UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SANEAMENTO MEIO AMBIENTE E RECURSOS HÍDRICOS
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE
CIANOTOXINAS EM RESERVATÓRIOS QUE UTILIZAM ÁGUA PARA ABASTECIMENTO PÚBLICO
Adilson Alves Moreira
BELO HORIZONTE
2005
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG ii
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE CIANOTOXINAS EM RESERVATÓRIOS QUE UTILIZAM ÁGUA
PARA ABASTECIMENTO PÚBLICO
Adilson Alves Moreira
Adilson Alves Moreira
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DE
CIANOTOXINAS EM RESERVATÓRIOS QUE UTILIZAM ÁGUA PARA ABASTECIMENTO PÚBLICO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos.
Área de concentração: Saneamento.
Linha de Pesquisa: Recursos
Hídricos/Aproveitamento.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Von Sperling.
Co-Orientadora: Prof.ª Dra. Sandra M.F.O Azevedo (UFRJ)
Belo Horizonte
Escola de Engenharia da UFMG 2005
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG iv
Pagina em branco para assinaturas é fornecida pela faculdade
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, que me colocaram para estudar quando eu só queria soltar papagaios e tudo fizeram para que seus filhos estudassem; lá onde eles agora devem estar, nunca imaginaram aonde seus filhos poderiam chegar.
À minha esposa pelo incentivo de perseverar e pela paciência em aguentar e ainda me ajudar;
aos meus parentes que respeitaram minha ausência; aos meus amigos pelo apoio e pelas diversas leituras aborrecidas que tiveram que fazer.
A todos os colegas do Laboratório Central da COPASA, muito obrigado, sem eles esse trabalho seria muito mais difícil do que realmente foi.
Agradeço aos meus orientadores por suas pertinentes correções de rota e a todos os funcionários do DESA pelas orientações durante o curso.
Aos Mestres e Doutores, os com título e os sem, os que me ensinaram a gostar de estudar e a ver estrelas, os que me ensinaram a sonhar e a crer na vida, a eles, minha eterna gratidão.
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG vi Aos meus pais.
“Que todos os seres tenham saúde, felicidade e paz. Que nenhum mal os fira, que nenhuma dificuldade os atinja, que nenhum problema os angustie. Possam eles ser sempre bem-sucedidos.
Que eles tenham paciência, coragem, compreensão e determinação para enfrentar e superar as inevitáveis dificuldades, problemas e fracassos da vida”
Buddha
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG viii
RESUMO
Devido à presença de cianobactérias e cianotoxinas em diversos mananciais, e aos seus efeitos deletérios sobre a saúde humana, à vida e ao meio ambiente, escolheu-se estudar os principais reservatórios utilizados para abastecimento público da Região Metropolitana de Belo Horizonte [Rio Manso, Serra Azul e Vargem das Flores], e em algumas cidades do interior de Minas Gerais, buscando-se confirmar a presença das variantes de cianotoxinas mais comumente encontradas, relatadas e elucidadas pela pesquisa científica, como microcistinas, cilindrospermopsina e as saxitoxinas. Partindo do monitoramento das hepatotoxinas e neurotoxinas, procurou-se implantar e aprimorar os métodos analíticos para determinação de cianotoxinas, visando adequa-los às práticas já existentes ao Laboratório Central que realiza o controle da qualidade da água das localidades estudadas. Decidiu-se pela utilização da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detetor de Arranjo de Diodo (CLAE/DAD), avaliado como um método adequado, tanto para a identificação quanto para a quantificação das hepatotoxinas e de CLAE com detetor de fluorescência (DFL), para a identificação e quantificação das neurotoxinas. Foram utilizados dados históricos e primários gerados pelo monitoramento. Os níveis de cianotoxinas, principalmente de microcistinas foram de, no máximo, 3 µg/L em amostras de seston, não sendo detectadas (ND) na maioria das amostras de água bruta e tratada, estando portanto, de acordo com a Portaria no 518/04 do Ministério da Saúde. O plano de amostragem foi mensal para as cianotoxinas, sendo o critério das coletas de água os já realizados pelo Laboratório para o controle de qualidade das águas, algumas coletas extras, além de coletas para análise de fitoplâncton, buscando-se realizar uma comparação limnológica da relação entre esses parâmetros e a sua influência na compreensão do funcionamento dos mananciais estudados.
ABSTRACT
The presence of cyanobacteria and cyanotoxin in many water sources all over the world and their negative effect on the environment and public health, were the main reasons for choosing this as a project subject. Rio Manso, Vargem das Flores e Serra Azul, the main reservoirs supplying the metropolitan region of Belo Horizonte, – Minas Gerais, Brazil – were studied with the aim to confirm the presence of microcistin, cylindrospermopsin and the saxitoxins, the varieties of cyanotoxin most commonly found in Minas Gerais and also most frequently reported by scientific researchers. Starting by monitoring those hepatotoxins and neurotoxins, it was sought to upgrade analytical methods so that they could meet operational needs, when rapid decisions are required. The High Performance Liquid Cromatography with diode array detector (HPLC/DAD) was applied, regarded as the most accessible, selective and sensitive method for both identification and quantification of cyanotoxins. Apart from the data produced during the monitoring season it was also considered data from the historical file. It was not found cyanotoxin in the treated water samples during the period of the study, complying with the water quality regulation (Portaria 518 do Ministério da Saúde). As far as cyanotoxins were concerned, the samples were collected on a monthly basis. Phytoplankton has also been analysed for some samples, searching a limnologic comparison of the relationship between these parameters and its influence in the studied water sources behaviour.
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG x
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 11. 1 Área de estudo ... 5
2 OBJETIVOS ... 11
2.1 Objetivo geral ... 11
2.2 Objetivo específicos ... 11
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 12
3.1 Tópicos sobre Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE ... 12
3.1.1 Histórico ... 12
3.1.2 Aplicações da cromatografia líquida de alta eficiência ... 15
3.2 Considerações sobre métodos de quantificação de cianotoxinas ... 18
3.3 Considerações analíticas e históricas sobre a determinação de hepatotoxinas em amostras de água e seston ... 21
3.3.1 Microcistina: aspectos históricos no Brasil e no mundo ... 21
3.3.2 Princípios do método de Extração em Fase Sólida para microcistina ... 28
3.3.3 Fatores gerais que influenciam a extração em fase sólida ... 31
3.4 Presença de cilindrospermopsina em amostras ambientais ... 32
3.4.1 Procedimentos para análises de cilindrospermopsina ... 35
3.5 Saxitoxinas e suas ocorrências ... 35
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 42
4.1 Plano de amostragem das cianobactérias ... 42
4.2 Determinação de microcistina por CLAE ... 45
4.3 Determinação e quantificação de cilindrospermopsina por CLAE ... 48
4.3.1 Procedimento para extração de cilindrospermopsina utilizando EFS em amostras de água e seston ... 49
4.3.2 Revisão do método para determinação e quantificação de cilindrospermopsina ... ... 51
4.4 Procedimentos para análises de saxitoxinas (STX’s)... 52
4.4.1 Procedimentos de análises para saxitoxinas - método pré-coluna ... 52
4.4.2 Procedimento de análises para Saxitoxinas pelo método de reação pós-coluna ... ... 56
Para facilitar a preparação das soluções e das fases móveis descritas, é conveniente deixar preparada em bancada e após uso guardar em geladeira (4ºC), as seguintes soluções estoques:.
