Apresentação do resultado do trabalho de monitoramento de cilindrospermopsina

Como exemplo de implantação do método, um resultado positivo para cilindrospermopsina de março de 2005 decorrente de uma floração de Cylindrospermopsis raciborskii na cidade de Guaranésia, localizada no sul do estado de Minas Gerais. Essa floração comprometeu o abastecimento da cidade e foi aproveitada para implantar e aprimorar o método de detecção de cilindrospermopsina por EFS. Os resultados, mostrados nas figuras 5.10 e 5.11, são os primeiros dados de quantificação de cilindrospermopsina por CLAE em Minas Gerais.

m in

0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5

m AU

- 0.4 - 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8

D AD 1 A, Sig= 262,16 R ef= 360,100 ( 010405C Y\C YLI0002.D ) 1.2

83

Ar ea: 2.86856 8.968

Pic o putativo de cilindrospermopsina - c onc, 49 ug/L

Figura 5.11 - Cromatograma de amostra de água de Guaranésia.

200 220 240 260 280 nm

Norm

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

*DAD1, 4.655 (0.8 mAU, - ) Ref=4.042 & 5.269 of CYLI0002.D

Cilindrospermopsina Especrto de absorcao da amostra( Saida Lagoa)

*Padrão

Figura 5.12- Espectro de absorção de amostra de água de Guaranésia padrão puro de cilindrospermopsina

Observa-se no espectro de absorção da amostra em comparação com o do padrão, coincidência em 262 nm, o que permite a positivação dos resultados.

5.4.6 Saxitoxinas

Foi implantado a partir deste trabalho o método de derivatização pós-coluna e pré-coluna para determinação de saxitoxinas, o qual realiza a integração dos picos cromatográficos das (figura 5.12 e 5.13).

a)

2 4 6 8 10 12 14 m in

%F

2 2.5

3 3.5

FLD1 A, Ex=330, Em =390 (071204UL\STXPOS01.D)

STX

Neo-STX-

dc-STX

5.3 56

6.43 9

10.52

b)

Figura 5.13 - Picos cromatográficos do grupo das saxitoxinas - Neo-STX, dc-STX e STX.

Métodos pós-coluna (a) e pré-coluna (b).

Os cromatogramas das toxinas do grupo das saxitoxinas apresentam picos com tempo de retenção e ordem de saída compatíveis com os padrões adquiridos e com a literatura publicada

FLD1 A, Ex=330, Em=390 (C:\BACKUP\1\DATA\090904B\SAXITOX0.D)

15.

40

STX3

(OSHIMA,Y.,1995).

Na figura 5.14 são apresentados os picos cromatográficos das goniautoxinas.

Figura 5.14 - cromatograma característico das goniautoxinas.

Nesse trabalho, como foi relatado no capítulo 4.4.1, os métodos empregados para identificação e quantificação das saxitoxinas foram os que envolvem derivatização pós-coluna ou pré-coluna, ou seja, onde as reações de acidificação e oxidação acontecem respectivamente, antes e após terem os componentes sido separados pela coluna, como descrito no capítulo 4.

Figura 5.15 - Curva de calibração para quantificação de saxitoxinas (STX´s).

Os dois métodos apresentam particularidades em alguns parâmetros cromatográficos. O tempo de retenção (RT) de algumas toxinas no método pré-coluna apresenta diferenças; esse fato pode ser explicado pelo caminho mais longo a ser percorrido até sua detecção, ao

Amount[ug/L]

0 Area

0 25 50 75 100 125 150

1 2

3

STX, FLD1 A

Correlation: 0.99985 Rel. Res%(1): 1.318

Area = 0.13784752*Amt -0.5129196

4

5 6

7

contrário do método pós-coluna onde a detecção é feita após a saída da cianotoxina da coluna e sua respectiva detecção.

Nota-se, como mostrado na figura 5.15, que o RT para STX no método pré-coluna apresenta-se um pouco maior.

O método pré-coluna pode ser empregado, quando não se tem um reator pós-coluna.

Esse equipamento – complexo em sua operação – apresenta frequentes vazamentos e consequente perda dos analitos. Por outro lado, quando bem consolidado em sua rotina, o método pós-coluna apresenta vantagens em relação ao pré-coluna, pois é capaz de realizar várias amostras em sequência, aumentando a produtividade com o uso do injetor automático e da programação de amostragem.

