PROGAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES
FARMACOLÓGICAS DE
DIFERENTES ESPÉCIES DE
LYCHNOPHORA UTILIZADAS
PELA POPULAÇÃO
Aluna: Luciana Souza Guzzo
Orientadora: Profa. Dra. Andrea Grabe Guimarães
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
G993a Guzzo, Luciana Souza.
Avaliação de atividades farmacológicas de diferentes espécies de Lychnopharas utilizadas pela população [manuscrito] / Luciana Souza Guzzo. - 2007.
xviii, 99f.: il., color.; tabs., grafs.
Orientadora: Profª. Andréa Grabe Gumarães.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica estrutural e fisiológica.
Dedico esse trabalho:
Aos meus pais, Luiz Carlos e Josélia, pelo apoio e incentivo constantes e incondicionais e pelo exemplo de vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que colaboraram para a realização e concretização desse trabalho, em especial:
À Prof. Andréa por ter me dado oportunidade de sua orientação, pela amizade, carinho e ensinamentos e pelo bom exemplo de pessoa e de competência e dedicação no trabalho.
“Você que com simplicidade e paciência me ensinou a gostar da ciência, a ter ética na pesquisa e principalmente proporcionou-me um grande crescimento pessoal e profissional. Pelas palavras de otimismo e compreensão nos momentos necessários, pelo respeito e confiança a mim concedidos e pela ótima convivência durante todos estes anos minha eterna gratidão.”
À Prof. Dênia Saúde Guimarães pela orientação de importante parcela desse trabalho, pela amizade, pelo convívio agradável e solidariedade.
Ao Prof. Homero Nogueira Guimarães pelo desenvolvimento do sistema de aquisição e de análise de dados dos parâmetros cardiovasculares.
À Prof. Vanessa Mosqueira pela ajuda na descoberta do solvente para o extratos, pelas colaborações importantes no desenvolvimento do trabalho e pela disponibilização dos aparelhos e equipamentos do Laboratório de Desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia da Escola de Farmácia da UFOP.
Às Prof. Carla Penido e Neila Barcellos pela ótima convivência e pelas valiosas contribuições em todos os momentos desse trabalho.
Ao Prof. Luis Fernando por está sempre disposto a ajudar.
Ao Prof. Mauro Martins Teixeira e o doutorando Flávio Amaral pela grande receptividade no laboratório de Imunofarmacologia da UFMG e pela disponibilização do pletismômetro para validação da metodologia do teste de edema de pata.
Ao Prof. Júlio Lombardi pela identificação das espécies de Lychnophora.
Aos professores da Escola de Farmácia e ICEB, pela convivência, incentivo e apoio durante todos esses anos.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFOP pelos ensinamentos dispensados.
Ao Cláudio e à Cristina funcionários do Biotério Central por disponibilizarem os animais sempre com presteza e ao Wilson por trazer os animais do Biotério Central para a Escola de Farmácia e cuidar dos mesmos.
Aos funcionários da Escola de Farmácia: Acássio, Cida, Conceição, Toninho, Carla..., pelo agradável relacionamento no dia-a-dia e pela presteza em ajudar.
À Cida, secretária do NUPEB, pela competência no trabalho e pela disponibilidade em ajudar sempre que necessário.
À PROPP pela bolsa de Iniciação Científica fundamental para o desenvolvimento inicial desse trabalho.
À Marina aluna de Iniciação Científica pelas valiosas contribuições na realização de alguns experimentos e na extração das espécies de Lychnophora.
Aos amigos do Laboratório de Farmacologia Experimental: Lorena, Alessandra, Priscila, Milton, Franciele, Aryane e Dani e aos amigos que passaram pelo laboratório: Suzana, Gabriella, Mariana, Paty, Max e Naira pela ótima convivência, amizade, companheirismo e pela colaboração em algum momento da realização desse trabalho.
À Elaine, aluna de mestrado que passou pelo laboratório, pelas contribuições ao longo desse trabalho e pelos seus bons exemplos.
Aos colegas de Pós-graduação pela amizade, aprendizado e pelos momentos legais vividos.
Às irmãs da República Bem-te-Vi pelos momentos de alegria e pelo apoio, em especial à Maísa pela força no ingresso à pós-graduação e por compartilhar de muitos momentos durante o curso.
Às amigas Jô e Fla pela grande amizade, apoio, incentivo e compreensão. Obrigada pelos momentos alegres vividos no dia-a-dia e por me tornarem muito mais feliz. Sentirei saudades...
Aos amigos da República Kome Keto pelo companheirismo, acolhimento e pelos momentos felizes compartilhados.
Aos meus pais Josélia e Luiz Carlos, pela dedicação e doação e por suas lições e sábios conselhos. Obrigada pelos exemplos de caráter, humildade, persistência e coragem e por jamais medirem esforços para esse momento acontecer. Vocês são minha fortaleza, meu esteio e fonte inesgotável de sabedoria.
Ao meu irmão e amigo Alfredo pela força e alegria transmitidas nas horas certas.
Ao Pablo pelos momentos maravilhosos que passamos juntos, pelo conforto nas horas difíceis, companheirismo, cumplicidade, carinho e motivação constantes.
À UFOP pela oportunidade e conhecimentos adquiridos
À Ouro Preto, minha escola de vida, pela acolhida, aprendizado, momentos inesquecíveis e grandes amigos aqui conquistados.
“Que eu encontre luz aonde eu vá como encontrei por aqui, e nessas lembranças, coragem para seguir em frente”.
RESUMO
As espécies do gênero Lychnophora são plantas nativas do Brasil, popularmente conhecidas como “arnica” e utilizadas na medicina popular como analgésico e antiinflamatório. Os extratos etanólicos de seis espécies de Lychnophora foram avaliados após a administração oral em camundongos quanto ao efeito antinociceptivo no método da placa quente e no método de contorções induzidas pelo ácido acético e quanto ao efeito antiinflamatório tópico no método de edema de pata induzido pela carragenina. No método da placa quente, os extratos etanólicos das espécies L. pinaster na dose 0,75 g/kg e L. ericoides na dose 1,50 g/kg aumentaram significativamente a variação do tempo de latência para lamber as patas. Os extratos de L. passerina, L. candelabrum e L. pinaster na dose 0,75 g/kg e de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) reduziram significativamente o número de contorções induzidas pelo ácido acético. A administração das pomadas de L. pinaster e L. trichocarpha em ambas concentrações avaliadas (5 e 10%) e de L. passerina e L. candelabrum 10% reduziram significativamente o edema de pata mensurado 3 h após a administração subplantar de carragenina 0,1%, evidenciando pela primeira vez a atividade antiinflamatória tópica de espécies de Lychnophora. O método de mensuração do edema de pata pelo paquímetro foi validado mostrando-se tão efetivo quanto o método de mensuração pelo pletismômetro.
Com o objetivo de detectar reações adversas advindas da administração oral de extratos de L. ericoides e L. trichocarpha, os mesmos foram avaliados quanto à atividade sobre o sistema nervoso central, antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções, no método do campo aberto, que avalia a atividade locomotora e capacidade exploratória dos animais e nos métodos de haste girante e tração, os quais avaliam a coordenação motora e força muscular dos animais, respectivamente. No método do campo aberto, os extratos etanólicos de L. ericoides (1,50 g/kg) em 1 h, de
animais, evidenciada pela redução significativa do número de vezes que o animal levanta em 5 min. A redução da locomoção espontânea tal como da capacidade exploratória em relação ao grupo controle são indicativas de atividade sedativa desses extratos. Os extratos de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) e em todos os tempos avaliados não causaram alteração significativa da coordenação motora e tônus muscular dos animais.