... 60
4.4.3 Coleta e análise do fitoplâncton ... 61
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 63
5.1 Resultados do fitoplâncton de Vargem da Flores ... 63
5.1.1 Resultados de cianotoxinas em Vargem das Flores ... 66
5.2 Resultados do fitoplâncton do Rio Manso (Org/mL) ... 68
5.2.1 Resultados de cianotoxinas no Rio Manso... 69
5.2.2 Resultados de cianotoxinas em Serra Azul ... 72
5.3 Apresentação dos dados linmológicos nos reservatórios pesquisados ... 72
5.4 Apresentação dos resultados alcançados com a implantação dos métodos para cianotoxinas ... 74
5.4.1 Microcistina ... 74
5.4.2 Limite de detecção do método ... 76
5.4.3 Cilindrospermopsina ... 77
5.4.4 Limite de detecção de cilindrospermopsina ... 79
5.4.5 Apresentação do resultado do trabalho de monitoramento de cilindrospermopsina. .... 80
6 CONCLUSÕES ... 86
7 RECOMENDAÇÕES ... 88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 89
ANEXOS ... 119
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 – Cianobactéria fóssil: Filamentos de Palaeolyngbye (a), colônia em forma de chroococos (b). Período Proterozoico, aprox. 850 milhões de anos. Origem: Austrália Central (bitter spring rocks).. ... 2Figura 1.2 – Vista geral do reservatório Serra Azul. ... 6
Figura 1.3 – Vista geral do reservatório Rio Manso... 7
Figura 1.4 – Vista geral do reservatório Vargem das Flores. ... 8
Figura 1.5 – (a) Ribeirão Betim, (b) margens do reservatório Vargem das Flores próxima a foz do Ribeirão Betim.. ... 9
Figura 3.1 – Esquema do cromatógrafo criado por Tswett em 1906 ... 13
Figura 3.2 – Esquema básico de um cromatógrafo líquido. ... 14
Figura 3.3 – Desenho esquemático de um detetor de arranjo de diodo (DAD). ... 16
Figura 3.4 – Relação entre sensibilidade e seletividade de diversos métodos analíticos para cianotoxinas ... 19
Figura 3.5 – Estrutura geral da microcistina, mostrando os principais grupos de aminoácidos. ... 24
Figura 3.6 – Espectro e cromatograma da primeira microcistina determinada por CLAE na COPASA em 1999. ... 26
Figura 3.7 – Estrutura molecular básica da nodularina mostrando os principais grupos de aminoácidos. ... 29
Figura 3.8 – Sistema de filtração a vácuo para análise de cianotoxina. ... 30
Figura 3.9 – Estrutura molecular da cilindrospermopsina, a variante deoxilicindrospermopsina perde o oxigênio da ligação OH (seta) ... 34
Figura 3.10 – Estrutura geral das saxitoxinas. ... 37
Figura 3.11 – Esquema básico de um detetor de fluorescência ... 39
Figura 4.1 – Cromatógrafo líquido ligado a um detetor de arranjo de diodo (DAD) e reator pós-coluna ... 47
Figura 4.2 – Ilustrativo de EFS mostrando a separação dos constituintes da amostra. Etapa 1 ativação do ODS e introdução da amostra; etapa 2 limpeza (clen-up); etapa 3 retenção dos analitos; etapa 4 eluição dos componentes de interesse. ... 49 Figura 4.3 – Esquema do injetor automático programável utilizado em análises de saxitoxinas.
... 56
Figura 5.1 – Variação quantitativa do fitoplâncton de Vargem das flores, período de outubro 2002 a junho de 2005. ... 66
Figura 5.2 – Variação quantitativa do total de cianobactérias, da espécie Microcystis, do oxigênio dissolvido e turbidez no reservatório Vargem das Flores, período de fevereiro de 2003 a setembro de 2004 ... 67
Figura 5.3 – Variação quantitativa do fitoplâncton do reservatório Rio Manso, período de outubro 2002 a junho de 2005. ... 70
Figura 5.4 – Variação quantitativa do fitoplâncton do reservatório Serra Azul, período de outubro 2002 a junho de 2005. ... 72
Figura 5.5 – Variação quantitativa do fitoplâncton dos reservatórios Serra Azul, Rio manso e vargem das Flores. Período de outubro 2002 a junho de 2005... 73
Figura 5.6 – Cromatograma de amostra de água de Vargem das Flores ... 76
Figura 5.7 – Espectro de absorção do padrão de microcistina-LR em 238nm (em vermelho), e amostra em azul. ... 75
Figura 5.8 – Cromatograma do padrão de cilindrospermopsina (40 µg/L) ... 77
Figura 5.9 – Espectro de absorção UV de cilindrospermopsina (200 a 340 nm) ... 78
Figura 5.10 – Curva de calibração para cilindrospermopsina ... 78
Figura 5.11 – Cromatograma de amostra de água de Guaranésia . ... 80
Figura 5.12 – Espectro de absorção de amostra de água de Guaranésia padrão puro de cilindrospermopsina ... 80
Figura 5.13 – Picos cromatográficos do grupo das saxitoxinas – Neo-STX, dc-STX e STX. Métodos pós-coluna (a) e pré-coluna (b). ... 81
Figura 5.14 – cromatograma característico das goniautoxinas... 82
Figura 5.15 – Curva de calibração para quantificação de saxitoxinas (STX´s). ... 82
Figura 5.16 – Cromatograma de STX utilizada como padrão externo para quantificação pelo método pré-coluna. ... 84
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 Aplicações da técnica de cromatografia líquida e a gás ... 17Tabela 3.2 Avanços da cromatografia a líquido e a gás ... 18
Tabela 3.3 Métodos analíticos e comentários para detecção de cianotoxinas ... 21
Tabela 3.4 Variantes mais frequentes de microcistina e sua massa molecular. ... 28
Tabela 3.5 Variações estruturais das saxitoxinas ... 40
Tabela 3.6 Fatores intervenientes na floração de cianobactérias – causas e medidas preventivas ... 41
Tabela 4.1 Coletas realizadas nos reservatórios pesquisados ... 45
Tabela 4.2 Condições do gradiente da fase móvel para análise de cilindrospermopsina ... 52
Tabela 4.3 Etapas da programação de injetor automático para análise de saxitoxinas ... 57
Tabela 4.4 Condições do gradiente de solventes ... 57
Tabela 5.1 Fitoplâncton no reservatório de Vargem das Flores, período outubro de 2002 a junho de 2005 ... 65
Tabela 5.2 Resultado das análises cromatográficas de cianotoxinas na água de Vargem das Flores ... 68
Tabela 5.3 Fitoplâncton no reservatório Rio Manso, período: outubro de 2002 a março de 2005 ... 69
Tabela 5.4 Fitoplâncton no reservatório Serra Azul, período: outubro de 2002 a março de 2005 ... 71
Tabela 5.4 Variação do fitoplâncton total dos três reservatórios. Organismos/Ml ... 74
Tabela 5.5 Limite de detecção – microcistina ... 77
Tabela 5.6 Limite de detecção – cilindrospermopsina ... 80
Tabela 5.7 Limite de detecção – saxitoxinas ... 86
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ACN Acetonitrila
AOAC Association of official analytical chemists C-18 Cadeia de dezoito carbonos
CG Cromatógrafo gasoso.
CG/DCE Cromatografia gasosa com detetor de captura de elétrons CG/EM Cromatografia gasosa com espectro de massas
CL/EM Cromatografia líquida com espectro de massa CLAE Cromatografia de alta eficiência
CLAE/DAD Cromatografia de alta eficiência com detetor de arranjo de diodo CLAE/DFL Cromatografia de alta eficiência com detetor de Fluorescência COPASA Cia de Saneamento de Minas Gerais
CSIRO-LW Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization- Land and Water Division
CYGSN-L Cianoginosina
CY Cilindrospermopsina
DAD Detetor de arranjo de diodo DFL Detetor de fluorescência
EEIC Ensaio de Enzima Imuno-Conjugada EFS Extração em fase sólida
EFS/ODS Extração em fase sólida com octadecil-silano ELISA Enzime Linked Imuno Sorbent Assay
Em Comprimento de onda de emissão.
