Estudo comparativo da expressão de genes associados ao processo de inflamação em grávidas portadoras de doença falciforme

LETÍCIA DE CARVALHO BAPTISTA

ESTUDO COMPARATIVO DA EXPRESSÃO DE GENES

ASSOCIADOS AO PROCESSO DE INFLAMAÇÃO EM GRÁVIDAS

PORTADORAS DE DOENÇA FALCIFORME

CAMPINAS

2015

iv

vii RESUMO

As doenças falciformes (DF) constituem um grupo de patologias genéticas

que têm como característica comum a presença da hemoglobina S, uma proteína

mutante que sofre polimerização sob baixas tensões de oxigênio, gerando

vaso-oclusão. A obstrução e a lesão do endotélio vascular e dos tecidos causam uma

resposta inflamatória que, por sua vez, resulta em um estado inflamatório crônico

nos pacientes. A gravidez de mulheres portadoras de DF é acompanhada por uma

incidência aumentada de episódios de dor, infecções, pielonefrite, complicações

pulmonares, eventos tromboembólicos, pré-eclâmpsia e hemorragia anteparto. No

entanto, os mecanismos responsáveis pelo desencadeamento destas

complicações e a fisiopatologia envolvida ainda são pouco explorados. A

circulação placentária materna é suscetível à vaso-oclusão, o que pode contribuir

para as áreas de fibrose, necrose das vilosidades e infarto na placenta. O objetivo

central da pesquisa foi avaliar a expressão gênica da resposta inflamatória de 84

genes em placentas de mulheres portadoras de DF através do PCR Array.

Portanto, propomos um estudo prospectivo, do tipo caso-controle, com avaliação

de três grupos: grupo 1 gestantes com anemia falciforme (N=5), grupo 2 gestantes

com doença da hemoglobina SC (N=6) e grupo 3 gestantes sem DF (N=10). Os

resultados apresentaram alterações significativas no perfil de expressão dos

genes FASLG (no grupo 1) e BCL6 (no grupo 2). A diminuição e o aumento da

expressão destes genes, respectivamente, indicam que pode estar ocorrendo

falha na invasão dos trofoblastos, prejudicando o fornecimento de oxigênio e

nutrientes para o feto. A invasão deficiente dos trofoblastos pode estar associada

viii gestações de mulheres com DF quando comparadas com o grupo controle, como

pré-eclâmpsia e restrição de crescimento intra-uterino. Este é o primeiro estudo

que avaliou a expressão gênica da resposta inflamatória em placentas de

mulheres portadoras de DF. Nossos resultados fornecem novas perspectivas para

que mais pesquisas sejam realizadas nesta área, a fim de se compreender como a

ix ABSTRACT

Sickle cell disease (SCD) is a group of genetic diseases that have in

common the presence of hemoglobin S, a mutant protein that undergoes

polymerization under low oxygen tensions, generating vaso-occlusion. The

obstruction and the lesion of the vascular endothelium and tissue cause an

inflammatory response that in turn results in a chronic inflammatory state in

patients. Pregnancy in SCD is accompanied by an increased incidence of pain

episodes, infection, pyelonephritis, pulmonar and thromboembolic events,

preeclampsia and antepartum haemorrhage. However, the mechanisms

responsible for the onset of these complications and the pathophysiology involved

are still poorly explored. The maternal placental circulation is susceptible to

vaso-occlusion, which may contribute to generate areas of fibrosis, villi necrosis and

infarction of the placenta. The main objective of this research was to evaluate the

gene expression of the inflammatory response of 84 genes in placentas from

women with SCD by PCR Array. Therefore, we have proposed a case-control

prospective study, with the evaluation of three groups: Group 1, pregnant women

with SCD (N = 5); group 2, pregnant women with hemoglobin SC disease (N = 6)

and group 3, pregnant women without SCD (N = 10). The results showed

significant changes in the expression profile of BCL6 and FASLG genes. The

decrease and increase in the expression of these genes, respectively, indicate that

a failure in the invasion of trophoblasts may be occurring, damaging the delivery of

oxygen and nutrients to the fetus. The poor invasion of trophoblasts may be

associated with some maternal and fetal complications that occur more often in

x preeclampsia and intrauterine growth restriction. This is the first study to assess

the gene expression of the inflammatory response in placentas of women with

SCD. Our results provide new perspectives for further research to be performed in

this area in order to understand how SCD affects the physiology of the placenta

xi SUMÁRIO

DEDICATÓRIA...xiii

AGRADECIMENTOS...xv

LISTA DE FIGURAS E QUADROS...xvii

LISTA DE TABELAS...xix

LISTA DE ABREVIATURAS...xxi

1. INTRODUÇÃO...1

1.1. HEMOGLOBINA...1

1.2. BASES MOLECULARES DA DOENÇA FALCIFORME...1

1.3. PREVALÊNCIA...3

1.4. POLIMERIZAÇÃO DA HEMOGLOBINA S...4

1.5. FISIOPATOLOGIA ...5

1.6. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS...9

1.7.GRAVIDEZ NA DOENÇA FALCIFORME...10

1.7.1. PLACENTA...13

1.7.2. PRÉ–NATAL...14

1.8. DIAGNÓSTICO...16

1.9. TRATAMENTO...17

2. OBJETIVOS...19

3. CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS...20

3.1. PACIENTES...20

3.1.1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO...20

3.2. ASPETOS ÉTICOS DA PESQUISA...21

4. MATERIAIS E MÉTODOS...22

4.1. COLETA DAS PLACENTAS...22

4.2. EXTRAÇÃO DE RNA...22

4.2.1. CONTROLE DE QUALIDADE DO RNA...23

4.3. SÍNTESE DE cDNA PARA PCR ARRAY...23

4.4. PCR ARRAY...24

xii

4.5. VALIDAÇÃO POR qRT-PCR...25

4.5.1. SÍNTESE DE cDNA PARA qRT-PCR...26

4.5.2. ESCOLHA DOS PRIMERS...26

4.5.3 PADRONIZAÇÃO DA qRT-PCR...27

4.5.4. qRT-PCR...28

4.5.6. ANÁLISE DOS DADOS DE qRT-PCR E ESTATÍSTICA...29

5. RESULTADOS...30

5.1. PCR ARRAY...30

5.2. VALIDAÇÃO DOS RESULTADOS POR qRT-PCR...35

6. DISCUSSÃO...37 6.1. CXCL10………37 6.2. CCR3………....39 6.3. CCL23………..40 6.4. FASLG, BCL6 e TLR9………...41 6.4.1. FASLG………..41 6.4.2. BCL6………...42 6.4.3. TLR9……….……….43 7. CONCLUSÕES...45 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...46 9. ANEXOS...59

9.1. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO...59

9.2. PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA DO CAISM...65

xiii DEDICATÓRIA

Ao meu pai, Nelson, por nunca me deixar desistir e por ser meu exemplo de vida. Obrigada por sempre estar ao meu lado, me ajudando e me incentivando a

xv AGRADECIMENTOS

À Dra Mônica pela orientação, confiança, apoio e amizade.

À Dra Laura pela co-orientação, pelos ensinamentos adquiridos, disponibilidade e confiança.

À Dra Dulcinéia e Regiane que me ensinaram e sempre me ajudaram na execução das metodologias.

Ao Dr Fernando pelo apoio.

À Dra Fernanda e Dra Mary pela ajuda e atenção no ambulatório de PNE do CAISM.

Ao Hugo, Lari e Danizinha pela amizade, conselhos e ajuda sempre que necessária.

A todas as gestantes que participaram do estudo, sempre foram muito gentis e solícitas.

À toda equipe que me ajudou no CAISM com as coletas de placentas e sangue periférico.

Aos colegas de laboratório Galina e Pedro pela atenção e paciência em tirar minhas dúvidas.

