UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE ECOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE BACHARELADO
AVALIAÇÃO DA FERTILIDADE E SENSIBILIDADE DE
Daphnia similis (CRUSTACEA, CLADOCERA)
SUBMETIDA A TRÊS DIFERENTES DIETAS.
Aline Cristina Beatrici
Porto Alegre
2001
AVALIAÇÃO DA FERTILIDADE E SENSIBILIDADE DE Daphnia similis (CRUSTACEA, CLADOCERA) SUBMETIDA A TRÊS DIFERENTES DIETAS.
ALINE CRISTINA BEATRICI
Dissertação apresentada ao Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas do Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como pré-requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas, Ênfase Ambiental.
Trabalho apresentado sob a forma de artigo a ser enviado a Revista Brasileira de Biologia.
Orientador(a): Prof. Dr. Maria Teresa Raya Rodriguez Coorientador: MSc. Alexandre Arenzon
Porto Alegre
2001
i
AVALIAÇÃO DA FERTILIDADE E SENSIBILIDADE DE Daphnia similis (CRUSTACEA, CLADOCERA) SUBMETIDA A TRÊS DIFERENTES DIETAS.
Aline Cristina Beatrici, Maria Teresa Raya Rodriguez, Alexandre Arenzon e Nade Janara Coimbra.
Centro de Ecologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, Brasil, CEP 91501-970 e-mail: aline@ecologia.ufrgs.br
Número de Figuras: 02
Key words: D. similis, chow, diet, sensitivity, Selenastrum capricornutum, fertility. Palavras-chave: D. similis, ração, dieta, sensibilidade, Selenastrum capricornutum, fertilidade.
Título Abreviado: Fertilidade e sensibilidade de D. similis expostas a três diferentes dietas.
ii
ABSTRACT
Daphnia is the oldest group used in toxicity tests (BAUDO, 1987). Amongst this group, the specie Daphnia similis had its biology widely studied and has being used for toxicity tests. Different conditions of culture, however, can influence in the productivity and sensitivity of the organisms. This study aims to evaluate the influence of different diets in the sensitivity and reproduction of D. similis. The cultures were kept in 250 mL beakers with 200 mL of water with ten individuals each, kept at 20°C, 16h/light and fed with three different food combinations with four replicate. A 1.5.105 cél./mL concentration of Selenastrum capricornutum was used as the first treatment (DIET A). In the second treatment (DIET B) all organisms were feed with artemia chow (Artemia sp) in the concentration of 13mg/L. In the third treatment (DIET C) a combination of algae and chow in the same previous concentrations was used. In each treatment the average of neonate/female was observed daily until the end of the life cycle. To each treatment, sensitivity tests to potassium dichromate were conducted according to NBR 12713 (ABNT, 1993). The females kept with artemia chow and with the combination of algae and the chow presented the best fertility results. A significative difference on the sensitivity presented by the organisms kept with algae and the others treatment was observed. The first one was more sensitive than the organisms kept with artemia chow and with the combination of algae and the chow.
iii
RESUMO
O gênero Daphnia é o grupo mais antigo utilizado em testes de toxicidade (BAUDO,1987). Dentre este grupo, a espécie Daphnia similis teve sua biologia amplamente estudada e vem sendo utilizada para testes toxicológicos. Diferentes condições de cultivo, no entanto, podem influenciar na produtividade e sensibilidade dos organismos. Este trabalho tem como objetivo, avaliar a influência de diferentes dietas na sensibilidade e na reprodução de D. similis. Foram realizados cultivos com dez indivíduos em béqueres de 250 mL com 200 mL de água de fonte natural, mantidos a 20°C, fotoperíodo de 16horas/luz e alimentados com três diferentes combinações de alimento com quatro réplicas cada. No primeiro tratamento foi utilizada a alga S. capricornutum na concentração de 1,5.105 céls./ml. O segundo tratamento foi alimentado com ração fermentada de artêmia (Artemia sp) na concentração de 13mg/L e o terceiro com uma combinação de alga e ração nas mesmas concentrações anteriores. Em cada tratamento observou-se diariamente o número médio de neonatos produzidos por fêmea até o fim do ciclo de vida. Paralelamente foram realizados testes de sensibilidade ao dicromato de potássio de acordo com a NBR 12713 (ABNT, 1993) para cada dieta. Os resultados obtidos quanto à fertilidade das fêmeas submetidas à dieta de ração e de combinação de alga e ração mostraram-se mais férteis do que as alimentadas apenas com alga. Quanto à sensibilidade observou-se uma diferença significativa entre os organismos cultivados apenas com alga, que se apresentaram mais sensíveis em relação aos cultivados somente com ração e com a combinação de alga e ração.