ETA Estação de tratamento de água ETE Estação de tratamento de esgotos Ex Comprimento de onda de excitação FMR Fator de morte rápida
GTX Goniautoxinas
HP-1100 Hewlett Packard - série 1110
LETC-IBCCF-UFRJ Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-Universidade Federal do Rio de
Programa de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da UFMG xvi Janeiro
MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time of Flight MC-LR Microcistina-leucina/arginina
MC-RR Microcistina- arginina/ arginina MYCST Microcistina
MC-YR Microcistina- Tirosina/ arginina
µl Microlitro
µm Micrometro
mM Milimolar
M Molar
N Normal
ND Não detectado
nm Nanômetros
NRC-CNRC National Research Council of Canadá
ODS Otadecilsilano
OMS Organização Mundial de Saúde
PA Para Analises
PH Potencial hidrogeniônico ρmol Pico mol
POP´s Procedimentos operacional padrão PSP Paralitic Shellfish Toxin
RMBH Região Metropolitana de Belo Horizonte RMN Ressonância Magnética Nuclear
RPM Rotações por minuto
SICQA Sistema Informática e Controle de Qualidade de Água.
STX Saxitoxinas
TFA Ácido trifluoracético
TPM Toxina paralisante de molusco
TR Tempo de retenção
UV Ultravioleta
1 INTRODUÇÃO
Nos anos recentes, notadamente nos últimos vinte e cinco anos, tem-se verificado no Brasil intenso crescimento populacional, industrial e de geração de bens de consumo, em níveis semelhantes – em alguns estados federativos – aos países desenvolvidos.
Esse avanço do país rumo ao desenvolvimento trouxe como consequências, reflexos definitivos ao meio ambiente aquático, aos lagos, rios e nos reservatórios construídos para a captação de água para o consumo humano.
Segundo estimativas de crescimento populacional, até 2020 prevê-se 8 bilhões de habitantes compartilhando o uso da água, do ar e do solo. Para o uso específico da água, nenhum grande projeto de repercussão, até o presente ano, tenha sido anunciado pelos organismos internacionais, como a OMS ou a ONU, que leve em conta fatores ambientais e econômicos decorrentes da exploração destes recursos.
Muito tem-se tentado nos fóruns de debates como a ECO-96 e Protocolo de Kioto, aceitos com relutância entre as nações mais desenvolvidas e por conseguinte mais poluidoras.
Como uma consequência direta do aumento dos nutrientes nos corpos hídricos provenientes da poluição, o mundo se deu conta de que organismos, até então sob controle, estavam predominando e tornando a água para dessedentação animal, para irrigação, para pesca e recreação, enfim, para consumo e para as atividades humanas impróprias para uso sem um tratamento caro, exigindo medidas preventivas e ecologicamente corretas, as cianobactérias.
Esses organismos procariontes foram provavelmente os primeiros seres vivos que realizaram a fotossíntese com liberação de oxigênio na Terra (SCHOPF, J.W., PACKER, B. M, 1997), e também consideradas como os primeiros organismos que colonizaram a terra (BROCK, 1973, SCHOPF, 1996).
A presença morfológica de aerótopos e condições ambientais propícias: atmosfera rica em oxigênio, eutrofização dos ambientes aquáticos – devido a fatores naturais e contribuições antropogênicas – as cianobactérias e outras algas planctônicas, passaram a predominar no meio ambiente aquático.
Importantes produtores primários, elas contribuíram para o desenvolvimento dos ciclos da vida, como espécies fixadoras de nitrogênio, importantes na fertilização do solo e na riqueza de nutrientes e de alimentos para outros organismos aquáticos (DOR & DANIN, 1996).
O seu potencial toxigênico pode estar diretamente ligado ao combate à herbivoria e a estratégias adaptativas muito próprias da classe as quais aumentam a sua valência ecológica em relação a outros organismos aquáticos (VAN & MUR, 1979).
De acordo com o Código Internacional de Nomenclatura Botânica, a classe Cyanophyceae conta com 150 gêneros e mais de 2000 espécies. Consideradas como o maior grupo de procariotas fototróficos, são também conhecidas como algas azuis (blue-green algae) devido aos pigmentos fotossintéticos, as ficocianinas (HOEK et al., 1995).
Cianobactérias fósseis foram encontradas em rochas sedimentares de 3,5 bilhões de anos na Austrália central (figura 1.1 a e b).
a) b)
Figura 1.1 - Cianobactéria fóssil: Filamentos de Palaeolyngbye (a), colônia em forma de chroococos (b). Período Proterozoico, aprox. 850 milhões de anos. Origem: Austrália Central (bitter spring rocks). Foto: University Press.
Fonte: SCHOPF, J.W., PACKER, B. M. (1997).
As cianobactérias possuem grande capacidade de colonizarem substratos inférteis, como cinzas vulcânicas, desertos e rochas, e possuem a notável habilidade de sobreviverem tanto em ambientes quentes tropicais quanto em geleiras dos polos Ártico e Antártico (SKULBERG,1996a).
Embora a convivência de cianobactérias tóxicas sejam letais para diversas espécies do zooplâncton, há indícios de que algumas classes de zooplâncton como Daphnia magna,
Daphnia pulicaria e Trichocerca similis (PENALOZA et al.,1990), apresentam mecanismos comportamentais e alimentares de adaptação, que permitem a coexistência com as cianobactérias sem serem afetados pelas toxinas por elas por elas excretadas. DeMott et al (1991) observaram que algumas espécies do zooplâncton alimentam-se de cianobactérias não- tóxicas na mesma floração onde foram encontradas cepas tóxicas.
Kiviranta et al., (1992) encontram uma dose letal de 14,9 µg ml–1 (LD50) de 48 horas para a toxina denominada microcistina-RR (MC-RR) para a fase larval do vetor da febre amarela, Aedes aegypti, quando imersa em solução dessa toxina, sugerindo outros tipos de enfoque de uso desta molécula para o combate de doenças tropicais, que utilizam diversos tipos de pesticidas (DELANEY & WILKINS, 1995).
Estudos verificaram que algumas cepas de cianobactérias são mais tóxicas das outras. Uma determinada cepa muito tóxica, mesmo que ocorra em menor quantidade, pode apresentar resultados sobrestimados de cianotoxinas em referência ao total da massa algal. Esse fato pode resultar em informações falsas do total de cianotoxinas nos corpos d’água investigados (SIVONEN et al 1989a, b; BOLCH et al. 1997; VEZIE et al.1998).
Consideradas como um grande grupo de toxinas naturais, comumente conhecidas por cianotoxinas – são moléculas neurotóxicas, hepatotóxicas e dermatotóxicas – extremamente prejudiciais, não somente ao homem, a pequenos animais, às aves e ao gado, como também ao fitoplâncton e ao zooplâncton que habita as lagoas e reservatórios (CARMICHAEL,1994). Na água doce, mundialmente utilizada para o abastecimento público – segundo os diversos artigos científicos bibliografados – são encontradas diversas cepas de espécies de cianobactérias capazes de produzir cianotoxinas.
Apesar de sua origem preferencialmente aquática, elas têm sido associadas a acidentes em ambientes terrestres, envolvendo o homem e animais, em todo o mundo (RUNNEGAR et al., 1988; FALCONER, 1996).
São relatados em diversos países casos, alguns fatais, de intoxicação em decorrência da ingestão ou introdução por outros meios destas moléculas. Classificadas como heptapetídeos cíclico com ação hepatotóxica, são produzidas por alguns gêneros das espécies Anabaena, Microcystis, Planktothrix, Nostoc, entre outros. Também foram relatados intoxicações pela
toxina alcaloide, também de ação hepatotóxica conhecida como cilindrospermopsina, em referência ao nome da espécie Cylindrospermopsis raciborskii (SIVONEN & JONES, 1999).
