Revisão da família Geastraceae corda (Geastrales, Basidiomycota) com ênfase em espécies neotropicais

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REVISÃO DA FAMÍLIA GEASTRACEAE CORDA (GEASTRALES, BASIDIOMYCOTA)

COM ÊNFASE EM ESPÉCIES NEOTROPICAIS

________________________________________________

Tese de Doutorado

Natal/RN, fevereiro de 2019

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JULIETH DE OLIVEIRA SOUSA

REVISÃO DA FAMÍLIA GEASTRACEAE CORDA (GEASTRALES, BASIDIOMYCOTA) COM ÊNFASE EM ESPÉCIES NEOTROPICAIS

ORIENTADOR: IURI GOULART BASEIA (UFRN) CO-ORIENTADORA: MARÍA PAZ MARTÍN (RJB-Espanha)

Natal - RN 2019

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JULIETH DE OLIVEIRA SOUSA

REVISÃO DA FAMÍLIA GEASTRACEAE CORDA (GEASTRALES, BASIDIOMYCOTA) COM ÊNFASE EM ESPÉCIES NEOTROPICAIS

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Doutora em Sistemática e Evolução.

Aprovada em: 26 de fevereiro de 2019.

Comissão Examinadora:

__________________________________________________________________ Dr.Iuri Goulart Baseia – UFRN (presidente)

__________________________________________________________________ Dr.Bruno Tomio Goto – UFRN

__________________________________________________________________ Dra. Raquel Cordeiro Theodoro – UFRN

__________________________________________________________________ Dra. Bianca Denise Barbosa da Silva – UFBA

__________________________________________________________________ Dra. Rhudson Henrique Santos Ferreira da Cruz – UFOB

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CDU 582.281.21 RN/UF/BSE-CB

1. Fungos gasteroides - Tese. 2. Estrelas-da-terra - Tese. 3. Barcode - Tese. 4. Phallomycetidae - Tese. 5. Taxonomia - Tese. I. Baseia, Iuri Goulart. II. Martín, María Paz. III.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. Sousa, Julieth de Oliveira.

Revisão da família Geastraceae corda (Geastrales,

Basidiomycota) com ênfase em espécies neotropicais / Julieth de Oliveira Sousa. - Natal, 2019.

164 f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson -

•Centro de Biociências - CB

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

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DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a todos os pesquisadores brasileiros, incluindo os alunos de pós-graduação.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, instituição a qual estou vinculada há 10 anos, por proporcionar o suporte necessário para minha formação desde a graduação (2009) até o doutorado (2019). Sou grata aos órgãos de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento deste trabalho e pelas Bolsas de Doutorado (por um ano em 2015/2016) e Doutorado Sanduíche (por quatro meses em 2017). Agradeço também a Pós-Graduação em Sistemática e Evolução. Hoje, como servidora da UFRN, eu devo agradecer ao Departamento de Nutrição, onde estou lotada, por ter me concedido afastamento por quatro meses para realizar Doutorado Sanduíche no Real Jardín Botánico de Madrid-Espanha.

Aos meus orientadores Prof. Iuri Baseia e Profa. María P. Martín sou extremamente grata. O Prof. Iuri, que é meu orientador desde a graduação, eu devo agradecer pela confiança que sempre depositou no meu trabalho e por todo o suporte que me conferiu durante esses anos. A Profa. María eu agradeço imensamente por tudo que vem me ensinando e por tornar este trabalho possível.

Sou grata aos professores Bianca Silva, Bruno Goto, Raquel Theodoro e Rhudson Cruz por aceitarem participar da avaliação deste trabalho.

Agradeço a todos os coautores dos artigos resultado desta tese e os colegas do Laboratório de Biologia de Fungos que colaboraram de alguma forma para a realização deste trabalho.

Os agradecimentos a familiares e amigos serão feitos pessoalmente, mas deixo aqui registrado a gratidão a todos que contribuíram direta ou indiretamente para que eu finalizasse esta etapa.

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RESUMO

Cerca de 97% das espécies fúngicas existentes ainda não foram descritas pela ciência, mesmo a identificação sendo embasamento para uma gama de estudos aplicados (e.x. bioprospecção, evolução, ecologia, conservação). A utilização dos códigos de barras moleculares (barcodes) vem auxiliando a delimitação de espécies. Sobretudo para os fungos gasteroides (Basidiomycota), o espaçador transcrito interno do DNA ribossômico nuclear (ITS) vem demostrando eficiência para o descobrimento de uma diversidade escondida. A família Geastraceae é constituída pelos gêneros gasteroides

Geastrum e Myriostoma, sendo os espécimes popularmente conhecidos como

estrelas-da-terra (earthstars). Embora seja uma das mais ricas da ordem Geastrales, o conhecimento sobre a diversidade desta família apresenta lacunas, especialmente na região Neotropical, onde há países megadiversos, “hotspots” e ecossistemas tropicais, os quais demonstram elevado potencial para abrigar uma diversidade escondida. Assim, objetiva-se revisar coleções de representantes da família Geastraceae, enfatizando os que apresentam distribuição Neotropical. As análises basearam-se em dados morfológicos e moleculares. Foram investigadas 215 amostras provenientes de 10 diferentes herbários nacionais e internacionais; sendo destas 14 coleções tipo. A metodologia consistiu em uma profunda revisão dos caracteres morfológicos, além de análises filogenéticas moleculares das regiões ITS, LSU, ATP6, RPB2 e TEF1α, sobre os critérios de Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana. Foram geradas 186 sequências novas, as quais foram comparadas com 294 sequências homólogas provenientes do banco de dados GenBank. Foram descritas 12 espécies novas de Geastrum: G. laevisporum J.O. Sousa & Baseia; G. pusillipilosum J.O. Sousa

et al.; G. verrucoramulosum T.S. Cabral, J.O. Sousa & Baseia; G. magnosporum J.O.

Sousa et al.; G. caatingense J.O. Sousa, M.P. Martín & Baseia; G. parvistellum J.O. Sousa, M.P. Martín & Baseia; G. baculicrystallum J.O. Sousa et al.; G.

brunneocapillatum J.O. Sousa et al.; G. courtecuissei P.-A. Moreau & C. Lécuru, G. neoamericanum J.O. Sousa et al.; G. rubellum P.-A. Moreau & C. Lécuru; G. rubropusillum J.O. Sousa et al. O nome Geastrum hirsutum Baseia & Calonge foi

revalidado e teve sequência de seu parátipo disponibilizano GenBank. Para o gênero

Myriostoma duas espécies novas foram descritas: M. calongei Baseia, J.O. Sousa, &

M.P. Martín e M. australianum J.O. Sousa Baseia & M.P. Martín; ademais, foram propostas duas combinações novas: M. areolatum (Calonge & M. Mata) M.P. Martín,

(8)

J.O. Sousa & Baseia e M. capillisporum (V.J. Stanek) L.M. Suz et al. Foram propostos, também, um lectótipo e um epitipo para a espécie M. coliforme (Dicks.) Corda. Os dados gerados por esta revisão modificaram as interpretações sobre a sistemática de Geastraceae, sendo possível comprovar que os complexos de espécies existentes subestimavam a diversidade da família Geatraceae em região Neotropical.

Palavras chave: barcode; estrelas-da-terra; fungos gasteroides; Phallomycetidae;

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ABSTRACT

About 97% of existing fungi species have not been described by science, although the identification being the basis for many appliced studies (ex: bioprospecting, evolution, ecology, conservation). Barcodes have been very useful to species delimitation. Mainly for gasteroid fungi (Basidiomycota), the Internal Transcribed Spacer of Nuclear rDNA (ITS) has demonstrated to be very efficacy to discover hidden diversity. The family Geastraceae is constituted by the gasteroid genus Geastrum and Myriostoma, being the specimens popularly known as earthstars. Although it is one of the richest families in the Geastrales order, the knowledge about the diversity of this family has gaps, especially in the Neotropical region, where there are megadiverse countries, “hotspots” and tropical ecosystems, which have high potential to shelter hidden diversity. Thus, this study aimed to review collections of family Geastraceae, emphasizing those with Neotropical distribution. Two hundred and fifteen samples from 10 distinct international and national fungal collections were investigated, of these, 14 type collections. The methodoly consisted in a deep revision of morphological characters, besides the molecular phylogenetic analyses of the DNA regions ITS, LSU, ATP6, RPB2 e TEF1α, following Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian inference criteria. There were generated 186 new sequences, which were compared with 294 homologue sequences from GenBank data. Twelve news species of Geastrum were described: G.

laevisporum J.O. Sousa & Baseia; G. pusillipilosum J.O. Sousa et al.; G. verrucoramulosum T.S. Cabral, J.O. Sousa & Baseia; G. magnosporum J.O. Sousa et al.; G. caatingense J.O. Sousa, M.P. Martín & Baseia; G. parvistellum J.O. Sousa, M.P.

