ml konzentrierte Waschlösung mit 450 ml Wasser mischen. Wird nicht die ganze Platte gebraucht, dann eine proportional entsprechende Menge der Lösung herstellen.

Versuchsprotokoll

1. Nur die für den Test erforderliche Anzahl von Streifen verwenden. 7 Vertiefungen für Leerwert und Kontrolle

reservieren. 50 μl von negativer Kontrolle auf 4 Vertiefungen und 50 μl von positiver Kontrolle auf 2 Vertiefungen hinzugeben. Eine Vertiefung für das Substratsleerwert freilassen.

2. 50 µl von jeder zu analysierenden Probe auf die entsprechenden Vertiefungen überführen.

3. 50 µl des Konjugats auf jede Vertiefung hinzugeben, mit Ausnahme der Vertiefung für die Leerwertsprobe. 4. Die Platte mit einer Haftfolie abdecken, leicht schütteln und 1 Stunde lang bei 37°C inkubieren.

5. Während der letzten 5-10 Minuten dieser Inkubation die Substrat-Chromogen-Lösung zubereiten. Bei Verwendung der ganzen Platte 280 µl der TMB-Chromogen-Lösung in die Reagenzflasche mit Substratpuffer (14 ml) einfüllen und gut mischen. Wird nicht die ganze Platte benötigt, dann die erforderliche Menge gemäß Tabelle 1 zubereiten. Die endgültige Lösung muss farblos sein; bei Blaufärbung nicht mehr verwenden.

TABELLE 1

Erforderliche Streifen 1 2 4 6 8 10 12

Substratpuffer ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

Chromogen (TMB) µl 20 40 80 120 160 200 240

HINWEIS: Das TMB ist in DMSO gelöst. Da die Schmelzpunkt von DMSO bei 18°C liegt muss das Chromogen vor Gebrauch auf eine Temperatur von 20-25°C gebracht und gut gemischt werden. Eine Gelbfärbung der Chromogenlösung ist normal.

6. Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Den Inhalt aus den Vertiefungen herauspipettieren und diese vollständig (ca. 350 µl) mit verdünnter Waschlösung befüllen. Den Vorgang aus Aspirierung und Auswaschen weitere 3 Mal wiederholen. Stellen sie sicher, dass jede Vertiefungsreihe mindestens 15 Sekunden einweicht, bevor ein neuer Aspirationszyklus einsetzt. Nach dem letzten Waschen die Platte umgekehrt über saugfähigem Papier ausklopfen, um alle Flüssigkeitsüberschüsse in den Vertiefungen zu beseitigen.

7. 100 µl des TMB-Substrats auf alle Vertiefungen sogar des Leerwertes hinzugeben. 8. 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren.

9. 100 µl Stopplösung in jede Vertiefung einfüllen, dabei die gleiche Reihenfolge und die gleichen Zeitabstände einhalten wie bei der Zugabe des TMB-Substrats.

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10. Das Messgerät anhand der Vertiefung mit der Leerwertsprobe bei 450 nm auf Null stellen und die Extinktion jeder einzelnen Vertiefung innerhalb einer Zeitspanne von maximal 30 Minuten ablesen. Empfohlen wird eine biochromatische Messung mit einem Referenzfilter von 620 - 630 nm.

Qualitätskontrolle

Die Ergebnisse einer Serie sind gültig, wenn folgende Kriterien erfüllt sind: 1. Substratleerwert: der Extinktionsgrad muss unterhalb oder gleich 0,100 sein.

2. Negative Kontrolle: keiner der einzelnen Extinktionswerte darf mehr als 20% vom Mittelwert der vier Werte abweichen.Der Extinktionsmittelwert muss nach dem Abzug von Leerwert bei oder höher als 0,600 liegen. 3. Positive Kontrolle: Der Extinktionsmittelwert muss nach dem Abzug von Leerwert bei oder unter 0,100 liegen. Qualitative Ergebnisse

1. Schwellenwert berechnen, indem der Extinktionsmittelwert der negativen Kontrolle und der der positiven Kontrolle addiert und das Ergebnis dieser Summe mit 0,4 multipliziert wird.