Outros acidentes envolvem outra classe de cianotoxina, classificadas como substâncias do grupo dos carbamatos, as saxitoxinas. Moléculas neurotóxicas, elas afetam os sinais entre os neurônios e as células musculares. São carbamatos alcaloides naturais, com os quais compartilham semelhanças na estrutura molecular, embora possam ser diferenciadas dos sintomas de envenenamento causados por pesticidas inibidores da acetilcolinesterase (KAO 1993).
Métodos analíticos para a detecção e quantificação de cianotoxinas na água exigem preparações complicadas, caras e demoradas, e no caso do uso de bioensaios em camundongos para se testar a toxidade das cianobactérias, considerações éticas já proíbem seu uso em diversos países, o que deve acontecer também no Brasil.
Evidencia-se futuramente o desenvolvimento de métodos analíticos específicos e sensíveis para a determinação do potencial tóxico das cianobactérias em bioensaios sem o uso de mamíferos, como por exemplo com o microcrustáceo Artemia salina, o qual pode ser usado como método alternativo junto aos testes de triagens mais usuais. Constata-se a necessidade de se buscar novos métodos para identificar e quantificar, com maior segurança, os grupos de cianotoxinas que possam estar presentes no ambiente aquático.
Os métodos analíticos para a detecção e quantificação das cianotoxinas, tanto para as hepatotoxinas quanto para as neurotoxinas, foram desenvolvidos, incluindo as análises por cromatografia gasosa com detector de captura de elétrons (CG/DCE) (STEVENS et al.,1988) e por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), (ERIKSSON et al.,1989;
MERILUOTO et al.,1989).
Métodos mais específicos para caracterizar as moléculas de cianotoxinas estão sendo aprimorados, como a cromatografia líquida em interface com um espectrômetro de massas – CLAE/EM (HARADA et al.,1999). Entretanto, a CLAE/DAD – a cromatografia líquida com detetor de arranjo de diodo – permanece como o método mais acessível devido ao custo inferior para a implantação das análises e a possibilidade de se utilizar o equipamento em outras determinações analíticas.
Para a determinação das saxitoxinas (STX’s), a CLAE é também o método mais utilizado atualmente, considerado como alternativo ao uso de bioensaios com camundongos (SULLIVAN, et al., 1983b) e, também, o mais utilizado em pesquisas e determinações para o monitoramento de neurotoxinas em água e em florações de cianobactérias (LAGOS, et al., 1999).
O método de ensaio de enzima imuno-conjugada (NAGATA et al.,1997), conhecido internacionalmente como ELISA (do inglês, enzyme-linked immunosorbent assay), proposto por CHU et al., (1990), utilizado em algumas análises, mostrou-se um ótimo recurso para avaliar rapidamente a presença de microcistina em amostras de água e seston
–
material algal utilizado para determinação de toxinas quando das florações de cianobactérias–
e pode ser utilizado em locais que não possuem equipamentos sofisticados. O teste ELISA é fornecido comercialmente sob a forma de Kits, possui custo bem abaixo de uma análise de CLAE, são fáceis de serem utilizados e que não necessitam de extensivos treinamentos para o domínio da técnica.1. 1 Área de estudo
A Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH) possui aproximadamente 35% de sua população, de 3,5 milhões de habitantes, abastecida pela água de três reservatórios localizados na parte oeste da região.
Os reservatórios de Serra Azul e Rio Manso possuem Área de Proteção Especial (APE) no entorno do corpo d’água, já o reservatório de Vargem das Flores, colocado em operação em 1978, não possui essa área de proteção, que foi somente regulamentada como Área de Proteção Ambiental (APA) por Lei Estadual, em 2006 e, devido à ocupação do solo no entorno da represa e ao crescimento populacional, encontra-se em uma crescente fase de degradação.
Constata-se também que Vargem das Flores por um longo período recebeu efluentes não tratados de um de seus tributários, sendo uma constante fonte de preocupação para a companhia de saneamento detentora da concessão.
Esses reservatórios de acumulação para posterior tratamento têm histórias bem distintas, devido principalmente à experiência que a COPASA, empresa que detém a concessão do tratamento e distribuição de água em Minas Gerais, adquiriu na construção dessas barragens e também, às medidas de proteção ambiental adotadas a partir da construção das barragens dos sistemas Serra Azul e Rio Manso. Esses dois reservatórios possuem dados históricos disponíveis que atestam uma boa qualidade da água, no que se refere às contribuições antropogênicas e ambientais, como a proliferação de cianobactérias que possam produzir toxinas, como é o caso dos gêneros das espécies Microcystis, Cylindrospermopsis entre outros, mas poucos dados estão disponíveis que realmente comprovem essa percepção no que diz respeito a presença ou não de cianotoxinas.
O reservatório de Serra Azul (figura 1.2) foi formado pelo barramento do ribeirão de mesmo nome, afluente da margem esquerda do rio Paraopeba e situa-se na latitude 19º 38’ 18’’ Sul e 44º 20’ 45’’ de longitude Oeste, próximo à cidade de Mateus Leme. Possui um volume de acumulação de aproximadamente 9, 50 x 106 m3, e está localizado na bacia hidrográfica do Rio São Francisco.
Figura 1.2 - Vista geral do reservatório Serra Azul.
Fonte: www.copasa.com.br.
A construção de sua barragem, concluída em 1991, foi precedida de um amplo estudo hidrológico e climatológico. Contou com estudos atualizados sobre a bacia (CETEC, 1994), que é caracterizada por períodos distintos de seca de abril a setembro e um período de chuvas, de outubro a março, que registra até 80% do valor total anual de chuvas, com ocorrência de meses em que não há qualquer precipitação.
O reservatório do Rio Manso (Figura 1.3), construído em 1987, está localizado entre os municípios de Brumadinho e Rio Manso, dentro da Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH).
Contou com um Plano de Controle Ambiental (PCA) implantado pela COPASA, atendendo à solicitação da Comissão de Política Ambiental
–
COPAM, e a fiscalização dos trabalhos de controle de erosão e outros impactos ambientais decorrentes das obras, realizada pela Fundação Estadual do Meio Ambiente–
FEAM, como parte do processo de concessão de licença de funcionamento (COPASA, 1991).Figura 1.3 - Vista geral do reservatório Rio Manso Fonte: www.copasa.com.br
Localizado na bacia hidrográfica do Rio São Francisco, a 20º 08’ 40’’ de latitude sul e 44º 15’
28’’ de longitude oeste, possui uma área inundada de aproximadamente 10,8 km2, e tem como principais afluentes os rios Veloso e Manso.
O reservatório de Vargem das Flores, diferentemente dos outros dois citados, foi construído em uma época anterior (1973), em que o enfoque ambiental não estava tão sedimentado como hoje, embora já fosse, na época, motivo de diversos estudos e projetos destinados a proteger sua bacia. Outro fato era que no local já existiam residências e atividades recreacionais que contribuíram para a queda na qualidade de suas águas.
Vargem das Flores (Figura 1.4) localiza-se nas coordenadas geográficas 19º 55’ 15” de latitude sul e a 44º 10’ 23’’ de longitude oeste. Pertence à bacia do Rio São Francisco, sub-
bacia do rio Paraopeba, tendo principalmente com os seguintes contribuintes os córregos Bela Vista, Água Suja e Morro Redondo e o com o ribeirão Betim.
Figura 1.4 - Vista geral do reservatório Vargem das Flores.
Fonte: Arquivo: COPASA.
A ação antrópica sobre esse ecossistema lacustre contribuiu de maneira decisiva para a eutrofização do reservatório, inclusive com a presença de cianobactérias como Microcystis, Cylindrospermopsis raciborskii, potencialmente tóxicas que são monitoradas pelo laboratório central da COPASA desde 1979.
