UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Nathan Ravi Medeiros Honorato
AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE TRIATOMÍNEOS E DISTRIBUIÇÃO DE DTUs DO Trypanosoma cruzi EM DIFERENTES MESORREGIÕES DO RIO
GRANDE DO NORTE, BRASIL
NATAL-RN 2020
Nathan Ravi Medeiros Honorato
AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE TRIATOMÍNEOS E DISTRIBUIÇÃO DE DTUs DO Trypanosoma cruzi EM DIFERENTES MESORREGIÕES DORIO
GRANDE DO NORTE, BRASIL
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área de parasitologia.
Orientadora: Profa. Dra. Antônia Cláudia Jácome da Câmara Co-orientadora: Dra. Andressa Noronha Barbosa da Silva
Natal-RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Honorato, Nathan Ravi Medeiros.
Avaliação da presença de triatomíneos e distribuição de DTUs Trypanosoma cruzi em diferentes mesorregiões do Rio Grande do Norte, Brasil / Nathan Ravi Medeiros Honorato. - Natal, 2020. 78 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Biologia Parasitária.
Orientadora: Profa. Dra. Antônia Cláudia Jácome da Câmara. Coorientadora: Profa. Dra. Andressa Noronha Barbosa da Silva.
1. Triatoma brasiliensis - Dissertação. 2. Peridomícilio - Dissertação. 3. Unidades distintas de tipagem - Dissertação. 4. Infecção mista - Dissertação. I. Câmara, Antônia Cláudia Jácome da. II. Silva, Andressa Noronha Barbosa da. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSCB CDU 616.937
Nathan Ravi Medeiros Honorato
AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE TRIATOMÍNEOS E DISTRIBUIÇÃO DE DTUs DO Trypanosoma cruzi EM DIFERENTES MESORREGIÕES DO RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL
Banca Examinadora
___________________________________________ Profa. Dra. Antônia Cláudia Jácome da Câmara Presidente – UFRN
___________________________________________ Profa. Dra. Renata Antonaci Gama Examinador interno – UFRN
___________________________________________ Profa. Dra. Daniella Castanheira Bartholomeu Examinador externo–UFMG
Natal,03 de março de 2020
Natal/RN 2020
INSTITUIÇÕES ENVOLVIDAS
Projeto de Pesquisa em desenvolvimento no Laboratório de Biologia de Parasitos e Doença de Chagas, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia 2º Andar, Rua Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, Petrópolis, 59012-570, Natal, RN. Telefone: 84 3342-9827
Laboratório de Biologia do Trypanosoma cruzi e doença de Chagas, Departamento de Parasitologia, Av. Antonio Carlos, 6627, Bloco L4,
Sala 179, Campus Pampulha, 31270-901, Belo Horizonte, MG. Telefone: 31 3409-2847.
Secretarias Municipais de Saúde do RN
Apoio Financeiro
Edital Universal Nº 423966/2016
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Honorato e Neucivânia, inspirações e razões do meu viver.
À Camila, minha companheira para a vida inteira.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Antônia Cláudia Jácome da Câmara, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado por quase cinco anos, desde a iniciação científica, pelos ensinamentos, confiança e incentivo na vida acadêmica.
À minha coorientadora, Dra. Andressa Noronha Barbosa da Silva, pela contribuição em todas as etapas da pesquisa, desde a elaboração do projeto, coletas, experimentos e escrita. Mas principalmente, pela amizade sincera desenvolvida tão rapidamente.
À Profa. Dra. Lúcia Maria da Cunha Galvão pelas ideias e pelo suporte financeiro para o desenvolvimento do trabalho.
Ao Laboratório de Imunogenética (IMT-UFRN) e ao Laboratório de
Biologia Molecular e Genômica (CB/UFRN) pela quantificação das amostras de DNA
no Nanodrop®.
À Secretaria Estadual de Saúde Pública do Rio Grande do Norte, especialmente à Lúcia Maria Abrantes Aguiar, pelos dados e amostras cedidas e pela agradável coleta em Caicó.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária pelos ensinamentos transmitidos.
Aos amigos do PPgBP pelos momentos de alegria e descontração ao longo de todo o curso, principalmente durante as disciplinas. Apesar da distância física na maior parte do tempo, vocês foram fundamentais nesses dois anos.
Aos moradores por permitir que adentrássemos em suas casas para realização da pesquisa.
Aos agentes de endemias de todos os municípios pela colaboração com as capturas.
Aos motoristas pela disposição e ajuda nas viagens.
À Vicente Toscano de Araújo Neto, George Harisson Felinto Sampaio e
Renata de Cássia Pires pela amizade, conversas e viagens agradáveis.
Aos alunos de iniciação científica Christiane Carlos Araújo de Negreiros,
Erivanessa Nara dos Santos, Letícia Mikardya Lima Sales e Miguel Henrique Ferreira da Silva pela amizade, risadas e colaboração nas coletas e nos experimentos
À Crisdavid Henrique da Silva Nascimento, Maria da Luz da Silva Filha e
Michelle Medeiros do Amaral Veríssimo pela amizade e auxílio e organização do
laboratório antes, durante e após os experimentos.
À Rogenilton, Elivan, Nilda e equipe de limpeza da Faculdade de Farmácia
da UFRN pelas conversas matinais e pela manutenção do prédio.
Aos meus pais Honorato e Neucivânia pela educação, incentivo, amor e por entenderem minha ausência nos últimos anos. Sem vocês nada disso seria possível.
À Camila pelo amor e companheirismo na nossa jornada.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, minha segunda casa. À Capes pelo apoio financeiro.
RESUMO
Este trabalho avaliou a presença, a distribuição de triatomíneos e unidades distintas de tipagem (DTUs, Discrete Typing Units) do Trypanosoma cruzi isolados de vetores em diferentes mesorregiões do estado do Rio Grande do Norte (RN). As buscas ativas dos triatomíneos foram realizadas em áreas rurais de 21 municípios, 71 comunidades rurais e 345 unidades domiciliares no período de 2015 a 2019. A genotipagem foi realizada pelos marcadores do gene mitocondrial da subunidade 2 do citocromo oxidase (CO II), domínio divergente D71 do gene 24Sα do DNA ribossomal (rDNA) e espaçador intergênico dos genes miniexon (SL-IR).A infestação foi observada em 7,5% (26/345) dos intradomicílios e em 16,2% (56/345) dos peridomicílios pesquisados. A presença de ninfas no peridomicílio foi observada em 94,7% (45/47) das unidades domiciliares infestadas, indicando colonização neste ambiente. Um total de 1.084 triatomíneos foram capturados em ambientes antrópicos e silvestres, sendo o Triatoma brasiliensis (84,5%) a espécie mais encontrada, seguida de Triatoma pseudomaculata (14,9%),
Panstrongylus lutzi (0,5%), Rhodnius nasutus (0,1%). O T. brasiliensis foi a única
espécie encontrada no intradomicílio, peridomicílio e ambiente silvestre, e também infestou a maior variedade de ecótopos. A infecção natural pelo T. cruzi foi observada em 11% (96/872) triatomíneos, sendo T. brasiliensis a espécie com maior número de exemplares (95,0%). Dos 96 triatomíneos infectados, foi possível isolar o parasito de 33 (34,4%) amostras, todas foram genotipadas. A DTUI: haplótipo A no COII, rDNA 2 e SL-IR com 150pb foi identificada em 51,5% (17/33) dos isolados do parasito no peridomicílio infectando T. brasiliensis nas três mesorregiões estudadas, e T.
pseudomaculata, na mesorregião Oeste. A DTU II: haplótipo C no COII, rDNA 1,
SL-IR com 150pb foi observado em 9,1% (3/33) dos isolados em T. brasiliensis apenas na mesorregião Central tanto no peridomicílio quanto em ambiente silvestre. Enquanto a DTU III: haplótipo B no COII, rDNA 2, SL-IR com 200pb estava em 27,3% (9/33) das amostras e também foi encontrada em todas as mesorregiões, no intradomicílio na mesorregião Oeste, em áreas silvestres no Centro e em peridomicílio no Agreste. A proximidade e até sobreposição de áreas de ocorrência dos genótipos foi observada em várias áreas. Em Caicó, este fato foi evidenciado pela detecção de infecções mistas com TcI e TcII. Estes resultados mostram que o T. brasiliensis continua sendo a espécie com maior importância epidemiológica no semiárido do RN, devido à ampla distribuição geográfica, alto grau de adaptação aos diferentes ambientes, ecótopos, elevado índice de
infecção natural pelo T. cruzi e a diversidade de DTUs, e reforçam a necessidade de vigilância entomológica contínua no estado, a fim de impedir o contato desta espécie com os seres humanos e animais domésticos.