Aos colegas do Hemocentro Carol e Kleber pela ajuda e por apresentar meu trabalho em congresso.

xvi À Tamires, Dani e Caíque pela agradável convivência e momentos de descontração no laboratório.

xvii LISTA DE FIGURAS E QUADROS

Figura 1. Alteração de membrana das hemácias por polímeros de Hb S. A desoxigenação da Hb S induz uma mudança conformacional em que a cadeia mutante se liga a um sítio complementar hidrofóbico, levando à formação de polímeros de Hb. Estes polímeros rompem o citoesqueleto da hemácia formando saliências, dando origem à característica forma de foice. A interrupção da ligação da membrana com o citoesqueleto resulta na exposição de epítopos de proteínas transmembranas e mudanças de lipídios, conhecidos como fosfatidilserina (PS), entre o interior e o exterior da célula. Exposição de glicolipídios carregados negativamente contribui para os estados pró-trombótico e pró-inflamatório do sangue de pacientes falciformes. Adaptado de Frenette et al., 2007...6

Figura 2. Etapas dos métodos. ...25

Figura 3. Padronização dos primers que amplificam o gene BCL6. A figura mostra a curva de diluição em seis concentrações de cDNA (6,32 ng, 20,0 ng, 63,26 ng, 120,0 ng, 200,0 ng e 632,6 ng) e a curva de melting dos primers (85,91°C), indicando a especificidade da amplificação e a curva de eficiência > 99%...28

Figura 4. Eletroforese de RNA extraído a partir de placenta no bioanalisador. Frações ribossomais 28S e 18S das amostras estão indicadas pelas setas e pelo número do RIN à direita...31

Figura 5. Perfil de expressão gênica dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e

IL1RAP. CON (grupo controle, N=10), SS (grupo 1, N=5) e SC (grupo 2, N=6). * p < 0.05 comparado ao CON...35

xviii Quadro 1. Resultado de PCR Array do grupo 1. A placa mostra o resultado final do PCR Array, ou seja, foi representado um esquema de placa de todas as placentas de pacientes do grupo 1 (5 pacientes) comparado ao grupo controle (10 pacientes). Em verde estão os genes que foram subexpressos, em vermelho os superexpressos e em azul os genes endógenos escolhidos. O valor de fold está

abaixo de cada símbolo

gênico...33

Quadro 2. Resultado de PCR Array do grupo 2. A placa mostra o resultado final do PCR Array, ou seja, foi representado um esquema de placa de todas as placentas de pacientes do grupo 2 (5 pacientes) comparado ao grupo controle (10 pacientes). Em verde estão os genes que foram subexpressos, em vermelho os superexpressos e em azul os genes endógenos escolhidos. O valor de fold está

abaixo de cada símbolo

xix LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Características clínicas das mães e recém-nascidos (RN)...21

Tabela 2. Genes escolhidos para validação do PCR Array...27

Tabela 3. Valores de Cts dos controles endógenos obtidos das 5 pacientes do grupo 1 (SS) e 5 pacientes do grupo 2 (SC)...31

Tabela 4. Valores de Cts dos controles endógenos obtidos das 10 pacientes do grupo controle (CON)...31

Tabela 5. Comparação de fold e valor de p entre PCR Array e qRT-PCR dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e IL1RAP do grupo 1...36

Tabela 6. Comparação de fold e valor de p entre PCR Array e qRT-PCR dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e IL1RAP do grupo 2...36

xxi LISTA DE ABREVIATURAS μg Micrograma μl Microlitro AF Anemia falciforme B2M Beta 2 microglobulina

BAC Beta actina

BCL6 Linfoma 6 das células B

Ca Cálcio CCL23 Ligante de quimiocina 23 CCL28 Ligante de quimiocina 28 CCR3 Receptor de quimiocina 3 CD40LG Ligante de CD40 CXCL6 Ligante de quimiocina 6 CXCL10 Ligante de quimiocina 10

cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar

CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média

Cl Cloro

Ct Cycle threshold

DF Doença falciforme

DNA Ácido desoxirribonucleico

DNAmt Ácido desoxirribonucleico mitocondrial

FASLG Ligante FAS

Hb Hemoglobina

Hb A Hemoglobina adulta Hb F Hemoglobina fetal HU Hidroxiureia

IL1RAP Proteína acessória do receptor da interleucina 1

K Potássio

min Minuto

xxii

nM Nanomolar

ng Nanograma

ON Óxido nítrico

pb Pares de bases

PCR Reação em cadeia da polimerase

PE Pré-eclâmpsia

qRT-PCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real RCIU Restrição de crescimento intra-uterino

RNA Ácido ribonucleico RPLP0 Proteína ribossomal P0 rpm Rotações por minuto

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TLR9 Receptor toll like 9

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular VOC Vaso oclusão

1 1. INTRODUÇÃO

1.1. HEMOGLOBINA

A hemoglobina (Hb) é uma metaloproteína presente no interior dos eritrócitos que tem como principal função o transporte de oxigênio dos pulmões até os tecidos. Sua estrutura é um tetrâmero de polipeptídios formado por dois pares de cadeias globínicas, sendo um par de cadeias do tipo alfa (alfa-α e zeta-ξ) e outro par de cadeias do tipo não-alfa (beta-β, delta-δ, gama-γ e épsilon-ε). Cada cadeia contém um grupo heme composto de um átomo de ferro contido no centro de um anel orgânico heterocíclico chamado porfirina, ao qual se liga o oxigênio1_.

As combinações entre as cadeias dos tipos alfa e não-alfa originam diferentes hemoglobinas, sintetizadas desde o período embrionário até a fase adulta. No período embrionário, há a formação dos tipos Gower 1 (ξ2ε2), Gower 2

(α2ε2) e Portland (ξ2γ2); entretanto, na fase fetal estes tipos de Hb são substituídos

pela fetal (Hb F) (α2γ2), que, por sua vez, dá lugar às Hb A (α2β2) e A2 (α2δ2) na

vida adulta. Seis meses após o nascimento, a Hb A é absolutamente predominante, compondo mais de 95% do total da Hb celular, enquanto a A2 se

mantém em níveis entre 2–3%, e a fetal entre 0–2%2,3_.

1.2. BASES MOLECULARES DA DOENÇA FALCIFORME

As doenças falciformes (DF) constituem um grupo de doenças genéticas que têm como característica comum a presença da Hb S, um gene mutante localizado no cromossomo 11, cuja principal característica é a de sofrer polimerização sob baixas tensões de oxigênio4_{. A Hb S, quando polimerizada}

2 dentro dos eritrócitos, deforma-os, fazendo com que os mesmos assumam forma de foice. Esses glóbulos vermelhos falcizados são precocemente destruídos, com o consequente desenvolvimento de anemia hemolítica crônica. A Hb S pode estar em combinação com outras hemoglobinas anormais, originando, por exemplo, a hemoglobinopatia SC ou a S-ß talassemia5_.

A DF mais comum e geralmente mais grave é a anemia falciforme (AF), estado homozigoto SS6_{. A AF foi relatada pela primeira vez por Herrick, em 1910,}

em um estudante que apresentava sintomas pulmonares7_{. Esta afecção é}

decorrente da substituição, em homozigose, de uma adenina por uma timina no códon 6 (GAG → GTG) do gene da globina beta, o que resulta na troca do aminoácido ácido glutâmico por valina, conduzindo à polimerização das moléculas de Hb anormal (Hb S) quando desoxigenadas8_.

Na AF ocorre o predomínio da produção de Hb S, ausência de Hb A, acompanhada por quantidades normais de HbA2 e aumento moderado de Hb F.

Quando o gene βS _{aparece em heterozigose (traço falciforme, genótipo AS), não}

são observadas anormalidades hematológicas nos portadores. A morfologia eritrocitária, o nível de Hb, assim como os números de leucócitos e plaquetas são normais9_{. O traço falciforme, portanto, caracteriza o portador assintomático,}

clinicamente normal.