Ilustra-se a referida bacia com o Ribeirão Betim, mostrado na Figura 1.5 a e b, sendo esse o principal contribuinte do reservatório, também conhecido como córrego Matadouro ou Riachinho, corresponde a 28,9% da área da bacia em estudo (PROSAM, 1997) e, durante seu percurso de aproximadamente 12,5 KM até atingir o reservatório de Vargem das flores, recebe principalmente esgotos domésticos e industriais, alguns clandestinos, provenientes do Centro Industrial de Contagem (CINCO) e de cidades economicamente mais desenvolvidas, que fazem parte da Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH).
a) b)
Figura 1.5 - (a) Ribeirão Betim, (b) margens do reservatório Vargem das Flores próxima a foz do Ribeirão Betim.
Fonte: Arquivo COPASA.
Desde o primeiro caso comprovado de mortes humanas por cianotoxinas, ocorrido em Caruaru em 1996 (JOCHIMSEN et al.,1998; AZEVEDO et al.,2002), a presença de cianotoxinas em águas destinadas ao abastecimento público se tornou uma preocupação urgente das companhias de saneamento. Como consequência, muitas delas passaram a monitorar a presença de cianotoxinas em seus reservatórios de acumulação buscando sua prevenção e controle.
Carmichael (1992), ressalta que – devido principalmente ao decréscimo na qualidade das águas, proveniente do aporte de nutrientes nos recursos hídricos verificado nos anos recentes, permitindo o aumento na eutrofizacão das águas para abastecimento humano – a ocorrência de florações nesses locais tende a crescer.
A água doce que são normalmente utilizadas para o abastecimento público e diversas cepas de cianobactérias encontradas podem ser de espécies capazes de produzir cianotoxinas.
Utilizando as atividades desenvolvidas pelo Laboratório Central da Companhia de Saneamento de Minas Gerais - COPASA, no monitoramento da qualidade da água aduzida para tratamento e distribuição, o presente trabalho aborda aspectos considerados importantes para se avaliar a qualidade da água utilizada para esse fim, nos três reservatórios, buscando avaliar e aprimorar os métodos analíticos utilizados para a detecção e quantificação desses compostos nos reservatórios citados.
Nesse sentido, o presente trabalho pretende contribuir na avaliação da qualidade da água, dentro dos parâmetros escolhidos, nos principais reservatórios que abastecem a Região Metropolitana de Belo Horizonte, e auxiliar no conhecimento e na proteção ambiental, como APE e APA, com que são monitorados esses importantes recursos hídricos.
A presente pesquisa dá continuidade temática, porém com o enfoque em cianotoxinas, aos trabalhos realizados por Jardim (1999), que pesquisou com sucesso as espécies de cianobactérias encontradas nos mananciais das cidades operadas pela COPASA e propôs a detecção de cianotoxinas, principalmente microcistina e cilindrospermopsina, pelos métodos de bioensaio com camundongos e por CLAE.
A partir daquela data, a COPASA passou a monitorar principalmente a presença de microcistina em seus mananciais, alcançando resultados promissores.
No entanto, foi necessário incluir na rotina analítica as análises de outras cianotoxinas, como as saxitoxinas, neo-saxitoxinas, as do grupo C1 e C2, as gonialtoxinas, cujas análises ainda não eram realizadas na época.
Essa inclusão foi um fator importante no direcionamento dos trabalhos de pesquisa, pois as cianobactérias desses gêneros e espécies enfocados podem em condições ambientais adequadas, constituir como fonte natural de doenças, como hepatotoxicoses de veiculação hídrica provenientes da ingestão de cianotoxinas.
Por esse motivo, esses compostos tóxicos foram incluídos na legislação brasileira através da Portaria n.º 518/2004 do Ministério da Saúde (Portaria 518/2004 MS - art.14, 1º)
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho visou a implantação de novos métodos analíticos de quantificação e detecção de cianotoxinas buscando estudar e pesquisar a sua ocorrência, avaliando a qualidade da água nos reservatórios pesquisados.
2.2 Objetivo específicos
• Avaliação da presença de microcistinas, cilindrospermopsina e de saxitoxinas que possam nos ambientes aquáticos estudados dentro da RMBH, identificando e quantificando as concentrações das principais moléculas;
• Aprimoramento das análises de cilindrospermopsina;
• Implantação e aprimoramento de análises de saxitoxinas, efetuando uma comparação entre os métodos de reação pós e pré-coluna;
• Comparação limnológica dos reservatórios pesquisados, enfocando a presença de cianobactérias e cianotoxinas, buscando contribuir com o conhecimento destes ambientes aquáticos.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste capítulo, na primeira e segunda parte, são feitas considerações sobre o histórico da técnica de cromatografia líquida e suas aplicações, e na terceira parte há uma breve revisão dos métodos analíticos utilizados para detecção de cianotoxinas.
3.1 Tópicos sobre Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE
3.1.1 Histórico
O termo cromatografia provém do grego, estando sua etimologia ligada à origem da técnica, que utilizava originalmente uma “escrita” (graphe), das “cores” (chroma) para decompor um analito em seus componentes principais. Atualmente, existem dúvidas sobre a quem se deve o batismo da técnica (ETTRE,L.S.1970).
Os princípios da cromatografia são bem antigos. Trabalhos realizados por Bruschwig em 1512, um médico prático que usou um método para purificar etanol, considerado hoje como o primórdio da cromatografia a gás, e Michael Tswett em 1903, que separou pigmentos de plantas usando o que seria uma coluna cromatográfica, foram os que primeiro empregaram o termo em seus estudos sobre o assunto (CIOLA,1998), definindo anos mais tarde o processo como apropriado para futuras separações e aplicações químicas e bioquímicas.
Tswett (1906), citado por McNair & Bonelli (1968) produziu cem trabalhos sobre cromatografia, criando o primeiro cromatógrafo funcional (Figura 3.1) da era moderna, e utilizou o termo “cromatografia” em dois trabalhos que faziam a separação dos constituintes da gema de ovo e de extratos de plantas.
Alguns conceitos como o de adsorção foram empregados pelos pesquisadores da época como W. Ostwald (1891,1895) e o próprio Tswett enfatizavam “ser evidente que o fenômeno de adsorção descrito não está restrito aos pigmentos da clorofila e devemos assumir que todas as espécies coloridas ou não coloridas podem estar sujeitas às mesmas leis’’ (DANIEL, 1980).
Figura 3.1- Esquema do cromatógrafo criado por Tswett em 1906.
Fonte: CIOLA,R. (1998).
Legenda: A: controle de pressão, D: Coluna cromatográfica M: Medidor de pressão, P: Bomba, R: Frasco da fase móvel.
Ramsey (1905) empregou pela primeira vez a cromatografia para a separação de gases.
Martin & Synge (1941) introduziram o método de cromatografia de partição entre duas fases líquidas, trabalho laureado com o Prêmio Nobel de Química em 1952 (MCNAIR &
BONELLI,1968).
Estes autores previram o uso em aplicações para separações cromatográficas utilizando uma fase móvel gasosa em lugar da fase líquida então utilizada, mas foi somente em 1952 que conseguiram construir um equipamento que permitia fazer a separação dos componentes de uma amostra usando gás como fase móvel. Era o início da cromatografia como conhecemos hoje.
A Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de microanálise, já que são quantificadas, dependendo do detetor utilizado, massas muito pequenas dos constituintes da amostra, que muitas vezes são inferiores a 10-18g (CIOLA, 1998); como por exemplo, limites de quantificação alcançados pelo detetor de fluorescência em determinações de saxitoxinas.
O primeiro nome da técnica era Cromatografia a Líquido de Alta Pressão, em uma tradução literal do termo em inglês, que deve seu nome às altas pressões utilizadas pela técnica.
