O número de integridade do RNA (RIN) dado pelo bioanalisador deve ser
igual ou maior que 4, conforme descrito por Jobarteh et al.69, as amostras com RIN
menores que 4 foram submetidas a nova extração ou retiradas do estudo (Figura
4).
Para determinar a expressão gênica da resposta inflamatória por PCR
Array, foram avaliadas cinco placentas de pacientes do grupo 1, cinco placentas de pacientes do grupo 2 e 10 placentas de pacientes do grupo 3. As 10 placentas
do grupo 3 foram usadas para fazer a análise dos dados tanto para o grupo 1
como para o grupo 2. As placas de PCR Array contêm os controles endógenos
BAC, B2M, GAPDH, HPRT1 e RPLP0. Os valores dos Cts obtidos para os controles endógenos escolhidos podem ser observados na tabela 3 para os
31 Figura 4. Eletroforese de RNA extraído a partir de placenta no bioanalisador. Frações ribossomais 28S e 18S das amostras estão indicadas pelas setas e pelo número do RIN à direita.
Tabela 3. Valores de Cts dos controles endógenos obtidos das 5 pacientes do grupo 1 (SS) e 5 pacientes do grupo 2 (SC).
Genes Endógenos SS 1 SS 2 SS 3 SS 4 SS 5 SC 1 SC 2 SC 3 SC 4 SC 5 BAC 18.25 18.97 18.16 18.27 18.47 18.71 18.29 18.25 18.71 18.71 B2M 18.65 18.91 19.38 18.65 18.89 18.93 18.99 18.92 19.15 18.65 RPLP0 18.24 19.17 18.43 18.24 18.77 18.49 18.58 19.21 18.73 18.02
Tabela 4. Valores de Cts dos controles endógenos obtidos das 10 pacientes do grupo controle (CON).
Genes Endógenos CON 1 CON 2 CON 3 CON 4 CON 5 CON 6 CON 7 CON 8 CON 9 CON 10 BAC 18.93 18.29 18.32 18.44 18.84 18.39 18.40 18.43 18.41 18.79 B2M 17.99 19.58 18.44 18.71 19.56 18.93 18.99 18.92 19.15 18.65 RPLP0 17.83 18.73 19.01 18.77 18.32 18.49 18.58 19.21 18.73 18.02
32 Resultados com diferença de expressão de 2 vezes (fold change), tanto
para ganho quanto para perda de expressão, foram considerados significativos.
Dos 84 genes analisados, 17 apresentaram diferença de expressão no grupo 1: 11
genes foram subexpressos (C3, CCL11, CCL8, CXCL10, CXCL6, CXCR1,
FASLG, KNG1, LTB, PTGS2 e SELE) e seis superexpressos (CCL22, CCL24, CCR3, CXCL1, CXCL2 e IL5) quando comparados com o grupo 3 (Quadro 1). Enquanto que, no grupo 2, 13 genes mostraram-se diferencialmente expressos:
quatro genes tiveram expressão diminuída (CCL11, CCL23, CRP e CXCL6) e
nove genes tiveram aumento de expressão (BCL6, CD40LG, CEBPB, IL1RAP,
IL235, IL5, RIPK2, TLR3 e TLR9) quando comparados com o grupo 3 (Quadro 2). Destes genes, os que apresentaram diferença estatisticamente significante foram:
linfoma 6 das células B, BCL6; ligante de quimiocina 23, CCL23; receptor de
quimiocina 3, CCR3; ligante do CD40, CD40LG; ligante de quimiocina 10,
CXCL10; ligante de quimiocina 6, CXCL6; ligante FAS, FASLG; proteína acessória do receptor da interleucina 1, IL1RAP e receptor toll like 9, TLR9.
33
Quadro 1. Resultado de PCR Array do grupo 1. A placa mostra o resultado final do PCR Array, ou seja, foi representado um esquema de placa de todas as placentas de pacientes do grupo 1 (5 pacientes) comparado ao grupo controle (10 pacientes). Em verde estão os genes que foram subexpressos, em vermelho os superexpressos e em azul os genes endógenos escolhidos. O valor de fold está abaixo de cada símbolo gênico.
34
Quadro 2. Resultado de PCR Array do grupo 2. A placa mostra o resultado final do PCR Array, ou seja, foi representado um esquema de placa de todas as placentas de pacientes do grupo 2 (5 pacientes) comparado ao grupo controle (10 pacientes). Em verde estão os genes que foram subexpressos, em vermelho os superexpressos e em azul os genes endógenos escolhidos. O valor de fold está abaixo de cada símbolo gênico.