A Hb F tem um papel importante na AF, uma vez que, em alta concentração, inibe a polimerização da Hb S e, consequentemente, reduz a frequência de crises vaso-oclusivas, síndrome torácica aguda, taxas de hospitalizações e de mortalidade dos pacientes10,11_.

3 glutâmico por lisina, na cadeia da β globina12_{. Na hemoglobinopatia SC o paciente}

possui ambas as hemoglobinas, que estão presentes em proporções iguais13_{. As}

complicações na doença SC ocorrem devido à contribuição da Hb C, que ao contrário da Hb S, tem predisposição à cristalização intraeritrocitária quando oxigenada, o que resulta em aumento da densidade celular devido ao efluxo de K+

e desidratação celular, aumentando a concentração intracelular de Hb e elevando a probabilidade da Hb S polimerizar13,14_{. A Hb C possui maior concentração de Hb}

corpuscular média (CHCM) quando comparada a Hb S. Esta elevação da CHCM tem fortes consequências patogênicas para os pacientes que expressam tanto Hb S como Hb C, levando a um quadro clínico semelhante ao da AF15_{, porém, menos}

grave, com crises de falcização menos frequentes e de menor intensidade16_.

1.3. PREVALÊNCIA

Os distúrbios hereditários das hemoglobinas são as doenças genéticas mais frequentes do homem e mais difundidas no mundo, abrangendo continentes como África, Américas, Europa e extensas regiões da Ásia17_{. No Brasil, as DF}

distribuem-se heterogeneamente, sendo mais frequente onde a proporção de antepassados negros da população é maior17_{, devido ao tráfico negreiro de}

inúmeras tribos africanas. Dados do Programa Nacional de Triagem Neonatal mostram que o estado com maior número de casos é a Bahia com 1:650, enquanto que no estado de São Paulo a incidência é de 1:4.000 nascidos vivos. Estima-se que 25 a 30 mil brasileiros sejam portadores de DF e que ocorra aproximadamente 3.500 novos casos por ano. Devido ao elevado número de afetados, esta doença é considerada um problema de saúde pública no Brasil18_.

4 1.4. POLIMERIZAÇÃO DA HEMOGLOBINA S

A velocidade e a extensão da formação de polímeros no interior das hemácias dependem da temperatura, pH, grau de desoxigenação, concentração intracelular de Hb S e níveis de Hb F19_{. A membrana dos eritrócitos possui vários}

canais de transporte de íons para manter a hidratação celular. Os dois mais importantes são o sistema de co-transporte do K-Cl e o canal de Gardos. O primeiro, quando ativado, permite que o K+ _{e o Cl}- _{saiam da célula, seguidos pela}

água, o que resulta em desidratação. Esta atividade está anormalmente aumentada na DF, o que leva a uma maior concentração intracelular de Hb S favorecendo a polimerização. O canal de Gardos é um canal de efluxo de K+

ativado pelo aumento intracelular de Ca2+ _{decorrente da desoxigenação e da}

falcização das hemácias. Como ocorre no sistema de K-Cl, a saída de K+ _é

seguida pelo efluxo de água, desidratação celular e aumento da concentração interna de Hb S20,21_.

Na molécula de Hb A, os resíduos externos são polares, conferindo

solubilidade e prevenindo interações intermoleculares, ao passo que os internos

são apolares, criando um ambiente no qual o O2 pode ser ligado sem que ocorra a

oxidação do heme. Quando a Hb S passa para a forma desoxigenada, a valina é exposta na superfície da cadeia βs _{permitindo interações intermoleculares}

hidrofóbicas e polimerização da Hb22_{. Esta interação de natureza hidrofóbica} desencadeia a formação de polímeros, compostos por fibras de desoxiemoglobinas, num processo denominado nucleação, que progride com o alongamento e alinhamento de mais fibras, criando uma estrutura

5 multipolimérica23_.

O fenômeno de “falcização” pode ser reversível após a reoxigenação. Contudo, a repetição desse fenômeno pode causar lesões de membrana em algumas células suscetíveis, fazendo com que a rigidez e configuração em forma de foice persistam mesmo após a reoxigenação. Esses eritrócitos, denominados “células irreversivelmente falcizadas” permanecem com a forma anormal mesmo na ausência de polimerização intracelular da Hb24_.

Além da alteração do formato, os polímeros podem ter um impacto direto sobre a membrana plasmática, levando à exposição de epítopos da proteína extracelular e glicolipídios que são normalmente encontrados no interior da célula. Devido a esta mudança, as hemácias em DF são mais aderentes ao endotélio vascular10 _{(Figura 1).}

1.5. FISIOPATOLOGIA

A vaso-oclusão (VOC) se inicia a partir de uma complexa interação de reticulócitos e hemácias falcizados e normais, células endoteliais, leucócitos e plaquetas, além de fatores de coagulação e outras proteínas do plasma provocando crises dolorosas recorrentes ao longo de toda a vida do indivíduo acometido, com isquemia e danos tecidual e funcional progressivos em órgãos e sistemas25_.

6 Figura 1. Alteração de membrana das hemácias por polímeros de Hb S. A desoxigenação da Hb S induz uma mudança conformacional em que a cadeia mutante se liga a um sítio complementar hidrofóbico, levando à formação de polímeros de Hb. Estes polímeros rompem o citoesqueleto da hemácia formando saliências, dando origem à característica forma de foice. A interrupção da ligação da membrana com o citoesqueleto resulta na exposição de epítopos de proteínas transmembrana e mudanças de lipídios, conhecidos como fosfatidilserina (PS), entre o interior e o exterior da célula. Exposição de glicolipídios carregados negativamente contribui para os estados pró-trombótico e pró-inflamatório do sangue de pacientes falciformes. Adaptado de Frenette et al., (2007).

A deposição de grande número de eritrócitos alterados na superfície endotelial reduz a luz dos capilares, provocando estase, que poderá se intensificar pela diminuição da temperatura do ambiente. Como consequência da estase, ocorre hipóxia tecidual, levando mais moléculas de Hb S ao estado desoxigenado, piorando a situação circulatória já desfavorável e lesando os tecidos irrigados por estes capilares. Os tecidos mal perfundidos podem sofrer infartos com necrose e formação de fibrose, principalmente no baço, medula óssea e placenta26_.

7 uma vez que leva à liberação de Hb no plasma, sendo fracionada em heme e globina27_{. Hemoglobina, heme e ferro heme catalisam a produção de radicais de}

oxigênio, limitando a biodisponibilidade de óxido nítrico (ON)28_{. A lise de eritrócitos}

libera arginase que destrói L-arginina, substrato para a produção de ON. Esta molécula é importante cofator da enzima guanilato-ciclase, responsável pela conversão de GTP (trifosfato de guanosina) em cGMP (monofosfato de guanina cíclica) que leva ao relaxamento dos músculos lisos vasculares e vasodilatação29,30_{. A baixa disponibilidade de ON resulta em vasoconstrição e}

altera a homeostasia vascular, aumentando a ativação plaquetária e expressão das moléculas de adesão nos leucócitos e células endoteliais22_.

A inflamação e ativação endotelial, exercem um papel central na VOC

observada nas DF. A ativação dos monócitos, com a secreção de citocinas pró– inflamatórias (interleucina 1, IL–1 e fator de necrose tumoral α, TNF–α), leva os leucócitos, em número constantemente elevado, a aderirem ao endotélio

inflamado e a interagirem com as hemácias falcizadas31_{. Os neutrófilos}

apresentam várias características que contribuem para a VOC, como, por

exemplo, o fato de serem células relativamente grandes (12-15 μm) e rígidas, fazendo com que seu recrutamento para a microcirculação reduza o fluxo

sanguíneo dos vasos, por aderirem às paredes do endotélio ativado e sofrerem

interações adesivas com eritrócitos, plaquetas ou outros leucócitos circulantes,

retendo e formando agregados celulares que obstruem ainda mais o lúmen

vascular32_.

A obstrução e a lesão do endotélio vascular e dos tecidos causam uma

8 significativas na produção das citocinas inflamatórias e fatores de crescimento.