Schwellenwert = (NKx + PKx) x 0,4

2. Die Extinktion der Probe durch den Schwellenwert teilen. Positiv: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert ≤ 1,0 Negativ: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert > 1,1 Zweifelhaft: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert > 1,0 ≤ 1,1 Auswertung der Ergebnisse

Ein positiver Befund auf Anti-HBc bedeutet, dass der Patient sich früher einmal mit Hepatitis B infiziert hat. Es ist kein Immunitätsmarker. Ein negativer Befund bedeutet, dass die analysierte Probe entweder keine Anti-HBc aufweist oder dass diese unterhalb der Nachweisgrenze des Kits liegen. Um die Situation eines Patienten im Hinblick auf Hepatitis B zu bewerten, müssen die Tests für die übrigen serologischen Marker der Hepatitis B durchgeführt werden.

Begrenzung der Methode

Wie auch bei anderen serologischen Untersuchungen dienen die mit bioelisa anti-HBc ermittelten Resultate als Hilfe bei der Diagnose und müssen unter Berücksichtigung des klinischen Befunds des Patienten interpretiert werden.

Für eine optimale Leistung des Kits sind die beschriebenen Anweisungen genauestens zu befolgen. Irgendeine Abweichung kann zu abwegigen Ergebnissen führen.

Proben mit einer Anti-HBc-Antikörperkonzentration von weniger als 1,5 E/ml (Standard PEI oder WHO) können nicht nachgewiesen werden.

Alle positiven oder zweifelhaften Proben müssen wiederholt und auf andere serologische HBV-Marker überprüft werden.

Erwartete Ergebnisse

Der Anti-HBc-Antikörper ist der am häufigsten auftretende Marker für eine Infektion mit dem Virus der Hepatitis B und er wird sowohl bei der akuten als auch chronischen Infektion sowie einer durchgemachten Infektion mit Erholung nachgewiesen. Die Prävalenz von Anti-HBc und sonstigen Hepatitis-B-Markern schwankt weltweit sehr stark, von hoch (70-90%, z.B. Afrika, Asien und Westpazifik) über mittel (20-55%, z.B. Süd- und Osteuropa bis niedrig (4-6%, z.B. Westeuropa, Nordamerika und Teile Südamerikas). Verschiedene Studien haben bei Blutspendern im Vereinigten Königreich eine Prävalenz von 0,53 bis 2,16% beschrieben.2,5,6

Charakteristika des Tests

Analytische Sensibilität

Die Nachweisgrenze des bioelisa anti-HBc beträgt 1,5 Einheit/ml, wenn das Referenz-Anti-HBc-Serum des Paul-Ehrlich-Instituts (PEI), Deutschland, benutzt wird. Nach internen Studien, 1,0 PEI-U/mL entspricht etwa 1,0

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Auswertungen

Die Leistungsfähigkeit von bioelisa anti-HBc wurde in Vergleichsstudien mit anderen kommerziellen Tests untersucht.

- Bei einer internen Auswertung wurden 233 Proben getestet, die mit einem anderen handelsüblichen Test positiv für Anti-HBc waren (76 von ihnen waren auch positiv für HBsAg). 227 erbrachten ein positives Ergebnis (sogar die 76 positiven für HBsAg) und 6 ergaben einen negativen Befund. Die 6 abweichenden Proben wurden mit einem dritten handelsüblichen Test geprüft und die Ergebnisse waren ebenfalls negativ.

- Bei einer externen Auswertung wurden im Vergleich mit einem anderen handelsüblichen Test 175 Proben getestet. 31 waren mit beiden Tests positiv und 141 negativ. Man erhielt eine Gesamtkonkordanz von 98,3% (172/175). Bei Ausschluss von 2 zweifelhaften Proben lag die relative Sensitivität bei 100% (31/31) und die relative Spezifität bei 99,2%.