Esse nome foi utilizado para diferenciá-la da cromatografia a líquido clássica, realizada à pressão ambiente. Essa técnica era também conhecida como CLAD, ou seja, Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, devido a origem do nome em inglês: High Performance Liquid Cromatography, HPLC, como é internacionalmente conhecida.
A cromatografia a líquido iniciou-se com as análises de amostras dissolvidas em solventes orgânicos, com a fase estacionária, em geral água, adsorvida em pequenas partículas ou em um suporte de fibras. Quando a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel, é chamada de “fase normal” (normal phase). Quando a fase estacionária é menos polar do que a fase móvel, é chamada de cromatografia em fase reversa (reverse phase), como são feita a maioria das determinações de cianotoxinas que utilizam a CLAE (Figura 3.2).
Figura 3.2 -Esquema básico de um cromatógrafo líquido.
Fonte: CIOLA, (1998)
Atualmente, na maioria das determinações em amostras ambientais, tanto em análises de resíduo de pesticidas, quanto de cianotoxinas, utiliza-se a fase estacionária conhecida pela abreviação de seu nome químico, ODS, ou octadecilsilano, uma cadeia de dezoito carbonos ligados a sílica (C18- Si -) de 5 µm como suporte.
A fase móvel nem sempre é somente água, muitas vezes é uma mistura de água com outros solventes como metanol, acetonitrila, em diferentes proporções, e em algumas determinações, com variações em função do tempo.
Nas determinações em CLAE, utiliza-se comumente programação de solventes ou “gradiente de solventes”, período em que a bomba de introdução da fase móvel na coluna altera continuamente a proporção dos solventes, de forma a cobrir diferentes polaridades.
Esse recurso permite uma melhor separação dos componentes da amostra; de maneira semelhante à cromatografia a gás, quando se utiliza
–
para uma melhor separação dos analitos–
programação de temperatura ou alteração no fluxo do gás de arraste.Outras determinações são feitas sem aumento ou variação na proporção dos solventes, conhecidas como análise sem “gradiente de solventes” chamada de linear ou isocrática - quando a fase móvel não se altera no decorrer da análise. Em amostras termolábeis, ou seja, que sofrem degradação com aumento de temperatura, a CLAE é recomendada, já que as análises em sua maioria são realizadas sem variações bruscas de temperatura ou realizadas a temperatura ambiente. O fator temperatura é crítico pois sua variação pode alterar o tempo de retenção dos componentes da amostra, causando uma falha em sua identificação CIOLA, (1998).
3.1.2 Aplicações da cromatografia líquida de alta eficiência
A técnica de CLAE se difundiu muito em pesquisas em que as amostras deveriam ser introduzidas nos cromatógrafos a temperatura ambiente.
Fatores como a influência da pressão e da vazão das fases móveis em análises de moléculas, como as proteínas e aminoácidos, que são em sua maioria termolábeis, o uso da CLAE se difundiu como uma técnica essencial em diferentes matrizes, para diversas determinações, desde pesticidas e compostos poluentes orgânicos, a medicamentos, drogas e toxinas.
O detetor ultravioleta (UV/Vis) é bastante sensível para moléculas que absorvem luz ultravioleta, e permite determinações nas duas regiões de comprimentos de onda, entre 190 a 350 nm (UV) e entre 350 a 900 nm (Vis), nos detetores modernos. O detetor que varia o comprimento de onda para determinar o máximo de absorbância de uma molécula de interesse, ou que leia em uma pequena faixa de comprimento de onda, onde a maioria das moléculas absorvem a luz, é conhecido como detector de arranjo de diodo (DAD), mostrado na figura 3.
Figura 3.3 – Desenho esquemático de um detetor de arranjo de diodo (DAD).
Fonte: Agilent (www.agilent.com)
O DAD dispersa a luz emitida em um espectro, e identifica o espectro de absorção de cada componente que absorva luz ultravioleta.
Os detetores para determinações e quantificações em CLAE são relativamente caros em comparação com alguns detetores utilizados em cromatografia a gás, como os detetores de ionização de chama (DIC) ou o detetor de captura de elétrons (DCE), que são mais baratos, sensíveis e específicos para determinados grupos químicos. Estes detetores são muito utilizados em análises de contaminantes ambientais.
No final dos anos sessenta e após essa época, estudos mostraram que a cromatografia líquida necessitava de um desenvolvimento tecnológico diferente daquele empregado até então, o que se verificou nos anos seguintes, com a introdução de solventes ultrapuros e detetores específicos e mais sensíveis, embora menos gerais como o DAD. Um exemplo é o detetor de fluorescência (DFL), que mede, como sugere o nome, a fluorescência emitida pelos componentes que absorveram luz ultravioleta.
Na cromatografia a gás é necessário que as moléculas sejam termoestáveis e voláteis, para possibilitar análises de compostos como pesticidas e orgânicos voláteis. Na cromatografia líquida é necessário que a amostra seja solúvel na fase móvel e que tenha uma certa interação com a fase estacionária - fator que também ocorre na cromatografia a gás. As espécies a serem analisadas na cromatografia líquida interagem ao mesmo tempo com a fase móvel, o
Lâmpada de deutério Célula de fluxo
Lentes de foco
Lente espectral
Espelho refletor Fenda
Arranjo de diodo
solvente que atravessa a coluna cromatográfica, e com a fase estacionária. Essas interações permitem a separação dos constituintes da amostra. A fase estacionária que preenche a coluna cromatográfica são produtos de origem vegetal como o carvão ativado, de origem animal, como as terras diatomáceas ou mineral, como o ODS, comumente utilizado em análises de cianotoxinas. A técnica cromatográfica permite a análises de diversos tipos de compostos que estão relacionados na tabela 3.1.
Tabela 3.1
Aplicações da técnica de cromatografia líquida e a gás
Tipo de Cromatografia Aplicações
Cromatografia líquida (CLAE) Proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos, polissacarídeos Lipídeos polares, pigmentos e metabólicos de plantas Farmacêuticos, polímeros sintéticos, surfactantes
Íons metálicos, cátions e ânions, complexos de metais pesados Corantes, explosivos.
Cromatografia a gás (CG) Pesticidas, compostos polares de alto peso molecular Compostos voláteis, sais inorgânicos e orgânicos Polímeros, aminoácidos puros, compostos iônicos.
Fonte: Fundamentos da cromatografia a gás e a líquido de alto desempenho. Remolo Ciola
Durante anos a cromatografia líquida permaneceu como uma “arte técnica” pois era necessário um certo conhecimento das cores para perceber a separação dos constituintes das amostras. As teorias que existiam na época não explicavam como era o desempenho das colunas cromatográficas, qual era a influência da fase móvel e como acontecia a interação dessa com a fase estacionária. No tempo de Tswett, a cromatografia a líquido era feita em tubos de vidro preenchidos com fase estacionária, quase sempre carvão vegetal ou terra diatomácea, e a passagem da fase móvel era feita por gravidade ou, quando muito, utilizando a pressão de um gás inerte, como hélio ou nitrogênio aplicado sobre o solvente (CIOLA, 1998). O processo era lento e às vezes demorava dias, e como dependia de observação visual, era comum a troca de observadores, o que às vezes dificultava a interpretação dos resultados, até que se passou a fazer análises químicas das frações coletadas, e com o auxílio destes resultados analíticos, construía-se um cromatograma, que não passava de um gráfico de
para a detecção de compostos insataurados e de lâmpadas fluorescentes para compostos aromáticos. Nessa época a cromatografia líquida era essencialmente uma técnica preparativa, onde a partir das frações separadas e purificadas era feita a identificação dos constituintes da amostra através de métodos físico-químicos convencionais. Essa técnica analítica permaneceu estagnada em comparação com a cromatografia a gás até os anos setenta, quando alcançou um rápido desenvolvimento, devido principalmente à necessidade de se analisar novos tipos de compostos, que eram introduzidos para o controle de pragas e vetores, a uma velocidade até então inédita. Os principais avanços alcançados nessa década da técnica de cromatografia estão listados na tabela 3.2 (Apostila COPASA).