Tais mediadores inflamatórios, como a interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8),

TNF-α e o fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) são encontrados em níveis elevados em pacientes falciformes33,34_.

O aumento dos níveis de citocinas têm consequências fundamentais na fisiopatologia da doença. Em células endoteliais ocorre aumento da expressão das moléculas de adesão intercelular (ICAM–1), das moléculas de adesão vascular (VCAM–1) e do fator tecidual (FT), o que induz à ativação, migração e mudanças na produção destas células. A interação entre endotélio e leucócitos através das proteínas e receptores de adesão como a E–selectina, P–selectina, e integrina αvβ3 contribuem para o processo de VOC22,35_{. Além disso, estes marcadores são}

cronicamente elevados nos indivíduos falciformes em estado estável, e muitas vezes são aumentados ainda mais após as crises dolorosas agudas.

Além da disfunção endotelial e inflamação, os pacientes com DF possuem aumento de espécies reativas de oxigênio. Este desequilíbrio pode ser consequência do aumento da atividade das enzimas NADPH-oxidase e xantina-oxidase endotelial, de repetidos ciclos de falcização das hemácias, dos processos de isquemia na microcirculação, da auto-oxidação da Hb polimerizada e do aumento da enzima óxido nítrico sintase (NOS)36,37_{. Na AF o estresse oxidativo}

está envolvido em vários mecanismos fisiopatológicos como hemólise acelerada, dano endotelial, redução da biodisponibilidade de ON, formação de peroxinitrito, aumento da adesão das células sanguíneas, ativação da arginase e hipercoagulabilidade, podendo contribuir para a VOC relacionada à doença e subsequentes danos em órgãos36,37_.

9 1.6. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

Uma das características das doenças falciformes é a sua variabilidade clínica. Apesar dos pacientes apresentarem a mesma doença genética, o curso clínico é variável, com a presença de doenças de evolução benigna, até mesmo assintomáticas, até complicações graves e óbito38_{. Fatores moduladores da}

gravidade clínica atualmente estudados são: genótipo, haplótipo relacionado ao complexo do gene beta, concentração de Hb F, associação com talassemia alfa, leucocitose, síndrome torácica aguda, insuficiência renal, acidente vascular cerebral, presença de três ou mais crises dolorosas por ano38_.

O recém-nascido é protegido pelos elevados níveis de Hb F nos eritrócitos durante as primeiras 8 a 10 semanas de vida. Como estes níveis declinam, as manifestações clínicas da AF aparecem e as manifestações hematológicas são detectáveis a partir da 10a _{- 12}a _{semanas de vida}39_{. Vários tipos de crises ocorrem}

e podem ser classificadas em: vaso-oclusivas (dolorosas); aplásticas e megaloblásticas; de sequestração e hemolíticas40_.

A dor aguda, que quase sempre é o primeiro sintoma da doença, constitui a complicação mais frequente após o período neonatal e a causa mais comum que leva o paciente a procurar assistência médica. Embora haja uma associação geral entre a intensidade da crise vaso-oclusiva e o genótipo, existe uma grande variabilidade entre portadores do mesmo genótipo, bem como no mesmo paciente com o decorrer do tempo41_.

Os pacientes com doença da Hb SC apresentam manifestações clínicas semelhantes às da AF, embora com uma evolução menos severa e com menor taxa de complicações13_{. Porém, certas complicações ocorrem com maior}

10 frequência em doentes com Hb SC (como retinopatia proliferativa e osteonecrose)42_{. Os sintomas são raros no primeiro ano de vida, podendo cerca}

de um quarto dos doentes permanecer assintomático durante a primeira década de vida13_.

A DF acomete múltiplos órgãos e dentre as características clínicas desta doença destacam-se as complicações neurológicas (risco aumentado de acidente vascular cerebral, ataques isquêmicos transitórios, hemorragia cerebral, convulsões), disfunção renal, hipertensão pulmonar, retinopatia falciforme, úlceras de perna, colelitíase e necrose avascular43_.

1.7.GRAVIDEZ NA DOENÇA FALCIFORME

A gestação na DF representa uma situação de risco materno-fetal, independente do genótipo (SS, SC ou S-ß-Talassemia)5_{. Estudos têm mostrado}

que a gravidez é mais benigna no genótipo SC do que em SS5,44_{. É relevante}

considerar, entretanto, que a gestação na hemoglobinopatia SC pode precipitar o aparecimento de complicações da doença, que até então cursava oligossintomática ou até mesmo assintomática5_{. Mohamed et al., relataram que}

em Benin gestantes com Hb SC apresentavam curso relativamente benigno quando não estavam grávidas, porém, o risco de óbito aumentava durante a gravidez45_.

A gravidez resulta em uma variedade de alterações fisiológicas que podem interagir negativamente com a Hb S para promover falcização43_{. A demanda de}

oxigênio durante a gravidez aumenta para suportar as exigências metabólicas da placenta e do feto46_{. A necessidade de um aumento relativo do volume plasmático}

11 para a produção de eritrócitos47_{, conhecida como “anemia fisiológica” da gravidez}

pode piorar significativamente a anemia em pacientes que já apresentam níveis de Hb muito baixos e menor sobrevida eritrocitária. Além disso, a reserva de oxigênio materna pode ser comprometida durante a gravidez, pois o consumo de oxigênio aumenta e a capacidade residual funcional diminui durante a gestação, predispondo as gestantes com AF à hipoxemia e, como consequência, podendo levar à polimerização da Hb S43_.

Em mulheres com AF a gravidez é acompanhada por uma incidência aumentada de episódios de dor, infecções, pielonefrite, complicações pulmonares, eventos tromboembólicos e hemorragia no anteparto43_{. Há evidências}

consistentes de que a anemia e crises de VOC ocorrem mais frequentemente durante a gravidez (principalmente no terceiro trimestre) e são as complicações maternas mais comuns associadas com a DF, ocorrendo em mais de 50% das mulheres grávidas com esta hemoglobinopatia48_.

Tanto estudos retrospectivos como observacionais têm reportado um risco

aumentado de pré-eclâmpsia (PE) e de hipertensão induzida pela gravidez, de

forma que mulheres portadoras de AF devem ser consideradas sob alto risco de

desenvolvimento destas doenças maternas49_{. Em um estudo realizado a partir de}

dados do Nationwide Inpatient Sample (NIS), que permitem a realização de uma

estimativa nacional dos EUA, foi reportado que pacientes portadoras de DF

apresentam risco três vezes maior de evoluir para eclâmpsia quando comparadas

com gestantes sem DF50,51_.

As complicações fetais da gravidez relacionam-se com o comprometimento do fluxo sanguíneo placentário e incluem aborto espontâneo, restrição de

12 crescimento intrauterino (RCIU), baixo peso ao nascimento, parto prematuro e morte fetal42,52_{. No estudo de Nana et. al., a ocorrência de RCIU foi mais elevada}

nas mulheres com genótipo SS em comparação com mulheres com genótipo SC, podendo ser devido a anemia crônica materna e da ocorrência mais frequente de falcização, VOC e nível de oxigênio reduzido na circulação placentária52_.

A base patológica para o aumento da taxa de morte fetal intraparto e RCIU em mulheres com AF não é muito compreendida. Bloqueio do fluxo de sangue causado pela VOC na placenta pode levar ao infarto placentário e afetar sua função, alterando o fornecimento de nutrientes e troca metabólica para o crescimento do feto. Além disso, o efeito da anemia crônica materna elevada e incidência de hipertensão gestacional podem contribuir para o aumento do risco de morte fetal intraparto52_.

Outro fator importante na complicação materna é o desenvolvimento de eventos tromboembólicos venosos durante o período gravídico. James et. al. mostraram que as mulheres com AF são 6,7 vezes mais propensas a desenvolver tromboembolismo venoso durante a gravidez do que as mulheres saudáveis, com estrutura normal da hemoglobina. No entanto, o uso profilático de anticoagulantes não foi rigorosamente estudado em grávidas com AF e, portanto, seu uso não é recomendado53_.