INTRODUÇÃO
O gênero Daphnia tem tido sua biologia amplamente estudada e diferentes espécies, tais como D. pulex, D. pulicaria, D. magna, D. similis vêm sendo cultivadas em laboratório e utilizadas em ensaios ecotoxicológicos (Green, 1955; Allan, 1976; Lei & Armitage, 1980; Fonseca, 1991; CETESB, 1992; Campagna, 1994; Pedrozo, 1995; Ferrão-Filho et al., 2000).
Atualmente, D. magna é um dos organismos zooplanctônicos mais utilizados em testes toxicológicos em vários países, com o objetivo de avaliar a toxicidade aguda de substâncias puras ou de descargas industriais de natureza complexa (Nikunen & Miettinem, 1985). No Brasil, D. similis, embora não sendo uma espécie nativa, vem sendo amplamente cultivada em laboratório e utilizada para testes de avaliação da toxicidade aguda embasando-se em normas padronizadas como a NBR 12713 (ABNT, 1993).
Existem diferentes normas que padronizam metodologias para realização de testes de toxicidade (IBAMA, 1990; CETESB, 1992; ABNT, 1993; EPA, 1993; OECD, 1993). Em relação aos cultivos, no entanto, são sugeridas diferentes combinações e concentrações de alimentos, assim como características da água de cultivo, que podem ser utilizadas de acordo com as condições e necessidades de cada laboratório.
Sabe-se que variáveis como a temperatura e dureza podem influenciar tanto no cultivo dos organismos quanto nos testes de toxicidade (Lewis & Maki, 1981; Persoone et al., 1989). Dentre todas as variáveis, no entanto, a dieta a qual os organismos são submetidos tem se mostrado como fator determinante no seu desenvolvimento (Kersting & Van der Leeuw, 1976; Lewis & Maki, 1981;
Venkataramen et al., 1986; Vijverberg, 1989; Lei et al., 1990; Kawbata & Urabe, 1998 ).
A importância na quantidade e qualidade do alimento fornecido pode ser avaliado através do número de filhotes produzidos nos cultivos, uma vez que a dieta pode influenciar diretamente na capacidade reprodutiva dos indivíduos (Hebert, 1978; Vijverberg, 1989).
A fertilidade, conforme Zagatto (1988), é um dos critérios que podem ser utilizados para avaliação da qualidade dos cultivos dos organismos que serão utilizados em testes de toxicidade, juntamente com o teor de lipídios acumulado nos organismos e a avaliação da sensibilidade a uma substância de referência.
O presente trabalho tem como objetivo analisar a influência de três diferentes dietas sobre a espécie D. similis, através da avaliação do número médio de neonatas produzidas por fêmea e da sua sensibilidade, utilizando dicromato de potássio como substância de referência.
MATERIAL E MÉTODOS
Os indivíduos da espécie D. similis, utilizados neste experimento, foram obtidos a partir de cultivos mantidos no laboratório de Ecotoxicologia da Universidade Federal do Rio Grande do sul há mais de seis anos, sendo a manutenção desses cultivos no laboratório realizados segundo CETESB, 1992.
Os organismos foram mantidos no laboratório, em béqueres de 1000 mL, em incubadoras com temperatura controlada de 20 ± 1ºC, com fotoperíodo de 16 horas-luz e intensidade luminosa de aproximadamente 1000Lux. A água utilizada, tanto para os cultivos quanto para diluição nos testes, foi de fonte natural (Porto Alegre, RS), com dureza ajustada entre 44 a 48 mg/L de CaCO3 e aerada por no mínimo 24
horas para saturação do oxigênio e total dissolução dos sais. No momento da montagem dos cultivos e dos testes de toxicidade o pH da água foi ajustado na faixa 7,2 - 7,6, e a condutividade e oxigênio dissolvido monitorados.
A alga utilizada como alimento foi S. capricornutum, uma alga clorofícea unicelular cultivada segundo EPA, 1993 e administrada para os cultivos na concentração de 1,5. 105 céls.mL-1.