- Bei einer anderen externen Auswertung, wurden 251 positive HBsAg-Proben getestet. 247 (98,4%) reagierten mit dem bioelisa anti-HBc, von denen 245 ebenfalls mit der routinemäßig für Anti-HBc verwendeten Alternativmethode reagierten. 4 Proben waren mit dem bioelisa und der Routinemethode Anti-HBc negativ und 2 waren nur mit dem bioelisa positiv. Somit lag die relative Sensitivität von bioelisa bei 100% (245/245) und die Gesamtkonkordanz zwischen beiden Methoden betrug 99,2% (249/251).

- Bei einer anderen externen Auswertung wurden 5058 aufeinanderfolgende Proben von gewöhnlichen Blutspendern parallel mit bioelisa und der Routinemethode getestet. Von diesen Proben reagierten 6 sowohl mit bioelisa als auch der Routinemethode, 5 davon wurden nach der Durchführung von zusätzlichen Tests für sonstige HBV-Marker als zurückliegende Infektion bestätigt, während 1 nur für Anti-HBc positiv ausfiel. Weitere 3 Proben waren wiederholt positiv mit bioelisa und negativ mit dem Routinetest, wobei 2 von ihnen nach Durchführung zusätzlicher Tests als falsch positiv und 1 als nicht eindeutiges Resultat eingestuft wurden. Wenn man die als zurückliegende Infektion bestätigten Proben als tatsächliche positive Befunde ansieht, lag die gefundene Spezifität bei 99,92% (5049/5053).

- Eine weitere externe Auswertung der Sensitivität am Endpunkt und Funktionieren mit Vergleich mit anderen handelsüblichen Versuchen, erscheint in der Literatur.3

Präzision

Intra-Assay Reproduzierbarkeit:

Die erhaltenen Variationskoeffizienten für die Extinktionswerte einer negativen Probe, die 48 Mal repliziert wurde, lagen bei 4,34%, 4,19% und 3,66% bei drei untersuchten Chargen.

Inter-Assay Reproduzierbarkeit:

Drei negative Proben unterschiedlichen Niveaus wurden in 3 verschiedenen Tests getestet. Die erhaltenen Variationskoeffizienten für das Verhältnis Extinktion/Schwellenwert der 3 Proben lagen bei 4,9%, 7,0% und 8,2%.

Interferenzen

Um mögliche Interferenzen zu prüfen, wurden Proben mit einem potenziellen Risiko zur Erzeugung von Kreuzreaktionen, wie etwa Seren mit positiven Rheumafaktor (RF), Anti-Nuklearen Antikörpern (ANA), heterophilen Antikörpern, IgM Anti-HAV, Anti-E. coli und von schwangeren Frauen getestet. Es wurden keine Hinweise auf Interferenzen beobachtet.

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bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung

Problem Mögliche

Ursachen

Lösung

1. Kontrollen außerhalb der Validierung.

1a. Temperatur, Inkubation oder Pipettieren falsch.

Methode überprüfen. Den Test wiederholen. 1b. Unsachgemäße Vorbereitung der Reagenzien, falsche Verdünnung. Reagenzien nicht richtig durchgemischt.

Methode überprüfen. Den Test wiederholen.

1c. Kreuzkontamination

zwischen Kontrollen. Sorgfältig pipettieren. Die Reagenzflascheverschlüsse nicht vertauschen. Den Test wiederholen.

1d. Falscher Lesefilter. Überprüfen, ob ein Lesefilter der Wellenlänge 450 nm eingesetzt ist. Wird kein Referenzfilter mit 620-630 nm eingesetzt, dann erhöht sich die Extinktion um ca. 0,050.

1e. Interferenz in der Optik. Das Messgerät überprüfen. Den Grund der Vertiefungen reinigen oder trocknen. Prüfen, ob Luftblasen eingeschlossen sind. Die Ablesung wiederholen. 1f. Es wurden Komponenten

aus unterschiedlichen Chargen verwendet.

Keine Komponenten aus unterschiedlichen Chargen mischen, da diese spezifisch für jeden Chargen

zusammengestellt sind.