Na primeira revisão extensa, realizada em 1941, no Reino Unido foi relatada uma taxa de morte fetal de 50%43_{. Há evidências de que hoje, a taxa de}

mortalidade perinatal possa variar de 48 a 134 por 1000 nascimentos. A mortalidade materna já foi muito elevada (até 33%), porém, atualmente é estimada em aproximadamente 1,6%, atingindo, em alguns países com alta incidência da

13 doença, taxas acima de 9,2%43_{. No entanto, apesar desta significativa queda na}

mortalidade, devido à evolução na terapêutica destas pacientes e também no diagnóstico e intervenções transfusionais disponíveis, a morbidade materna e neonatal continua elevada, com necessidade de seguimento pré-natal rigoroso, controle clínico e laboratorial seriado por equipe multidisciplinar e avaliação de vitalidade fetal frequente.

1.7.1. PLACENTA

A placenta humana é um órgão hemocorial, ou seja, os glóbulos vermelhos entram em contato direto com o trofoblasto fetal. É responsável pela transferência de gases para o feto, papel desempenhado pelos pulmões ao nascimento. Atua também de maneira semelhante aos rins, realizando a excreção, o balanço hídrico e a manutenção fisiológica do pH fetal. Tem função endócrina, secretando os hormônios proteicos como a gonadotrofina coriônica (hCG) e esteroides como a progesterona, estradiol, estrona e estriol54_.

Entretanto, a placenta de pacientes com DF é anormal em tamanho, localização, aderência à parede uterina e histologia. Em algumas gestantes falciformes há descolamento da placenta que pode ser causada pelo processo de VOC, levando à trombose da arteríola decidual, necrose decidual e hemorragia venosa subsequente55,56,57_.

Estudos de ultrassom do tipo Doppler demonstraram evidências de fluxo sanguíneo útero-placentário restrito, indicativo de possível lesão vascular, estreitamento ou vasoconstrição31_{. É provável que a VOC crônica, mesmo na}

14 contribua para a lesão da placenta e afete negativamente o crescimento fetal58_.

No estudo de Trampont et al., no qual exames macro e microscópicos de placentas de pacientes com DF foram realizados, quando comparadas com as dos controles, as placentas do grupo falciforme apresentaram mais anomalias vasculares, principalmente no parênquima localizado entre o feto e as superfícies maternas. Além de ocorrer com maior frequência excesso de formação de aglomerados sinciciais e depósitos de fibrina, associados ou não a necrose vilosa e congestão59_.

1.7.2. PRÉ-NATAL

Uma vez que a gravidez é confirmada, mulheres com DF devem ter o seu atendimento pré-natal prestado por uma equipe multidisciplinar. A melhora na morbidade materna e fetal foi atribuída à melhora na atenção obstétrica e hematológica. Os pacientes devem ser gerenciados pela equipe que cuidam de gestações de alto risco53_.

O pré-natal de alto risco e os cuidados puerperais devem focar a identificação dos fatores de risco para baixo peso ao nascimento, partos pré-termo e demais complicações associadas à gestação. Nutrição adequada e profilaxia de fatores que precipitem eventos dolorosos deverão ser enfatizadas. O monitoramento do peso deve ser rigoroso e a medida do tamanho do baço naquelas que mantém esplenomegalia é um cuidado adicional, na tentativa de detectar precocemente sequestro esplênico42,60_.

Após avaliação geral, a paciente deve ser orientada quanto aos fatores específicos que influenciam a gravidez como as necessidades nutricionais, uso de

15 ácido fólico e a suplementação com vitaminas. Medicação adicional inclui baixa dose de aspirina como profilaxia contra a PE. A suplementação de ferro só deve ser administrada na presença de deficiência de ferro documentada (algumas pacientes aumentam os estoques de ferro devido a transfusões de sangue anteriores). Deve ser recomendada a ingestão diária de líquidos para evitar desidratação. Na presença de cefaléia, edema, escotomas, dor abdominal, cólicas e secreção vaginal mucosa, deve ser procurado atendimento médico imediato, devido à alta frequência de toxemia e trabalho de parto prematuro61_.

O intervalo entre as consultas é, em geral, de duas semanas até a vigésima oitava semana e após esse período, semanal. Nestas consultas são monitorizadas as pressões arteriais, o ganho de peso e a taxa de crescimento uterino. Trimestralmente são avaliados o hemograma completo, a contagem de reticulócitos, urocultura, provas de função hepática e renal, glicemia, proteínas totais e frações e sorologias61_.

Um estudo retrospectivo de transfusão profilática encontrou uma diminuição no percentual de gestações com crises de dor em cerca de 33%. Um pequeno estudo de coorte retrospectivo realizado no Brasil revelou que eritrocitaférese profilática administrada a mulheres grávidas com AF durante o terceiro trimestre reduziu o risco de RCIU e oligoidrâmnio53_.

Em relação à analgesia, os opiáceos são os mais indicados na presença de dor severa. A maioria dos relatórios não demonstram evidência de teratogenicidade em relação ao consumo de opiáceos na gravidez, mas a exposição a longo prazo pode resultar em síndrome de abstinência neonatal logo após o nascimento49_{. Em contrapartida, o Programa Nacional de Toxicologia}

16 reconheceu evidências sobre o comprometimento do desenvolvimento observado em fetos de camundongos e ratos com o uso materno de hidroxiuréia durante o período gestacional. Por isso, é recomendada sua cessação pelo menos 6 meses antes da concepção ou imediatamente após a confirmação da gravidez62_.

1.8. DIAGNÓSTICO

Com a finalidade de prevenir doenças em recém-nascidos, o Programa Nacional de Triagem Neonatal permite rastrear e detectar hemoglobinopatias, além de outras doenças genéticas como a fenilcetonúria, o hipotireoidismo congênito e a fibrose cística através do “teste do pezinho”, realizado em grande parte das maternidades do país. Esse exame laboratorial é feito a partir do sangue coletado do calcanhar do recém-nascido em papel filtro, realizado preferencialmente entre o 2º e o 7º dia de vida63,64_.

O diagnóstico laboratorial das DF é bastante simples e se baseia principalmente na carga elétrica das variantes. Os métodos mais utilizados para separá-las e identificá-las são a eletroforese de Hb, a focalização isoelétrica e a cromatografia líquida de alta performance de troca catiônica22_{. A utilização de dois}

métodos possibilita maior segurança no resultado, pois o resultado positivo apontado por um deles pode ser confirmado pelo outro. Como nos recém-nascidos predomina a hemoglobina fetal (Hb F), nos casos em que o resultado da triagem neonatal indica a presença de Hb alterada além da Hb F, torna-se necessária a realização de exames confirmatórios após o sexto mês de vida para diagnóstico da DF. Nesse período, a Hb F já terá sido substituída pela Hb prevalente no sangue da criança65_{. Após a identificação dos pacientes, é imprescindível que o}

17 adequado acompanhamento clínico seja regularmente efetuado, garantindo melhor qualidade de vida a pessoa portadora de DF22_.

1.9. TRATAMENTO

O uso profilático de penicilina e da vacinação contra pneumococos e Haemophilus influenzae tipo b, é importante para as crianças com DF que são muito mais susceptíveis a serem infectadas por esses microorganismos do que crianças saudáveis. A introdução dessa terapêutica reduziu expressivamente a morbimortalidade desses pacientes na infância22_.

As estratégias terapêuticas utilizadas e desenvolvidas para o tratamento da DF são baseadas em três pontos: o primeiro seria diminuir a concentração intracelular de Hb S com agentes que ativem a síntese de Hb F ou agentes que impeçam a falcização da hemácia; o segundo seria diminuir os eventos de adesão celular e, consequentemente, a VOC; e o terceiro ponto seria reduzir o processo inflamatório e o estresse oxidativo66_.