As amostras podem ser corridas à noite quando o cromatógrafo está disponível, o que não acontece com o método pré-coluna, no qual as amostras devem ser realizadas uma a uma e acompanhada pelo analista. Deve-se também ter o cuidado em não elevar o tempo total da corrida cromatográfica devido à possível degradação do composto de derivatização produzido. Essa degradação, embora não tenha sido o foco desse trabalho, não foi verificada.

No método pré-coluna – devido a programação do injetor que utiliza volumes iguais em cada injeção, deve também ser levado em conta, o volume total dos reagentes e da amostra.

As adições devem ser levadas em conta para o correto cálculo estequiométrico para a quantificação das cianotoxinas.

(5.1)

Esse cálculo pode ser ilustrado pelas seguintes equações na qual:

55 = µL volume final injetado da amostra de interesse;

Quantidade

injetada = 55 x 20 µL 92

92 = µL volume total de reagentes e amostra (20 µL da amostra + 70 µL do agente oxidante + 2 µL de ácido acético).

Consultar tabela 4.4 página 72.

Como exemplo, utilizando-se um padrão de STX de 65 µmoles/L temos:

(5.2) na qual:

55 = µL volume final injetado da amostra de interesse após a adição dos reagentes;

92 µL = volume total de reagentes e amostra (20 µL da amostra + 70 µL do agente oxidante + 2 µL de ácido acético);

65 = concentração do padrão em µmoles da saxitoxina;

1000 = fator de conversão para moles.

O valor encontrado relacionado à área do padrão injetado, onde: 777, 2 ρmoles encontrados em (5.2) é relativo a 29877 de unidades de áreas do padrão de STX (figura 5.16), injetado nas mesmas condições da amostra.

Figura 5.16 - Cromatograma de STX utilizada como padrão externo para quantificação pelo método pré-coluna.

Quantidade

injetada STX = 20 x 65 x 55 = 777,2 ρmoles 1000 92

0 2 4 6 8 10 12 14 min

%F

1.5 2 2.5 3 3.5 4

FLD1 A, Ex=330, Em=390

(1008PRE\SAXPOS01.D)

Area 29877 7.507

Esses cromatogramas foram gerados pelos padrões puro de saxitoxinas adquiridos do NRCR, Canadá, os quais foram usados na curva de quantificação das saxitoxinas (tabela 5.7) calculadas em relação aos valores equivalentes grama ao encontrado para STX.

Utilizou-se o sistema de padronização externa que relaciona a área dos picos cromatográficos das amostras com a concentração conhecida e incluída na curva de calibração do método.

Os dados gerados no trabalho permitiram concluir que, em pesquisas para identificação e quantificação de saxitoxinas, ambos os métodos abordados podem ser utilizados, desde que sejam considerados os limites e as particularidades, como diferentes RT e reagentes usados.

5.4.6.1 Limite de detecção de saxitoxinas – método pós-coluna Tabela 5.7

Limite de detecção – saxitoxinas

P arâmetr o: Saxitox inas Data: 20/07/2005

A par elho HP LC 1100 Patrim ônio: 186427

M étodo: Cromatografia liquida com detetor de fluoresc ênc ia

P adr ão 1 20,4 ng/L

N leituras

1 20,31

2 20,74

3 20,64

4 20,45

5 20,89

6 21,65

7 20,85

M édia X 20,79 Desv io S 0,4329

P RECIS ÃO % Sd=( S*100)/x

%DR 2,08 A CEITO

E XATIDÃ O Da =(( Vr-m édia)/Vr )*100conc

%A final 1,91 A CEITO

RE CUP ERAÇÃO DO MÉTODO % R = (média/valor real)*100conc V alor lim ite 80 a 120 %

%R1 101,91

TESTES DAS RAZÕ ES V alor lim ite 10%

Razão das concentrações 0,98 c orreto LIMITE DE DETE CÇÃO DO MÉ TODO LDM =( Valor real *2,0*S)/Média

LDM 0,8495 ng/L

LIMITE DE CONFIANÇA LConf = (t.S)/raizN conc

S 0,4329 desv io

t 95% 2,365 fator student

N 7 no leituras

Raiz N 2,6458

Lc onfianç a 0,3869 ug/L