35 5.2. VALIDAÇÃO DOS RESULTADOS POR qRT-PCR
Baseado nos resultados de PCR Array (levando em consideração os
valores de p e fold change), foram selecionados cinco genes (BCL6, CD40LG,
CXCL6, FASLG e IL1RAP) para validação por qRT-PCR. Os resultados obtidos podem ser observados na Figura 5. Infelizmente o gene CXCL6 foi expresso
somente em três placentas de pacientes controle, duas placentas de pacientes do
grupo 1 e apenas uma placenta de paciente do grupo 2, impossibilitando sua
análise.
Figura 5. Perfil de expressão gênica dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e
IL1RAP. CON (grupo controle, N=10), SS (grupo 1, N=5) e SC (grupo 2, N=6). * p < 0.05 comparado ao CON.
36 As comparações dos resultados das duas metodologias estão disponíveis
nas Tabelas 5 e 6. Dos quatro perfis de expressão gênica avaliados, dois foram
validados (FASLG no grupo 1 e BCL6 no grupo 2). Não foram avaliados quatro
genes que seriam de interesse segundo os resultados do PCR Array (CCR3,
CCL23, CXCL10 e TLR9) devido à falta de amostra específica (linhagem celular, tecido ou órgão) onde esses genes são altamente expressos. Em placentas, a
expressão destes genes é baixa e a curva de diluição necessária para a
padronização seria inviável. Porém, os quatro genes citados acima serão incluídos
na discussão e as validações serão feitas assim que possível.
Tabela 5. Comparação de fold e valor de p entre PCR Array e qRT-PCR dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e IL1RAP para o grupo 1.
Gene SS vs. CON Fold
PCR Array Valor de p SC vs. CON Fold qRT-PCR Valor de p BCL6 1.53 0.1829 1.60 0.7679 CD40LG 1.16 0.2046 1.47 0.8541 FASLG -4.97 0.0007* -4.84 0.0435* IL1RAP 1.76 0.2648 -1.11 0.5941
Tabela 6. Comparação de fold e valor de p entre PCR Array e qRT-PCR dos genes BCL6, CD40LG, FASLG e IL1RAP para o grupo 2.
Gene SC vs. CON Fold
PCR Array Valor de p SC vs. CON Fold qRT-PCR Valor de p BCL6 2.22 0.0168* 4.67 0.0420* CD40LG 2.17 0.0027* 1.28 0.7861 FASLG 1.13 0.8798 -2.76 0.2635 IL1RAP 2.63 0.0275* 3.20 0.1806
37 6. DISCUSSÃO
Inflamação, adesão de leucócitos e hemácias no endotélio vascular e
subsequente dano endotelial estão relacionados com a patogênese da DF. Altos
níveis circulantes de quimiocinas têm sido observados em muitos processos
patológicos e podem servir como indicadores precoces de resultados adversos da
gravidez70. As citocinas e quimiocinas podem estar envolvidas em vários
mecanismos que contribuem para a VOC, como ativações endotelial e plaquetária.
Nossos resultados mostraram que há diferença na expressão gênica da via
inflamatória em placentas de mulheres portadoras de DF quando comparadas ao
grupo controle, sugerindo que, nestas placentas os genes regulados positivamente
ou negativamente possam estar associados com as complicações materna e fetal
que ocorrem durante a gestação. A diferença observada nos resultados de PCR
Array e qRT-PCR pode ter ocorrido devido à diferença de sequência dos primers, já que as amostras de RNA total utilizadas foram as mesmas para ambas as
metodologias. A sequência dos primers de PCR Array não é disponibilizada para
os consumidores.
6.1. CXCL10
Devido à ocorrência de VOC na circulação de pacientes falciformes, a angiogênese se torna frequente na presença de crise álgica71. A angiogênese é
um processo complexo que pode ser desencadeado por baixo teor de oxigênio nos tecidos, consistindo na criação de novos vasos a partir de vasos já existentes72. Em situações de hipóxia aguda, a vasoconstrição atua como um
38 Complementarmente, para uma melhor adaptação, são liberados fatores de crescimento para células endoteliais e fibroblastos, na tentativa de remodelar os vasos72.
Estudo feito por Trampont e colaboradores mostrou que em placentas de pacientes portadoras de DF, os níveis de proteína do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) estavam elevados em análise realizada de imuno- histoquímica, podendo esta ser uma adaptação fisiológica a situações de hipóxia59. O VEGF, nesse caso, aumentaria não apenas o aporte de oxigênio,
como também a permeabilidade e o tônus vascular73, atuando como um fator pró-
angiogênico. Quando os fatores pró-angiogênicos superam os fatores antiangiogênicos, as células endoteliais trocam seu estado quiescente por um estado ativo74.