Várias drogas, como a 5-azacitidina, o butirato de sódio e a hidroxiuréia, têm, por mecanismos diferenciados, a capacidade de reativar os genes γ e elevar a produção de Hb F22_{. A toxicidade dessas drogas, no entanto, limita sua}

utilização, sendo apenas a HU o único medicamento aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento de DF67_{, enquanto as demais drogas}

estão em fase de investigação. Estudos multicêntricos têm demonstrado que este quimioterápico é altamente efetivo na redução das crises dolorosas, na síndrome torácica aguda e nas necessidades transfusionais, reduzindo a mortalidade em cerca de 40%22_{. Entretanto, além dos efeitos adversos como a mielossupressão,}

18 nem todos os pacientes respondem à terapia66_.

O único tratamento curativo atualmente conhecido é o transplante de medula óssea. Infelizmente, a maioria dos pacientes não dispõe de doadores compatíveis relacionados e os transplantes com doadores compatíveis não-relacionados ou haploidênticos ainda correspondem a taxas de mortalidade muito altas. A Sociedade Brasileira de Transplante de Medula Óssea concluiu um consenso que coloca a AF entre as doenças que tem indicação de transplante de medula óssea, levando em consideração dados da literatura internacional que apontam a cura dos doentes tratados68_{. Porém, a prática de transplante de medula}

óssea no Brasil é restrita, visto que o Ministério da Saúde ainda não incluiu a doença na lista das terapias passíveis de transplante, por isso, ainda não é coberto pelo Sistema Único de Saúde.

19 2. OBJETIVOS

1. Investigar se há diferença na expressão de genes relacionados à

resposta inflamatória em placentas de mulheres portadoras de DF quando

comparadas com o grupo controle.

2. Avaliar se a expressão dos genes alterados em DF são os mesmos entre

as placentas de mulheres com AF e placentas de mulheres com doença da Hb

20 3. CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS

3.1. PACIENTES

Para o estudo realizado, foram avaliados três grupos de gestantes, todas

acompanhadas no ambulatório de Pré-Natal no Centro de Atenção Integral da

Saúde da Mulher (CAISM) - Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti,

UNICAMP. Dois grupos foram compostos por gestantes com DF e um grupo com

gestantes sem DF, chamado de grupo controle. Os grupos foram divididos em:

grupo 1 - pacientes com AF, Hb SS (n=5), grupo 2 - pacientes com doença da Hb

SC (n=6) e grupo 3 - pacientes controle (n=10). Para todas as pacientes foi

preenchida uma ficha de coleta de dados (resultados maternos e fetais), a partir

da avaliação do prontuário médico (Tabela 1).

3.1.1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO

- Para os grupos 1 e 2: diagnóstico comprovado por eletroforese de Hb.

- Para o grupo 3: confirmação da ausência de Hb S por eletroforese de Hb

e exclusão de gestantes com hipertensão, proteinúria, diabetes, infecções

maternas durante o pré-natal e anomalias fetais.

- Para os três grupos: concordância da mulher em participar do estudo – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) assinado, e pré-natal e parto

21 3.2. ASPÉCTOS ÉTICOS DA PESQUISA

Conforme determinações estabelecidas pelo Conselho Nacional de Saúde

(Resolução 466/12), o projeto foi submetido à apreciação pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP (sob o n°

14092013.4.0000.5404 do Certificado de Apresentação para Apreciação Ética),

que aprovou o protocolo de pesquisa e o TCLE.

Tabela 1. Características clínicas das mães e recém-nascidos (RN).

Características Grupo controle Grupo SS Grupo SC

Total de gestantes (n) 10 5 6

Nulípara 4 4 2

Idade gestacional (semanas) 38.60 ± 1.50 34.00± 4.3 37.33 ± 1.50 Idade materna (anos) 26.70 ± 5.01 24.6 ± 5.89 28.33 ± 7.96

Via de parto Vaginal 5 2 2 Cesárea 5 3 4 Peso ao nascer (gr) 2959 ± 546.80 2058 ± 949.80 2827 ± 397.70 Sexo do RN Feminino 7 1 2 Masculino 3 4 4 Peso da placenta (grs) 539.28 ± 87.15 (n=7) 367.50 ± 151.73 (n=4) 542.00 ± 80.43 (n=5) Altura ao nascer (cms) 47.65 ± 2.80 42.25 ± 8.53 (n=4) 47.00 ± 1.27 Complicações relacionada a DF Crises álgicas - 3 2

Síndrome torácica aguda - 1 1

Prematuridade - 3 2

RCIU - 2 0

Mortalidade perinatal - 1 0

Transfusão de sangue

22 4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. COLETA DAS PLACENTAS

Após o parto, as placentas foram mantidas em geladeira a 4°C até a coleta

do tecido, que foi obtido a partir da localização do cordão umbilical e dissecado na

interface materna da placenta, evitando áreas calcificadas e membranas fetais. Foi

realizada a lavagem em solução estéril e fria de tampão fosfato (PBS) isenta de

RNase para remover o restante do sangue materno e cada amostra foi

imediatamente colocada em nitrogênio líquido ou solução de RNAlater (Qiagen,

Carlsbad, CA, USA). Para as amostras que foram imergidas em RNAlater foi

seguido o protocolo do fabricante e armazenadas 12 horas em geladeira a 4°C

para depois serem estocadas em freezer -80°C até posterior extração de RNA

(ácido ribonucleico) total.

4.2. EXTRAÇÃO DE RNA

As placentas foram descongeladas e colocadas em um almofariz para

serem maceradas com pistão em nitrogênio líquido. Após a maceração, foi

adicionado 1 ml do reagente Trizol (Life Technologies, MD, EUA) no almofriz e

faz-se a homogeneização com a placenta para posterior transferência para um tubo

de 2 ml. Duzentos microlitros de clorofórmio foram acrescentados no tubo para

prosseguir com a centrifugação a 14000 rpm durante 18 min em temperatura de

4°C. Depois de centrifugada, a fase aquosa foi removida e transferida para um

novo tubo de 2 ml; 350 µl de etanol 70% foram adicionados e homogeneizados.

23 RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, EUA) e a purificação foi efetuada segundo o protocolo da Qiagen. Finalizada a extração, as amostras de RNA foram mantidas

em freezer -80°C para posterior controle de qualidade.

4.2.1. CONTROLE DE QUALIDADE DO RNA

O RNA foi quantificado por meio de leitura da densidade óptica no

espectrofotômetro Nanodrop 2000 (ThermoScientific, CA, EUA), em comprimento

de onda de 260 nm; a integridade da amostra foi verificada por leitura no

equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn,

Alemanha). As amostras íntegras apresentaram duas subunidades ribossomais:

18S e 28S.

Depois de realizada a transcrição reversa e antes da reação em cadeia da

polimerase (PCR) Array, todas as amostras foram submetidas à reação de

qRT-PCR para o controle endógeno beta-actina (BAC) com o objetivo de avaliar a

qualidade das amostras com relação à existência de contaminação por DNA

(ácido desoxirribonucleico) genômico.

4.3. SÍNTESE DE cDNA PARA PCR ARRAY

A síntese de ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) foi realizada

por meio do kit RT2 _{First Strand (SABiosciences, MD, EUA) de acordo com as}

instruções do fabricante. Para cada amostra, 0,5 μg de RNA foi adicionado a 2 μl de tampão 5x de eliminação de DNA genômico e água livre de RNase para um

volume final de 10 μl. A reação foi mantida a 42°C por 5 min, seguido por resfriamento em gelo por, pelo menos, 2 min. O mix para transcrição reversa foi

24 preparado a partir de 4 μl de tampão, 2 μl de enzima, 1 μl de controle para primer e 3 μl de água livre de RNase. Este mix foi adicionado junto aos 10 μl da reação para eliminação de DNA genômico e incubado a 42°C por 15 min e 95°C por 5

min. Após a incubação, foram adicionados 91 μl de água estéril e o mix estocado a -20°C até ser realizado o PCR array.