Palavras-chave: Triatoma brasiliensis. Peridomícilio. Unidades distintas de tipagem.
ABSTRACT
This work evaluated the presence, distribution of triatomines and discrete typing units (DTUs) of Trypanosoma cruzi isolated from vectors in different mesoregions of the state of Rio Grande do Norte (RN). The captures of triatomines were carried out in rural areas of 21 municipalities, 71 rural communities e 345 domiciles in the period from 2015 to 2019. The genotyping was performed using the markers mitochondrial cytochrome oxidase subunit 2 (COII) gene, the region of the 24Salpha rRNA, spliced leader intergenic region (SL-IR). The infestation was observed in 7.5% (26/345) of households and 16.2% (56/345) of the surveyed households. The presence of nymphs in the home was observed in 94.7% (45/47) of the infested households, indicating colonization in this environment. A total of 1,084 triatomines were captured in anthropic and wild environments, with Triatoma brasiliensis (84.5%) being the most found species, followed by Triatoma pseudomaculata (14.9%), Panstrongylus lutzi (0.5%), Rhodnius nasutus (0.1%). T. brasiliensis was the only species found in the home, peridomicile and wild environment, and also the one that was able to infest the largest variety of infested ecotopes. Natural infection by T. cruzi was observed in 11.0% (96/872) triatomines, with T. brasiliensis being the species with the highest number of specimens (95.0%). Of the 96 infected triatomines, it was possible to isolate the parasite from 33 (34.4%) samples, all of which were genotyped. DTU I: haplotype A in COII, rDNA 2 e SL-IR with 150pb (51.5%; 17/33) was identified in the peridomicile infecting
T. brasiliensis in the three studied mesoregions, and T. pseudomaculata, in the western
mesoregion. DTU II: haplotype C in COII, rDNA 1, SL-IR with 150pb: (9.1%; 3/33) was found in T. brasiliensis only in the Central mesoregion, both in the home and in the wild. DTU III: haplotype B in COII, rDNA 2, SL-IR with 200pb:(27.3%, 9/33) was also found in all mesoregions, in the home area in the West mesoregion, in wild areas in the Center and the home area in Agreste. The proximity and even overlap of areas of occurrence of the genotypes were observed in several areas. In Caicó, this fact was evidenced by the detection of mixed infections with TcI and TcII. These results show that T. brasiliensis remains the species with the greatest epidemiological importance in the semi-arid region of RN, due to its wide geographical distribution, high degree of adaptation to different environments and ecotopes, high rate of natural infection by T.
entomological surveillance in the state, in order to prevent contact of this species with humans and domestic animals.
Key-words: Triatoma brasiliensis. Peridomicile. Discrete Typing Units. Mixed
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Delineamento experimental do estudo. SESAP – Secretaria de Saúde Pública do Estado do Rio Grande do Norte; rDNA – Domínio divergente (D71) do gene 24Sα do DNA ribossomal; SL-IR – Espaçador intergênico dos genes miniexon; COII – Polimorfismo do gene mitocondrial da subunidade 2 do citocromo oxidase.
23
Figura 2 Mapa do Brasil e do Rio Grande do Norte evidenciando as mesorregiões do estado os municípios de baixo, médio e alto de risco de transmissão vetorial do T. cruzi, de acordo com os dados entomológicos da SESAP-RN de 2005 a 2015
24
Figura 3 Mapa do Brasil e do Rio Grande do Norte destacando os municípios com busca ativa de triatomíneos, incluindo a ESEC-Seridó, e aqueles com amostras provenientes da SESAP-RN, identificados com asterisco (*)
25
Figura 4 Ambientes onde foram realizadas as buscas por triatomíneos no período de 2015 a 2019 em municípios do Rio Grande do Norte.
26
Figura 5 Percentual das espécies capturadas e estágios evolutivos de triatomíneos por ambiente de captura no período de 2015 a 2019
35
Figura 6 Percentual de captura de triatomíneos por ecótopos peridomiciliares no RN no período de 2015 a 2019
35
Figura 7 Percentual das espécies capturadas e estágios evolutivos de triatomíneos cedidos pela SESAP-RN por ambiente
38
Figura 8 Géis de poliacrilamida a 6% corados pela prata representativos das amplificações dos marcadores COII (A), rDNA (B) e SL-IR (C) dos isolados do T. cruzi obtidos de triatomíneos procedentes de diferentes mesorregiões do RN
43
Figura 9 Mapa do estado do Rio Grande do Norte mostrando a distribuição dos isolados do T. cruzi e as espécies de triatomíneos relacionados
43
Figura 10
Mapa do Rio Grande do Norte com destaque para as áreas de detecção de genótipos de T. cruzi e mostrando o raio de ocorrência a partir de cada ponto
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Cepas e clones de referências do T. cruzi utilizados como controles na caracterização genética
30
Tabela 2 Aspectos entomoepidemiológicos dos triatomíneos capturados por busca ativa em ambientes antrópicos por mesorregião e os municípios investigados no período de 2015 a 2019
33
Tabela 3 Distribuição das espécies de triatomíneos capturados por busca ativa pela equipe deste trabalho por região e municípios do estado do Rio Grande do Norte no período de 2015-2019
34
Tabela 4 Número de triatomíneos cedidos pela SESAP-RN por espécie, região e municípios do estado do Rio Grande do Norte no período de 2018-2019
37
Tabela 5 Distribuição das espécies de triatomíneos infectados por ambiente de origem capturados
38
Tabela 6 Origem, características epidemiológicas e genotipagem de populações do T. cruzi de isolados de triatomíneos capturados nas mesorregiões Oeste, Central e Agreste potiguar
LISTA DE ABREVIATURAS
AgNO3 Nitrato de prata
CCS Centro de Ciências da Saúde
CO II Citocromo oxidase subunidade II
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfato
DTU “DiscreteTyping Unit”, Unidades Distintas de
Tipagem
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ESEC-Seridó Estação Ecológica do Seridó
IRR/FIOCRUZ/MINAS Instituto René Rachou/Fundação Oswaldo
Cruz/Minas Gerais
HCl Ácido Clorídrico
HgCl2 Cloreto de mercúrio
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ICMBio Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade
KCl Cloreto de potássio
kDNA DNA do cinetoplasto
km Quilômetro
KRT Tampão Krebs-Ringer-Tris
LABIOPAR/UFRN Laboratório de Biologia de Parasitos e Doença de Chagas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
LIT “LiverInfusionTryptosemedium”, Meio Infuso de
Fígado e Triptose
Low TE Tampão Tris-HCl-EDTA
M Molar
mg Miligramas
MgCl2 Cloreto de Magnésio
min Minuto
MLEE MultilocusEnzymeElectrophoresis, Eletroforese de
Enzimas Multilocus
mM Milimolar
NaCl Cloreto de Sódio
Nº Número
ng Nanograma
nm nanômetro
NNN Meio McNeal, Novy e Nicolle
OPAS Organização Panamericana de Saúde
pb Pares de bases
PBS “PhosphateBuffered Saline”, Tampão
Fosfato-Salino
PCR “Polymerase Chain Reaction”, Reação em Cadeia
da Polimerase
pH Potencial Hidrogeniônico
RAPD Randon AmplifiedPolymorphic DNA,
Amplificação Aleatória de DNA Polimórfico
rDNA DNA ribossomal
RN Rio Grande do Norte
RNA Ácido Ribonucléico
rpm Rotações por minuto
SESAP-RN Secretaria de Saúde Pública do Estado do Rio
Grande do Norte
SL-IR “IntergenicRegionofSpliced-Leader”, Espaçador
Intergênico dos Genes Miniexon
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
UD Unidade domiciliar
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
v/v Volume/Volume
μL Microlitros
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
1.1 O parasito ... 14
1.2 Caracterização genética do T. cruzi ... 15
1.3 Epidemiologia da doença de Chagas ... 16
1.4 Os triatomíneos ... 18
1.4.1 Considerações gerais ... 18
1.4.2 Epidemiologia dos vetores no Nordeste ... 20
2 OBJETIVOS ... 22 2.1 Objetivo geral ... 22 2.2 Objetivos específicos ... 22 3 METODOLOGIA ... 23 3.1 Delineamento experimental ... 23 3.2 Área de estudo ... 23
3.3 Captura e identificação dos triatomíneos ... 25
3.4 Indicadores entomológicos ... 27
3.5 Avaliação da infecção natural ... 27
3.6 Caracterização genética do parasito ... 28
3.6.1 Cultura acelular e obtenção da massa úmida do T. cruzi ... 28
3.6.2 Extração do DNA a partir da massa úmida ... 28
3.6.3 Marcadores moleculares ... 29
3.7 Espacialização do T. cruzi no RN ... 30
4 RESULTADOS ... 32
4.1 Capturas, identificação de triatomíneos e indicadores entomológicos ... 32
4.2 Infecção natural por tripanossomatídeos ... 38
4.3 Caracterização genética do T. cruzi ... 38
4.4 Espacialização das DTUs do T. cruzi ... 40
5 DISCUSSÃO ... 45
6 CONCLUSÃO ... 52
1 INTRODUÇÃO 1.1 O parasito
O Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909), agente etiológico da tripanossomíase americana ou doença de Chagas (DC), é um protozoário flagelado pertencente ao Grupo Euglenozoa, Subgrupo Kinetoplastea e Gênero Trypanosoma (ADL et al., 2005), caracterizado pela presença de um único flagelo e cinetoplasto. O T. cruzi é um parasito digenético, presente em diversas espécies de mamíferos e triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) (BRENER, 1973).
