Procedimentos de análises para saxitoxinas - método pré-coluna

CLAE ou em bancada. Ela é realizada, utilizando-se reagentes de derivatização e acidificação, em proporções estequiométricas adicionadas em frascos com volumes conhecidos e quantificadas pela comparação entre as áreas.

Chamado de método pré-coluna devido a derivatização para emissão de fluorescência dos constituintes da amostra ser realizada antes de sua introdução na coluna cromatográfica e no detetor, esse método possui a vantagem da determinação das toxinas ser mais rápida, embora não possa ser realizado continuamente com a programação automática do injetor. Isso se deve a troca constante das posições das amostras ser feitas uma a uma pelo analista, com os reagentes de derivatização e acidificação adicionados pelo amostrador automático de maneira constante. Os frascos utilizados – quando em amostragem automática – devem ser trocado em cada injeção para não haver transferência e contaminação de uma amostra para outra, exigindo atenção do analista em todas as etapas operacionais do cromatógrafo, tornando a análise das saxitoxinas, neste método, improdutiva e passível de erros.

Com alguma perda de automação, esse fato pode ser contornado fazendo-se a adição dos reagentes de derivatização e acidificação em bancada, aguardando-se o tempo adequado para conclusão das reações químicas citadas.

As amostras de água bruta e tratada, coletadas em um frasco âmbar de um litro de capacidade devem ser colocadas em béquers e evaporadas em uma chapa aquecedora a 45ºC até secura.

Em seguida, atacadas com aproximadamente 2 mL de ácido acético 50 mM, filtrados em membranas filtrantes 0,45 µm adequadas para o uso em solventes aquosos, visando retirar materiais em suspensão, transferidas para frasco de injeção de 2 mL e guardada em geladeira até análise.

Foram feitas coletas de seston nos períodos de floração de algas, verificadas somente no reservatório de Vargem das Flores, no verão de 2003 e 2004.

As amostras de seston foram liofilizadas ou concentradas em um filtro de borosilicato, colocadas em um béquer em banho de gelo, adicionadas com um volume de ácido acético 50 mM até serem cobertas, ultrasonicadas três vezes por dez minutos com intervalos de cinco minutos, reunidas e centrifugadas por 15 minutos a 2500g para remoção da parte sólida.

A fase líquida foi filtrada em membrana filtrante aquosa de 0,45 µm e colocada em frasco de

2 mL, e guardada em geladeira até análise por CLAE.

No método de determinação de saxitoxinas por pré coluna, cada etapa do programa deve ser adequada para que as reações ocorram, como a introdução do reagente de oxidação no passo 3 por exemplo e, a espera de seis minutos no passo 6 para o término da etapa de oxidação. Essas etapas são mostradas na tabela 4.3.

A fase móvel é constituída de duas soluções, um tampão de potássio e sódio (fase A) e outra do mesmo tampão adicionado com 3,5 % de acetonitrila (fase B), ambas soluções, corrigidas para um pH de 6.8.

A amostra a ser analisada deve ser identificada como frasco 1, o reagente de oxidação – composto de uma solução com periodato de sódio – como frasco 2 e o acidificante, ácido acético, como frasco 3, por exemplo. Alíquotas dos frascos citados acima devem ser reunidas em frasco vazio, onde ocorrerá a reação de derivatização, para em seguida, serem injetados no cromatógrafo.

As condições iniciais do programa de injeção são importantes para que quando for utilizado um amostrador automático, as amostras possam ser localizadas na ordem de amostragem correta. Podem ser escolhidos outros números de frascos desde que se respeite a ordem de amostragem (ORR, 2001).

O injetor automático (figura 4.4) deve ser capaz de realizar uma limpeza constante da agulha de injeção com a fase móvel, entre cada passo, para se evitar contaminações entre uma amostra e outra.

A amostra e os reagentes de oxidação e de acidificação devem ser recolhidos conforme a programação de injeção e misturados através de um capilar de 100 µL ou maior.

Esse método de análise pode ser feito em bancada quando não se tem disponível um injetor automático, e deve seguir os mesmos etapas descritos no método.

Figura 4.3 – Esquema do injetor automático programável utilizado em análises de saxitoxinas.

A tabela 4.3 lista os vários passos para análise automatizada de saxitoxinas por derivatização pré-coluna.

A etapa 1 é necessária para que o injetor automático do CLAE/ HP 1100 esteja pronto para realizar as outras etapas. Alguns cromatógrafos de outras marcas podem não necessitar desta etapa. As etapas de 1 a 4 são realizadas automaticamente dentro de um capilar de teflon® que deve ter a capacidade de pelo menos 100 µL para possibilitar a mistura da amostra com o reagente oxidante.

A derivatização das saxitoxinas em um composto que emite fluorescência é realizada a temperatura ambiente.

Os compostos são separados em uma coluna cromatográfica de fase reversa ODS/C18 de 15mm ou de 25 mm e detectados através de um detetor de fluorescência usando o comprimento de onda de excitação a 330 nm e emissão a 390 nm.

B ra ço m ecânico

B andeja

L o op

Sering a de injeção

V álvula de seis vias

Tabela 4.3

Etapas da programação de injetor automático para análise de saxitoxinas

1 Aspira Ar (etapa de preparação do injetor) 2 Aspira 20 µL da amostra (frasco 1) 3 Aspira 70 µL agente oxidante (frasco 2) 4 Mistura 10 vezes (Frascos 1 e 2 ) 5 Ejeta (mistura) Frasco 4 (frasco vazio)

6 Espera Seis minutos

7 Aspira 2 µL de ácido acético glacial (frasco 3) 8 Ejeta 2 µL de ácido acético frasco 4

9 Aspira 100 µL do frasco 4 (mistura final)

10 Mistura 10 vezes

11 Ejeta Resultante da mistura no frasco 4 12 Aspira 55 µL da mistura final

13 Injeta CLAE / DFL

Fonte: Método COPASA (modificado método CSIRO- Land and Water Company, Austrália, 2001).

A fase móvel para a análise de saxitoxinas pelo método de reação pré-coluna é constituída por duas soluções: um tampão de fosfato de potássio dibásico (K₂HPO₄) e fosfato de sódio dibásico (Na₂HPO₄₎ chamados aqui de “fase A”, e o mesmo tampão adicionado a 3,5% de acetonitrila, chamado de “fase B”, ambos em pH 6.8.

As análises de saxitoxinas por esse método são realizadas com gradiente de solventes para separação das saxitoxinas (tabela 4.4).

Tabela 4.4

Condições do gradiente de solventes

Tempo/min %A %B Fluxo (ml/min Pressão (PSI)

0,01 100,0 0,0 1000 400

11,00 0,0 100,0 1000 400

24,99 0,0 100,0 1000 400

25,00 100,0 0,0 1000 400

Legenda: %A = Tampão fosfato de potássio (0% ACN). %B = Tampão fosfato de potássio (3.5 % ACN).