Além da avaliação da atividade sobre o SNC, no presente estudo para melhor estabelecer a segurança terapêutica do extrato de L. ericoides, a espécie mais utilizada pela população, a atividade cardiovascular foi avaliada de 90 a 120 min após sua administração por via oral. Os resultados demonstraram que o extrato de L. ericoides na dose 1,50 g/kg, causou aumento da pressão arterial sistólica e diastólica e da freqüência cardíaca dos animais.
ABSTRACT
The Lychnophora genus species are native plants from Brazil, popularly known as “arnica” and used in the folk medicine as analgesic and anti-inflammatory. The antinociceptive activity of the etanolic extracts of six species of Lychnophora were evaluated in the hot-plate test and in the acetic acid-induced writhing test and the anti-inflammatory topical activity were evaluated in the carrageenan-induced paw oedema test. In the hot-plate test the etanolic extracts of L. pinaster (0.75 g/kg) and L. ericoides (1.50 g/kg), significantly increased the variation of the latency time for licking of the paws. The extracts of L. passerina, L. candelabrum and L. pinaster in the dose 0.75 g/kg and of L. ericoides and L. trichocarpha in both doses evaluated (0.75 and 1.50 g/kg) significantly decreased the number of writhes induced by acetic-acid. The topical administration of L. pinaster and L. trichocarpha in both concentrations evaluated (5 and 10%) and of L. passerina and L. candelabrum 10%, significantly reduced the paw oedema measured 3 h after the subplantar injection of carrageenan 0.1%, evidencing for the first time the anti-inflammatory activity of the topical administration of Lychnophora species. The method of measurement of the paw oedema using a pakimeter were validated and showed that the pakimeter is so effective how the plethysmometer to measure the paw oedema induced by carrageenan.
compared to the control group were indicative of sedative effect. The extracts of L. ericoides and L. trichocarpha in both doses (0.75 and 1.50 g/kg) and in all times evaluated did not induce significant modification of the motor coordination and the muscular tone of the animals.
Beyond the evaluation of the activity on the SNC, in the present study to better establish the therapeutical security of the L. ericoides ethanolic extract, the specie most used by the population, its cardiovascular activity was evaluate from 90 to 120 min after its administration by oral route. The results demonstrated that the L. ericoides extract in the dose 1.50 g/kg increased the systolic and diastolic arterial pressure and the heart rate of the animals.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fotos das espécies L. ericoides (A), L. trichocarpha (B), L. pinaster (C) e L. passerina (D)...11
Figura 2: Extração vegetal: pulverização (A), extração por percolação (B) e evaporação com o uso de rotavapor (C)...24
Figura 3: Camundongo sobre a placa aquecida a 56 ± 1ºC...29 Figura 4: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre o tempo gasto para lamber as patas em camundongos...33
Figura 5: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre o número total de contorções induzidas pelo ácido acético em 30 min em camundongos...33
Figura 6: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras (A-F) e de fármacos padrão (G) sobre o número total de contorções induzidas pelo ácido acético contadas em períodos de 5 min por 30 min em camundongos...36
Figura 7: Mensuração do edema de pata com pletismômetro em camundongos...39 Figura 8: Variação percentual da espessura da pata medida com paquímetro em camundongos...46
Figura 9: Variação percentual da espessura da pata medida com pletismômetro em camundongos...46
Figura 10: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras na variação da espessura das patas medidas antes e 3 h após administração de carragenina 0,1% em camundongos...48
Figura 11: Camundongo no campo aberto (A), haste girante (B) e aparelho de tração (C)...56
Figura 12: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min analisado antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções...57
Figura 13: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre o número de vezes que o animal levanta em 5 min analisado antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções...58
Figura 15: Efeito dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides (A) e L. trichocarpha (B) sobre a força muscular dos animais avaliada no método de tração antes, 1, 2, 4 e 24 h após administração das soluções...61
Figura 16: Sistema de Aquisição de ECG e PA 1) Visão geral do sistema; 2) Visão de um animal com os eletrodos inseridos no tecido subcutâneo, indicados pela seta; 3) Registro de ECG e PA obtidos a partir do animal em experimentação...65
Figura 17: Esquema do protocolo experimental de avaliação da atividade cardiovascular...66
Figura 18: Traçado do ECG e PA de um rato Wistar apresentando os parâmetros analisados (RR, PAS e PAD)...67
Figura 19: Efeito do extrato etanólico de L. ericoides sobre a PAS (A), PAD (B) e FC (C) dos animais...70
LISTA DE QUADROS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Número de contorções induzidas pelo ácido acético em camundongos..37 Tabela 2: Variação percentual da espessura das patas dos animais...47 Tabela 3: Variação percentual do volume das patas dos animais...47 Tabela 4: Variação da espessura das patas dos animais após injeção de carragenina ou introdução da agulha na pata (sham) e tratamento tópico...49
Tabela 5: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o número de quadrados percorridos pelos animais em 5 min no método do campo aberto...59
Tabela 6: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o número de vezes que o animal levanta em 5 min no método do campo aberto...59
Tabela 7: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre o tempo de permanência do animal na haste girante...62
Tabela 8: Efeito dos extratos etanólicos de L. ericoides e L. trichocarpha sobre a força muscular dos animais no método de tração...62
SUMÁRIO
RESUMO ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS E QUADROS LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1. INTRODUÇÃO GERAL... 2
1.2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 6
1.2.1. Lychnophoras... 6
1.2.2. Inflamação e dor... 14
1.2.3. Toxicidade... 17
1.2.3.1. Atividade sobre o Sistema Nervoso Central... 17
1.2.3.2. Atividade Cardiovascular... 19
2. OBJETIVOS... 21
2.1. OBJETIVO GERAL... 22
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 22
3.METODOLOGIA GERAL... 23
3.1. MATERIAL VEGETAL... 24
3.2. EXTRAÇÃO VEGETAL... 24
3.3. PREPARO DAS SOLUÇÕES DOS EXTRATOS DE LYCHNOPHORAS 25
3.4. ANIMAIS EXPERIMENTAIS... 25
3.5. MATERIAIS... 26
3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 26
4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 29
5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA... 38
5.1. METODOLOGIA... 39
5.1.1. Validação da metodologia de mensuração do edema de pata... 39
5.1.2. Preparo das pomadas de Lychnophoras... 40
5.1.3. Método de edema de pata induzido pela carragenina... 40
5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 40
6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL... 50
6.1. METODOLOGIA... 51
6.1.1. Método do Campo Aberto... 51
6.1.2. Método da Haste Girante... 51
6.1.3. Método de Tração... 52
6.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 52
7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR... 63
7.1. METODOLOGIA... 64
7.1.1. Confecção de cateteres para implantação intravascular... 64
7.1.2. Procedimentos cirúrgicos... 64
7.1.3. Obtenção dos sinais de eletrocardiograma e pressão arterial... 64
7.1.4. Protocolo Experimental... 65
7.1.5. Análise dos Registros... 66
7.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 67
8. DISCUSSÃO GERAL... 72
9. CONCLUSÕES... 76
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 79
1.1. INTRODUÇÃO GERAL
No presente estudo foram realizados estudos farmacológicos de plantas do gênero Lychnophora, tipicamente brasileiras, que são conhecidas popularmente como “arnica” e amplamente utilizadas na medicina popular como analgésico e antiinflamatório (CERQUEIRA et al., 1987).