O ciclo do T. cruzi no vertebrado se inicia quando as tripomastigotas metacíclicas, formas infectantes para os mamíferos, presentes nas fezes do triatomíneo, penetram na região de mucosa ou conjuntiva íntegra ou na pele lesionada do indivíduo durante ou após o repasto sanguíneo. Após chegar à corrente sanguínea, estas formas podem infectar qualquer tipo de célula nuclear, via fagocitose clássica ou induzida. As tripomastigotas metacíclicas rompem o vacúolo parasitóforo e a diferenciação em amastigotas ocorre no citoplasma da célula. No citoplasma, as amastigotas se multiplicam por sucessivas divisões binárias, ocupando todo o citoplasma da célula hospedeira. Logo após, o parasito se diferencia em tripomastigotas que rompem a membrana da célula e são liberados no espaço extracelular, entrando na corrente sanguínea e infectando novos macrófagos, células cardíacas musculares e lisas, neurônios e células epiteliais. Ao realizar o repasto sanguíneo em um indivíduo infectado, o triatomíneo ingere as tripomastigostas sanguíneas. Estas formas são conduzidas à porção anterior do aparelho digestivo do inseto, onde se diferenciam em epimastigostas. As formas epimastigotas sobreviventes se dividem por divisão binária e aderem às membranas perimicrovilares das células epiteliais do intestino médio do inseto. Na região posterior, as epimastigotas se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos ao entrar em contato com a urina e outras substâncias intrínsecas do inseto em um processo chamado metaciclogênese e prendem-se à cutícula que reveste o epitélio do reto e do saco retal. Ao se soltarem do epitélio, podem ser eliminadas na urina ou fezes durante ou após o próximo repasto sanguíneo (CHAGAS, 1909; BRENER, 1973; DE SOUZA, 1984).
O T. cruzi é naturalmente encontrado em ambiente silvestre infectando triatomíneos e várias espécies de mamíferos. No Brasil, este parasito foi encontrado em mamíferos não voadores pertencentes a 33 ordens além de em diversos gêneros de Chiroptera, em todos os biomas do país (JASEN et al., 2018). A transmissão pode
ocorrer da forma clássica, por meio da contaminação com as fezes do vetor ou oralmente, pela predação de animais reservatórios infectados por outros susceptíveis. A dinâmica de interação entre o parasito e hospedeiros é complexa e cada animal possui um papel único no ciclo de transmissão nos diferentes locais de ocorrência (JANSEN & ROQUE, 2010).
1.2 Caracterização genética do T. cruzi
A diversidade do T. cruzi vem sendo estudada desde a descoberta devido a diferenças observadas nas formas tripomastigotas sanguíneas (CHAGAS, 1909). Desde então, diversos critérios foram usados para a classificação desse parasito como a morfologia (BRENER & CHIARI, 1963), o tropismo por determinados órgãos (ANDRADE, 1974), o perfil eletroforótico de isoenzimas denominado zimodema (MILES et al., 1977; BARRETT et al., 1980), além de parâmetros biológicos e histopatológicos em animais experimentais conhecido como biodemas (ANDRADE, 1985).
Na tentativa de facilitar a comunicação entre a comunidade científica, um consenso foi proposto com a divisão do T. cruzi em dois grupos: T. cruzi I e T. cruzi II. As cepas e clones anteriormente denominadas como zimodema 1 (MILES et al., 1977, 1978; BARRETT, et al., 1980), tipo III (ANDRADE, 1974), linhagem 2 (SOUTO et al., 1996), grupo 1 (TIBAYRENC, 1995), ribodema II/III (CLARK & PUNG,1994) ou similar foram designadas T. cruzi I. Já os isolados denominados zimodema 2 (MILES et al., 1977, 1978; BARRETT et al., 1980), zimodema A (ROMANHA et al., 1979), tipo II (ANDRADE, 1974), linhagem 1 (SOUTO et al., 1996), grupo 2 (TIBAYRENC, 1995), ribodema I (CLARK & PUNG, 1994) ou similar foram classificados como T.
cruzi II (ANONYMOUS, 1999). Mas, algumas amostras do parasito caracterizadas
como Zimodema 3 por Miles et al., 1977, 1978 não agrupavam em T. cruzi I ou T. cruzi II foram posteriormente denominada T. cruzi III por Freitas et al. (2006a).
Usando técnicas de eletroforese de enzimas multilocus (MLEE, do inglês
Multilocus Enzyme Electrophoresis) e amplificação aleatória de DNA polimórfico
(RAPD, do inglês Randon Amplified Polymorphic DNA), as populações do parasito foram novamente subdivididas em unidades distintas de tipagem (DTU, do inglês
Discrete Typing Unit). As cepas do T. cruzi I permaneceram como linhagem única ou
DTU I ou TcI. Enquanto, o grupo T. cruzi II foi classificado em cinco grupos denominados de IIa, IIb, IIc, IId e IIe (BRISSE et al., 2000, 2001).
Com os avanços do entendimento da estrutura populacional do parasito, um novo consenso determinou a mais recente revisão a nomenclatura, 10 anos após o primeiro acordo. Estabeleceu-se a divisão do parasito em seis grupos. As DTUs I e IIb correspondem, respectivamente a TcI e TcII. A DTU IIc equivale ao TcIII, a DTU IIa ao TcIV, a DTU IId ao TcV e a DTU IIe ao TcVI (ZINGALES et al., 2009).
O genótipo TcI é a DTU mais abundante em todo o continente americano, desde os Estados Unidos (ROELLING et al., 2008) até o Chile (APT et al., 1987), associado aos ciclos silvestre e doméstico, sendo encontrado em todos os gêneros de vetores (ZINGALES et al., 2012). TcIII e TcIV são DTUs silvestres presentes na área que compreende o Chaco Argentino, Venezuela e Amazônia brasileira (LLEWELLYN et al., 2009; MARCILI et al., 2009a). TcII, TcV e TcVI estão presentes na América do Sul relacionadas ao ciclo de transmissão domiciliar (ZINGALES et al., 2012).
Uma nova linhagem do parasito, denominada TcBat, encontrada inicialmente em
Myotis spp. e Noctilio spp. (morcegos) foi descrita por Marcili et al. (2009a), estando
mais próxima do TcI na árvore filogenética. Outros autores (PINTO et al., 2012) sugerem que o TcBat seja considerado uma nova DTU, dada as distinções entre as DTUs tradicionais e do T. cruzi marinkellei. Este genótipo foi reportado infectando humanos na Colômbia (RAMÍREZ et al., 2014).
No RN, três DTUs foram encontrados em diferentes reservatórios. O TcI foi detectado em humanos em dois municípios da mesorregião Central (Caicó e Angicos) (CÂMARA et al., 2010; MARTINS et al., 2015) e em quatro da mesorregião Oeste (Assu, Apodi, Caraúbas e Severiano Melo), além de em Triatoma brasiliensis
brasiliensis (Neiva, 1911) (neste trabalho chamado apenas de T. brasiliensis) por
Marcili et al. (2009b). O TcII foi encontrado em humanos em Acari, Caicó, Caraúbas, Governador Dix-Sept Rosado, Severiano Melo e Serra Negra do Norte e em T.
brasiliensis em Caicó e Serra Negra do Norte no peridomicílio e ambiente silvestre,
respectivamente (BARBOSA-SILVA et al., 2016). Já o TcIII foi identificado em vetores como T. brasiliensis no ambiente silvestre e Panstrongylus Lutzi (Neiva & Pinto, 1923) nos ambientes intradomiciliar e silvestre, em animais silvestres como
Euphractus sexcinctus e Galea spixii, e também em humanos com a forma
indeterminada da doença (MARTINS et al., 2015).