Para o preparo da ração de artêmia digerida (Artemia sp.), uma porção de artêmia congelada foi lavada visando eliminar o sal contido. A massa de artêmia foi pesada, e para cada 80g de artêmia limpa adicionou-se 1000 mL de água destilada reconstituída com dureza entre 42 e 48 mg.L-1 de CaCO3., permanecendo sob
intensa aeração por sete dias para que o processo de decomposição aeróbica ocorresse. Após esse período, a ração foi colocada para decantar por 24 horas a 4ºC, e o sobrenadante sifonado e filtrado em uma malha de nylon de 120 µm de abertura. O precipitado e o material retido no filtro foram descartados. Desse sobrenadante filtrado retirou-se uma alíquota de 10 mL para a determinação do seu peso seco segundo CETESB, 1992 e seu resultado expresso em g.L-1.
A ração final foi obtida a partir da mistura de 10 mL de água destilada, com dureza previamente ajustada entre 42 à 48 mg/L de CaCO3, e a quantidade de
fermento biológico necessário para manter a relação de 0,5g de fermento para cada 2,5 g.L-1 em peso seco de Artêmia. Essa mistura foi agitada por 15 minutos. Acrescentou-se 100mL do sifonado de artêmia digerida e a mistura agitada por mais 15 minutos. Para este experimento, a ração obtida foi administrada aos organismos na concentração de 13 g/L.
Para a avaliação da influência do tipo de alimento sobre a reprodução de D.
receberam tratamentos diferentes, denominados Dieta A (apenas alga S.
capricornutum na concentração de 1,5. 105 céls/mL), Dieta B (ração na
concentração de 13 g/L), e Dieta C (combinação de alga, na concentração de 1,5. 105 céls/mL, e ração na concentração de 13 g/L).
A partir de um mesmo cultivo mantido com alga na concentração de 1,5. 105 céls/mL, e ração na concentração de 13 g/L, foram separados 150 indivíduos e divididos em um grupo de 50 indivíduos para cada dieta. Após 24 horas de exposição a cada dieta, os indivíduos de cada tratamento foram divididos em quatro réplicas de dez indivíduos, dispostos em béqueres de 250 mL com 200 mL de água de cultivo nas mesmas condições e concentrações de alimento descritas anteriormente para cada dieta. Estas primeiras réplicas foram denominadas de P0.
Na terceira postura da geração P0 de cada dieta, separou-se 50 neonatas, que foram novamente divididas em quatro réplicas, originando a geração F1. O mesmo foi realizado para a formação da F2. Em todas as gerações os indivíduos que restaram foram descartados.
Diariamente foram contados os números de filhotes e fêmeas vivas em cada béquer para que se estimasse o número médio de neonatas por fêmea. Os filhotes foram descartados.
A fertilidade de D. similis foi estimada a partir do número médio de neonatas por fêmea viva e os dados analisados estatisticamente comparando-se o número médio total de neonatas produzidas no período de vinte e um dias entre as diferentes dietas e ao longo das gerações. O período de 21 dias foi usado como referência por se tratar do tempo máximo de permanência dos cultivos em laboratório e por ser o tempo de duração do teste crônico para algumas espécies de
Dafinídeos (OECD, 1993) onde a reprodução é uma das principais variáveis analisadas.
A análise dos dados de fertilidade foi realizada através do teste estatístico de Tukey e de Kruskal-Wallis, para dados paramétricos e não paramétricos, respectivamente, através da utilização do software TOXSTAT 3.3 computer Program (Gulley et al., 1991).
Para cada dieta, em cada geração, foram realizados três testes de sensibilidade, exceto na F2 onde foram realizados apenas dois. Todos os testes foram realizados segundo CETESB, 1992, e utilizaram o dicromato de potássio como substância de referência, nas concentrações de: 0,01 - 0,02 - 0,04 - 0,085 - 0,17 - 0,35 mg/L, cada concentração com quatro réplicas, com cinco indivíduos, totalizando 20 organismos expostos em cada concentração. Os valores de EC50; 24h (concentração efetiva que provoca imobilidade e/ou mortalidade de 50%
dos organismos no período de 24horas) foram determinados através do teste estatístico Trimed Spearman Karber (Hamilton et al., 1977) ou o método das Probitas. A comparação dos valores de sensibilidade entre as dietas e entre as gerações foram realizadas através dos testes estatísticos de Tukey e Kruskal-Wallis através da utilização do software TOXSTAT 3.3 computer Program (Gulley et al., 1991).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Comparando estatisticamente, até o 21º dia, a fertilidade de D. similis diferiu entre as três dietas em todas as gerações avaliadas. O número médio de neonatas produzidos por fêmea na dieta A foi significativamente menor (α = 0,05) que o
número médio de neonatas por fêmea produzidas na dieta B e ambas foram significativamente menores que o número médio de filhotes produzidos na dieta C (Figura 1 ).