As plantas são fontes importantes de produtos biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para síntese de um grande número de fármacos. Pesquisadores da área de “produtos naturais” mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na natureza revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas (WALL & WANI, 1996). Acredita-se que os “produtos naturais” em geral e as plantas medicinais sejam importantes fontes de novas substâncias químicas biologicamente ativas com potencial aplicabilidade terapêutica (ELISABETSKY, 1986; FARNSWORTH, 1989; EISNER, 1990; ANDRADE et al., 2007) e há um interesse crescente em plantas como fonte de medicamentos (RATES, 2001). O estudo de constituintes bioativos de plantas se mostra promissor na descoberta de novas drogas. A investigação de plantas usadas como medicamentos na medicina tradicional pode ser uma ferramenta útil para identificar moléculas biologicamente ativas das mais de 250.000 espécies de plantas existentes (MBWAMBO et al., 1996). Apesar do aumento do número de estudos nessa área, os dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (SOEJARTO, 1996).
essas plantas ou preparações destas no que se refere à atenção primária à saúde (FARNSWORTH et al., 1985; BRASIL, 2006a). Ao lado disso, destaca-se a participação dos países em desenvolvimento nesse processo, já que possuem 67% das espécies vegetais do mundo. O Brasil possui grande potencial para o desenvolvimento da terapêutica utilizando “produtos naturais”, com a maior diversidade vegetal do mundo, ampla sociodiversidade, uso de plantas medicinais vinculado ao conhecimento tradicional e tecnologia para validar cientificamente esse conhecimento (BRASIL, 2006a). O mercado mundial atual de fitofármacos e fitoterápicos é da ordem de 9 a 11 bilhões de dólares por ano, sendo que mais de 13.000 plantas são mundialmente usadas como fármacos ou fonte de fármacos (TYLER, 1994). Outras estimativas revelam que o mercado mundial de produtos farmacêuticos movimenta 320 bilhões de dólares por ano, dos quais 20 bilhões são originados de substâncias ativas derivadas de plantas (ROBBERS et al., 1996).
seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, através principalmente da promoção do uso sustentável da biodiversidade, do desenvolvimento da cadeia produtiva e do fortalecimento da indústria farmacêutica nacional, estimulando a produção de fitoterápicos em escala industrial e incrementando suas exportações (BRASIL, 2006b), o que pode ajudar a superar a dependência externa.
plantas medicinais englobam os diferentes aspectos do cabedal de conhecimento necessário para que um novo medicamento fitoterápico possa ser registrado (LAPA et al., 2004).
1.2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.2.1. LYCHNOPHORAS
As espécies do gênero Lychnophora pertencem à família Asteraceae, uma das maiores famílias de plantas existentes, possuindo cerca de 2.000 gêneros e mais de 20.000 espécies cujos estudos conduziram a mais de 4.000 novos compostos (BRUNETON, 1995). Esse gênero compreende trinta e quatro espécies restritas ao cerrado brasileiro (ROBINSON, 1999). As Lychnophoras são plantas nativas do Brasil com ocorrência nos estados de Minas Gerais, Goiás e Bahia (CUNHA et al., 1995) e são popularmente conhecidas como “arnica”, “falsa arnica” ou “arnica da serra” devido ao odor semelhante à espécie européia Arnica montana L. (CERQUEIRA et al., 1987). Muitas espécies de Lychnophora são utilizadas na medicina popular brasileira imersas em água, etanol ou cachaça, como analgésico e antiinflamatório, no tratamento de contusões, reumatismo, feridas, coceira e picada de insetos (CERQUEIRA et al., 1987; SAÚDE et al., 1998; LOPES, 2001). A coleta indiscriminada das espécies de Lychnophora tem causado o declínio de suas populações, as quais já foram incluídas pela Sociedade Brasileira de Botânica na lista de plantas em perigo de extinção (IBAMA, 2005).
Muitas espécies de Lychnophora já foram objeto de estudo fitoquímico (SAÚDE, 1994), fornecendo terpenóides, esteróides e flavonóides como constituintes principais (BORELLA et al., 1992). Constituintes como poliacetilenos e lignanas que apresentam várias atividades biológicas (MACRAE & TOWERS, 1984), também foram relatados para algumas espécies deste gênero (BORSATO et al., 2000). As lactonas sesquiterpênicas presentes nas Lychnophoras são das classes furanoeliangolídeo, goiazensolídeo, eremantolídeo, guaianolídeo e eudesmanolídeo (BORELLA et al., 1992; ARAGÃO, 2003). A família Asteraceae é a maior fonte de lactonas sesquiterpênicas, constituintes esses que também apresentam várias atividades biológicas já descritas (PICMAN, 1986; RODRIGUEZ et al., 1986).
CANALLE et al., 2001), antimicrobiana (MIGUEL et al., 1996; SAÚDE et al., 1998; MACIEL, 2002), tripanossomicida (CHIARI et al., 1991; 1996; OLIVEIRA et al., 1996; JORDÃO et al., 1997; GRAEL et al., 2000; TAKEARA et al., 2003; JORDÃO et al., 2004; ALCÂNTARA et al., 2005; SILVEIRA et al., 2005b), antinociceptiva (CERQUEIRA et al., 1987; BORSATO et al., 2000; SANTOS et al., 2005) e antiinflamatória (AZEVEDO, 2004; FERRAZ FILHA et al., 2006) foram avaliadas (Quadro 1).
As Lychnophoras são típicas do cerrado e regiões áridas localizadas na parte central do Brasil, onde alta incidência de luz e raios UV bem como longos períodos de estiagem são característicos da região. Em geral, para adaptação em tais ambientes e para proteção, as plantas acumulam flavonóides que podem absorver luz UVB (TEVINI et al., 1991; KOOTSTRA, 1994). Estudo fitoquímico do extrato etanólico da espécie
L. passerina (Mart. ex. DC) Gardn., levou ao isolamento das lactonas sesquiterpênicas
15-deoxigoiazensolídeo e goiazensolídeo e de cinco flavonóides. Estudo da atividade antioxidante desses flavonóides demonstraram que quercetina, kaempferol e tiliroside são eficientes antioxidantes e por isso protetores contra raios UV (CHICARO et al., 2004). KANASHIRO et al. (2004) demonstraram que oito flavonóides das espécies L. granmongolense (Duarte) D.J.N. Hind, L. salicifolia Mart. e L. ericoides Mart. foram capazes de inibir a formação de espécies de oxigênio reativos por neutrófilos, estimulado por dois tipos de imunocomplexos em coelhos e que essa ação foi altamente dependente da estrutura dos flavonóides.
Lactonas sesquiterpênicas citotóxicas foram isoladas durante a busca por agentes antitumorais de origem natural. Neste processo, foi observado que a ocorrência de atividade citotóxica era muito comum e a atividade antitumoral ocorria em menor extensão (KUPCHAN et al., 1971). As lactonas sesquiterpênicas licnoforolídeos A e B isoladas de L. affinis Gardn. apresentaram atividades citotóxica e antitumoral (LÊ QUESNE et al., 1982) e as lactonas licnofolídeo e eremantolídeo C isoladas de
L. trichocarpha também demonstraram atividade antitumoral contra trinta e três e
dezoito linhagens de células tumorais, respectivamente (SAÚDE, 1994). Flavonóides isolados do extrato etanólico das folhas e tronco de L. affinis também apresentaram atividade antitumoral em cultura de células de carcinoma nasofaríngeo humano (LÊ QUESNE et al., 1976). HERZ & GOEDKEN (1982) demonstraram a atividade citotóxica do goiazensolídeo isolado de L. passerina e CANALLE et al. (2001) do licnofolídeo, lactona sesquiterpênica já isolada de L. ericoides (SAKAMOTO et al., 2003) e L. trichocarpha (OLIVEIRA et al., 1996).