1.3 Epidemiologia da doença de Chagas
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que há cerca de 5,7 milhões de indivíduos infectados em todo o mundo, a maioria na América Latina, distribuídos em
21 países endêmicos, entre os quais se destacam Argentina, Brasil, México e Bolívia. No Brasil, estima-se que 1,2 milhões de pessoas estejam infectadas e outras 25,4 milhões com risco de adquirir a infecção (WHO, 2015).
No Brasil, a transmissão vetorial ainda apresenta importância, representando 8,9% dos novos casos registrados no país de 2012 a 2016. Entretanto, a principal forma de transmissão do T. cruzi nos últimos anos foi a via oral, representando 73,0% dos casos agudos no mesmo período (BRASIL, 2019). A ingestão de alimentos contaminados tais como açaí e palmito de babaçu, são as principais fontes de contaminação (SOUZA-LIMA et al., 2013; FERREIRA, 2014). Grande parte desse tipo de transmissão ocorre na Região Amazônica, com foco para o estado do Pará, onde o consumo destes alimentos in natura é muito comum (BRASIL et al., 2015). Relatos de casos agudos ocasionados pela ingestão de caldo de cana contaminado também já foram registrados no Nordeste e no Sul do país (SHIKANAY-YASUDA et al., 1991; STEINDEL et al., 2008; VARGAS et al., 2018).
O primeiro inquérito soroepidemiológico nacional em humanos, realizado no período de 1975 a 1980, revelou 4,22% de indivíduos infectados pelo T. cruzi nas zonas rurais, e no Rio Grande do Norte (RN) foi observada a prevalência de 1,78% (CAMARGO et al., 1984). No segundo inquérito, realizado em crianças e adolescentes até 15 anos de idade no período de 1989 a 1997, 0,2% dos indivíduos foram soropositivos para a infecção (SILVEIRA & VINHAES, 1998). O terceiro inquérito soroepidemiológico realizado com crianças até cinco anos em zonas rurais de todo o país, exceto Rio de Janeiro, de 2001 a 2008, mostrou 32 crianças com sorologia confirmada para infecção por T. cruzi, sendo que em 11 casos a sorologia da mãe que não foi reativa indicando provável transmissão vetorial, dos quais um foi Várzea no RN, município com baixa risco de transmissão (LUQUETTI et al., 2011).
Segundo o Ministério da Saúde, os municípios brasileiros são classificados como de alto, médio e baixo risco quanto à transmissão vetorial do T. cruzi. Esta classificação leva em conta critérios como espécies, dispersão e infestação de triatomíneos na área, condições de moradia e outros fatores demográficos da população (BRASIL, 2005). Habitualmente, os municípios considerados de alto e médio risco são obrigados a executar a vigilância ativa, enquanto que os de baixo risco executam apenas a vigilância passiva.
No RN foi realizado outro inquérito soroepidemiológico por Brito et al. (2012) em residentes da zona rural entre 2007 e 2009, em moradores da mesorregião Oeste e do
município de Caicó, de médio risco, na mesorregião Central. A mesorregião Oeste apresentou prevalência de 6,5% de infectados, com maior concentração de casos nos municípios de Caraúbas, Governador Dix-Sept Rosado, Severiano Melo, Apodi e Lucrécia, todos de alto risco. E no município de Caicó apresentou 3,3% de moradores também com sorologia positiva.
Recentemente, Vargas et al. (2018) relataram um surto de DC aguda associada a ingestão de alimentos contaminados em Marcelino Vieira, município considerado de alto risco na mesorregião Oeste do estado. Neste evento, foram registrados óbitos de três indivíduos e duas espécies de vetores foram encontradas infectadas na região.
1.4 Os triatomíneos
1.4.1 Considerações gerais
Os triatomíneos são insetos hematófagos da subfamília Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) de grande importância médica por serem transmissores do T. cruzi (CHAGAS, 1909). Atualmente existem 155 espécies de triatomíneos identificadas (OLIVEIRA & ALEVI, 2017; DORN et al., 2018; LIMA-CORDÓN et al., 2019), divididas em 18 gêneros (ALEVI et al., 2016; MENDONÇA et al., 2016; ROSA et al., 2017; OLIVEIRA & ALEVI, 2017). Apesar de haver registros na Ásia e no norte da Austrália, estes insetos estão distribuídos principalmente no continente americano, do sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina, inclusive no Brasil (SCHOFIELD & GALVÃO, 2009).
No Brasil, em todos os estados há registros de triatomíneos. Até então, foram descritas 65 espécies de triatomíneos de 10 gêneros diferentes (GALVÃO, 2014). Destas, 42 (64%) são endêmicas do país, sendo a Bahia, o estado com maior diversidade (GALVÃO, 2014). Algumas espécies são encontradas em diversas regiões do país, em áreas com características bastante diferentes, mostrando capacidade de adaptação a diferentes condições ecológicas, como por exemplo o Panstrongylus geniculatus (Latreille, 1811) e Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), presentes em três biomas em mais de 20 estados. Em contrapartida outras espécies estão fortemente relacionadas ao bioma nas quais estão inseridas, como é o caso de Rhodnius pictipes(Stål, 1872) e
Rhodnius robustus (Larrousse, 1927) na Amazônia; Rhodnius neglectus (Lent, 1954), Triatoma sordida (Stål, 1859), e Triatoma costalimai (Verano& Galvão, 1958) no
Cerrado; Triatoma rubrovaria (Blanchard, 1843) nos pampas; e Triatoma tibiamaculata (Pinto, 1926) e Triatoma vitticeps (Stål, 1859) na Mata Atlântica. Na Caatinga,
(Correa & Espínola, 1964), Triatoma melanocephala (Neiva & Pinto, 1923), e Triatoma
petrocchiae (Pinto & Barreto, 1925) são as mais encontradas (GURGEL-GONÇALVES
et al., 2012; GALVÃO, 2014).
Diversos ecótopos podem ser habitados por triatomíneos. No ambiente silvestre, é possível encontrá-los em ninhos de pássaros, como Psammolestes tertius (Lent & Jurberg, 1965) (GURGE-GONÇALVES et al., 2007, 2011), tocas de tatu, como P.
lutzi(DIAS-LIMA et al., 2003), e palmeiras, como R. nasutus (DIAS et al., 2008; LIMA
et al., 2008; BARBOSA-SILVA et al., 2016). Entretanto, com o avanço das construções humanas no ambiente silvestre, como também pelo desmatamento, muitas espécies foram deslocadas e outras se adaptaram ao peridomícilio (LENT & WYGODZINSKY, 1979). Assim, inúmeros ecótopos artificiais como currais, pilhas de telhas, galinheiros, cercas de pedras e até mesmo o intradomicílio passaram a ser infestados por espécies como T. brasiliensis e T. pseudomaculata (BARBOSA-SILVA et al., 2016), proporcionando-as abrigo contra predadores e proximidade ao alimento.
Com a invasão do ambiente silvestre pelos seres humanos, o parasito foi inserido no ciclo doméstico, que envolve o homem, animais sinantrópicos e domésticos e triatomíneos domiciliados. Neste contexto, a transmissão é própria de áreas rurais, onde há interação do vetor nos ambientes silvestres, peridomésticos e domésticos (DIAS et al., 1992).
A domiciliação do vetor está diretamente relacionada com a degradação de ecótopos naturais, as condições de abrigo e o grau de antropofilia de cada espécie (FORATTINI, 1980). A luz das residências e a oferta de alimento representada pela presença de animais domesticados, como cães, gatos, caprinos, ovinos, entre outros, atraem os insetos, com possibilidade de inserção de cepas silvestre do parasito no habitat humano, facilitando a manutenção do ciclo de transmissão vetorial. Dessa forma, o peridomicílio tem grande importância epidemiológica por ser um intermédio entre os ambientes silvestres e domiciliar (ROQUE & JENSEN, 2014).
Os hábitos alimentares dos triatomíneos são bastante variáveis (RABINOVICH et al., 2011). Há espécies frequentemente associadas a aves como T. pseudomaculata (FORATTINI, 1980; FREITAS et al., 2005), outras a mamíferos como P. megistus (VILLELA et al., 2010), e outras com maior ecletismo com relação ao repasto sanguíneo como T. brasiliensis (BEZERRA et al., 2018).Esse ecletismo pode proporcionar múltiplas infecções durante a vida do vetor e, consequentemente, a mistura
de vários genótipos de T. cruzi (SCHAUB, 1988, 1989; BOSSENO et al., 1996; LEHANE et al., 2000).