Martín & Baseia; G. baculicrystallum J.O. Sousa et al.; G. brunneocapillatum J.O. Sousa et al.; G. courtecuissei P.-A. Moreau & C. Lécuru, G. neoamericanum J.O. Sousa

et al.; G. rubellum P.-A. Moreau & C. Lécuru; G. rubropusillum J.O. Sousa et al. For

the genus Myriostoma, two new species were described: M. calongei Baseia, J.O. Sousa, & M.P. Martín and M. australianum J.O. Sousa Baseia & M.P. Martín; moreover, two new combinations were proposed: M. areolatum (Calonge & M. Mata) M.P. Martín, J.O. Sousa & Baseia and M. capillisporum (V.J. Stanek) L.M. Suz et al. A lectotype and an epitype for the specie M. coliforme (Dicks.) Corda was elected. The data generated by this revision changed the systematic interpretations about the family Geastraceae, it was possible to prove that there were species complex which underestimated the knowledge about the richness of this family in Neotropical region.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estruturas tradicionalmente utilizadas nas descrições taxonômicas de

Geastrceae. A-B. Geastrum. C-D. Myriostoma. ... 26

Figura 2. Exemplos de géis de eletroforese obtidos neste trabalho. A. Gel de

comprovação amplificação de TEF1α (EF1-1018F/EF11620R). B. Gel de comprovação amplificação de RPB2 (RPB2-5F/RPB2-7.1R nested com bRPB2-6F/bRPB2-7R2). C. Gel de comprovação de purificação poços de 1-6 região ITS (ITS5/ITS4), poços 7-12 região LSU (LR0R/LR5). D. Gel de comprovação de purificação poços de 1-5 região LSU (LR0R/LR7), poços de 6-12 região LSU ( LR0R/LR5)... ... 33

Capítulo I

Figura 3 (Fig. 1) Site in “Caatinga”, Brazil. A. Map of the “Caatinga” biome in Brazil.

B. Paraíba State. C-D. landscape images... 56

Figura 4 (Fig. 2) Basidiomata in situ (A-B) and ex situ (C-D). A. Basidiomata with

arched exoperidium. B. Detailed mycelial layer. C. Basidiomata with strongly hygroscopic rays. D. Detailed peristome. ... 57

Figura 5 (Fig. 3) Basidiospores under LM (A-D). ... 58 Figura 6 (Fig. 4) SEM images. A-B. Basidiospores. C. Hyphae of endoperidium. D.

Eucapillitium. ... 59

Capítulo II

Figura 7 (Fig. 1) Strict consensus tree of the eight most parsimonious trees of

concatenated ITS and LSU nrDNA sequences of Geastrum indicated in Table 1. ... 74

Figura 8 (Fig. 2) Geastrum caatingense sp. nov. A. Fresh basidiomata in situ (UFRN–

Fungos 2843, holotype). B. Fresh basidioma in situ. C (UFRN–Fungos 2960, isotype). Peristome detail. D. Endoperidial body detail. E. Endoperidium surface under SEM. F. Eucapillitialy hypha under SEM. G. Basidiospores under LM. H. basidiospore under SEM. ... 75

Figura 9 (Fig. 3) Geastrum parvistellum sp. nov. A. Fresh basidioma in situ (UFRN–

(12)

Peristome detail. D. Pedicel detail. E. Endoperidium surface under SEM. F. Eucapillitial hyphae under SEM. G. Basidiospores under LM. H. Basidiospore under SEM.. ... 76

Capítulo III

Figura 10 (Fig. 1) Bayesian trees of ITS (on the left) and ITS/LSU (on the right) nrDNA

sequences of Geastrum species... ... 83

Figura 11 (Fig. 2) Type collections of Geastrum hirsutum and Geastrum schweinitzii.

(A) Geastrum hirsutum MA-Fungi 67886, paratype. (B) Geastrum hirsutum UFRN-Fungos 245, holotype. (C) Geastrum schweinitzii K (M) 180188, type. (D) Geastrum

schweinitzii K (M) 180187 ... 85

Figura 12 (Fig. 3) Analysis involving species of Geastrum schweinitzii complex. (A)

Bayesian analysis conducted in Beast 2 software along 50 million generations. (B) Topo-phylogenetic and (C) Topo-phylogenetic network representations. ... 87

Figura 13 (Fig. 4) Geastrum schweinitzii and allies. (A). Geastrum neoamericanum sp.

nov. (B) Geastrum baculicrystallum sp. nov. (C). Geastrum courtecuissei sp. nov. (D)

Geastrum rubropusillum sp. nov.. ... 88

Figura 14 (Fig. 5) Geastrum hirsutum and allies. (A) Geastrum brunneocapillatum sp.

nov. (B) Geastrum hirsutum. (C) Geastrum pusillipilosum. (D) Geastrum rubellum sp. nov.. ... 90

Capítulo IV

Figura 15 (Fig. 1) The 50% majority-rule consensus tree of ITS/LSU nrDNA sequences

of Myriostoma species using a Bayesian approach. ... 108

Figura 16 (Fig. 2) Myriostoma areolatum (MA-Fungi 68596, isotype). (a) Dried

expanded basidioma ex situ, bar = 10 mm. (b) Stomata, bar = 5 mm. (c) Basidiospores under SEM, bar = 2 μm. (d) Endoperidial surface under SEM, bar = 50 μm. ... 110

Figura 17 (Fig. 3) Myriostoma calongei. (a) Fresh expanded and unexpanded

basidiomata in situ (UFRN-Fungos 2019, holotype), bar = 20 mm. (b) Endoperidial surface (UFRN-Fungos 386, paratype), bar = 1 mm. (c) Stoma (UFRN-Fungos 386, paratype), bar = 2 mm. (d) Basidiospores under LM (UFRN-Fungos 2020, isotype), bar = 10 μm. (e) Capillitium under LM (UFRN-Fungos 2019, holotype), bar = 10 μm. (f) Basidiospores under SEM, bar = 2 μm. (g) Endoperidial surface under SEM (UFRN-Fungos 2019, holotype), bar = 50 μm. ... 112

(13)

Figura 18 (Fig. 4) Myriostoma capillisporum. (a–b) Dried expanded basidiomata ex situ

(KM205483 and K(M)205482, respectively), bar = 20 mm. (c–d) Basidiospores under LM (K(M)205483), bar = 10 μm. (e) Basidiospores under SEM (K(M)205483), bar = 2.5 μm. (f) Endoperidial surface under SEM (K(M)205483), bar = 50 μm. ... 113

Figura 19 (Fig. 5) Myriostoma coliforme. (a–b) Dried expanded basidiomata ex situ

(K(M)138625, epitype), bar 10 mm. (c) Endoperidial surface (PC0723885), bar = 1 mm. (d) Stoma (MJ8714), bar = 1 mm. (e) Basidiospores under LM (K(M)138625, epitype), bar = 10 μm. (f) Capillitium under LM (MJ8714), bar = 10 μm. (g) Basidiospores under SEM (K(M)138625, epitype), bar = 2.5 μm. (h). Endoperidial surface under SEM (K(M)138625, epitype), bar = 100 μm. ... 116

Figura 20 (Fig. 6 )Dickson’s illustration of Myriostoma coliforme (lectotype) published

in 1785 as (Tab. III: Fig 4). ... 117

Figura 21 (Fig. 7) Distribution map of the Myriostoma specimens included in the

phylogenetic analyses of this study (geometric figures in colour).. ... 117

Capítulo V

Figura 22 (Fig. 1) Phylogenetic tree, 50% Bayesian majority rule combined consensus

tree of ITS and LSU nrDNA... 133

Figura 23 (Fig. 2) Myriostoma australianum (holotype MEL 2305388). A: Expanded

dried basidiomata B: Stoma in detail. C: Basidiospore (LM). D–E: Basidiospores (SEM). ... 134

Figura 24 (Fig. 3) Myriostoma australianum (holotype MEL 2305388), Exoperidium

layers under LM. A. Mycelial layer under LM B. Fibrous layer C. Pseudoparenchimatous layer. ... 135

Figura 25 (Fig. 4) Line drawing of basidiospores. A. Myriostoma australianum

(holotype MEL 2305388). B. M. capillisporum (K(M)205483).. ... 135

Anexo I

Figura 26. Overview Mucoromycotina and Agaricomycotina phylogeny ... 140 Figura 27. One of the 19 equally most parsimonious trees of ITS nrDNA sequences

obtained after a heuristic search using SeaView v. 4.6 (Gouy et al. 2010).. ... 142

Figura 28. Colour illustrations. Brazil, Paraíba, Reserva Biológica Guaribas, ﬁeld track