Na busca de novos agentes profiláticos para doença de Chagas, foi feita uma triagem de trinta “produtos naturais” in vivo e in vitro contra as formas tripomastigotas de Trypanossoma cruzi e dentre eles o extrato etanólico das partes aéreas de
L. villosissima Mart. e a lactona sesquiterpênica 15-deoxigoiasenzolídeo isolada desse
extrato apresentaram atividade (CHIARI et al., 1991). Esse foi o primeiro relato de atividade tripanossomicida de lactona sesquiterpênica, o que estimulou a triagem de espécies da família Asteraceae. Várias espécies de plantas dessa família foram então avaliadas e dentre elas as espécies L. pinaster Mart., L. passerina e L. trichocarpha, na forma de extrato etanólico, lisaram 100% das formas tripomastigotas in vitro e in vivo (CHIARI et al., 1996). O fracionamento dos extratos brutos dessas três espécies de
Lychnophora levou ao isolamento de quatro substâncias com atividade
tripanossomicida: o ácido licnofóico e as lactonas goiazensolídeo, erematolídeo C e licnofolídeo (OLIVEIRA et al., 1996). O ácido licnofóico e seus derivados ésteres e álcoois (ALCÂNTARA et al., 2005) e os extratos acetato de etila das partes aéreas de
L. salicifolia (JORDÃO et al., 1997) e de L. granmongolense (GRAEL et al., 2000;
e das lactonas sesquiterpênicas centraterina e goiazensolídeo (GRAEL et al., 2000). Centraterina e goiazensolídeo causaram lise total dos parasitas e, apesar do goiazensolídeo ter sido ativo em menor concentração, apresentou atividade hemolítica (GRAEL et al., 2000). O extrato metanólico das folhas de L. staavioides Mart. mostrou atividade com 98,8% de lise das formas tripomastigotas na concentração de 4 mg/ml. Esse extrato foi fracionado fornecendo flavonóides dos quais o mais ativo foi a quercetina 3-metil éter (TAKEARA et al., 2003). Do extrato hexânico e diclorometânico das partes aéreas de L. pinaster foram isolados misturas de hidrocarbonetos homólogos (DUARTE, 1999), triterpenos, ácidos graxos, ácido licnofóico, quercetina e 15-deoxigoiazensolídeo (SILVEIRA et al., 2005a) e do extrato aquoso foram isolados os seguintes compostos: ácido cafeico, ácido isoclorogênico, vitexina, isovitexina e quercetina (SILVEIRA et al., 2005b). A despeito do extrato bruto de L. pinaster ter lisado 100% das formas tripomastigotas de T. cruzi (SILVEIRA et al., 2005b), nessa concentração causou lise das células sanguíneas provavelmente devido à presença de saponinas, já detectadas nas partes aéreas de L. pinaster (DUARTE, 1993).
Os extratos etanólicos de L. pinaster e L. pseudovillosissima Semir & Leitão, não demonstraram atividade contra moluscos da espécie Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário do Schistosoma mansoni, em uma triagem que foi realizada de sessenta e seis espécies da família Asteraceae (MENDES et al., 1999). Entretanto, o goiazensolídeo isolado de L. passerina já foi relatado como um agente moluscicida (VICHNEWSK, 1976).
Recentemente, FERRAZ FILHA et al. (2006) revelaram que os extratos brutos das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e
L. trichocarpha possuem alta atividade inibitória da enzima xantina oxidase,
outro lado, o extrato aquoso da mesma espécie não demonstrou inibição significativa da enzima 5-lipooxigenase (LOX) (SILVEIRA et al., 2005b), talvez devido à baixa lipoficidade dos constituintes presentes nesse extrato (PANTHONG et al., 1994).
Entre as espécies de Lychnophora, a espécie L. ericoides é a mais utilizada pela população. Investigação fitoquímica do extrato apolar de suas folhas apresentou como constituintes as lactonas sesquiterpênicas, centraterina, 15-desoxigoiazensolídeo e licnofolídeo, (SAKAMOTO et al., 2003) e flavonóides (BORELLA et al., 1998) e das raízes foram extraídas as lignanas (BORSATO et al., 2000). O extrato diclorometânico das raízes de L. ericoides, do qual foram extraídas 10 lignanas, apresentou atividade antinociceptiva significativa demonstrada no método de contorções induzidas pelo ácido acético. Entre as lignanas isoladas, a metilcubebina e a cubebina foram as mais ativas (BORSATO et al., 2000). SANTOS et al. (2005) demonstraram que a fração n-butanólica do extrato das raízes de L. ericoides e os ácidos 3,5- e 4,5-di-O-[E]- cafeoilquínicos isolados dessa fração também apresentaram atividade antinociceptiva demonstrada no método de contorções. Além dos extratos das raízes, os extratos aquosos das folhas e tronco de L. ericoides também apresentaram atividade antinociceptiva demonstrada no método da placa quente (CERQUEIRA et al., 1987). A investigação fitoquímica do extrato polar de L. ericoides apresentou como constituintes o 6,8-di-C- -glucosilapigenina e o novo composto 6,8-di-C- -glucosilcrisina. Para o primeiro foi demonstrada atividade antiedematogênica no método de edema de pata induzido pela carragenina em ratos (GOBBO-NETO et al., 2005).
Do extrato de folhas secas de Lychnophoriopsis candelabrum (Schultz-Bip.) H.
Robinson foram isolados três triterpenos e cinco flavonóides (SANTOS et al., 2004),
entretanto essas substâncias ainda não tiveram as atividades farmacológicas estudadas. Essa espécie era conhecida como Lychnophora candelabrum Sch. Bip. e foi reclassificada por ROBINSON (1992) como sendo do gênero Lychnophoriopsis. Entretanto como essa espécie, típica da Serra do Espinhaço do estado de Minas Gerais, era classificada dentro do gênero Lychnophora, foi incluída no presente estudo como tal.
farmacológicas para essas espécies e seus constituintes químicos já foram descritas na literatura. Além disso, embora tenham sido realizados estudos de atividade antinociceptiva e antiinflamatória de espécies do gênero Lychnophora nenhum deles avaliou tais atividades comparativamente in vivo, ressaltando assim mais uma vez a importância do presente estudo.
Figura 1: Fotos das espécies L. ericoides (A), L. trichocarpha (B), L. pinaster (C) e L. passerina (D).
C
A
B A
Quadro 1: Atividades farmacológicas e biológicas de espécies de Lychnophora e de seus constituintes
Espécies Constituintes Atividade Referência
L. passerina quercetina, kaempferol e tiliroside
antioxidante Chicaro et al., 2004
L. granmongolense, L. salicifolia e L. ericoides
oito flavonóides antioxidante Kanashiro et al., 2004
L. trichocarpha licnofolídeo, 1 2,3-dihidrolicnofolídeo, 1 -hidroxi-2,3-dihidroeremantolídeo C e 3’hidroxieremantolídeo C
antibacteriana Saúde et al., 2002
L. salicifolia ácido acetil licnofólico
antimicrobiana Miguel et al., 1996
L. ericoides extrato antibacteriana Maciel, 2002
L. affinis licnoforolídeos A e B citotóxica e antitumoral
Lê Quesne et al., 1982
L. trichocarpha licnofolídeo e eremantolídeo
antitumoral Saúde, 1994
L. affinis flavonóides antitumoral Lê Quesne et al.,1976
L. passerina goiazensolídeo citotóxica Herz & Goedken, 1982
L. villosissima extrato e
15-deoxigoiasenzolídeo isolado desse extrato
tripanossomicida Chiari et al., 1991
L. pinaster, L. passerina e L. trichocarpha
extrato tripanossomicida Chiari et al., 1996
L. pinaster, L. passerina e L. trichocarpha
ácido licnofóico,
goiazensolídeo, erematolídeo C e licnofolídeo
tripanossomicida Oliveira et al., 1996
L. salicifolia extrato tripanossomicida Jordão et al., 1997
L. granmongolense extrato, quercetina-7,3’,4’- trimetil éter, ácido licnofólico
tripanossomicida Jordão et al., 2004
L. granmongolense extrato, centraterina e
goiazensolídeo tripanossomicida Grael et al., 2000
L. staavioides extrato e quercetina 3-metil éter tripanossomicida Takeara et al., 2003
L. pinaster extrato tripanossomicida Silveira et al., 2005b
L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha
extrato antireumática Ferraz Filha et al., 2006
L. pinaster extrato antinociceptiva,
antiedematogênica e antiinflamatória
Azevedo, 2004
L. ericoides extrato, metilcubebina e a
cubebina antinociceptiva Borsato et al., 2000
L. ericoides extrato e ácidos 3,5- e
4,5-di-O-[E]- cafeoilquínicos antinociceptiva Santos et al., 2005
1.2.2. INFLAMAÇÃO E DOR
Muitas plantas medicinais têm sido investigadas como o objetivo da descoberta de novas drogas ou como modelos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e dentre essas muitas são conhecidas popularmente por suas propriedades antiinflamatória e analgésica (BOHLIN, 1995).