1.4.2 Epidemiologia dos vetores no Nordeste
Quanto à região Nordeste, estudos pioneiros revelaram a presença constante do T.
brasiliensis e T. pseudomaculata nos ambientes domiciliar e peridomiciliar nos estados
da Paraíba (LUCENA & COSTA, 1954), Ceará (ALENCAR, 1965), Piauí (COURA et al., 1996) e RN (LUCENA, 1959; CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; DIAS et al., 2000). Em seguida, durante o primeiro e segundo inquéritos nacionais, a distribuição dos vetores no nordeste ocupou a segunda e primeira posição respectivamente, em número de infectados e índices de infestação por triatomíneos com predominância das espécies T. brasiliensis e T. pseudomaculata no ambiente domiciliar (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; SILVEIRA & VINHAES, 1998). Estas espécies, nativas do semiárido e com ampla distribuição territorial (PIRAJÁ DASILVA, 1913; LUTZ & MACHADO, 1915; LUCENA, 1952; LUCENA, 1959; FORATTINI, 1980; ALENCAR, 1987; DIAS et al., 2000; GALVÃO et al., 2003; GURGEL-GONÇALVES et al., 2012), são encontradas em todos os estados da região e capturadas em ecótopos artificiais, os quais reinvadem a partir do ambiente silvestre (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; SILVEIRA & VINHAES, 1998; DIAS et al., 2000; COSTA et al., 2003; SILVEIRA, 2011).
O T. brasiliensis e o T. pseudomaculata continuam sendo as espécies mais capturadas em vários estados do Nordeste, com elevados índices de infecção. No Piauí, de 22.896 espécimes capturados, 65% eram T. brasiliensis e 28% eram T.
pseudomaculata (GURGEL-GONÇALVES et al., 2010). Em Pernambuco, as espécies T. brasiliensis e T. pseudomaculata foram as mais capturadas em 185 municípios
investigados, com índices de infecção natural pelo T. cruzi de 13,1% e 35,1%, respectivamente (SILVA et al., 2015). Em Morada Nova, no estado do Ceará, 730 exemplares foram capturados em ecótopos naturais e artificiais, com índice de infecção natural de 11,6%, e aproximadamente 90% eram T. brasiliensis (SARQUIS et al., 2012). Ainda no Ceará, elevados índices de infecção também foram detectados em T.
pseudomaculata (18%) e T. brasiliensis (15,3%) capturados em vários ambientes no
município de Jaguaruana (SARQUIS et al., 2004). No RN, Barbosa-Silva et al. (2016) mostraram a presença de triatomíneos infectados das espécies R. nasutus (10,0%), P.
antrópicos e silvestres. Estas duas últimas, são as espécies de triatomíneos com maior distribuição no estado (BARBOSA-SILVA et al., 2019).
1.4.3 Controle de triatomíneos no Brasil
As ações de controle de triatomíneos são realizadas no Brasil desde a década de 1950. A primeira delas foi conduzida pelo Serviço Nacional de Malária nos estados de Minas Gerais e São Paulo. Desde então, com a intensificação destas ações, as transmissões vetoriais do T. cruzi vem reduzindo no Brasil (DIAS et al., 2016). Intervenções como melhoria das condições de moradia, reordenamento do peridomicílio e uso de inseticidas de ação residual no interior e nos anexos das unidades domiciliares (UD) infestadas, são realizadas para impedir a inserção e eliminar colônias instaladas no ambiente antrópico (SILVEIRA & DIAS, 2011).
Em 1991, países como Brasil, Argentina e Bolívia, extremamente afetados pela infecção pelo por T. cruzi, formaram a Iniciativa do Cone Sul Contra Doença de Chagas (SCHOFIELD & DIAS, 1999). Dentre os objetivos estavam o comprometimento com o combate ao Triatoma infestas Klug 1834. O êxito nesta campanha resultou na certificação da interrupção da transmissão da Doença de Chagas pelo principal vetor domiciliado ao Brasil, concedida em 2006 pela OPAS/OMS (DIAS et al., 2016).
Essas ações de controle foram sustentadas desde então, ainda que o alcance nas últimas duas décadas tenha sido progressivamente menor em virtude de mudanças de priorização técnico-política, bem como devido ao reordenamento político-institucional no país. Atualmente, o risco de transmissão vetorial no Brasil se dá em função da persistência de focos residuais do T. infestans, ainda existentes em alguns municípios da Bahia e do Rio Grande do Sul, da presença de reservatórios do T. cruzi e da aproximação cada vez mais frequente das populações humanas a esses ambientes, e da existência de espécies autóctones de triatomíneos com elevado potencial de colonização (DIAS et al., 2016).
Diante do cenário de infestação e colonização de diversas espécies de triatomíneos em ambientes antrópicos e da ocorrência de transmissão vetorial fora das áreas de maior incidência de casos, entender a epidemiologia dos vetores é de fundamental importância para expandir os conhecimentos sobre o processo de domiciliação e transmissão do T.
cruzi para humanos e animais. Desta forma, é imprescindível realizar estudos que
elucidema distribuição das DTUs nos triatomíneos, demonstrando a associação das diferentes espécies de vetores e dos isolados com os ciclos de transmissão do parasito no território potiguar.
2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Avaliar a presença de triatomíneos e a distribuição das DTUs do T. cruzi isolados destes vetores em diferentes mesorregiões do RN.
2.2 Objetivos específicos
✓ Conhecer a distribuição dos vetores nos ambientes domiciliares, peridomiciliares e silvestres e nos ecótopos associados no RN;
✓ Verificar os indicadores entomológicos dos municípios pesquisados; ✓ Avaliar a infecção natural por T. cruzi dos insetos capturados;
✓ Conhecer e avaliar a distribuição das DTUs do T. cruzi em triatomíneos no território potiguar.
3 METODOLOGIA
3.1 Delineamento experimental
Figura 1–Delineamento experimental do estudo. SESAP – Secretaria de Saúde Pública do Estado do Rio
Grande do Norte; rDNA – Domínio divergente (D71) do gene 24Sα do DNA ribossomal; SL-IR – Espaçador intergênico dos genes miniexon; COII – Polimorfismo do gene mitocondrial da subunidade 2
do citocromo oxidase.
3.2 Área de estudo
O RN está dividido politicamente em 167 municípios, agrupados em quatro mesorregiões: Oeste Potiguar, Central Potiguar, Agreste Potiguar e Leste Potiguar (Figura 1). A população está estimada de 3.506.853 habitantes, com cerca de 700 mil vivendo em zonas rurais (IBGE, 2019). O estado está localizado na Região Nordeste do Brasil e possui 80% de seu território recoberto pela Caatinga. Este bioma é caracterizado por apresentar vegetação xerófila, clima semiárido, árido ou sub-úmido seco, relevo plano a ondulado com solos pedregosos e baixo índice pluviométrico (ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO RN, 2015).
A Estação Ecológica do Seridó (ESEC-Seridó-ICMBio) foi a área onde foi conduzida a busca em ambientes silvestres. Esta é uma unidade de conservação criada pelo decreto 87.222 de 31/05/1982, Lei Nº. 6.902 de 27/04/1982, localizada em Serra Negra do Norte, situada na porção central do estado, com uma área de 1.166,38 hectares (VARELA-FREIRE, 2002). A ESEC-Seridó está situada em área de Caatinga, apresentado clima semiárido e estação chuvosa entre março e maio (AB'SÁBER, 1974). Ao longo do seu território, há diversos afloramentos rochosos, cobertos pela vegetação do tipo hiperxerófila arbórea-arbustiva na estação chuvosa, ou expostos durante a estação seca (VELLOSO et al., 2002). As buscas na ESEC-Seridó foram realizadas à noite, entre 18:00 e 22:00, em afloramentos rochosos e troncos e cascas de árvores durante a estação seca, localizados a mais de cem metros de construções humanas.
No RN, a mesorregião Leste Potiguar possui um município de médio e 25 municípios de baixo risco para a transmissão do T. cruzi; a mesorregião Agreste Potiguar é constituída por nove municípios de alto risco, 12 de médio e 23 de baixo risco; a mesorregião Central potiguar apresenta quatro municípios de alto risco, 24 de médio e seis de baixo risco; e na mesorregião Oeste Potiguar, há 23 municípios considerados de alto risco, 30 de médio e 10 de baixo (Figura 1) (BARBOSA-SILVA et al., 2019).
Figura 2 – Mapa do Brasil e do Rio Grande do Norte evidenciando as mesorregiões do estado os
municípios de baixo, médio e alto de risco de transmissão vetorial do T. cruzi, de acordo com os dados entomológicos da SESAP-RN de 2005 a 2015
Fonte: Barbosa-Silva et al. (2019). Disponível em: https://doi.org/10.1590/0037-8682-0061-2019. Acessado em 01 de outubro de 2019.