4.4. PCR ARRAY

O RT2 _{Profiler PCR Array (SABiosciences, MD, EUA) é uma combinação de}

duas técnicas: a reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) e o

microarray, que avaliam vários genes simultaneamente. A placa de PCR Array usada neste estudo foi a da resposta inflamatória humana e autoimunidade. Nesta

placa estavam inclusos 84 genes relacionados à via de inflamação, cinco genes

endógenos, um controle de DNA genômico, três controles de transcrição reversa e

três controles positivos da PCR. Procedeu-se a técnica de acordo com as

instruções do fabricante. Para preparar o mix da reação de qRT-PCR foram

utilizados 1350 μl de 2x RT2 _{SYBR Green Mastermix, 102 μl da reação de síntese}

de cDNA e 1248 μl de água livre de RNase, totalizando 2700 μl. A placa possui 96 poços e em cada poço foram adicionados 25 μl do mix (Figura 2).

O equipamento utilizado para a detecção de expressão gênica por PCR

Array e qRT-PCR foi o StepOne Plus (Apllied Biosystems, CA, EUA) e as condições de ciclagem foram: um ciclo em 95°C por 10 min e 40 ciclos com

temperaturas de 95°C por 15 s e 60°C por 1 min, seguido pelo período de

25 Figura 2. Etapas dos métodos.

4.4.1. ANÁLISE DOS DADOS DO PCR ARRAY

Os dados gerados pelo PCR Array foram analisados no software RT2

Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5

(http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). O programa de

análise avaliou os dados e a expressão gênica foi calculada em relação aos genes

endógenos BAC, beta 2 microglobulina (B2M) e proteína ribossomal P0 (RPLP0).

O cálculo de expressão gênica foi realizado pelo software baseado na fórmula de

2 ^ (-ΔΔCt) que resulta em valores de fold change, ou seja, quantas vezes o gene da paciente foi mais ou menos expresso quando comparado ao grupo controle.

4.5. VALIDAÇÃO POR qRT-PCR

Para a validação dos resultados obtidos através do PCR Array, foram

26 placentas de pacientes com DF em relação às placentas de pacientes do grupo

controle. Os experimentos foram feitos em duplicata e foi utilizado o método de

qRT-PCR.

4.5.1. SÍNTESE DE cDNA PARA qRT-PCR

As amostras de RNA (1 μg) foram tratadas com DNAase I (Fermentas – Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA), durante 30 min a 37°C, para a remoção de qualquer DNA genômico. A reação foi interrompida com a adição de 1 μl de EDTA e incubação a 65°C por 10 min. Em seguida, foram adicionados os reagentes:

dNTPs (necessários para a formação da fita a ser sintetizada), oligo dT (que

liga-se à cauda poli-A do RNA mensageiro, liga-servindo de ancorador), e a enzima

transcriptase reversa (responsável pela síntese de cadeia de cDNA). A reação foi

incubada por 60 min a 42°C e 5 min a 70°C, para a inativação da enzima

transcriptase reversa.

4.5.2. ESCOLHA DOS PRIMERS

As sequências do RNAm dos genes selecionados para a validação do PCR

Array foram obtidas a partir do banco de dados National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Com o auxílio do software Primer Express (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), os primers foram desenhados para gerar

produtos de amplificação entre 60 e 150 pb e temperatura de anelamento de 60°C.

A formação de estruturas como hairpins e dimers foi avaliada pelo programa Gene

27 Tabela 2. Genes escolhidos para validação do PCR Array.

Genes Sequência [ ] de primer Produto BAC F5´-AAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3´ 150 nM 79 pb R5´-TCGCTCCAACCGACTGCTGT-3´ BCL6 F5´-TAACATCGTTAACAGGTCCATGAC-3´ 150 nM 121 pb R5´-AGTCCCCACAGCATGCAGAG-3´ CD40LG F5´-GAAATGCAAAAAGGTGATCAGAAT-3´ 300 nM 92 pb R5´-ACATCTGTGTTACAGTGGGCTGA-3´ CXCL6 F5´-GTTTACGCGTTACGCTGAGAGT-3´ 150 nM 105 pb R5´-GAAGTGGTAGCCTCCCTGAAGA-3´ FASLG F5´-ATTTAACAGGCAAGTCCAACTC-3´ 150 nM 101 pb R5´-GTGAAGTATAAGAAGGGTGGCCT-3´ IL1RAP F5´-AGGTAGTAGGCTCTCCAAAAAAT-3´ 150 nM 96 pb R5´-AGAACCAGGAGAGGAGCTACTCA-3´

F = forward, R = reverse, [ ] = concentração e pb = pares de bases.

4.5.3 PADRONIZAÇÃO DA qRT-PCR

Para a padronização da reação de qRT-PCR foram determinadas três

concentrações do primer (70 nM, 150 nM e 300 nM), sendo selecionada a

concentração ideal onde o gene alvo foi amplificado mais precocemente (menor

valor de Ct – cycle threshold).

A confiabilidade e reprodutibilidade da qRT-PCR estão diretamente

relacionadas com a eficiência da reação. Assim, uma reação é realizada

utilizando-se a concentração de primers selecionada e diluições seriadas de uma

amostra, obtendo-se uma curva cujo valor da inclinação (slope) é aplicado à

fórmula [10 (-1/slope) -1] x 100 = 100%, resultando no valor percentual de

28 valores entre 99 e 100% e correlação acima de 0,98. Um exemplo pode ser

visualizado na Figura 3.

Figura 3. Padronização dos primers que amplificam o gene BCL6. A figura mostra a curva de diluição em seis concentrações de cDNA (6,32 ng, 20,0 ng, 63,26 ng, 120,0 ng, 200,0 ng e 632,6 ng) e a curva de melting dos primers (85,91°C), indicando a especificidade da amplificação e a curva de eficiência > 99%.

4.5.4. qRT-PCR

Para todas as amostras foram realizadas reações com 12 μl de volume final; sendo 6,0 μl do reagente SYBR Green PCR Master Mix 1x, 3,0 μl de mix de amostra de cDNA (10 ng/μl de concentração final) e 3,0 μl do mix do primer. Foi feito controle negativo para cada primer analisado, ou seja, os 3,0 μl de mix de amostra de cDNA foram substituídos por 3,0 μl de água estéril a fim de avaliar eventual contaminação dos primers. O programa foi iniciado a 95°C/10 minutos,

29 seguido de 40 ciclos: 95°C/15 s e 60°C/1 min. Posteriormente, adicionou-se um

passo de 20 min, no qual a temperatura aumenta gradualmente de 60°C para

95°C.

4.5.5. ANÁLISE DOS DADOS DE qRT-PCR E ESTATÍSTICA

Todas as análises das reações de qRT-PCR foram realizadas a partir da

quantificação relativa baseada na fórmula de 2 ^ (-ΔCt) ou seja, os valores da expressão foram normalizados em relação ao controle endógeno (BAC). Todos os

experimentos foram realizados em duplicata e os resultados foram indicados em

média e desvio padrão. Os gráficos e os cálculos foram obtidos por meio do

programa GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc.). O teste de Mann-Whitney

foi utilizado para avaliar a diferença de expressão entre os dois grupos e valores

30 5. RESULTADOS

5.1. INTEGRIDADE DO RNA E PCR ARRAY

O número de integridade do RNA (RIN) dado pelo bioanalisador deve ser

igual ou maior que 4, conforme descrito por Jobarteh et al.69_{, as amostras com RIN}

menores que 4 foram submetidas a nova extração ou retiradas do estudo (Figura

4).