A busca de novos compostos analgésicos (MATTISON et al., 1988) e antiinflamatórios (VERPOORTE, 1999) tem sido prioridade das indústrias farmacêuticas há algum tempo. Dois principais fatores são determinantes nesse interesse: primeiramente compostos analgésicos ou antiinflamatórios, tais como os opióides, antiinflamatórios esteroidais (AIEs) e não esteroidais (AINEs), ainda apresentam uma variedade de efeitos colaterais abrindo espaço para novos e mais seguros compostos (MILLER et al., 1978; AHMADIANI et al., 1998; VELPOORTE, 1999); e em segundo lugar, o mercado internacional desses medicamentos é estimado em vários bilhões de dólares (FLOWER et al., 1985).
Inflamação é a resposta de um tecido vascularizado a um agente agressor. A reação inflamatória é caracterizada pela presença de rubor (eritema), calor (aumento de temperatura na região inflamada), tumor (edema), dor e perda da função do tecido afetado (PEREIRA, 2004).
As respostas vascular e celular da inflamação são mediadas por fatores químicos provenientes do plasma ou de células e desencadeados pelo estímulo inflamatório.
vascular para o local da inflamação quimiotaxicamente (JOHNSTON & BUTCHER, 2002). Os neutrófilos polimorfonucleares são o tipo celular predominante nos estágios iniciais da resposta (inflamação aguda). Caso o processo inflamatório persista, aumenta a migração de células mononucleares (monócitos e linfócitos) para o local, modificando o padrão do tipo celular prevalente.
O principal objetivo dos efeitos vasculares citados acima é facilitar o acesso de células e outros constituintes plasmáticos ao tecido lesado, onde são necessários para enclausurar, neutralizar, destruir e eliminar o agente agressor.
O desenvolvimento da resposta inflamatória aguda é mediado por citocinas, aminas vasoativas (histamina e serotonina), produtos de clivagem dos sistemas enzimáticos presentes no plasma (sistemas do complemento, da coagulação, das cininas e fibrinolítico), por mediadores lipídicos como prostaglandinas (PG), tromboxanos (TX), leucotrienos (LT) e fator de ativação plaquetário (PAF) e pelo óxido nítrico (NO) (FERREIRA, 2002). Os principais mediadores responsáveis pela vasodilatação durante a inflamação são histamina, serotonina, bradicinina, NO e PGE2, PGI2 e PGD2. A
interação de substâncias como as aminas vasoativas, a bradicinina e o PAF acarretam aumento da permeabilidade vascular (ver COLLINS, 2000; RANG et al., 2003).
Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IAPS) a dor é uma experiência desagradável, de natureza sensorial, cognitiva e emocional, associada ao dano tissular real ou potencial. A dor é uma experiência subjetiva incluindo um componente emocional, sendo que sua ocorrência só pode ser seguramente determinada quando ela é relatada. Apesar dos animais não apresentarem a capacidade de relatar a ocorrência de dor, eles exibem respostas comportamentais, através das quais podemos constatar a percepção do estímulo nociceptivo.
O estímulo lesivo ativa as fibras aferentes primárias que compreendem as fibras C amielinizadas de condução lenta, as Aδ mielinizadas de velocidade de condução intermediária. As fibras C estão associadas tanto aos nociceptores polimodais quanto aos nociceptores específicos para estímulos químicos, térmicos e mecânicos. As fibras Aδ estão associadas a mecanoreceptores (MEYER et al., 1994). As fibras aferentes primárias fazem conexão com neurônios que transmitem o estímulo ao SNC. O estímulo passa primeiramente pelo corno dorsal da medula espinhal e centros supraespinhais até atingir os centros córtico-límbicos (ver BESSON & CHAOUCH, 1987).
1.2.3. TOXICIDADE
As plantas medicinais utilizadas como medicamentos podem ser consideradas como xenobióticos, isto é, produtos estranhos ao organismo humano, nele introduzidos com finalidades terapêuticas. Como todo corpo estranho, os produtos de sua biotransformação são potencialmente tóxicos e assim devem ser considerados. Uma planta medicinal não pode ser considerada inócua, se do reino vegetal são obtidas substâncias extremamente tóxicas como, por exemplo, a estricnina, a digitoxina, os curares e os heterosídeos cianogênicos (LAPA et al., 2004). Nesse sentido, as plantas medicinais não se diferenciam de outros xenobióticos sintéticos e sua preconização, ou a autorização oficial do uso de plantas medicinais e registro de fitoterápicos deve ser fundamentada em evidências experimentais comprobatórias que demonstram que os riscos a que se expõem aqueles que as utilizam é suplantado pelos benefícios que possam advir (BRASIL, 1995). Diante disso, comprovada a eficácia de determinada planta medicinal, a mesma é submetida a estudos toxicológicos na etapa de estudos farmacológicos pré-clínicos, com intuito de avaliar sua segurança, ou seja, a relação risco/benefício. Com o objetivo de garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, o Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006, que aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, tem como uma de suas diretrizes criar e apoiar centros de pesquisas especializados em toxicologia de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2006b).
É nesse contexto, que o presente estudo, teve como objetivo além de determinar as atividades terapêuticas, a saber, atividade antinociceptiva e antiinflamatória de extratos etanólicos de seis espécies de Lychnophora, avaliar também a atividade sobre o SNC dos extratos de duas dessas espécies e a atividade cardiovascular de uma espécie.
1.2.3.1. ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL
por meio de mecanismos de transporte específicos (PARDRIDGE, 1988). Substâncias tais como triterpenos, lactonas sesquiterpênicas, constituintes encontrados nos extratos de Lychnophoras por serem lipofílicas têm potencial para atravessar por difusão passiva a barreira hematoencefálica.
De acordo com LANDRIGAN et al. (1992), o SNC tem como característica única entre outras, uma baixa capacidade regenerativa, ou seja, muitas de suas células não são capazes de multiplicar e uma vez danificadas essas células não podem ser substituídas. A toxicidade sobre o SNC merece então, grande atenção devido à sua irreversibilidade no que se refere à lesão celular.
Neurotoxicidade pode ser definida como a capacidade de um agente químico, biológico ou físico em causar uma reação adversa ou variação funcional ou estrutural no SNC. A avaliação de atividades sobre o SNC ou neurocomportamentais in vivo podem ser realizadas principalmente ao nível de atividades motora, cognitiva e sensorial, e constituem ferramentas relevantes, que em conjunto podem indicar a toxicidade de uma substância ou conjunto de substâncias sobre o SNC.