(14)

isotype); b. detail of hairy exoperidium (UFRN-Fungos 2315, holotype); c. basidiospores under the light microscope (UFRN-Fungos 2314); d. verrucose basidiospore with columnar warts (UFRN-Fungos 2314).. ... 142

Anexo II

Figura 29 (Fig. 1) Phylogenetic tree obtained by Bayesian analysis derived from

concatenated data (atp6 and nuc-LSU), with representatives of section Exareolata. Codes after species names are herbarium vouchers; in bold the new species Geastrum

verrucoramulosum. Numbers on nodes indicate support values (posterior probabilities

values above, and percentage of bootstrap below)and the scale bar indicates substitution per site. ... 155

Figura 30 (Fig. 2) Geastrum verrucoramulosum sp. nov., fresh (A, B) and dried (C–F)

basidiomata. A: LABEV 6059, paratype (Photo: Wendeson Castro). B: INPA264956, holotype (Photo: D.L. Komura). C–F: UFRN-Fungos 2782, paratype (Photos: Wendeson Castro). C: Exoperidium with densely verrucose surface. D: Non-delimitated peristome. E: Cross-section expanded basidioma. F: Ramulose stipe………. .. 156

Figura 31 (Fig. 3) Geastrum verrucoramulosum sp. nov., micro-structures of

UFRN-Fungos 2782 (paratype) under scanning electron microscope (Photo: Iuri G. Baseia). A, B: Basidiospores. C: Hyphae of endoperidium surface. D: Hyphae of eucapillitium.. 157

Figura 32 (Fig. 4) Geastrum verrucoramulosum sp. nov., micro-structures of stipe (A,

B). A: Under 400 × of light microscope. B: Under 1000 × of light microscope.. ... 157

Anexo III

Figura 33. Overview Mucoromycotina and Basidiomycota phylogeny.. ... 162 Figura 34. Colour illustrations. Brazil, Paraíba, Reserva Biológica Guaribas, SEMA II,

open area of Atlantic rainforest where the type species was collected; expanded basidiomata in situ (UFRN – Fungos 2312, holotype); expanded basidiomata ex situ (UFRN – Fungos 2312, holotype); basidiospores under LM; basidiospores under SEM; eucapillitium under SEM. Scale bars = 2.5 mm (basidiomata in situ), 2 mm (basidiomata

ex situ), 10 μm (basidiospores under LM), 1 μm (basidiospores and eucapillitium under

(15)

Figura 35. The ﬁrst of three equally most parsimonious trees of the ITS nrDNA

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Regiões alvos da amplificação ... 29 Tabela 2. Espécies novas descritas neste trabalho. ... 32 Tabela 3. Material utilizado nas análises moleculares... 34

Capítulo II

Tabela 4 (Table 1) Geastrum species included in the molecular analyses with their

country, collection number and GenBank accession numbers of ITS and LSU of nuclear ribosomal DNA. The new sequences in bold. ... 72

Tabela 5 (Table 2) Comparative table with morphologic characteristics from species of

section Corollina. ... 73

Capítulo III

Tabela 6 (Table 1) Specimens and sequences included in this study. ... 81

Capítulo IV

Tabela 7 (Table 1) Specimens and sequences included in this study. ... 105 Tabela 8 (Table 2) Matrix of pairwise Kimura-2-parameter (K2P) distance between

ITS sequences from the four species analysed in this paper. ... 109

Capítulo V

Tabela 9 (Tabela 1) Specimens and sequences used to reconstruct the phylogenetic

trees. New ITS and LSU sequences are indicated in bold. ... 127 Tabela 10 (Tabela 2) Comparative tableo of morphologic characteristics of

Myriostoma australianum and M. capillisporum. ... 131

Anexo II

Tabela 11 (Table 1) Sequences used in aligment 2. Species names, herbarium

(17)

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 18 1.1. Geastraceae... 20 1.1.1. Geastrum ... 23 1.1.2. Myriostoma ... 24 2. OBJETIVOS... 25 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 25 3.1. Análises Morfológicas... 25 3.2. Análises Moleculares ... 27 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 31 4.1. Geastrum ... 40 4.2. Myriostoma ... 44

Capítulo I — Geastrum laevisporum: a new earthstar fungus with uncommon smooth spores...54

Introduction ... 55

Materials & Methods ... 56

Results.... ... 57

References ... 60

Capítulo II — Contribution to Neotropical data of Geastrum section Corollina (Basidiomycota): Two new earth–stars from Caatinga vegetation, Brazil ... 62

Introduction ... 65

Materials and methods ... 65

Results… ... 66

Discussion ... 68

References ... 69

Capítulo III — Hidden fungal diversity from Neotropics: Geastrum hirsutum, G. schweinitzii (Basidiomycota, Geastrales) and their allies ... 77

Introduction ... 78

Results ... 82

Discussion ... 96

References ... 99

Capítulo IV — More than one fungus in the pepper pot: Integrative taxonomy unmasks hidden species within Myriostoma coliforme (Geastraceae, Basidiomycota) ... 102

(18)

Introduction ... 103

Results… ... 106

Discussion ... 118

References ... 119

Capítulo V — Strengthening Myriostoma (Geastraceae, Basidiomycota) diversity: Myriostoma australianum sp. nov ... 122

Taxonomy ... 129

References ... 131

6. CONCLUSÃO GERAL ... 136

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 136

Anexo I — Geastrum pusillipilosum J.O. Sousa, Alfredo, R.J. Ferreira, M.P. Martín & Baseia, sp. nov. ... 137

Anexo II — A remarkable new species of Geastrum with an elongated branched stipe 143 Anexo III — Geastrum magnosporum J.O. Sousa, B.D.B. Silva, P. Marinho, M.P. Martín & Baseia, sp. nov. ... 158

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1. INTRODUÇÃO

O conhecimento sobre a diversidade do Reino Fungi (cerca de 135 mil espécies descritas) está a uma distância abissal quando comparado aos outros Reinos eucarióticos, como Plantae (cerca de 400 mil espécies descritas) e Animalia (cerca de 1 milhão de espécies descritas) (Mora et al., 2011; Hibbett et al., 2016; RBQ Kew, 2016). A incipiência sobre o estudo dos fungos fica ainda mais evidente frente às estimativas de diversidade. Na era pré-estudos de biologia molecular, Hawksworth (1991) estimou o número de espécies fúngicas em 1.5 milhões, baseado na relação média de fungos encontrada por espécie de planta (6:1) em Ilhas britânicas. Estudos moleculares mais atuais estimam que exista aproximadamente cinco a seis milhões de espécies de fungos (Blackwell, 2011; Taylor et al., 2014), sendo, portanto quase 97% das espécies existentes ainda nem sequer descritas pela ciência.

Os fungos são organismos heterotróficos extremamente múltiplos em suas formas. Estão “virtualmente onipresentes”, sendo encontrados na forma unicelular ou pluricelular. São fundamentais agentes na decomposição, além de realizarem importantes interações ecológicas mutualísticas, parasitárias ou predatórias com animais e plantas. Quando “domesticados”, os fungos têm alta aplicabilidade em vários setores da economia mundial: como fabricação de pão, cerveja e vinho, proveniente da fermentação realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen; produção de fármacos como a penicilina, que foi o primeiro antibiótico descoberto a partir de uma espécie do gênero Penicillium Link; cultivo de cogumelos comestíveis como Agaricus bisporus (J.E.Lange) Imbach, Lentinula edodes (Berk.) Pegler e Tuber

melanosporum Vittad. (conhecidos na gastronomia como Champignon, Shitake e Trufa

Negra, respectivamente), os quais têm elevado valor comercial (Carlile et al., 2001; Webster & Weber, 2007; Willis, 2018).

O degrau elementar para que se possa utilizar qualquer organismo, independente de sua aplicabilidade, é a identificação. A taxonomia é a ciência responsável por esta tarefa, além de ser a base para estudos evolutivos, ecológicos e de conservação. A taxonomia do Reino Fungi passou por uma revolução nas últimas décadas, devido ao emprego da ferramenta molecular. A utilização de porções da sequência do DNA como caracteres vem auxiliando na delimitação de espécies, uma vez que a utilização de apenas caracteres morfológicos, e os diferentes pesos dados a eles, pode se tornar um

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obstáculo para classificar os mais variados grupos (Stielow et al., 2011; Haelewaters, 2018).