Os organismos alimentados somente com a alga S. capricornutum (DIETA A) reproduziram-se significativamente menos do que os expostos as demais dietas, o que pode indicar um estado de desnutrição do organismo. A influência da qualidade e quantidade de alimento sobre a reprodução de dafinídeos tem sido discutida, segundo Herbert (1978) é comum observar indivíduos adultos não reprodutivos sob uma dieta insuficiente. O uso de S. capricornutum como única fonte de alimento para dafinídeos em cultivos de laboratório, segundo Vijverberg (1989), pode não ser adequado, uma vez que por estar sujeita a uma rápida sedimentação suas células podem ficar indisponíveis para os organismos na coluna d’água. Lewis & Maki (1981), comparando indivíduos de D. magna quando submetidos a três diferentes dietas (ração de truta e alfafa, S. capricornutum mais ração de truta e alfafa e somente S. capricornutum) constataram que a menor produtividade ocorreu nos organismos que receberam somente S. capricornutum como alimento.
A utilização de ração de artêmia como alimento único (DIETA B) resultou em um melhor desempenho reprodutivo de D. similis quando comparada com a utilização de somente S. capricornutum. O mesmo resultado foi obtido por Platte (1993) ao avaliar a utilização de diferentes combinações de alimento para
Ceriodaphnia dubia, que observou que organismos recebendo apenas ração de
artêmia como alimento reproduziram significativamente melhor do que os alimentados com a alga S. capricornutum.
A Dieta C, combinação de alga e ração, apresentou a maior taxa de reprodução deste experimento. Lewis & Maki (1981), ao exporem D. magna a uma dieta de S.
capricornutum mais ração de truta e alfafa, observaram uma reprodução 70% maior
do que quando alimentadas somente S. capricornutum ou somente com ração. É importante ressaltarmos que nesta dieta alterou-se não somente a qualidade como também a quantidade de alimento disponibilizado para os organismos. Segundo Lei
et al. (1990), até um certo limite, quanto maior a quantidade de alimento fornecida
para D. similis maior a sua taxa de ingestão, aumentando os níveis de energia disponíveis para o organismo.
Quando expostos a uma dieta diferente, em quantidade e qualidade, da dieta a que vinham sendo submetidos, os organismos diminuíram o número de filhotes produzidos por fêmea ao longo das gerações. Na dieta B, a diferença significativa entre P0 e as demais gerações indicam uma possível influência da energia armazenada das mães na prole dos filhotes, ao longo das gerações. Vijverberg (1989) ao analisar a influência do estado nutricional da mãe sobre a prole gerada observou que as condições dos neonatos podiam ser afetadas pelo nível de alimento presente no meio em que suas mães foram cultivadas. No presente experimento, quando mantida a mesma dieta dos cultivos em laboratórios (DIETA C) não foi observada diferença no número de filhotes produzidos ao longo das gerações (Figura 2).
A tabela I apresenta o número médio de neonatas produzidas por fêmea no período de vinte e um dias ao longo das três diferentes gerações observadas. Apenas na F1 da Dieta A o coeficiente de variação dos dados (CV) foi elevado (85%). Essa variação poderia ser explicada pela morte precoce das fêmeas em duas réplicas do cultivo na geração F1.
Quanto a sensibilidade, a análise estatística realizada demonstrou não haver diferença estatisticamente significativa (α = 0,05) entre os valores de EC50; 24h
encontrados para as três gerações (P0, F1 e F2) de D. similis expostas ao dicromato de potássio. Os resultados dos testes de sensibilidade realizados com organismos expostos a cada uma das dietas são apresentados na Tabela II.