A atividade sobre o SNC in vivo de várias plantas já foi demonstrada tais como a do extrato de Cecropia obtusifolia (PÉREZ-GUERRERO et al., 2000), Clerodendrum phlomidis (MURUGESAN et al., 2001) e Nelumbo nucifera (MUKHERJEE et al., 1996) que causaram perda da coordenação motora e do tônus muscular de animais experimentais. A depressão da atividade motora de animais também já foi relatada como conseqüência da administração do extrato de Casimiroa edulis (MORA et al., 2005). Poucos estudos de atividade sobre o SNC foram realizados com espécies de Lychnophora. CERQUEIRA et al. (1987) relatou a redução da locomoção espontânea provocada pela administração oral do extrato hidroalcoólico de L. ericoides e AZEVEDO (2004) em estudos realizados com L. pinaster não constatou atividade relaxante muscular do extrato hidroalcoólico dessa espécie.
força muscular dos animais, respectivamente. O uso de vários métodos é importante, pois nenhum método é capaz de examinar todos os aspectos do sistema nervoso, sendo necessário o uso de vários métodos para indicar a neurotoxicidade de uma substância (LANDRIGAN et al., 1992).
1.2.3.2. ATIVIDADE CARDIOVASCULAR
Além da avaliação da atividade sobre o SNC, no presente estudo foi avaliada a atividade cardiovascular, mais especificamente a pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC) do extrato de L. ericoides, a mais utilizada na medicina popular, com o objetivo de determinar possíveis efeitos adversos dessa planta, para que assim seja estabelecida a sua segurança.
A pressão arterial (PA) é definida como aquela exercida no interior das artérias sobre as suas paredes e pode ser calculada pelo produto da resistência vascular periférica total versus o débito cardíaco. Assim, devido a esta proporcionalidade, todos os fatores que alteram estas duas variáveis podem alterar a PA. Dentre os fatores que modificam o débito cardíaco, estão as alterações da volemia, da contratilidade do miocárdio e da FC. Já a regulação da resistência vascular periférica depende de um complexo mecanismo de regulação, no qual atuam de modo interrelacionado: os barorreceptores e quimioreceptores que atuam no controle da PA a curto prazo; o balanço de eletrólitos, especialmente de sódio, potássio e cálcio; o sistema renina-angiotensina-aldosterona; substâncias vasoativas tais como PG, TX, NO e endotelinas, neurotransmissores como adrenalina e noradrenalina e hormônios tais como peptídeo natriurético atrial, vasopressina, cortisol e sistema calicreína-cinina (ver AIRES, 1999; BERNE et al., 2004). Em situações em que há alterações nesse complexo mecanismo controlador da pressão arterial, poderá ocorrer o desenvolvimento de uma situação em que a pressão arterial se manterá em níveis elevados, caracterizando a hipertensão arterial (IRIGOYEN et al., 2003).
(SUS), correspondendo à terceira causa de internações hospitalares (DATASUS, 2003). O Framinghham Heart Study, permitiu quantificar os riscos das doenças cardiovasculares em relação aos níveis pressóricos, verificando que a hipertensão arterial é o fator de risco mais prevalente e que mais contribui para o desenvolvimento dessas doenças (KANNEL, 1996).
2.1. OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como objetivo avaliar atividades farmacológicas in vivo de seis espécies de Lychnophora utilizadas pela população.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Em âmbito mais específico este trabalho tem como objetivos principais:
Avaliar comparativamente a atividade antinociceptiva dos extratos etanólicos das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides,
L. staavioides e L. trichocarpha, administrados por via oral, utilizando os
métodos da placa quente e de contorções induzidas pelo ácido acético em camundongos.
Validar o método de mensuração do edema de pata induzido pela carragenina por paquímetro utilizando o pletismômetro.
Avaliar comparativamente a atividade antiinflamatória dos extratos etanólicos das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides,
L. staavioides e L. trichocarpha, administrados por via tópica, utilizando o
método de edema de pata induzido pela carragenina em camundongos.
Avaliar as atividades sobre o SNC dos extratos etanólicos das espécies L. ericoides e L. trichocarpha, administrados por via oral, utilizando os métodos do campo aberto, da haste girante e de tração em camundongos.
3.1. MATERIAL VEGETAL
As partes aéreas das espécies Lychnophora passerina (Mart. ex. DC.) Gardn.,
Lychnophoriopsis candelabrum (Schultz-Bip.) H. Robinson, Lychnophora ericoides
(Mart.) e Lychnophora staavioides Mart. coletadas em Setembro de 2000 e Lychnophora pinaster Mart. coletada em Março de 2003, foram depositadas no Herbarium do Instituto de Ciências Biológicas (ICB), UFMG, Belo Horizonte, Brasil. Lychnophora trichocarpha Spreng foi coletada em Outubro de 2003 e depositada no Herbarium do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas (ICEB), UFOP, Ouro Preto, MG, Brasil. Todas as espécies foram coletadas no estado de Minas Gerais, Brasil.
3.2. EXTRAÇÃO VEGETAL
As partes aéreas das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster
L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha foram secadas em estufa a 40oC por sete dias. Após a secagem, foram pulverizadas e a partir de 800 g de cada espécie foi realizada a extração com etanol, à temperatura ambiente, até o esgotamento do material vegetal. O etanol foi, então, evaporado à pressão reduzida até a obtenção do resíduo bruto.
A
Figura 2: Extração vegetal: pulverização (A), extração por percolação (B) e evaporação com o uso de rotavapor (C).
3.3. PREPARO DAS SOLUÇÕES DOS EXTRATOS DE LYCHNOPHORAS
Para avaliação das atividades antinociceptiva e antiinflamatória os extratos etanólicos brutos das espécies de Lychnophora foram solubilizados em Tween 80, dimetilsulfóxido (DMSO) e água destilada 1:1:8 (veículo) para preparo das soluções nas concentrações 75 mg/ml e 150 mg/ml.
Para avaliar a atividade cardiovascular e sobre o SNC das Lychnophoras, cada extrato etanólico bruto foi solubilizado em Capryol: água destilada (6,5:3,5) e suspenso em 0,5% de carboximetilcelulose (CMC) para preparo das soluções nas concentrações 50 mg/ml e 100 mg/ml.
3.4.ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Os animais utilizados foram provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto e mantidos no Biotério da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto até a realização dos experimentos. Os animais foram mantidos em caixas em grupos de cinco, no ciclo 12 horas claro e 12 horas escuro, com acesso livre à comida e água. Para os experimentos em que a administração das soluções foi realizada por via oral, os animais foram mantidos em jejum num período de oito a doze horas antes dos experimentos com acesso livre somente à água.
Os estudos das atividades antinociceptiva e antiinflamatória foram realizados em camundongos albinos Swiss (30 ± 5 g) de ambos os sexos e os métodos de avaliação da atividade sobre o SNC foram realizados em camundongos machos. Os estudos da atividade cardiovascular foram realizados em ratos Wistar machos normotensos (250 ± 30 g).
diclofenaco sódico emulgel (Novartis, Brasil), cloreto de sódio e pentobarbital sódico (Cristália, Brasil). Todos os solventes utilizados foram de grau analítico e a água foi purificada por destilação.
3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA
4.1. METODOLOGIA
Para avaliação da atividade antinociceptiva os camundongos receberam solução controle (veículo) ou extratos etanólicos das espécies L. candelabrum, L. ericoides, L. passerina, L. pinaster, L. staavioides e L. trichocarpha nas doses 0,75 g/kg ou 1,50 g/kg por via oral. Como fármacos padrão foram utilizados: morfina 10 mg/kg (1 mg/ml) por via intraperitoneal (i.p.) ou dipirona 200 mg/kg (25 mg/ml) por via oral, ambas dissolvidas em água destilada, utilizados nos dois métodos descritos abaixo ou a indometacina 10 mg/kg (1 mg/ml) por via oral solubilizada em água destilada e 0,5% de Tween 80 (ESTEVES et al., 2005) utilizada no método de contorções.