1g. Reagenzien abgelaufen. Verfallsdatum des Kits prüfen. Ein abgelaufenes Kit nicht mehr verwenden.

2. Keine oder nur schwache Färbung am Ende des Tests.

2a. Ein Reagenz oder mehrere nicht oder in der falschen Reihenfolge hinzugefügt.

Methode überprüfen. Den Test wiederholen.

2b. Konjugat inaktiv:

unsachgemäße Konservierung.

Prüfen, ob es zu einer

Kontamination gekommen ist. Methode überprüfen. Den Test wiederholen.

2c. Mikrotiterplatte inaktiv:

unsachgemäße Konservierung.

Die nicht verwendeten Streifen sind immer im verschließbaren Folienbeutel zusammen mit dem

Trockenmittel aufzubewahren. Den Test wiederholen.

2d. Substrat inaktiv: unsachgemäße Konservierung oder Verdünnung, der verwendete Behälter beeinträchtigt die Stabilität des Substrats, Kreuzkontamination mit der Stopplösung.

Immer eine neu zubereitete TMB-Lösung im

Substratpuffer verwenden. Einwegbehälter verwenden oder die Behälter mit Säure oder Ethanol auswaschen und mit desionisiertem Wasser ausspülen. Methode überprüfen. Den Test wiederholen.

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bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung

Problem Mögliche

Ursachen

Lösung

3. Zu starke Färbung in allen Vertiefungen der Mikrotiterplatte.

3a. Substrat kontaminiert, oxidiert oder

unsachgemäß vorbereitet.

Prüfen, ob das vorbereitete Substrat farblos ist; bei Blaufärbung nicht mehr verwenden. Vor Verwendung das TMB prüfen und

sicherstellen, dass es vollkommen flüssig ist. Für eine vollständige

Durchmischung des TMB im Substratpuffer sorgen. Einweg-Reagenzgläser oder –Behälter verwenden oder diese mit Säure oder Ethanol auswaschen. Den Test wiederholen.

3b. Reagenzien kontaminiert

oder unsachgemäß zubereitet.

Auf Kontamination prüfen (Trübung). Verdünnungen prüfen. Den Test wiederholen.

3c. Waschlösung (1x)

kontaminiert.

Die Qualität des

destillierten/deionisierten Wassers zur Herstellung der Verdünnung prüfen. Den Test wiederholen.

3d. Waschen ungenügend

oder nicht konsistent: Füllmenge und/oder Aspirieren ungenügend oder nicht einheitlich, Anzahl der Waschzyklen ungenügend. Wascher kontaminiert.

Wascher prüfen. Die Vertiefungen bis zum Rand befüllen und vollständig aspirieren. Die Anzahl der Waschzyklen und die Einweichzeit erhöhen. Die umgekehrte Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen. Den Test wiederholen.

3e. Es wurde Waschlösung

von einem anderen Hersteller verwendet.

Nur die Waschlösung von biokit verwenden.

4. Schlechte

Reproduzierbarkeit oder erhöhte Anzahl reaktiver Proben, die sich nicht wiederholen.

4a. Probleme beim Waschen. Siehe Abschnitte 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetten schlecht kalibriert oder Pipettenspitzen nicht richtig eingesetzt. Unsachgemäße Pipettiertechnik.

Nur kalibrierte Pipetten mit richtig eingesetzten

Pipettenspitzen verwenden. Sorgfältig und ohne Blasen und Spritzer pipettieren. Den Test wiederholen.

4c. Reagenzien und Seren nicht auf Raumtemperatur oder vor Gebrauch nicht richtig gemischt.

Reagenzien und Seren auf Raumtemperatur bringen und vor Gebrauch gut mischen.

4d. Mikrotiterplatten während der Inkubationen der Zugluft ausgesetzt.

Die Mikrotiterplatte vor Zugluft geschützt lagern.

4e. Zuviel Zeit bei der Zugabe von Proben und/oder Reagenzien. Inkonsistente

Zeitintervalle. Luftblasen.

Eine einheitliche und konsistente Technik entwickeln.