Os organismos submetidos a uma dieta com apenas S. capricornutum obtiveram uma maior sensibilidade à substância testada diferindo significativamente dos organismos alimentados apenas com ração e os alimentados com alga e ração, mostrando a influência da dieta na sensibilidade do organismo.
Embora vários trabalhos tenham sido realizados comparando a influência de diferentes alimentos sobre a reprodução de dafinídeos, poucos enfocaram a influência do mesmo sobre a sensibilidade dos organismos. Winner et al. (1977), observaram que o estado nutricional de Daphnia sp influenciou na toxicidade de substâncias químicas para os organismos, especialmente no teste crônico onde o crescimento e a reprodução foram avaliados.
CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos neste trabalho pode-se concluir que a qualidade e quantidade de alimento influenciaram a reprodução de D. similis quando cultivadas em laboratório.
Como alimento isolado, nas concentrações utilizadas, S. capricornutum promoveu a menor eficiência reprodutiva dos organismos.
A ração de artêmia, utilizada neste experimento, mostrou-se um alimento eficiente em manter um bom nível de fertilidade, suficiente para atender o número de filhotes necessários para a utilização em testes de toxicidade.
O maior desempenho reprodutivo, no entanto, foi obtido com a combinação de ração de artêmia com S. capricornutum
Desta forma, sugere-se a utilização da ração de artêmia, descrita neste trabalho, como alimento isolado ou em complemento a uma dieta a base de algas. Entretanto, novos trabalhos devem ser desenvolvidos a fim de definir as melhores concentrações destes alimentos.
Quanto a sensibilidade não se pode afirmar que os organismos alimentados apenas com alga mostraram-se mais sensíveis ao dicromato de potássio unicamente como indicativo de sua toxicidade, ou influenciado por um estado de subnutrição dos organismos por conseqüência da dieta a que vinham sendo submetidos.
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Maria Teresa Raya Rodriguez, Alexandre Arenzon e Nade Janara Coimbra, pela ajuda e apoio sempre que necessário e aos amigos e colegas do laboratório de Ecotoxicologia, Duda, Carina, Cris, Lúcia, Marianna, André e Régis pela colaboração e paciência em momentos importantes.
Em especial aos amigos Nade Janara e Alexandre Arenzon pela ajuda e incentivo no desenvolvimento e conclusão do presente trabalho.
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0 50 100 150 200 250 300 A
B C
Dietas
Nº médio de neonatas por fêmea no período de 21 dias
F2 F1 P0
Figura 1- Comparação entre o número médio de neonatas produzidas por fêmea de
D. similis entre as três dietas em cada geração no período de 21 dias.
0 50 100 150 200 250 300 P0 F1 F2 Gerações
Nº médio de neonatas por fêmea no período de 21 dias
Dieta C Dieta B Dieta A
Figura 2- Comparação entre o número médio de neonatas produzidas por fêmea de
Tabela 1- Número médio de neonatas produzidas por fêmea de D. similis (em cada réplica) no período de 21 dias ao longo de diferentes
gerações quando exposta a três deferentes dietas.
Dieta A Dieta B Dieta C
P0 F1 F2 P0 F1 F2 P0 F1 F2 81 100 51 179 140 97 283 244 351 Réplica s 71 12 88 203 116 114 286 293 265 81 110 17 80 53 59 215 190 122 125 120 87 264 309 255 262 293 289 Média 85 52 62 196 126 122 285 263 299 DP 16,84 44,39 17,17 15,62 10,21 25,28 18,44 21,02 36,49 CV(%) 19,64 84,96 27,37 7,97 8,10 20,72 9,96 7,97 12,18
Tabela 2- Valores de EC50; 24h ao Dicromato de Potássio dos testes de
sensibilidade realizados com os organismos submetidos as três dietas alimentares em cada geração.
EC5024h
Teste Dieta A Dieta B Dieta C
1º P0 0,170 0,220 0,230 2º P0 0,144 0,190 0,263 3º P0 0,135 0,265 0,270 1º F1 0,180 0,227 0,230 2º F1 0,144 0,263 0,280 3º F1 0,200 0,320 0,270 1º F2 0,142 0,332 0,305 2º F2 0,110 0,300 0,245 Média EC (50) 24h 0,153 0,265 0,262 Desvio Padrão 0,028 0,050 0,026 CV(%) 18,30 18,86 9,92