Avaliação da atividade antinociceptiva foi realizada utilizando o método da placa quente e o método de contorções induzidas pelo ácido acético.
4.1.1. MÉTODO DA PLACA QUENTE
4.1.2. MÉTODO DE CONTORÇÕES INDUZIDAS PELO ÁCIDO ACÉTICO
Para avaliação da atividade antinociceptiva foi utilizado o método de contorções descrito por KOSTER et al. (1959). A resposta induzida pela administração i.p. de ácido acético consiste na contração do músculo abdominal junto ao estiramento das patas posteriores do animal. As soluções dos extratos etanólicos das seis espécies de
Lychnophora estudadas nas duas doses avaliadas (0,75 ou 1,50 g/kg, via oral), as
soluções de morfina, dipirona ou indometacina ou a solução controle foram administradas 30 min antes da injeção de ácido acético 0,8% v/v. As contorções foram contadas por 30 min, em períodos de 5 min, iniciando logo após a administração do ácido acético. A redução significativa do número de contorções comparado ao grupo controle foi considerada resposta antinociceptiva positiva.
4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente estudo avaliou comparativamente pela primeira vez o efeito antinociceptivo de seis espécies de Lychnophora nativas do Brasil. Para isso, foram usados os métodos da placa quente e de contorções induzidas pelo ácido acético, os quais são descritos na literatura como métodos para avaliação da atividade antinociceptiva central e periférica, respectivamente (VERMA et al., 2005).
pelo aumento no tempo de reação do animal, sendo 25 ± 7,3 s e 18 ± 4,8 s, respectivamente. Este efeito foi semelhante ao observado após administração de dipirona (17 ± 2,6 s) e morfina (29 ± 4,1 s) e diferente do grupo controle (3 ± 0,8 s). No método da placa quente o calor induz a ação termoceptiva cutânea. A integração do estímulo ocorre devido à estimulação de fibras C de condução lenta, que apresenta terminais não capsulados de receptores termais e mecânicos e fibras do tipo Aδ de condução rápida que induz ao reflexo de retirada da pata pela ativação de termorreceptores (HENDRY et al., 1999) e a latência do reflexo de retirada da pata ocorre por integração medular com influência supraespinhal (LE BARS et al., 2001).
Como já relatado por SANTOS et al. (1998), a indometacina, um AINE, não apresenta atividade no método da placa quente (Figura 4). Este método é considerado seletivo para compostos com atividade sobre o SNC (JANSSEN et al., 1963; LE BARS et al., 2001), por isso a morfina, analgésico narcótico opióide, apresentou atividade no método da placa quente. A dipirona, não tem o mecanismo de ação pelo qual se evidencia seu efeito analgésico claramente elucidado, parecendo concorrer mecanismos periféricos e centrais e em diferentes níveis de processamento da informação dolorosa (ANDRADE, 2005). O fato da dipirona ter apresentado atividade antinociceptiva no método da placa quente reforça achados recentes de VAZQUEZ et al. (2005), que demonstraram que a administração intravenosa (i.v.) de dipirona em ratos leva à ativação de circuitos opioidérgicos endógenos na substância cinzenta periaquedutal e no núcleo magno da rafe, áreas que compõem o sistema descendente inibitório espinhal.
A Figura 5 e a Tabela 1 mostram o número total de contorções durante 30 min de observação, iniciado imediatamente após a administração i.p. do ácido acético. Os resultados observados nesse método demonstraram o efeito de L. passerina, L. candelabrum e L. pinaster na dose 0,75 g/kg. O extrato etanólico de L. ericoides e L. trichocarpha em ambas doses avaliadas (0,75 e 1,50 g/kg) reduziram o número de contorções de maneira dose-dependente. Esta redução representa 52,7% e 88,1% para L. ericoides e 47,9% e 89,1% para L. trichocarpha para as doses 0,75 e 1,50 g/kg, respectivamente. Os extratos mais efetivos em produzir efeito antinociceptivo por este método foram então, aqueles obtidos de L. ericoides e L. trichocarpha.
antinociceptivo da indometacina ocorreu entre 5 e 25 min. Como mostrado na Figura 6 e Tabela 1, a redução do número de contorções após a administração dos extratos de Lychnophoras foi observada 5 min após a injeção de ácido acético e não foi mais observada após 20 min exceto para os extratos de L. ericoides (Figura 6D e Tabela 1) e L. trichocarpha (Figura 6F e Tabela 1) na dose 1,50 g/kg, cujo efeito antinociceptivo foi observado até o final da análise (30 min). Os extratos de L. passerina (Figura 6A) no tempo 10-15 min e de L. staavioides no tempo 0-5 min (Figura 6E), ambos na dose 1,50 g/kg, induziram à hiperalgesia evidenciada pelo aumento significativo do número de contorções.
O método de contorções induzidas pelo ácido acético é considerado inespecífico, sendo muito utilizado para triagem que permite a detecção de compostos com atividade antinociceptiva principalmente periférica. COLLIER et al. (1968) propuseram que o ácido acético age indiretamente pela liberação de mediadores endógenos que estimulam neurônios nociceptivos. DERAEDT et al. (1980) relataram que o método de contorções induzidas pelo ácido acético está relacionado ao aumento dos níveis de PGE2 e PGF2 e
produtos da LOX, durante os primeiros 30 min após a administração de ácido acético. Adicionalmente, DUARTE et al. (1988) demonstraram que a administração i.p. de ácido acético induz também à liberação de mediadores do sistema nervoso simpático. Mais recentemente, RIBEIRO et al. (2000) propuseram que a atividade nociceptiva do ácido acético pode está relacionada à liberação de citocinas, tais como TNF- , IL-1 e IL-8, à partir de macrófagos peritoniais e de mastócitos. Considerando o método de contorções como o modelo antinociceptivo de menor seletividade (TOMA et al., 2003), pode-se inferir no presente estudo, que por isso, um maior número de espécies e doses de extratos etanólicos de Lychnophoras mostrou atividade nesse método.
método da placa quente. Esses triterpenos já foram isolados das espécies L. ericoides (SAKAMOTO et al., 2003), L. candelabrum.(SANTOS et al., 2004), L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005a) e L. trichocarpha (SAÚDE et al., 1998). Além disso, sitosterol presente na espécie L. trichocarpha (SAÚDE et al., 1998) reduziu o número de contorções induzidas pelo ácido acético e aumentou o tempo de reação dos animais no método da placa quente (VILLASSENOR et al., 2002). Quercetina e vitexina, flavonóides já isolados de L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005b), também apresentaram atividade antinociceptiva no método da placa quente (RYLSKI et al., 1979). KAUR et al. (2005) demonstraram que a quercetina induz ao efeito antinociceptivo que involve principalmente a modulação de vias adrenérgicas.
Os extratos etanólicos de L. passerina e L. candelabrum no método de contorções e L. pinaster nos dois métodos utilizados apresentou atividade antinociceptiva significativa na menor mas não na maior dose avaliada. Este efeito foi provavelmente causado pela presença de substâncias que agem somente na maior dose causando hiperalgesia. Este efeito hiperalgésico parece mascarar a atividade antinociceptiva dos extratos de Lychnophoras agindo através da interação sinérgica entre bradicinina, serotonina e histamina (LAVICH et al., 2003). Este resultado pode ser explicado se for considerado que o extrato bruto de uma planta é uma mistura de inúmeras substâncias dotadas de atividades biológicas diversas, entre elas substâncias potencialmente irritantes para os tecidos, tais como sais diversos, hexoses, saponinas e a própria clorofila que, em altas concentrações, poderiam gerar ou potenciar uma resposta hiperalgésica. Desta forma, o aumento da dose dessas espécies de Lychnophora poderia levar à administração de quantidades maiores destas substâncias, cujo efeito seria antagônico ao efeito antinociceptivo em estudo.