A proteína 10 induzida pelo interferon gama (IP-10 ou CXCL10) é uma quimiocina da família CXC75. Uma característica única de membros desta família
de quimiocinas é que elas têm propriedades pró-inflamatórias e atuam como moduladores da angiogênese76,77 em certas condições, tais como na cicatrização
de feridas, isquemia e neoplasia78,79. Estas propriedades estão relacionadas com
a expressão de receptores específicos de quimiocinas em leucócitos e células endoteliais.
A quimiocina CXCL10 foi subexpressa no grupo 1 quando comparado ao grupo controle. Esse resultado está de acordo com o estudo feito por Ostadebrahimi, que mensurou os níveis de CXCL10 em plasma e também encontrou esta quimiocina diminuída em pacientes falciformes80. O aumento de VEGF e a diminuição de CXCL10 em placentas de pacientes com AF sugere que
39 o processo de angiogênese seja maior nestas gestantes. A obstrução ou perfusão limitada de sangue leva à injúria tecidual, podendo evoluir para necrose81.
Placentas de pacientes com DF possuem maior ocorrência de necrose55,56,57
quando comparadas com placentas de mulheres sem essa patologia, sugerindo a presença de eventos vaso-oclusivos. A expressão diminuída desta quimiocina pode ser devido à VOC e subsequente hipóxia, sendo fundamental a neovascularização para suprimento de oxigênio adequado do feto.
6.2. CCR3
Os eosinófilos são leucócitos que estão envolvidos na iniciação e
propagação de doenças inflamatórias com respostas diversificadas82. Após o
engajamento de receptores para citocinas, imunoglobulinas e complemento, eles
podem atuar como células pró-inflamatórias, liberando citocinas e mediadores
lipídicos. Os efeitos de tais moléculas incluem aumento de adesão e modulação
do tráfico celular, ativação e regulação da permeabilidade vascular, secreção de
muco em tecido epitelial e constrição do músculo liso83.
O RNAm do CCR3 é altamente expresso em eosinófilos, mas também é
encontrado em basófilos e em uma subpopulação de linfócitos T auxiliares. Alguns
estudos também indicam a expressão deste receptor em neutrófilos e macrófagos
quando em estado inflamatório84. Nossos resultados estão de acordo com os
demais autores que comprovaram o aumento de eosinófios em pacientes
falciformes85, sendo possível que estas células participem do fenômeno vaso-
oclusivo. Assim, a elevação dos níveis de RNAm de CCR3 pode indicar que esteja
40 eosinófilos, conduzindo para VOC. Porém, uma análise de imuno-histoquímica em
tecido placentário é necessária para tal confirmação.
Em células estromais deciduais, a inflamação induzida pelo aumento da
expressão desse receptor vinculado ao ligante de quimiocina 28 (CCL28) está
relacionada à apoptose celular e aborto no primeiro trimestre da gestação86.
Porém, a expressão de CCL28 não foi avaliada no presente estudo, não sendo
possível prever se o aumento da expressão de CCR3 em AF está relacionada com
a quimiocina CCL28.
6.3. CCL23
A maioria das quimiocinas da subfamília CC é responsável pela ativação de
monócitos, linfócitos, basófilos e eosinófilos. Consequentemente, estão envolvidas
nos processos de inflamação crônica e alérgica87. A circulação da quimiocina
CCL23 tem sido associada com doenças inflamatórias como a artrite reumatóide88.
Esta quimiocina tem ação quimioatratora para monócitos e células dendríticas e se
ligam predominantemente ao receptor 1 de quimiocina (CCR1). No entanto, a sua
ação em DF não tem sido explorada.
Estudo realizado por Bosco et al. investigou o perfil transcricional de
monócitos humanos quando colocados em um microambiente hipóxico. Os
resultados mostraram que o nível de RNAm desta quimiocina era diminuído,
enquanto que, IL1RAP tinha aumento de expressão sob estado de hipóxia89.
Esses resultados foram semelhantes aos nossos obtidos por PCR Array,
superexpressão de IL1RAP e subexpressão de CCL23, ambos no grupo de
41 estatisticamente e o primer da quimiocina CCL23 ainda não foi padronizado para
podermos sugerir que a expressão diminuída deste gene nas placentas de
pacientes falciformes seja devido à deficiência de oxigênio.