3.3 Captura e identificação dos triatomíneos
Os municípios e localidades rurais foram selecionados com base no histórico de captura de triatomíneos pelas secretarias municipais de saúde nos últimos cinco anos. A cada expedição de busca de triatomíneos foram selecionados cerca de dois ou três municípios classificados prioritariamente como de médio e/ou alto risco para a transmissão do T. cruzi. A procura por triatomíneos foi realizada de forma amostral, isto é, nem todas as residências dos municípios foram pesquisadas, seja por questões logísticas, restrições de tempo ou dificuldade de acesso às localidades. As coletas foram realizadas em municípios de alto, médio e baixo risco para a transmissão do T. cruzi nas mesorregiões Oeste, Central e Agreste do RN com a assistência dos respectivos agentes de endemias das Secretarias Municipais de Saúde, no período de 2015 a 2019, nas estações seca e chuvosa, conforme o mapa mostrado na Figura 3.
Figura 3–Mapa do Brasil e do Rio Grande do Norte destacando os municípios com busca ativa de
triatomíneos, incluindo a ESEC-Seridó, e aqueles com amostras provenientes da SESAP-RN, identificados com asterisco (*). Fonte: Modificado pelo autor com base na base cartográfica do IBGE.
Disponível em: <https://portaldemapas.ibge.gov.br/portal.php#homepage>. Acessado em 17 de novembro de 2019.
Os insetos foram capturados manualmente, sem o uso de substâncias desalojantes ou armadilhas, com o auxílio de pinças entomológicas no período diurno entre 8:00 e 16:00 (exceto no município de Caicó, onde também houve capturas à noite). Nas UDs, as capturas foram em todos os cômodos, atrás e em baixo de móveis (Figura 4A), e no peridomicílio, definido como a área ao redor da residência de um raio de até cem metros (OLIVEIRA-LIMA et al., 2000). Dentre os anexos peridomiciliares foram pesquisados galinheiros, pilhas de telhas, chiqueiros, cercas de pedra e de madeira, afloramentos rochosos próximo às habitações, entre outros (Figura 4B-G). As buscas foram realizadas por, no mínimo, duas pessoas, por um período de 30 minutos em cada UD.
Os triatomíneos foram armazenados vivos em potes de plástico fechados com furos para entrada de oxigênio e encaminhados ao Laboratório de Biologia dos Parasitos e Doença de Chagas/Centro de Ciências da Saúde/Universidade Federal do RN (LABIOPAR/UFRN), onde foram devidamente identificados por meio de chaves dicotômicas (LENT & WYGODZINSKY, 1979; DALE et al., 2018) e quantificados. Os triatomíneos foram mantidos vivos até o momento do exame do conteúdo intestinal.
A SESAP-RN também forneceu triatomíneos provenientes de diversos municípios do estado. Estes insetos foram enviados com uma ficha de identificação do ambiente de captura, espécie e resultado do exame de compressão abdominal para atestar a infecção. Todos os insetos foram novamente identificados e examinados pela nossa equipe.
Figura 4 – Ambientes onde foram realizadas as buscas por triatomíneos no período de 2015 a 2019 em
municípios do Rio Grande do Norte.(A) ambiente intradomiciliar; (B) galinheiro; (C) curral; (D) casa de taipa; (E) telhas; (F) pilha de madeira; (G) cerca de pedra; (H) afloramento rochoso em ambiente silvestre
no período noturno; (I) afloramento rochoso em ambiente silvestre no período diurno; (J) vegetação seca da caatinga no ambiente silvestre. Fonte: autoria própria.
3.4 Indicadores entomológicos
Os indicadores entomológicos avaliados foram infestação (intradomiciliar e peridomiciliar), colonização (intradomiciliar e peridomiciliar) e infecção natural, considerados altos a partir de 5% (SILVEIRA et al., 2002). Nos municípios onde foram realizados a busca ativa tiveram os indicadores calculados. Os cálculos foram realizados conforme preconizado pela WHO (1991) e pela OPAS (2003), como descrito a seguir:
𝐼𝑛𝑓𝑒𝑠𝑡𝑎çã𝑜 𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝑚𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑎𝑟 = (Nº de UDs infestadas no intradomicílio
Nº de UDs pesquisadas ) × 100
𝐼𝑛𝑓𝑒𝑠𝑡𝑎çã𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑑𝑜𝑚𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑎𝑟 = (Nº de UDs infestadas no peridomicílio
Nº de UDs pesquisadas ) × 100
𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎çã𝑜 𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝑚𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑎𝑟 = (Nº de UDs com ninfas no intradomicílio
Nº de UDs infestadas no intradomicílio) × 100
𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎çã𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑑𝑜𝑚𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑎𝑟 = (Nº de UDs com ninfas no peridomicílio
Nº de UDs infestadas no peridomicílio) × 100
𝐼𝑛𝑓𝑒𝑐çã𝑜 𝑛𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎𝑙 = (Nº de triatomíneos infectados por 𝑇. 𝑐𝑟𝑢𝑧𝑖
Nº de triatomíneos examinados ) × 100
3.5 Avaliação da infecção natural
O exame direto foi realizado de acordo com o protocolo de Barbosa-Silva et al. (2016). Apenas os triatomíneos vivos, tanto ninfas quanto adultos, foram examinados. Os insetos foram previamente imergidos na solução esterilizante de White (0,25g de HgCl2, 6,5g de NaCl, 1,25mL de HCl concentrado, 250ml de etanol a 95% e 750mL de
H2O) durante 20min. Em seguida, 500μL do tampão fosfato-salino (PBS) foram adicionados em placa estéril de 24 poços. Sob condições assépticas e com auxílio de pinças, tesoura e ponteiras estéreis, cada inseto foi examinado individualmente e teve as cutículas do abdome removidas e o conteúdo intestinal retirado e transferido individualmente para cada poço. A suspensão foi dividida em três partes: (1ª) 20μL foram utilizados para pesquisa de tripanossomatídeos ao microscópio no aumento de 400x; (2º) 200μL diluídos (v/v) com Guanidina-HCl 6M/EDTA 0,2M, que foram fervidos a 100ºC por 15 minutos (BRITTO et al., 1993) e armazenados a 4ºC até o
momento da extração de DNA para futuras análises; e aproximadamente 250μL para a xenocultura em meios de cultura acelular McNealNovy e Nicolle (NNN) acrescido de
LiverInfusionTryptose (LIT) (CAMARGO, 1964), incubadas a 27ºC ± 1 e examinadas
ao microscópio após 15, 30, 60 e 90 dias.
3.6 Caracterização genética do parasito
3.6.1 Cultura acelular e obtenção da massa úmida do T. cruzi
Nas amostras positivas para a xenocultura, os parasitos foram repicados para um novo meio LIT e mantidos em fase logarítmica de crescimento de até aproximadamente 80mL de meio. Os parasitos foram lavados três vezes com tampão Krebs-Ringer-Tris (KRT) pH 7,2, centrifugados a 2.500rpm por 20min a 4ºC e armazenados a -20ºC em uma concentração de cerca de 1x108 epimastigotas/mL até o momento da extração do DNA (MACEDO et al., 1992).
3.6.2 Extração do DNA a partir da massa úmida
A extração do DNA a partir da massa úmida foi realizada seguindo o protocolo de Macedo et al. (1992). Primeiramente adicionou-se aos parasitos 1mL de tampão de lise contendo 0,1mg/mL de proteinase K (Promega, Madison, WI, USA), homogeneizou-se o conteúdo em agitador (Vortex QL-901, BioMixer) e o transferiu para tubos
Eppendorf® de 2mL, sendo após isso incubado overnight a 37ºC. Posteriormente, a
amostra foi centrifugada a 13.500rpm por 2min. Para desproteinizar o lisado, adicionou-se 0,5mL de fenol destilado, adicionou-seguido de leve agitação manual durante 5min e centrifugação a 13.500rpm por 1min. O fenol, fase inferior, foi coletado e desprezado. A fase superior foi recuperada, extraída com igual volume com fenol:clorofórmio:álcoolisoamílico (25:24:1) e centrifugada a 13:500rpm por 5min, sendo a fase inferior novamente desprezada. Em seguida, o conteúdo foi purificado com 500μL de clorofórmio:álcoolisoamílico (24:1) e centrifugado a 13.500rpm por 5min e a fase superior coletada e transferida para um novo tubo. O DNA foi precipitado com etanol absoluto (2:1) e estocado a 4ºC overnight. Novamente, as amostras foram centrifugas a 13.500rpm por 10min, o líquido foi decantado, e o DNA retido nas paredes do tubo foi ressuspendidocom 500μL de tampão RNAse (Promega, Madison,
USA) (NaCl 80mM/ EDTA 5mM, pH 8,0, 10U de ribonuclease) e incubado a 37ºC por
2h, seguido de nova extração e precipitação do DNA. Após a volatilização do etanol, as amostras foram ressupendidas com 100μL de tampão Low TE (10mM Tris-HCl e 0,1mM EDTA pH 8,0) e armazenados a 4ºC. A quantificação do DNA foi feita em espectrofotômetro (NanoDrop™ 2000/c SpectrophotometersThermoFisherScientific,
Waltham, MA, EUA) com comprimento de onda de 260/280nm em triplicata. A
concentração final do DNA de cada amostra foi ajustada para 3ng/μL, sendo novamente estocadas a 4ºC até o momento da caracterização molecular do T. cruzi.