0 5 10 15 20 25 30 35 V a ri a ç ã o d o t e m p o d e l a tê n c ia p a ra l a m b e r a p a ta ( s ) Controle
Dipirona 200 mg/kg Morfina 10 mg/kg Indometacina 10 mg/kg
L. passerina 0,75 g/kg L. passerina 1,50 g/kg L. candelabrum 0,75 g/kg L. candelabrum 1,50 g/kg L. pinaster 0,75 g/kg L. pinaster 1,50 g/kg L. ericoides 0,75g/kg L. ericoides 1,50 g/kg L. staavioides 0,75 g/kg L. staavioides 1,50 g/kg L. trichocarpha 0,75 g/kg L. trichocharpha 1,50 g/kg
Figura 4: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras sobre a variação do tempo gasto para lamber as patas em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P 0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 N ú m e ro t o ta l d e c o n to rç õ e s e m 3 0 m in Controle
Dipirona 200 mg/kg Morfina 10 mg/kg Indometacina 10 mg/kg
0 3 6 9 12 15
L. passerina0,75 g/kg
L. passerina1,50 g/kg Controle
0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30
*
*
+A
*
Tempo após administração de ácido acético (min)
N ú m e ro d e c o n to rç õ e s 0 2 4 6 8 10 Controle
L. candelabrum 0,75 g/kg
L. candelabrum 1,50 g/kg
0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30
B
*
*
Tempo após administração de ácido acético (min)
N ú m e ro d e c o n to rç õ e s 0 2 4 6 8 10 Controle
L. pinaster 0,75 g/kg
L. pinaster 1,50 g/kg
0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30
C
*
*
Tempo após administração de ácido acético (min)
0 2 4 6 8 10 Controle
L. ericoides0,75 g/kg
L. ericoides 1,50 g/kg
0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30
*
*
*
*
*
*
*
*
*
D
Tempo após administração de ácido acético (min)
N ú m e ro d e c o n to rç õ e s 0 2 4 6 8 10 12 Controle
L. staavioides 0,75 g/kg
L. staavioides 1,50 g/kg
0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30
*
*
+
*
*
E
Tempo após administração de ácido acético (min)
N ú m e ro d e c o n to rç õ e s 0 2 4 6 8 10 12 Controle
L. trichocarpha 0,75 g/kg
L. trichocarpha 1,50 g/kg
0-5 5 -10 10 -15 15 -20 20 -25 25 -30
0 2 4 6 8 10 Controle
Dipirona 200 mg/kg Morfina 10 mg/kg Indometacina 10 mg/kg
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0-5 5-10 10 -15 15-20 20-25 25-30
G
Tempo após administração de ácido acético (min)
N ú m e ro d e c o n to rç õ e s
Figura 6: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras (A-F) e de fármacos padrão (G) sobre o número total de contorções induzidas pelo ácido acético contadas em períodos de 5 min por 30 min em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m.
*P 0,05 redução do número de contorções comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett).
+
Tabela 1: Número de contorções induzidas pelo ácido acético em camundongos Tempo após administração do ácido acético (min)
Tratamento 0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 Total
Controle 3 ± 0,6 7 ± 0,7 8 ± 0,7 9 ± 0,7 6 ± 0,6 3 ± 0,4 35 ± 2,7
Morfina 10mg/kg 0 ± 0,0* 0 ± 0,2* 0 ± 0,3* 0 ± 0,3* 0 ± 0,0* 0 ± 0,0* 1 ± 0,7*
Dipirona 200 mg/kg 0 ± 0,0* 0,0 ± 0,2* 1 ± 0,2* 1 ± 0,3* 1 ± 0,3* 0 ± 0,2* 3 ± 0,7*
Indometacina 10 mg/kg 1 ± 0,4 3 ± 0,6* 4 ± 0,7* 3 ± 0,5* 3 ± 0,4* 2 ± 0,4 16 ± 2,1*
L. passerina 0,75 g/kg 3 ± 0,5 3 ± 0,6* 3 ± 0,6* 5 ± 1,6* 3 ± 1,5 1 ± 0,6 18 ± 4,7*
L. passerina 1,50 g/kg 1 ± 0,2 7 ± 08 13 ± 1,1+ 11 ± 0,9 7 ± 0,9 1 ± 0,4 38 ± 3,1
L. candelabrum 0,75 g/kg 1 ± 0,4 2 ± 0,6* 4 ± 0,7* 6 ± 1,1 6 ± 1,4 2 ± 0,6 21 ± 3,5*
L. candelabrum 1,50 g/kg 3 ± 1,5 7 ± 1,4 5 ± 1,4 7 ± 2,0 4 ± 1,1 1 ± 0,4 26 ± 5,6
L. pinaster 0,75 g/kg 3 ± 1,4 4 ± 1,2 4 ± 1,0* 4 ± 1,0* 3 ± 0,9 2 ± 0,9 19 ± 5,4*
L. pinaster 1,50 g/kg 2 ± 1,2 7 ± 1,2 7 ± 1,3 6 ± 1,2 5 ± 0,9 4 ± 1,0 31 ± 3,9
L. ericoides 0,75 g/kg 1 ±0,9 3 ± 1,2* 3 ± 1,1* 4 ± 1,1* 3 ± 0,7* 3 ± 0,9 16 ± 5,1*
L. ericoides 1,50 g/kg 2 ± 0,8 1 ± 0,5* 1 ± 0,3* 0 ± 0,2* 0 ± 0,2* 0 ± 0,2* 4 ± 2,2*
L. staavioides 0,75 g/kg 4 ± 1,2 5 ± 1,2 4 ± 0,8* 5 ± 1,3* 4 ± 0,9 3 ± 0,8 26 ± 4,8
L. staavioides 1,50 g/kg 7 ± 2,2+ 8 ± 2,4 5 ± 1,8 3 ± 1,0* 3 ± 0,9* 2 ± 0,7 29 ± 8,3
L. trichocarpha 0,75 g/kg 5 ± 1,9 5 ± 1,6 4 ± 1,5* 2 ± 0,6* 1 ± 0,6* 1 ± 0,6 18 ± 5,7*
L. trichocarpha 1,50 g/kg 1 ± 0,6 2 ± 1,1* 1 ± 0,4* 0 ± 0,3* 0 ± 0,1* 0 ± 0,3* 4 ± 2,0*
Os valores representam a média + erro padrão da média.
*P 0,05 redução do número de contorções comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett).
+
5.1. METODOLOGIA
5.1.1.VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE MENSURAÇÃO DO EDEMA DE PATA
O método de mensuração do edema de pata pelo paquímetro utilizado no presente estudo foi validado utilizando o pletismômetro (FERREIRA et al., 1979), que consiste na imersão da pata do animal na cuba do aparelho até a articulação tibio-társica, registrando-se o volume deslocado.
Foi administrado por via subcutânea na pata direita o volume de 0,02 ml de carragenina 0,1% ou 1% em solução salina e na pata esquerda 0,02 ml de solução salina. Foram mensurados o volume da pata do animal utilizando-se o pletismômetro (modelo 7140, UGO BASILE, Itália) e a espessura entre as faces dorsal e ventral da mesma pata foi obtida com o uso de um paquímetro (Vonder, China) posicionando-o na porção central da pata, sem pressionar. As mensurações foram feitas antes, 1 e 3 h após administração da solução de carragenina ou solução salina. A variação da espessura em mm foi comparada à variação do volume em mililitros (ml).