Tabela 3.2
Avanços da cromatografia a líquido e a gás
Ano Autores Avanços
1903 Tswett Fenômenos de adsorção em colunas
1931 Kuhn, Lederer e Winterstein Primeiras separações preparativas importantes 1938 Izmailov e Shraiber Cromatografia de camada fina
1941 Martin e Synge (Nobel) Cromatografia de partição líquido-líquido 1944 Consden, Gordon e Martin Cromatografia em papel
1949 Speeding e Tompkins Cromatografia de troca iônica
1952 James e Martin Cromatografia a gás
1957 Golay Colunas capilares para CG
1959 Porath e Flodin Cromatografia por exclusão por tamanho
1966 Piel Cromatografia a líquida moderna*
Legenda: *Primeiro autor a efetuar separações cromatográficas com grande eficiência.
3.2 Considerações sobre métodos de quantificação de cianotoxinas
Alguns métodos para se detectar e quantificar cianotoxinas em água e seston foram desenvolvidos com o objetivo de se identificar precisamente quais cianotoxinas estão presentes no corpo d‘água (CARMICHAEL, 1992). Diferentes cianobactérias produzem toxinas diversas que possuem características químicas próprias, e que são analisadas, muitas vezes, variando as fases móveis e empregando diferentes reagentes químicos para a sua determinação.
A Figura 3.4 mostra diversos métodos possíveis de serem usados para a detecção de cianotoxinas em relação à seletividade versus sensibilidade, adaptado de CHORUS, &
BARTRAM, 1999.
CG/EM 100 RMN CG/EM 75
CLAE / UV/DAD
25
CL/camada fina
Bioensaio (camundongo) EEIC (ELISA)
Ensaio de fosfatase
0 ug
ng
pg
fg
10-6
10-9 10-12 10-15 Sensibilidade
Figura 3.4 - Relação entre sensibilidade e seletividade de diversos métodos analíticos para cianotoxinas. Em negrito ensaio biológico ou bioquímico, em itálico ensaio físico-químico. A linha vermelha indica os ensaios mais sensíveis em relação aos mais seletivos. A posição da seta indica os métodos mais sensíveis. Legenda: (CG/EM, cromatografia gasosa com espectrometria de massas; CLAE/ EM / DAD, cromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas, detetor de arranjo de diodo; CL, cromatografia de camada fina;
EEIC, ensaio de enzima imuno-conjugada (ELISA); UV, ultravioleta; RMN, ressonância magnética nuclear).
Para se verificar a qualidade da água aduzida e distribuída deve-se realizar análises de cianobactérias que possam estar presentes no manancial, para a partir daí então, conduzir as análises de cianotoxinas.
Apenas a identificação taxonômica das algas, não é suficiente para avaliar, em florações de cianobactérias, a presença de cianotoxinas, pois algumas cepas podem não ser tóxicas (VEZIE et al. 1998, MOREIRA & JARDIM 1996).
Assim, deve existir no laboratório responsável pelas análises uma intensa troca de informações tanto analíticas quanto hidrobiológicas, bem como informações de campo,
CLAE/EM S
e n s
i l i d a d e
visando adequar a coleta segundo as necessidades dos métodos para as determinações de cianotoxinas de acordo com o volume e matriz da amostragem.
Coletas realizadas em um dia podem não ser representativas e deve-se levar em conta condições locais, como direção do vento, que conduz as florações para as margens, ou para próximo à tomada d’água da captação, aspectos morfológicos e características físico-químicas e biológicas capazes de provocar alterações que induzam ao aparecimento de florações de algas e cianobactérias (VON SPERLING, 1999).
Além disso, outras áreas operacionais e gerenciais devem ser envolvidas para que em uma tomada de decisão se leve em conta as características de cada manancial.
Deve-se levar em conta no entanto, os custos e o conhecimento das técnicas disponíveis para se definir qual é a mais adequada em cada caso como mostrado na Tabela 3.3.
Tabela 3.3
Métodos analíticos e comentários para detecção de cianotoxinas Cianatoxinas Método Estimativa de
custos1
Comentário CLAE/DAD Alto por espectro de
UV
Tentativa de identificação
CL/EM Muito alto2 Diferentes interfaces, confirmação do nº massa, requer especialista Microcistina
Nodularina
TLC5 Baixo3 Qualitativo, requer confirmação das toxinas
MALDI-TOF4 Baixo3 Seletividade, confirmação da toxina, requer especialista RM Muito alto Pode caracterizar a toxina, requer
especialista, alta concentração Cilindrospermopsina CLAE/DAD Alto Padrão difícil acesso, identificação
por espeto de UV
CLAE - pré-coluna Alto Requer derivatização, baixa estabilidade do derivado Saxitoxinas CLAE - pós
coluna
Alto Requer sistema de derivatização, uso de diferentes fases,
seletividade
CL/EM Muito alto Melhor método para todas
variantes. Requer especialista, alto investimento de recursos
(1) - Custos altos referem-se à aquisição, treinamento e consumíveis.
(2) - Custos muito altos referem-se ao alto investimento em equipamentos, treinamento etc.
(3) - Custos baixos referem-se ao pouco investimento em equipamentos, consumíveis etc.
(4) - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF).
(5) – Thin Layer Cromatography- do Inglês cromatografia em camada delgada.
Fonte: Adaptado de CHORUS, I & BARTRAM, J (1999).
Técnicas analíticas simples e de baixo custo, como o ensaio de enzima imuno-conjugada
(EEIC), podem ser empregadas quando se quer respostas rápidas para a operação ou em regiões distantes dos grandes centros e podem ajudar em uma rápida tomada de decisão.
Com base nesses resultados, deve-se realizar análises mais complexas, que envolvem maiores custos, além de treinamento específico para se determinar e quantificar com maior segurança os tipos de cianotoxinas presentes.
Devido às diversas substâncias biologicamente ativas produzidas pelas cianobactérias, com características físico-químicas distintas, faz-se necessário adequar a técnica analítica de cromatografia líquida a cada uma delas.
As análises e determinações qualitativas e quantitativas para microcistinas, cilindrospermopsina e saxitoxinas serão descritas em Material e Método.
3.3 Considerações analíticas e históricas sobre a determinação de hepatotoxinas em amostras de água e seston
3.3.1 Microcistina: aspectos históricos no Brasil e no mundo
As microcistinas são atualmente as cianotoxinas mais estudadas no mundo. Sua estrutura molecular elucidada demonstra que atualmente pelo menos 80 variantes similares produzidas por cianobactérias de água doce, principalmente Microcystis aeruginosa, Anabaena, Nostoc e Oscillatoria (algumas recentemente classificadas como Planktothrix).
A história destas biotoxinas, conhecidas como microcistinas e sua ocorrência no mundo, como causadora de hepatotoxicoses, em casos que envolvem animais (SCWIMMER&
SCWIMMER, 1988; CARMICHAEL, 1994) e seres humanos, é bem documentada e com ocorrências de intoxicações largamente distribuídas geograficamente (CHORUS e BARTRAM, 1999), tanto em países de clima temperado quanto tropical.
Após alguns anos de estudo (BOTES et al., 1982, 1985; SANTIKARN et al., 1988), a microcistina-LR teve sua estrutura molecular elucidada.
Baseado em análises de espectrometria de massas de bombardeamento atômico rápido (EM/BAR) e ressonância magnética nuclear (RMN), estudos realizados por esses autores na molécula denominada BE-4, produzida por uma cepa WR70 sul-africana de Microcystis aeruginosa, mostrou ser um heptapeptídeo cíclico com peso molecular de 909 Daltons.