3.6.3 Marcadores moleculares
A caracterização genética do T. cruzi foi realizada por meio de PCR convencional de acordo com a metodologia proposta por D’ávila et al. (2009), utilizando os seguintes marcadores:
a) Domínio divergente (D71) do gene 24Sα do DNA ribossomal (rDNA): utilizando os iniciadores D71 (5’-AAGGTGCGTCGACAGTGTGG-3’) e D72 (5’-TTTTCAGAATGGCCGAACAGT-3’) e realizando 30 ciclos de amplificação, variando entre as temperaturas de 94°C, 60°C e 72°C (SOUTO et al., 1996). Na reação foram utilizados 3,5mM de MgCl2,0,2mM de cada dNTP,
0,25mM de cada primer e 0,6U de TaqDNA polimerase (Promega, Madison,
USA). A visualização de fragmentos de 110pb indicaram a presença de TcI
(rDNA2), enquanto fragmentos na altura de 125pb indicaram a presença de TcII. b) Espaçador intergênico dos genes miniexon (SL-IR): utilizando os iniciadores
TCac (5’-CTCCCCAGTGTGGCCTGGG-3’) e UTCC (5’-
CGTACCAATATAGTACAGAAACTG-3’). Cada reação foi realizada contendo 20mM Tris-HCl pH 8,4; 50mM KCl; 3mM MgCl2; 250mM de cada
dNTP; 3μM de cada iniciador, 1U Taq DNA polimerase Platinum (InvitrogenCarlsbad, CA, USA); 1μL de DNA total (~3ng/ μl) e quantidade de H2O Milli-Q estéril suficiente para 15μL. Os ciclos de amplificação da PCR consistiram de uma etapa inicial de desnaturação (94ºC, 3min), anelamento (68ºC, 1 min), extensão dos iniciadores (72ºC, 1 min) e desnaturação (94ºC, 1 min). A cada três ciclos, a temperatura de anelamento foi diminuída para 66, 64, 62 e 60ºC. Na última temperatura o número de ciclos foi aumentado para 35, seguido de uma extensão final (72ºC, 10 min). A amplificação de fragmentos de 200pb identificam o TcIII enquanto a amplificação de fragmentos entre 150-157pb indicam a presença de isolados pertencentes ao TcI, TcII ou híbridos (BURGOS et al., 2007).
c) Polimorfismo do gene mitocondrial da subunidade 2 do citocromo oxidase (CO II): utilizando os iniciadores Tcmit-10 (5’- CCATATATTGTTGCATTATT-3’) e Tcmit-21 (5’- TTGTAATAGGAGTCATGTTT-3’), amplificando o fragmento de 375pb do maxicírculo do T. cruzi contendo três sítios de restrição para a
enzima AluI (Promega, Madison, USA). Foram utilizados 1-10ng de DNA de cada amostra em um volume final de 20μL da reação, contendo 2,5 U de Taq DNA polimerase, 1,5mM MgCl2, 2,0μL tampão 10 x (Phoneutria, Minas Gerais, Brasil) 50mM KCl e 10ηM TrisHCl, 0,25mM de cada dNTP (Sigma ChemicalCompany, Missouri, USA) e 0,25μM de cada iniciador. As condições
da PCR foram de 30 ciclos: 30 segundos de desnaturação a 94°C, anelamento a 48°C por 2min e uma extensão a 72ºC durante 2min. Após amplificação pela PCR, os produtos foram digeridos com a enzima de restrição AluI (16h) e os fragmentos gerados foram analisados em gel de poliacrilamida a 6%. A visualização dos fragmentos de 30, 81 e 264pb corresponderam ao haplótipo A (T. cruzi I) enquanto os de 81 e 212pb foram indicadores das cepas relacionadas ao haplótipo C (T. cruzi II). Ainda puderam ser visualizados os fragmentos de 81 e 294pb, correspondem ao haplótipo B relacionado às cepas híbridas (FREITAS et al., 2006a).
Em todas as reações da caracterização molecular do T. cruzi foram utilizadas cepas de referência como controle positivo, além de amostras sem DNA como controle negativo (Tabela 1). Todos os produtos das reações foram visualizados em géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata (AgNO3) após eletroforese (SANTOS et
al., 1993), como descrito anteriormente.
Tabela 1 – Características genéticas das cepas e clones de referências do T. cruzi
rDNA1: domínio divergente (D71) do gene 24Sα do DNA ribossomal (SOUTO et al., 1996); CO II2: polimorfismo do gene mitocondrial da subunidade 2 do citocromo oxidase (FREITAS et al., 2006a); SL-IR3: espaçador intergênico dos genes miniexon (BURGOS et al., 2007)
3.7 Espacialização do T. cruzi no RN
Para entender a distribuição das DTUs foi realizado um estudo da análise espacial das amostras de T. cruzi originárias de triatomíneos no RN. Para isso, artigos publicados que abordaram a presença de DTUs em vetores como de Câmara et al. (2010), Martins
Cepas e clones Marcadoresgenéticos Referências
rDNA (pb)1 CO II (haplótipo/pb)2 SL-IR (pb)3 DTU
Colombiana 110 A/30,81,264 150 TcI Federici et al. (1964)
Y 125 C/81,212 150 TcII Silva &Nussenzweig (1953)
SM76 110 B,81,294 200 TcIII Martins et al. (2015)
AM64 117/119 B,81,294 200 TcIV Monteiro et al. (2010)
3253 110+125 B,81,294 150 TcV Lajes-Silva et al. (dados não
publicados)
et al. (2015) e Barbosa-Silva et al. (2016) foram utilizados para essa análise. Os autores gentilmente forneceram as coordenadas dos locais das coletas, uma vez que estas não são mencionadas nos respectivos artigos.
As coordenadas geográficas dos ecótopos de onde foram capturados triatomíneos infectados foram obtidas utilizado o Google Earth Pro ®. Posteriormente, essas informações foram inseridas no Sistema de Informações Geográfica, ou seja, esses dados passaram a ter uma referência espacial (coordenadas geográficas), os quais foram articulados com a malha territorial do RN. Tanto as informações dos genótipos quanto a representação territorial dos municípios, foram convertidas para arquivos no formato shapefile (.shp), por meio dos quais foi possível aplicar as operações de análise espacial de dados no software Arc Map 10.3.
Para representar a área de ocorrência de um isolado presente em um vetor, foi representado um raio de 700m partindo de cada ponto (BEZERRA et al., 2018), aplicando a técnica de análise espacial denominada buffer (ALLEN, 2009). Este valor foi considerado visto que as áreas estudadas por este e pelo referido estudo são semelhantes: ambas estão situadas na Caatinga, em estado vizinhos no Nordeste do Brasil, e com ecótopos peridomiciliares e silvestres similares.
4 RESULTADOS
4.1 Capturas, identificação de triatomíneos e indicadores entomológicos
A busca ativa foi realizada em 345 UDs rurais de 21 municípios das mesorregiões Agreste, Central e Oeste potiguar. Das 345 UDs rurais amostradas, 7,5% (26/345) estavam infestadas no intradomicílio e 16,2% (56/345) no peridomicílio. A presença de ninfas no peridomicílio foi observada em 94,7% (53/56) das UDs infestadas, indicando colonização neste ambiente. No intradomicílio, houve colonização em 46,2% das UDs. O peridomicílio foi o ambiente com maior número de insetos capturados (n=1004), enquanto o intradomicílio apresentou 49 espécimes (Tabela 2).