Regiões do DNA ribossomal (subunidade menor do rDNA ribossômico “SSU”; subunidade maior do rDNA ribossômico “LSU”; espaçador transcrito interno do rDNA ribossômico “ITS”) e mitocondriais (subunidade 6 da ATP sintase-DNA mitocondrial “ATP6”) são preferencialmente empregadas para responder questões da sistemática e evolução de fungos em diferentes níveis taxonômicos. Essas regiões são principalmente utilizadas pela facilidade em amplificação, uma vez que apresentam muitas cópias ao longo da cadeia de DNA; e devido à presença de iniciadores (primers) universais (White et al., 1990; Gardes & Bruns, 1993; Matheny et al., 2002). Em 2012 a região ITS foi designada como região código de barra (barcode) universal do Reino Fungi (Schoch et al., 2012). Entretanto, estudos prévios demonstraram também resultados satisfatórios na sistemática em nível de espécie utilizando-se regiões codificadoras de proteínas como: maior subunidade da RNA polimerase II “RPB1”; segunda subunidade maior da RNA polimerase II “RPB2” e fator de elongação 1 – α da RNA polimerase II “TEF1α” (Matheny et al., 2002, 2007; Matheny, 2005).

O filo Basidiomycota é caracterizado pela estrutura microscópica denominada basídio, a partir de onde são originados os basidiósporos (Webster & Weber, 2007). Este filo, juntamente com Ascomycota, compõe o sub-reino Dicarya (Hibbett et al., 2007). Sobretudo para os fungos gasteroides, agrupamento polifilético do filo Basidiomycota distinguido pelo basidioma angiocárpico e basidiósporos estatismosporos, o emprego da ferramenta molecular utilizando o barcode universal do reino Fungi (região ITS nrDNA) vem demostrando eficiência na taxonomia, possibilitando o descobrimento de uma diversidade escondida (Martín et al., 2013; Phosri et al., 2014; Baseia et al., 2016).

A diversidade da região Neotropical é ainda pouco estudada quando comparada com as regiões Neárticas e Paleárticas (Olson et al., 2001; Brooks et al., 2006). Contudo, esta região abrange países megadiversos, sete “hotspots” (Mesoamérica, Ilhas do Caribe, Andes Tropicais, “Tumbes-Chocó-Magdalena”, Cachoeiras do Chile e Florestas Valvidias, Cerrado e Mata Atlântica) e ecossistemas tropicais, os quais demonstram elevado potencial para abrigar espécies de fungos ainda não conhecidas pela ciência (Myers et al., 2000; Hawksworth, 2001). Além disso, países como o Brasil vêm

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apresentando grande representatividade na descoberta de novos táxons dentro da família Geastraceae Corda, onde da última década até o presente momento foram descobertas uma dezena de espécies (exceto as descritas nesta tese): Geastrum aculeatum B.D.B. Silva & Baseia, G. echinulatum T.S. Cabral, B.D.B. Silva & Baseia (Silva et al., 2013);

G. caririense R.J. Ferreira et al. (Crous et al., 2017); G. entomophilum Fazolino

(Fazolino et al., 2008); Calonge & Baseia; G. hirsutum Baseia & Calonge (Baseia & Calonge, 2006); G. inpaense T.S. Cabral B.D.B. Silva & Baseia (Cabral et al., 2014a);

G. ishikawae Accioly, J.O. Sousa Baseia & M.P. Martín (Crous et al., 2016); G. piquiriunense Accioly, A.A. Lima, J.O. Sousa, M.P. Martín & Baseia (Crous et al.,

2018); G. rusticum Baseia, B.D.B. Silva & T.S. Cabral (Cabral et al., 2014b); G.

setiferum Baseia (Baseia & Milanez, 2002).

Análises filogenéticas, baseadas tanto na morfologia da família Geastraceae quanto em análises moleculares, enfatizando espécies Neotropicais são escassas. Desta forma, almejamos investigar as relações filogenéticas dos representantes da família Geastraceae, utilizando novos caracteres morfológicos e moleculares, dando ênfase em táxons com distribuição neotropical. Pretendemos confirmar a seguinte hipótese: “Existem complexos de espécies que subestimam o conhecimento sobre a diversidade de Geastraceae na região Neotropical”.

1.1. Geastraceae

Os representantes da família Geastraceae Corda (Geastrales, Basidiomycota) são visualmente reconhecidos pelos corpos de frutificação em forma de estrela, devido à deiscência do exoperídio em raios na maturidade, sendo denominados comumente “earthstars”. Baseado em estudos moleculares mais recentes esta família é constituída por dois gêneros: Geastrum Pers. (Persoon, 1801) e Myriostoma Desv. (Desvaux, 1809) os quais apresentam basidiomas gasteroides e basidiósporos liberados passivamente através do mecanismo de fole (Hosaka et al., 2006; Jeppson et al., 2013; Zamora et al., 2014).

Apesar da maioria dos representantes de Geastrum apresentar basidioma em forma de estrela, alguns podem ser classificados como falsas-trufas, sendo caracterizados pelo basidioma esférico e hábito geralmente hipógeo. Essas espécies eram anteriormente classificadas no gênero Radiigera Zeller, o qual, atualmente, é um sinônimo de

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classificados em Radiigera demonstra ser um caráter homoplásico dentro do gênero

Geastrum, tendo surgido em várias ocasiões dentro da história evolutiva do gênero

(Hosaka et al., 2006; Trappe et al., 2009; Zamora et al., 2014).

Sunhede (1989) considera oito gêneros na família: Geastrum, Myriostoma,

Geasteropsis Long, Trichaster Czern, Phialastrum Sunhede, Pyrenogaster Malençon e

Riousset, Radiigera e Terrostella Long (= Geasteropsis). No entando, alguns desses gêneros, além de Radiigera, como Trichaster e Geasteropsis são considerados por Kirk et al. (2008) sinônimos de Geastrum. Outros como Phialastrum e Pyrenogaster (=

Schenella T. Macbr.) necessitam ser mais bem investigados para comprovar sua

classificação (Estrada-Torres et al., 2005).

Os gêneros que compõe Geastraceae são essencialmente saprofíticos, sendo encontrados principalmente no solo decompondo madeira morta ou liteira. Entretanto, há relato que esses fungos podem realizar associações ectomicorrízicas facultativas, favorecendo o estabelecimento de comunidades vegetais (Carlile et al., 2001; Tedersoo

et al., 2010). Existem vários registros etnomicologicos sobre a utilização desses fungos

na medicina popular, principalmente para uso hemostático e cicatrização (Shepard et al., 2008). Ensaios bioquímicos demostram potencial anti-inflamatório e antioxidante desses fungos (Dore et al., 2007; Sevindik et al., 2017).

Geastraceae apresenta uma distribuição global, sendo cosmopolita (Kasuya et al., 2012; Jeppson et al., 2013). Geastrum é um dos gêneros gasteroides mais diversos, com cerca de 100-120 espécies de acordo com Zamora et al. (2014). Enquanto Myriostoma foi considerado monoespecífico até 2017, constituído apenas por Myriostoma coliforme (Dicks.). Corda (Sunhede, 1989; Sousa et al., 2017, Capítulo VII desta tese); espécie que, ainda que amplamente distribuída, tem ocorrência rara, sendo classificada na lista vermelha de espécies ameaçadas com “status” de ameaçada de extinção em algumas localidades europeias, como no Reino Unido (Jeppson et al., 2013).

De acordo com Kirk et al. (2008), no total esta família abrange 64 espécies, porém condigno com as recentes publicações de novos táxons para ciências, além de espécies crípticas, este número está subestimado, não refletindo a quantidade real de espécies conhecidas até o momento. Geastraceae é a família tipo da ordem Geastrales Hosaka et Castellano. Ainda assim, não foi definida uma sinapomorfia que caracterize a família.

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Acredita-se que com base na morfologia da rizomorfa seja possível elucidar caracteres que definam este clado (Agerer, 2006; Hosaka et al., 2006).

No século XX alguns estudos sobre a sistemática e taxonomia da família Geastraceae foram realizados (Coker & Couch, 1928; Ponce de Léon, 1968; Sunhede, 1989). Porém, esses estudos levaram em conta exclusivamente caracteres morfológicos, não apresentando uma classificação baseada na filogenia do grupo. Além disso, as análises tiveram foco principalmente em espécimes do Hemisfério Norte, sendo mínima ou ausente a representatividade de táxons da região Neotropical.

Apenas nos últimos anos foram publicados trabalhos sobre Geastraceae utilizando dados de filogenia molecular. Cabral et al. (2014a, b), Caffot et al. (2016) Crous et al. (2015, 2017), Douanla-Meli et al. (2005) e Silva et al. (2013) empregaram a ferramenta molecular para comprovar a descoberta de novos táxons. Enquanto, Kasuya et al. (2012) propuseram a polifilia da espécie Geastrum triplex Jungh. Contudo, esses estudos realizados não tiveram uma amostragem significativa de espécimes neotropicais, além de não utilizarem o tipo da espécie nas análises. No ano seguinte, Jeppson et al. (2013) realizaram estudo de Sistemática das espécies europeias, propondo a sinonimização do gênero Radiigera com Geastrum.