O estudo desses autores mostrou também que outras três toxinas provenientes da cepa WR-70 continham os mesmos aminoácidos-D e mais dois novos aminoácidos conhecidos depois como Medha e ADDA. A estrutura diferia nessa cepa, a qual, continha os aminoácidos-L- leucina-arginina, tirosina-arginina e tirosina-alanina - ao contrário da leucina-alanina presente na toxina BE-4. Essa molécula teve então seu grupo químico foi determinado como N- metildehidroalanina (Medha), uma cadeia apolar de vinte átomos de carbono, que se desdobrava em um aminoácido-β, e um ácido dienóico 3-amino 9-metoxi-2-,6,8-trimetil-10- decafenil-4,6, conhecido pela sigla ADDA.
Foi demonstrado também que, a hepatotoxina isolada de uma floração no reservatório de Malpas, em Nova Gales do Sul, Austrália (ELLEMAN et al., 1978), continha cinco aminoácidos característicos da molécula estudada por eles, mais o aminoácido-L variante da tirosina-metionina.
Um nome genérico proposto de cianoginosina (CYGSN-L), indicando pelo sulfixo, o nome da espécie (M. aeruginosa), onde foi encontrada a toxina seguido da letra L que indica a sequência e identidade do aminoácido (BOTES, 1985), a qual foi renomeada para cianoginosina-LA, referente aos aminoácidos envolvidos em sua molécula, respectivamente leucina e alanina.
Microcistina é o termo que foi dada ao fator de morte rápida (FMR) produzido pelas cepas NRC-1 e SS-17 de Microcystis aeruginosa (BISHOP et al., 1959; KONST et al., 1965).
Outros nomes foram propostos para designar esse fator como cyanoviridin (KUSUMI et al., 1987), mas em 1988 o termo microcistina (MCYST) foi internacionalmente estabelecido por Carmichael et al., (1988 b) e aceito pela comunidade científica, evitando a confusão de nomenclaturas nos artigos publicados sobre esses peptídeos cíclicos.
Variações dos sete aminoácidos já foram pesquisadas, sendo a mais frequente as substituições dos aminoácidos-L das posições 2 e 4, e a desmetilação das posições 3 e/ou 7 mostradas na
figura 3.5 (SIVONEN et al., 1999).
Figura 3.5 - Estrutura geral da microcistina, mostrando os principais grupos de aminoácidos.
Fonte: CHORUS, I., BARTRAM, J. Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health consequences, monitoring and management. Published on behalf of World Health Organization, p. 45.
Atualmente as microcistina são classificadas como heptapeptideos cíclicos que possuem a estrutura molecular geral mostrada na figura 3.4.
Essa estrutura contém um ácido D-glutâmico γ- ligado (∆-Glu), D-alanina (∆-Ala), ácido β- metil aspártico-eritro-D, β-ligado (∆-MeAsp), N- metildehidroalanina (Mdha) e o aminoácido dienóico - C20β (Adda-3-amino-9-metoxi-2,6,8,trimetil-10-decafenil-4 (E), 6 (E)).
Os outros dois aminoácidos-L são variações das posições dois e quatro da cadeia cíclica (LAWTON et al., 2001).
Assim, diferentes microcistinas são nomeadas pelos aminoácidos L mais comuns presentes, como arginina-arginina (RR), tirosina-arginina (YR) e leucina-arginina (LR), que nomeiam respectivamente as variantes de microcistina RR, YR e LR, as mais tóxicas e comuns na maioria das determinações feitas em amostras do ambiente aquático.
Essas microcistinas são frequentemente encontradas em diversos países em florações de Microcystis, embora nem sempre ocorram todas as variantes juntas (WATANABE et al.,1986; PARK et al., 1993; HENRIKSEN, 1996).
As variações dos sete aminoácidos mais frequentes - aminoácidos - L, microcistinadimetil-H
ou CH3 (R1 e R2), ácido β-metil aspártico-eritro-D, (∆-MeAsp), N-metildehidroalanina (Mdha) e o aminoácido dienóico (Adda) são responsáveis por quase todas as 60 variantes de microcistina, que foram determinadas e caracterizadas por pequenas modificações em sua molécula em vários países (MARŠÁLEK et al., 2001 citados por CHORUS, 2001).
A microcistina, principalmente a variante LR, é largamente encontrada em todo mundo, sendo também a mais encontrada em florações de cianobactéria (VASCONCELOS et al., 1995, 1996), seguida das variantes MC-RR e/ou MC-YR.
Há também relatos da predominância da microcistina -LR em amostras de seston em trabalhos nos Estados Unidos, Canadá e na França (STOTTS et al., 1991; KOTAK et al., 1995; VEZIE et al., 1997).
Na Lagoa dos Patos, no sul do Brasil, foram encontrados resultados médios que variaram de 0,1 a 1 µg.mg-1 de cianotoxinas intracelulares provenientes de Microsystis aeruginosa consideradas altamente tóxicas (YUNES et al., 1996; MATTHIENSEN et al.,1999). Esses valores são compatíveis com os encontrados por Coelho et al., (1998) e Hirooka et al. (1998) ambas para o gênero Microsystis spp, também relatada em outros países, (WATANABE et al.,1992, CRRISTOFFERSEN, 1996, UENO et al.,1996).
Na Austrália, 23 diferentes microcistinas foram detectadas por CLAE em uma floração de Microcystis aeruginosa, mas nenhuma foi relatada como microcistina-LR (JONES et al., 1995), a variante mais comum.
No Brasil, em florações de Microcystis aeruginosa, M. flos-aquae e M. novacekii, a mesma variante de microcistina-LR foi encontrada em uma estação de tratamento de esgotos (ETE), para a remoção de matéria orgânica e lançamento posterior a um possível manancial de captação de água (JARDIM,1999) relatada como a primeira determinação de cianotoxina por CLAE realizada em Minas Gerais, mostrada na figura 3.6.
Figura 3.6 - Espectro e cromatograma da primeira microcistina determinada por CLAE na COPASA em 1999.
Fonte: COPASA.
Em 1988, uma grave epidemia de gastroenterite, com 88 casos fatais e 2000 internações hospitalares ocorrida na região de Paulo Afonso (BA), foi relacionada à presença de Microcystis na água do reservatório de Itaparica (TEIXEIRA et al., 1993).
Uma outra ocorrência mais grave ainda, estudada por pesquisadores brasileiros e pela comunidade internacional, foi um surto de hepatotoxicose em fevereiro de 1996 no estado de Pernambuco, cidade de Caruaru (AZEVEDO, 1996).
Naquela ocasião, 116 pacientes de uma clínica de hemodiálise tiveram sintomas que variaram de náusea, vômito, fraqueza muscular e aumento do fígado (hepatomegalia), além de hemorragia. Destes pacientes, 110 desenvolveram um grave hepatotoxicose.
Em dezembro do mesmo ano, 76 pacientes vieram a morrer, sendo que, 53 dessas mortes foram decorrentes da “síndrome de Caruaru” (AZEVEDO, 1996; CARMICHAEL et al., 1998), como passou a ser conhecida essa fatalidade.
Posteriores estudos do fitoplâncton, análises da água e de tecidos, permitiram concluir que a maior fatalidade ocorreu em pacientes intoxicados via exposição intravenosa principalmente por microcistina, das variantes LR, AR e YR, embora tenha sido também identificada nas amostras a presença do alcaloide hepatotóxico cilindrospermopsina (CARMICHAEL et al., 2001; AZEVEDO et al., 2002).
Espectro da amostra (238 mm)
Espectro de microcistina - padrão em vermelho
(238mm) Pico cromatografico da
amostra