Um total de 1.084 triatomíneos foram capturados em ambientes antrópicos e silvestres por busca ativa. A espécie mais frequente foi T. brasiliensis (84,5%; 916/1084), estando presente em 16 dos 17 municípios com capturas. A segunda espécie mais frequente foi T. pseudomaculata (14,9%; 161/1084), seguida de P. lutzi (0,5%; 6/1084) e R. nasutus (0,1; 1/1084). A mesorregião Central foi a responsável pelo maior número de capturas, representando 70,4% (781/1016) do total. Esta mesorregião também foi responsável pela maior variedade de espécies, onde foram encontradas quatro das cinco espécies capturadas neste estudo (Tabela 3).
Triatoma brasiliensis foi encontrado em todos os ambientes pesquisados. Nos três
ambientes, ninfas desta espécie foram identificadas em quantidade superior aos insetos adultos. Triatoma pseudomaculata esteve presente em ambos os ambientes antrópicos, enquanto o P. lutzi foi capturado somente com insetos adultos no intradomicílio e em área silvestre. Rhodnius nasutus foi encontrado em apenas um ambiente, o peridomícilio (Figura 5).
Tabela 2 – Aspectos entomoepidemiológicos dos triatomíneos capturados por busca ativa em ambientes antrópicos por mesorregião e os
municípios investigados no período de 2015 a 2019
IC: índice de colonização; II: índice de infestação; IN: infecção natural; Intra: intradomicílio; n: número; NE: número de insetos examinados; Peri: peridomicílio; UD: unidade domiciliar; %: percentual; -: dados indisponíveis;
Mesorregião/Município Número de Localidades UDs existentes UDs investigadas UDs infestadas II IC Capturados NE IN % (n) Intra Peri Intra Peri Intra Peri Intra Peri
Agreste Bento Fernandes 5 76 21 1 1 4,8 4,8 0 100 0 2 1 0 (0)
João Câmara 5 147 23 0 2 0 8,7 0 100 0 17 17 41,2 (7) Santa Cruz 4 61 20 3 1 15 5 33,3 100 3 5 8 12,5 (1) Santo Antônio 3 71 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (0) Serrinha 3 90 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (0) Tangará 1 90 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (0) Várzea 4 30 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (0) Subtotal 25 565 152 4 4 2,6 2,6 25 100 3 24 26 30,8 (8) Central Acari 5 - 30 6 9 20 30 50 100 16 103 52 17,0 (9) Afonso Bezerra 2 - 4 1 1 25 25 100 100 2 1 3 0 (0) Caicó 6 - 8 1 5 12,5 62,5 100 100 2 371 163 19,0 (31) Jardim de Angicos 1 35 15 0 4 0 26,7 0 100 0 75 65 0 (0) Jardim do Seridó 2 - 3 0 2 0 66,6 0 100 0 51 35 0 (0) Lajes 2 18 8 1 2 12,5 25 0 100 1 85 34 0 (0) Parelhas 3 - 31 1 2 3,2 6,5 0 50 1 17 18 0 (0) São Fernando 2 - 3 1 2 33,3 66,6 100 100 3 4 7 0 (0) Subtotal 23 53 102 11 27 10,8 26,5 54,6 96,3 25 707 377 10,6 (40) Oeste Alexandria 4 - 6 0 5 0 83,3 0 80 0 29 29 0 (0) Caraúbas 5 - 16 4 5 25 31,3 75 80 10 33 43 14,0 (6) Campo Grande 3 135 12 4 6 33,3 50 25 100 5 65 70 0 (0) Janduís 3 8 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (0) Marcelino Vieira 4 - 8 1 6 12,5 75 0 100 3 73 76 44,7 (34) Upanema 4 131 30 2 3 6,7 10 50 100 3 73 76 0 (0) Subtotal 23 274 91 11 25 14,3 32,5 45,5 92 21 273 208 19,5 (40) Total 71 - 345 26 56 7,9 16,9 46,2 94,7 49 1004 697 12,6 (88)
Tabela 3 – Distribuição das espécies de triatomíneos capturados por busca ativa por
região e municípios do estado do Rio Grande do Norte no período de 2015-2019
N: número; *: apenas ambiente silvestre; %: percentual
Mesorregião/Município Espécies de triatomíneos Total N (%) T. brasiliensis T. pseudomaculata P. lutzi R. nasutus
Agreste Bento Fernandes 0 1 1 0 2
João Câmara 17 0 0 0 17 Santa Cruz 8 0 0 0 8 Santo Antônio 0 0 0 0 0 Serrinha 0 0 0 0 0 Tangará 0 0 0 0 0 Várzea 0 0 0 0 0 Subtotal 25 1 1 0 27 (2,5) Central Acari 107 11 1 0 119 Afonso Bezerra 3 0 0 0 3 Caicó 372 1 0 0 373 Jardim de Angicos 75 0 0 0 75 Jardim de Seridó 14 37 0 0 51 Lajes 67 19 0 0 86 Parelhas 17 0 1 0 18 São Fernando 3 4 0 0 7 Serra Negra do Norte* 29 0 2 0 31 Subtotal 687 72 4 0 763 (70,4) Oeste Alexandria 29 0 0 0 29 Caraúbas 26 15 1 1 43 Campo Grande 13 57 0 0 70 Janduís 0 0 0 0 0 Marcelino Vieira 76 0 0 0 76 Upanema 60 16 0 0 76 Subtotal 204 88 1 1 294 (27,1) Total N (%) 916 (84,5) 161 (14,9) 6 (0,5) 1 (0,1) 1084 (100,0)
Figura 5 – Percentual das espécies capturadas e estágios evolutivos de triatomíneos por ambiente de
captura no período de 2015 a 2019
Diversos ecótopos estavam infestados no peridomicílio, incluindo cercas de pedra, telhas, tijolos, galinheiros, madeiras, currais, afloramentos rochosos próximo às casas, entulhos, armazém, além de casas de taipa inabitada perto das residências. O T.
brasiliensis foi encontrado em todos os ecótopos, exceto em cerca de madeira, estando
presente em nove dos 10 ecótopos infestados. As cercas de pedra foram os ecótopos com mais capturas desta espécie (39,4%). Por sua vez, T. pseudomaculata se distribuiu em cinco ecótopos, e os galinheiros foram os mais infestados por esta espécie (79,5%) (Figura 6). O único exemplar de R. nasutus capturado foi encontrado também em galinheiro. Neste ecótopo foi observada a presença de infestação simultânea de T.
brasiliensis e T. pseudomaculata no munícipio de Lajes. No ambiente silvestre foram
capturados exemplares de T. brasiliensis (29) e de P. lutzi (2) em afloramentos rochosos
Figura 6 – Percentual de captura de triatomíneos por ecótopos peridomiciliaresno RN no período de 2015
a 2019
A infecção natural foi constatada em 12,6% (88/697) dos insetos examinados capturados em ambientes antrópicos, com destaque para o município de Marcelino
Vieira, na mesorregião Oeste, com 44,7% (34/76) dos insetos infectados. Elevados índices de infecção também foram verificados em insetos capturados em João Câmara (41,2%; 7/17) na mesorregião Agreste e em Acari (17,0%; 9/52) e Caicó (19,0%; 31/163) na mesorregião Central (Tabela 2).
A Tabela 4 mostra que a SESAP/RN encaminhou para analise 144 triatomíneos. Assim como nas capturas realizadas pela equipe deste trabalho, T. brasiliensis foi a espécie mais capturada (70,8%; 102/144), sendo registrada em 19 dos 21 municípios que realizaram atividades de vigilância entomológica. As espécies T. pseudomaculata (18,7%; 27/144), P. lutzi (4,9%; 7/144), R. nasutus (4,2%; 6/144) e T. petrochiae (1,4%; 2/144) também foram observadas. A maioria dos espécimes de triatomíneos foi capturada na mesorregião Central, correspondendo a 54,2% do total (78/144), seguido pela mesorregião Oeste (20,8%; 30/144) e a Agreste (14,0%; 20/144). Alguns exemplares foram fornecidos sem a devida identificação, o que impossibilitou a associação com o município.
Ninfas e adultos de T. brasiliensis foram encontrados pelos agentes de endemias dos municípios em ambos os ambientes antrópicos. O T. pseudomaculata e o P. lutzi também foram encontrados dentro de casa, o primeiro com ninfas e o segundo com insetos adultos. Alguns exemplares não foram identificados quanto a origem e o ecótopo (72/144) (Figura 7).
Também foram recebidos dois insetos pertencentes à ordem Hemiptera e família Reduviidae identificados erroneamente como subfamília Triatominae ambos provenientes do município de Serrinha, na mesorregião Agreste: um predador, identificado no LABIOPAR como sendo da subfamília Reduviinae, encontrado no peridomicílio e um fitófago, sem identificação de subfamília, capturado no intradomicílio.