Posteriormente, Zamora et al. (2014) realizaram um amplo estudo morfológico e de filogenia molecular utilizando as sequências das regiões gênicas: ITS, LSU, RPB1 e

ATP6, no qual foi proposta divisão do gênero Geastrum em 14 seções e 9 subseções.

Neste estudo, além dos caracteres tradicionalmente utilizados na taxonomia de Geastraceae, novos caracteres com proposição de importância taxonômica foram apresentados, incluído morfologia de cristais presente nas rizomorfa dos espécimes. Contudo, das 139 amostras analisadas por Zamora et al. (2014), apenas 23 são provenientes da região Neotropical (13 da Argentina, 6 do Brasil, 2 da Bolívia e 2 do Peru). Desta forma, algumas seções propostas por Zamora et al. (2014) necessitam ser melhor investigadas, principalmente para adição de dados Neotropicais.

As seções Myceliostroma (Henn.) P.Ponce de León e seção Exareolata De Toni são as únicas seções com espécimes capazes de produzir subículo (densa camada esbranquiçada de hifas que se estendem sobre o substrato), característica a qual, de acordo com Ponce de Léon (1968), está presente exclusivamente em espécies com

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distribuição tropical. Enquanto a seção a seção Corollina J.C. Zamora apresenta espécies tipicamente americanas (G. morganii Lloyd, G. saccatum Fr. e G. violacum Rick), porém com alguns representantes ainda não identificados em nível de espécie. Assim, essas três seções serão as principais abordadas neste estudo.

1.1.1. Geastrum

O gênero Geastrum é facilmente reconhecido pelo basidioma estreliforme e um único ostíolo apical. O nome do gênero faz referência à deiscência dos corpos de frutificação em raios; “geo”, em grego, significa terra; enquanto “aster” significa corpo celeste ou estrela. O gênero foi proposto por Persoon em 1974, apresentando como espécie tipo

Geastrum coronatum Pers. (Zamora, 2014). Além de Radiigera, outros sinônimos de

repercussão de Geastrum são: Coilomyces Berk. & M.A., publicado em 1853 com espécie tipo C. schweinitzii Berk. & M.A. Curtis (= Geastrum schweinitzii Berk. & M.A. Curtis) (Zeller, 1948); e Trichaster Czern., publicado em 1845 com a espécie tipo

T. melanocephalus Czern. (= Geastrum melanocephalus Czern.) (Capellano & Riousset,

1968; Kasuya et al., 2012).

Geastrum destaca-se dentre os fungos gasteroides por sua riqueza, abundância e

ampla distribuição, sendo encontrado em variados tipos de ecossistemas. Assim, é um gênero considerado subcosmopolita, com ocorrência em todos continentes, excluindo-se a Antártida. Ocorre desde florestas tropicais e subtropicais, como Mata Atlântica e os Pampas brasileiros; ou ainda em desertos como Sonora no México, e regiões semiáridas como a Caatinga no Brasil (Silva et al., 2011; Sousa et al., 2015; Trierveiler-Pereira et

al. 2017).

Segundo o Index Fungorum (www.indexfungorum.org) são encontradas 337 espécies agrupadas neste gênero. Baseado em Kirk et al. (2008), há 50 espécies válidas agrupadas em Geastrum, enquanto que de acordo com Zamora et al. (2014), 100-120 espécies pertencem a este gênero. Na região Neotropical, em consonância com levantamento bibliográfico realizado neste estudo, existe cerca de 90 espécies, sendo 60 destas (67%), ocorrentes em território brasileiro, Entretanto, estes números são incertos, devido à grande quantidade de sinônimos, escassez de dados neotropicais e espécies novas publicadas recentemente e de maneira recorrente.

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1.1.2. Myriostoma

O gênero Myriostoma é um raro fungo gasteroide com basidioma estreliforme. Apresenta macro-morfologia muito similar a outros gêneros gasteroides com este mesmo formato, tais como Astreus Morgan; e, sobretudo, Geastrum. Contudo,

Myriostoma é claramente distinguido pela presença de vários estomas na superfície

apical do endoperidio, além de apresentar mais de um pedicelo abaixo do corpo endoperidial e basidiósporos com ornamentação reticulada (Phosri et al., 2014; Sousa et

al., 2017). Devido aos múltiplos estomas, por onde a gleba pulverulenta e amarronzada

é liberada, o gênero foi denominado. “Myri” em grego significa muitos, enquanto “stoma” significa boca ou orifício. Os espécimes deste gênero são popularmente conhecidos como “pepper pot earthstar” (estrela da terra pote de pimenta) ou “colaender

puffball” (bufa-de-lobo coador) (Sousa et al., 2017).

A primeira citação de um representante do gênero Myriostoma foi realizada por Withering em 1776 como Lycoperdon coliforme With. Este mesmo nome foi utilizado por Dickson (1785) em trabalho com ilustração da espécie. Em 1801, Persoon propõe

Geastrum coliforme (Dicks.) Pers. baseando-se no trabalho de Dickson. O primeiro

nome válido do gênero foi apenas proposto em 1809, baseado na espécie Myriostoma

anglicanum Desv., cujo material tipo, atualmente, encontra-se perdido (Bates, 2004).

Gray (1821) propôs o gênero Polystoma (Dicks.) Gray, baseando-se na espécie

Lycoperdon coliforme do trabalho de Dickson, contudo, por Polystoma ser sinônimo de Myriostoma, e baseando-se na prioridade da publicação mais antiga, o nome

considerado válido para o gênero é Myriostoma (Sunhede, 1989). Em 1842, Corda propôs a combinação Myriostoma coliforme (Dicks.: Pers.) Corda. A ilustração de Dickson (1785) [Fasc. pl. crypt. brit. (London) 1:24] baseada em Lycoperdon colliforme (= Myriostoma coliforme (With.: Pers.) Corda) foi considerada até 2017 seu único material tipo.

Desde o século XIX Myriostoma coliforme vinha sendo reconhecida como a única espécie do gênero, apresentando distribuição global. Em 2017 foi publicada revisão do gênero, resultando em 4 espécies classificada neste gênero. Esta atualização de

Myriostoma desmistifica o “status” de monoespecífico do gênero e faz parte dos

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2. OBJETIVOS

Geral: Revisar espécies de Geastraceae com distribuição Neotropical, interpretando as relações filogenéticas a fim de ampliar a compreensão da sistemática do grupo.

Específicos:

 Caracterizar molecular e morfologicamente representantes da família Geastraceae da região Neotropical;

 Elucidar novos caracteres a serem utilizados nos estudos taxonômicos da família;

 Revisar os espécimes tipo utilizando base morfológica moderna;  Realizar estudos comparativos com espécimes tipo.

 Estudar a relação morfologia-filogenia dos espécimes Neotropicais de Geastraceae.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Análises Morfológicas

O estudo dos espécimes foi realizado no Laboratório de Biologia de Fungos (UFRN, Natal, Brasil) e no Departamento de Micología del Real Jardín Botánico (RJB-CSIC, Madrid, Espanha). Foram analisadas amostras coletadas durante o decorrer desta revisão (expedições de campo realizadas por membros do Lab. De Biologia de Fungos UFRN entre os anos de 2015-2018) e depositadas em herbários, dando ênfase aos espécimes coletados em regiões Neotropicais e amostras tipo. Os principais herbários brasileiros investigados foram: Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN, Porto Alegre) Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN-Fungos, Natal), Universidade Federal de Pernambuco (URM, Recife), Instituto Anchietano de Pesquisa/UNISINOS PACA (Rio Grande do Sul, São Leopoldo), Instituto Nacional de Pesquisas na Amazônia (INPA, Manaus). Bem como, foram consultados os herbários onde se concentram amostras provenientes da região Neotropical, a saber: Herbarium of the Muséum national d'Histoire Naturelle (PC, Paris, França), Naturalis (L, Leiden, Holanda), U.S. National Fungus Collections (BPI, Beltsville-MD, Estados Unidos), Royal Botanic Gardens (K, Londres, Inglaterra) e Real Jardín Botánico (MA-Fungi, Madrid, Espanha). Descrições detalhadas das características macro e micro

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morfológicas (Fig. 1) foram desenvolvidas baseando-se nas metodologias propostas por Sunhede (1989), Calonge (1998) e Zamora et al. (2013).

Figura 1. Estruturas tradicionalmente utilizadas nas descrições taxonômicas de

Geastrceae. A-B. Geastrum. C-D. Myriostoma.