Para determinar a expressão gênica da resposta inflamatória por PCR

Array, foram avaliadas cinco placentas de pacientes do grupo 1, cinco placentas de pacientes do grupo 2 e 10 placentas de pacientes do grupo 3. As 10 placentas

do grupo 3 foram usadas para fazer a análise dos dados tanto para o grupo 1

como para o grupo 2. As placas de PCR Array contêm os controles endógenos

BAC, B2M, GAPDH, HPRT1 e RPLP0. Os valores dos Cts obtidos para os controles endógenos escolhidos podem ser observados na tabela 3 para os

31 Figura 4. Eletroforese de RNA extraído a partir de placenta no bioanalisador. Frações ribossomais 28S e 18S das amostras estão indicadas pelas setas e pelo número do RIN à direita.

Tabela 3. Valores de Cts dos controles endógenos obtidos das 5 pacientes do grupo 1 (SS) e 5 pacientes do grupo 2 (SC).

Genes Endógenos SS 1 SS 2 SS 3 SS 4 SS 5 SC 1 SC 2 SC 3 SC 4 SC 5 BAC 18.25 18.97 18.16 18.27 18.47 18.71 18.29 18.25 18.71 18.71 B2M 18.65 18.91 19.38 18.65 18.89 18.93 18.99 18.92 19.15 18.65 RPLP0 18.24 19.17 18.43 18.24 18.77 18.49 18.58 19.21 18.73 18.02

Tabela 4. Valores de Cts dos controles endógenos obtidos das 10 pacientes do grupo controle (CON).

Genes Endógenos CON 1 CON 2 CON 3 CON 4 CON 5 CON 6 CON 7 CON 8 CON 9 CON 10 BAC 18.93 18.29 18.32 18.44 18.84 18.39 18.40 18.43 18.41 18.79 B2M 17.99 19.58 18.44 18.71 19.56 18.93 18.99 18.92 19.15 18.65 RPLP0 17.83 18.73 19.01 18.77 18.32 18.49 18.58 19.21 18.73 18.02

32 Resultados com diferença de expressão de 2 vezes (fold change), tanto

para ganho quanto para perda de expressão, foram considerados significativos.

Dos 84 genes analisados, 17 apresentaram diferença de expressão no grupo 1: 11

genes foram subexpressos (C3, CCL11, CCL8, CXCL10, CXCL6, CXCR1,

FASLG, KNG1, LTB, PTGS2 e SELE) e seis superexpressos (CCL22, CCL24, CCR3, CXCL1, CXCL2 e IL5) quando comparados com o grupo 3 (Quadro 1). Enquanto que, no grupo 2, 13 genes mostraram-se diferencialmente expressos:

quatro genes tiveram expressão diminuída (CCL11, CCL23, CRP e CXCL6) e

nove genes tiveram aumento de expressão (BCL6, CD40LG, CEBPB, IL1RAP,

IL235, IL5, RIPK2, TLR3 e TLR9) quando comparados com o grupo 3 (Quadro 2). Destes genes, os que apresentaram diferença estatisticamente significante foram:

linfoma 6 das células B, BCL6; ligante de quimiocina 23, CCL23; receptor de

quimiocina 3, CCR3; ligante do CD40, CD40LG; ligante de quimiocina 10,

CXCL10; ligante de quimiocina 6, CXCL6; ligante FAS, FASLG; proteína acessória do receptor da interleucina 1, IL1RAP e receptor toll like 9, TLR9.

33

Quadro 1. Resultado de PCR Array do grupo 1. A placa mostra o resultado final do PCR Array, ou seja, foi representado um esquema de placa de todas as placentas de pacientes do grupo 1 (5 pacientes) comparado ao grupo controle (10 pacientes). Em verde estão os genes que foram subexpressos, em vermelho os superexpressos e em azul os genes endógenos escolhidos. O valor de fold está abaixo de cada símbolo gênico.

34

Quadro 2. Resultado de PCR Array do grupo 2. A placa mostra o resultado final do PCR Array, ou seja, foi representado um esquema de placa de todas as placentas de pacientes do grupo 2 (5 pacientes) comparado ao grupo controle (10 pacientes). Em verde estão os genes que foram subexpressos, em vermelho os superexpressos e em azul os genes endógenos escolhidos. O valor de fold está abaixo de cada símbolo gênico.

35 5.2. VALIDAÇÃO DOS RESULTADOS POR qRT-PCR

Baseado nos resultados de PCR Array (levando em consideração os

valores de p e fold change), foram selecionados cinco genes (BCL6, CD40LG,

CXCL6, FASLG e IL1RAP) para validação por qRT-PCR. Os resultados obtidos podem ser observados na Figura 5. Infelizmente o gene CXCL6 foi expresso

somente em três placentas de pacientes controle, duas placentas de pacientes do

grupo 1 e apenas uma placenta de paciente do grupo 2, impossibilitando sua

análise.

Figura 5. Perfil de expressão gênica dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e

IL1RAP. CON (grupo controle, N=10), SS (grupo 1, N=5) e SC (grupo 2, N=6). * p < 0.05 comparado ao CON.

36 As comparações dos resultados das duas metodologias estão disponíveis

nas Tabelas 5 e 6. Dos quatro perfis de expressão gênica avaliados, dois foram

validados (FASLG no grupo 1 e BCL6 no grupo 2). Não foram avaliados quatro

genes que seriam de interesse segundo os resultados do PCR Array (CCR3,

CCL23, CXCL10 e TLR9) devido à falta de amostra específica (linhagem celular, tecido ou órgão) onde esses genes são altamente expressos. Em placentas, a

expressão destes genes é baixa e a curva de diluição necessária para a

padronização seria inviável. Porém, os quatro genes citados acima serão incluídos

na discussão e as validações serão feitas assim que possível.

Tabela 5. Comparação de fold e valor de p entre PCR Array e qRT-PCR dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e IL1RAP para o grupo 1.

Gene SS vs. CON Fold

PCR Array Valor de p SC vs. CON Fold qRT-PCR Valor de p BCL6 1.53 0.1829 1.60 0.7679 CD40LG 1.16 0.2046 1.47 0.8541 FASLG -4.97 0.0007* -4.84 0.0435* IL1RAP 1.76 0.2648 -1.11 0.5941

Tabela 6. Comparação de fold e valor de p entre PCR Array e qRT-PCR dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e IL1RAP para o grupo 2.

Gene SC vs. CON Fold

PCR Array Valor de p SC vs. CON Fold qRT-PCR Valor de p BCL6 2.22 0.0168* 4.67 0.0420* CD40LG 2.17 0.0027* 1.28 0.7861 FASLG 1.13 0.8798 -2.76 0.2635 IL1RAP 2.63 0.0275* 3.20 0.1806

37 6. DISCUSSÃO

Inflamação, adesão de leucócitos e hemácias no endotélio vascular e

subsequente dano endotelial estão relacionados com a patogênese da DF. Altos

níveis circulantes de quimiocinas têm sido observados em muitos processos

patológicos e podem servir como indicadores precoces de resultados adversos da

gravidez70_{. As citocinas e quimiocinas podem estar envolvidas em vários}

mecanismos que contribuem para a VOC, como ativações endotelial e plaquetária.

Nossos resultados mostraram que há diferença na expressão gênica da via

inflamatória em placentas de mulheres portadoras de DF quando comparadas ao

grupo controle, sugerindo que, nestas placentas os genes regulados positivamente

ou negativamente possam estar associados com as complicações materna e fetal

que ocorrem durante a gestação. A diferença observada nos resultados de PCR

Array e qRT-PCR pode ter ocorrido devido à diferença de sequência dos primers, já que as amostras de RNA total utilizadas foram as mesmas para ambas as

metodologias. A sequência dos primers de PCR Array não é disponibilizada para

os consumidores.

6.1. CXCL10

Devido à ocorrência de VOC na circulação de pacientes falciformes, a angiogênese se torna frequente na presença de crise álgica71_{. A angiogênese é}

um processo complexo que pode ser desencadeado por baixo teor de oxigênio nos tecidos, consistindo na criação de novos vasos a partir de vasos já existentes72_{. Em situações de hipóxia aguda, a vasoconstrição atua como um}