Para o estudo das características macroscópicas caracteres como disposição do exoperídio (arqueado, saculiforme, fornicado), morfologia do peristômio (fribriloso, sulcado), presença ou ausência de pedicelo, tamanho e cor dos basidiomas foram analisados. A definição da coloração dos espécimes foi baseada na tabela de cores proposta por Kornerup & Wanscher (1978) ou Küppers (2002). Para análise das micro-estruturas, lâminas foram montadas com auxílio de pinças e o conteúdo foi reidratado em KOH 5% para visualização em microscópio óptico, utilizando principalmente as objetivas de 40 e 100 . Basidiósporos, basídios, capilícios, hifas do exoperídio e da rizomorfa foram analisados. Nas análises dos basídios foi utilizado o corante Vermelho Congo. De cada coleção, foram medidos no mínimo trinta basidiósporos aleatoriamente, todas as medições incluíram a ornamentação. Após medição do diâmetro dos basidiósporos, a ornamentação foi medida separadamente. Medidas estatísticas como média do diâmetro e altura dos basidiósporos, desvio padrão (x ± SD, respectivamente), além do quociente entre largura e altura média (Qm) foram realizadas, como também,

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foram realizadas análises de ultraestrutura com auxílio de microscópio eletrônico de varredura (MEV); a preparação do material analisado em MEV seguiu Silva et al. (2011).

3.2. Análises Moleculares

Os procedimentos de extração, amplificação e purificação de DNA foram realizados no Laboratório de Genética Molecular de Plantas do Centro de Biociências- Universidade Federal do Rio Grande do Norte, coordenado pelo Professor Doutor Paulo Marinho; e no Laboratório de Sistemática Molecular - Real Jadrín Botánico de Madrid, onde os trabalhos foram coordenados pela Dr. María P. Martín. Para extração de DNA fragmentos de aproximadamente 10 mg foram retirados do basidioma herborizado e adicionados a tubos de 1,5 ml, dando preferência à porção fértil (gleba). Os fragmentos de basidioma foram macerados com um micro pistilo ou trituradas com auxílio de micro-esferas de vidro no equipamento TissueLyser (Qiagen). Os kits utilizados para a extração de DNA foram: QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, California, U.S.A.) ou The Speedtools Tissue DNA Extraction Kit (Biotools B&M Labs.S.A). Os protocolos de extração foram adaptados com base em Martín & Winka (2000). Uma das modificações aplicadas ao protocolo original dos fabricantes dos Kits de extração foi submeter às amostras + Buffer 1 a temperatura 56-60ºC durante 1-2 dias. Para espécies herborizadas, com data de coleta muita antiga, ou espécies com problemas na extração utilizando a metodologia citada anteriormente, foi utilizado Kits forense de extração (FTA Cards), seguindo a metodologia de extração baseada em Telleria et al. (2014).

A amplificação foi realizada através de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) utilizando “PCR beads” (Illustra™ PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads). Nos tubos de PCR beads foi adicionado 1 μl de cada iniciador a uma concentração de 10 M, 1-23 μl do DNA dependendo de sua concentração, e água ultra pura estéril, resultando em um volume final de 25 μl. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose, utilizando-se marcadores de pares de base padrão (1 kb ladder) para confirmar o tamanho das bandas (Figura 1). As regiões alvo do DNA foram: subunidade maior do rDNA (LSU= 28S); espaçador transcrito interno do rDNA ribossômico (ITS = ITS1 + 5.8S+ ITS2); segunda maior subunidade da RNA polimerase II (RPB2); fator de

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elongação 1 – alpha da RNA polimerase II (TEF1α). Os indicadores para cada região são os seguintes (Tabela 1):

- ITS. Foi utilizado o par de iniciadores ITS1F/ITS4 (Gardens & Bruns, 1993; White

et al., 1990). Quando necessário (bandas ausentes ou fracas na eletroforese) foi

realizada uma PCR-nested; para isto, uma primeira amplificação com os iniciadores ITS1F/ITS4B (Gardes & Bruns, 1993), nas quais se incluiu 1 μl de DNA, na segunda amplificação se utilizou 1 μl do produtor da primeira amplificação e os iniciadores ITS5/ITS4 (White et al., 1990). Informações do programada utilizado: 1ª fase desnaturação inicial (94ºC por 5 minutos); 2ª fase - 5 ciclos: (desnaturação 94º por 30 segundos) + (anelamento a 54ºC por 30 segundos) + (extenção a 72ºC por 1 minuto); 3ª fase- 33 ciclos: (desnaturação 94º por 30 segundos) + (anelamento a 48ºC por 30 segundos) + (extenção a 72ºC por 1 minuto); 4ª fase (extensão a 72 º por 10 minutos); 5ª fase (armazenamento a 4 ºC ∞).

- LSU. Foram utilizados os iniciadores LR0R/LR7 (Rehner & Samuels, 1994; Vigalys & Hester, 1990). Também, quando necessário foi realizada uma

PCR-seminested com os iniciadores LR0R/LR5 (Vigalys & Hester, 1990). Informações do

programada utilizado: 1ª fase desnaturação inicial (94ºC por 5 minutos); 2ª fase - 36 ciclos: (desnaturação 94º por 30 segundos) + (anelamento a 52ºC por 30 segundos) + (extenção a 72ºC por 1 minuto); 3ª fase- (extensão a 72 º por 10 minutos); 5ª fase (armazenamento a 4 ºC ∞).

- RPB2. Foi realizada diretamente uma PCR-nested, com iniciadores externos RPB2-5F/RPB2-7.1R (Matheny, 2005) e os internos bRPB2-6F/bRPB2-7R2 (Matheny, 2005), com as mesmas quantidades de DNA que para a região ITS. Informações do programada utilizado: 1ª fase desnaturação inicial (95ºC por 5 minutos); 2ª fase - 35 ciclos: (desnaturação 94º por 1 minuto) + (anelamento a 55ºC por 1 minuto) + (extenção a 72ºC por 1 minuto); 3ª fase- (extensão a 72 º por 10 minutos); 5ª fase (armazenamento a 4 ºC ∞).

- TEF1α. Foram utilizados os iniciadores EF1-1018F/EF11620R (Matheny et al., 2007) para uma PCR direta, utilizando 1 μl de cada iniciador e 23 μl do produto de extração. Informações do programada utilizado: 1ª fase desnaturação inicial (94ºC por 5

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minutos); 2ª fase - 40 ciclos: (desnaturação 94º por 1 minuto) + (anelamento a 48ºC por 1 minuto) + (extenção a 72ºC por 1 minuto); 3ª fase- (extensão a 72 º por 7 minutos); 5ª fase (armazenamento a 4 ºC ∞).

Anteriormente ao sequenciamento, os produtos foram purificados mediantes os protocolos do kit com colunas da marca Speedtools PCR Clean-Up Kit (Biotools B&M Labs. S.A), quando nos géis de eletroforese se observaram mais de uma banda; ou mediante a enzima ExoSAP-IT1(USB Corporation, OH, USA), quando se observou banda única na eletroforese (Fig. 2).

Tabela 1. Regiões alvos da amplificação

Iniciadores Utilizados Sequência do Iniciador

5’ – 3’ ITS (ITS1+5.8S+ITS2) ITS1F ITS4B ITS5 ITS4

CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A

CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG

GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G

TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

LSU (28S)

LR0R

LR7r

LR5r

ACC CGC TGA ACT TAA GC

TAC TAC CAC CAA GAT CT

TCC TGA GGG AAA CTT CG RPB2 RPB2-5F RPB2-7.1R bRPB2-6F bRPB2-7R2 GAYGAYMGWGATCAYTTYGG CCCATRGCYTGYTTMCCCATDGC TGGGGYATGGTNTGYCCYGC ACYTGRTTRTGRTCNGGRAANGG TEF1α EF1-1018F EF11620R GAYTTCATCAAGAACATGAT GACGTTGAADCCRACRTTGTC

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O sequenciamento bidirecional foi realizado na empresa Sul Coreana Macrogen, utilizando os mesmos iniciadores que geraram as amplificações de PCR. As sequências consenso foram obtidas com auxílio do programa Sequencher 5.2.4 (Gene Codes Corp., USA). Os consensos foram submetidos a uma busca no Genbank/ncbi.nlm.nih.gov utilizando a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), este procedimento foi necessário para que sequencias nucleotídicas errôneas não fossem utilizadas na análise. Os alinhamentos das sequências obtidas neste trabalho e sequências retiradas do Genbank foram inicialmente realizados com o algoritmo do MAFFT e posteriormente editados manualmente no software Seaview version 4.7 ou Molecular Evolutionary Genetics Analysis-MEGA (Gouy et al., 2010). As análises filogenéticas foram realizadas obtidas sobre três critérios: Máxima Parcimônia (MP), Máxima Verossimilhança (MV) e Inferência Bayesiana. As analises foram realizadas com as regiões alvo da amplificação por separado e, posteriormente, também concatenadas. As análises de MP foram realizadas no software PAUP* (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) v.4.0b10 (Swofford 2003) utilizando a busca heurística e análise de bootstrap (MPbs) com 10 mil replicações mediante a opção rápida. As análises de MV utilizaram RAxML no portal CIPRES portal (CIPRES Science Gateway v.3.3) com o modelo evolutivo GTRGAMMA ou GTR+I+G e bootstrap (MVbs) de mil replicações. As análises de Inferência Bayesiana foram realizadas no programa MrBayes, assumindo o modelo GTR+I+G. As probabilidades posteriores (PP) e os valores de bootstrap foram levados em conta para identificar o grau de confiabilidade dos clados (Lutzoni et al., 2004). As árvores obtidas foram visualizadas no FigTree, sendo posteriormente exportadas para programas de edição de imagem.

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram analisadas 215 coleções, das quais 14 corresponderam a exemplares tipos:

Geastrum aculeatum (UFRN-Fungos 1681, holótipo); G. echinulatum (UFRN-Fungos

1682, parátipo); G. entomophilum, (UFRN-Fungos 504, holótipo); G. hariotii Lloyd (PC0084345, holótipo): G. hirsutum (UFRN-Fungos 245, holótipo; MA-Fungi 67886, parátipo); G. lloydianum Rick (BPI 841471, lectotype); G. pleosporum Douanla-Meli (MA–Fungi 56971, isótipo); G. schweinitzii (Berk. & M.A. Curtis) Zeller (K(M) 180187, isótipo); G. triplex Jungh. (L0053171, holótipo); G. velutinum Morgan (K(M)179863, holótipo); G. welwitschii Mont. (PC073886, holótipo); Myriostoma

coliforme var. areolatum Calonge & M. Mata (MA-Fungi 68596, isótipo; MA-Fungi

36165, parátipo). Ao final dessa revisão foram descritas 14 espécies novas (Tabela 1). Foram realizadas no total 184 extrações de DNA. No total foram realizadas 349 reações de amplificação da região ITS, sendo destas 139 reações de PCR “nested”; 142 de LSU, sendo destas 37 de PCR “semi-nested”; 40 da região RPB2, sendo todas estas de PCR “nested”; além de 35 reações de amplificação da região TEF1α. Como se pode observar na Fig. 1, nem todos os produtos de amplificação tiveram a mesma qualidade (banda única e brilhante), desta forma, foram realizadas 356 reações de purificação de produtos de PCR e enviados para sequenciamento 308 purificaçãos. Quando editados os electroferogramas, foram obtidas 86 sequências de ITS, 77 de LSU, 18 de RPB2 e 16 de

TEF1 (Tabela 2), que correspondem aos dois gêneros estudados. Como pode observar na Tabela 1, apenas foi detectado nove sequências de outros gêneros (contaminações).

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32 Tabela 2. Espécies novas descritas neste trabalho.

ESPÉCIES NOVAS

1- G. laevisporum J.O. Sousa & Baseia Capítulo I, publicado

2- G. pusillipilosum J.O. Sousa et al. Anexo I, publicado

3- G. verrucoramulosum T.S. Cabral, J.O. Sousa & Baseia Anexo II, publicado

4- G. magnosporum J.O. Sousa et al. Anexo III, publicado

5- G. caatingense J.O. Sousa, M.P. Martín & Baseia Capitulo II, aceito

6- G. parvistellum J.O. Sousa, M.P. Martín & Baseia Capitulo II, aceito

7- G. baculicrystallum J.O. Sousa et al. Capítulo III, publicado

8- G. brunneocapillatum J.O. Sousa et al. Capítulo III, publicado

9- G. courtecuissei P.-A. Moreau & C. Lécuru Capítulo III, publicado

10- G. neoamericanum J.O. Sousa et al. Capítulo III, publicado

11- G. rubellum P.-A. Moreau & C. Lécuru Capítulo III, publicado

12- G. rubropusillum J.O. Sousa et al Capítulo III, publicado

13- M. calongei Baseia, J.O. Sousa, & M.P. Martín Capítulo IV, publicado

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33 Figura 2. Exemplos de géis de eletroforese obtidos neste trabalho. A. Gel de

comprovação amplificação de TEF1α (EF1-1018F/EF11620R). B. Gel de comprovação amplificação de RPB2 (RPB2-5F/RPB2-7.1R nested com bRPB2-6F/bRPB2-7R2). C. Gel de comprovação de purificação poços de 1-6 região ITS (ITS5/ITS4), poços 7-12 região LSU (LR0R/LR5). D. Gel de comprovação de purificação poços de 1-5 região LSU (LR0R/LR7), poços de 6-12 região LSU ( LR0R/LR5). M= marcador (1Kb Ladder); Negativos: poços 27A e 18B. Seta vermelha= banda indicando amplificação com presença de DNA degradado, sendo necessário purificação com Kit de colunas. Seta verde= banda indicando amplificação com banda única e “limpa”, material a ser purificado com enzima ExoSAP. Seta amarela= banda “fraca” indicando pouca quantidade de produto amplificado. Seta azul= ausência de banca após a purificação,

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34 Tabela 3. Material utilizado nas análises moleculares. Em negrito sequências enviadas GenBank; (Acc.Nº) = sequências a serem enviadas ao

GenBank; (elec. duplo) = sequências com eletroferogama duplo; (seq. curtas) = sequências curtas; (cont.) = contaminação; * = extrações realizadas no Real Jardín Botánico de Madrid.

Espécie Código Coleção Local de coleta Código

Extração _ITS _LSU _RPB2 _TEF1α

G. aculeatum UFRN Fungos 1681, holótipo Serra da Confusões-PI E15/13-2 (Acc.Nº) - - -

G. albonigrum (FN-40) Brasil E17/34-1* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. albonigrum UFRN-Fungos 2279 (JM151) Brasil, Areia-PB E16/6-8 (Acc.Nº) - - -

G. baculicrystallum sp. nov. UFRN-Fungos 2835 (JM137) Brasil, Areia-PB E15/13-6 MH634995 MH635028 - -

G. brunneocapillatum sp. nov. UFRN-Fungos 2834 (JM117) Brasil, Areia-PB E15/2-5 MH634997 MH635030 - -

UFRN-Fungos 2131 (JM45) Brasil, Areia-PB E15/3-8 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

UFRN-Fungos 2286 (JM101) Brasil, Guaribas-PB E15/2-7 MH634996 MH635029 - -

UFRN-Fungos 2287 (JM106) Brasil, Guaribas-PB E15/2-8 (Acc.Nº) - - -

UFRN-Fungos 2851 (Ovrebo 2203)

Costa Rica E15/15-5 MH634998 - - -

G. caatingense sp. nov. UFRN-Fungos 2843 (PB04) Brasil, Triunfo-PB E16/6-6 MH253884 MH253886 - -

G. cf. arenarium UFRN-Fungos 355 Brasil, PE E16/6-11 MG938500 MG938501 - -

G. cf. calceum UFRN-Fungos 2842 (PB03) Brasil, Triunfo-PB E15/1-10 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. cf. hariotii (JM127) Brasil,Areia-PB E15/17-6 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. cf. hirsutum (AMO 705) Brasil, AC E16/6-2 (Acc.Nº) - - -

(DT174) Brasil, Serra das

Confusões-PI

- (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

(36)

35

Espécie Código Coleção Local de coleta Código Extração

Regiões Amplificadas

ITS LSU RPB2 TEF1α

G. cf. hirsutum UFRN-Fungos 1500 Brasil, Natal-RN E15/2-4 (elec. duplo) - - -

UFRN-Fungos 1781 Brasil, Baía Formosa-RN

E15/3-1 (elec. duplo) - - -

UFRN-Fungos 2244 Brasil, Manaus-AM E15/2-11 (elec. duplo) - - -

G. cf. javanicum MA-Fungi 82855 Costa Rica E17/34-4* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

MA-Fungi 78294 Brasil E17/34-5* (Acc.Nº) (cont.) - -

MA-Fungi 34133 Venezuela E17/34-6* (elec. duplo) - - -

UFRN-Fungos 3002 (Ovrebo 3757)

Panamá E16/6-4 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

(Ovrebo3704) Panamá E15/17-1 (seq. curta) - - -

G. cf. lloydianum BPI 841471, lectótipo Brasil E17/33-4 *

E17/33-5*

(cont.) (Acc.Nº) - -

MA-Fungi 80070 República Dominicana E17/34-7* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

UFRN-Fungos 2840 (JM115) Brasil, Guaribas-PB E15/17-5 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. cf. pectinatum UFRN-Fungos 1796 Brasil, Baía

Formosa-RN

E15/17-11 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

UFRN-Fungos 1798 Brasil, Natal-RN E15/17-10 (seq. curta) - - -

G. cf. saccatum Ovrebo 4044 Panamá E15/17-3 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. cf. schweinitzii Ovrebo 2843 Costa Rica E16/6-3 (Acc.Nº) - - -

G. cf. stiptatum MA-Fungi 39161 Camarões E17/45-2* (cont.) - - -

G. cf. triplex L 0837171 México E17/34-9* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

L 0837172 Russia E17/34-10* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

L 3961257 Áustria E17/42-9* (Acc.Nº) - - -

L 3961340 Indonésia, Java E17/44-4*

E17/44-5*

(37)

36

ITS LSU RPB2 TEF1α

G. cf. triplex L 396331 França E17/42-1* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

L 3961324 Suíça E17/42-6* (elec. duplo) - - -

L 3961343 EUA, Tennessee E17/34-8* (Acc.Nº) - - -

L 3961344 EUA, Oregon E17/42-5* (elec. duplo) (cont.) - -

G. cf. velutinum MA-Fungi 73247 India E17/34-3* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. echinulatum UFRN-Fungos 1682, parátipo Brasil, Serra da

Jibóia-BA

E15/13-13 (Acc.Nº) - - -

G. entomophilum UFRN-Fungos 504, holótipo Brasil, Natal-RN E15/13-3 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. hariotii PC084345, tipo Brasil E17/33-7* (elec. duplo) - - -

PC00844350 Nova Caledônia E17/34-2 (elec. duplo) (Acc.Nº) - -

G. hirsutum MA-Fungi 67886, paratipo Brasil, Recife-PE E17/33-1*

E17/33-2*

MH538295 (cont.) - -

UFRN-Fungos 245, holótipo Brasil, PE E15/2-13 (cont.) - - -

INPA 259950 Braisl, Manaus-AM E15/3-7 MH634993 MH635026 - -

G. laevisporum sp. nov. UFRN-Fungos 2587 Brasil,Triunfo-PB E15/1-9 (elec. duplo) - - -

UFRN-Fungos 2258 Brasil,Triunfo-PB E17/42-11* (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. magnosporum sp. nov. UFRN-Fungos 2310 Brasil,Guaribas-PB E15/17-8 MG938498 MG938499 - -

UFRN-Fungos 2312 (JM110) Brasil,Guaribas-PB E15/17-9 MG938496 MG938497 - -

G. neoamericanum sp. nov. UFRNFungos 2850 (DAS 279) Brasil, MG E16/6-10 MH635000 MH635032 - -

UFRN Fungos 2302 (JM90) Brasil,Guaribas-PB E15/13-5 MH635001 MH635040 - -

G. parvistellum sp. nov. UFRN-Fungos 2841 (PB02) Brasil, Triunfo-PB E16/6-5 MH253885 MH253887 - -

G. pusillipilosum sp. nov. UFRN - Fungos 2759 (JD171) Brasil,Guaribas-PB E15/3-10 KX61177 KX761178 - -

(38)

37

ITS LSU RPB2 TEF1α

G. pusillipilosum sp. nov. (RJFnº23) Brasil, Crato-CE E14/15-2 (seq. curta) - - -

UFRN-Fungos 2316 (JM103) Brasil,Guaribas-PB E14/12-12 KX761179 - - -

UFRN-Fungos 1934 Brasil, MG E15/3-5 (seq. curta) - - -

UFRN-Fungos 2315 (JM100) Brasil,Guaribas-PB E15/2-9 KX761175 KX761176 - -

G. rubellum sp. nov. UFRN-Fungos 2844 (AMO604) Brasil, AC E16/6.1 MH634999 MH635031 - -

E15/3.2 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. rubropusillum sp. nov. UFRN2308 (JM36) Brasil, Areia-PB E15/13.11 MH634994 MH635027 - -

G. rusticum UFRN-Fungos 2301 (JM105) Brasil,Guaribas-PB E15/17.4 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

(Ovrebo 3620) Panamá E15/17.2 (seq. curta) - - -

UFRN-Fungos 1217, holótipo Brasil, Baía Formosa-RN

E15/13.12 (elec. duplo) - - -

G. schweintizii K(M)180187, isótipo Surinam - MH635016 (Acc.Nº) - -

G. setiferum URM 77077, parátipo Brasil, Rebio Serra

Negra-PE

E15/13.1 (elec. duplo) - - -

G. triplex L 053171, tipo Indonesia, Java E17/44-1

E17/44-2

(cont.) (cont.) - -

G. velutinum K(M) 179863, holótipo EUA - (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

G. welwitschii PC073886, tipo Portugal E16/1-6 (Acc.Nº) - - -

G. xerophilum UFRN-Fungos 944 Brasil, Catimbau-PE E15/17-12 (seq. curta) - - -

Geastrum sp. JM146 Brasil, Areia-PB E16/6-9 (seq. curta) - - -

JM146 Brasil, Areia-PB E15/13-10 (seq. curta) - - -

UFRN-Fungos 2125 ( JM49) Brasil, Areia-PB E15/13-9 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

(39)

38

ITS LSU RPB2 TEF1α

Geastrum sp. UFRN-Fungos 2291 (JM143) Brasil, Guaribas-PB E15/13-7 (Acc.Nº) (Acc.Nº) - -

(JD170) Brasil, Guaribas-PB E15/3-9 (Acc.Nº) - - -

(Ovrebo 4065) Panamá E16/6-12

E15/15-6

(elec. duplo) - - -

UFRN-Fungos 2839 (JM156) Brasil, Areia-PB E15/13-8 (seq. curta) (Acc.Nº) - -

M. areolatum comb. nov MA-Fungi 36165 Costa Rica E15/99.5* KY096673 KY096690 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

M. australianum sp. nov. MEL 310277 Austrália, Sydney E17/43-5* (Acc.Nº) (Acc.Nº) (elec.

duplo)

(Acc.Nº)

MEL 2310279 Austrália, Sydney E17/43-6* (Acc.Nº) (Acc.Nº) (Acc.Nº) (elec.

duplo)

MEL 2091620 Austrália, Sydney E17/43-2* MG675903 MG675884 - (Acc.Nº)

MEL 2305388 Austrália, Sydney E17/43-4* MG675901 MG675882 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

MEL 2060796 Austrália, Sydney E17/43-1* MG675902 MG675883 (elec.

duplo)

-

MEL 2095275 Austrália, Sydney E17/43-3* MG675904 MG675885 - -

M. calongei sp. nov. L 3961249 Brasil E17/35-4 * MG675905 MG675886 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

ICN 175617 Brasil, RS E17/27-3 * MG675906 MG675887 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

ICN 177080 Brasil, RS E17/27-4* MG675907 MG675888 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

URM 31429 Eua, New mexico E17/27-5* (elec. duplo) (Acc.Nº) - -

URM 31433 Eua, New mexico E17/27-2 MG675908 MG675889 - -

E15/15-2 KY096676 KY096693 - -

UFRN -Fungos 2020 Brasil, Baía Formosa-RN

E15/15-1 KY096677 KY096694 - -

UFRN-Fungos 386 Brasil, Catimbau-PE E15/15-4 KY096674 KY096691 - -

(40)

39

ITS LSU RPB2 TEF1α

M. coliforme L 3961237 Bulgária E17/35-9* MG675912 MG675893 (Acc.Nº) (seq.

curta)

L 3961244 Áustria E17/35-15* MG675910 MG675891 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

L 3961240 França E17/35-5* MG675914 MG675895 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

L 3961245 Áustria E17/35-13* - (Acc.Nº) (Acc.Nº) -

L 3961239 Ilha de Jersey E17/35-6* MG675913 MG675894 - (seq.

curta)

L 3961250 USA, Ohio E17/35-1* MG675919 MG675900 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

L 3961251 Holanda E17/35-7* MG675917 MG675898 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

L 3961243 Hungry E17/35-2* MG675916 MG675897 - -

L 3961241 Austria E17/35-12* MG675909 MG675890 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

L 3961246 Austria E17/35-11* (elec. duplo) (Acc.Nº) (Acc.Nº) (Acc.Nº)

L 3961247 Austria E17/35-14* MG675911 MG675892 - (Acc.Nº)

L 3961248 Hungria E17/35-8* (elec. duplo) (Acc.Nº) - -

L 3961242 Alemanha E17/35-10* MG675915 MG675896 (Acc.Nº) -

L 3961238 Slovakia E17/35-3* MG675918 MG675899 (Acc.Nº) (Acc.Nº)

MA-Fungi 31316 Porugal E15/99-4* - - (Acc.Nº) -

Ma-Fungi 60898 Espanha E15/99-7* - - (Acc.Nº) -

MA-Fungi 40288 Espanha E15/99.-3* - (elec. duplo) - (Acc.Nº)