RENATA MOURA XAVIER
VARIAÇÕES MENSAIS DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE
DUAS ESPÉCIES DE PLANTAS MEDICINAIS CONHECIDAS COMO
GUACO: MIKANIA GLOMERATA SPRENGUEL E MIKANIA
LAEVIGATA SCHULTZ, AO LONGO DE UM ANO.
CAMPINAS
2015
RENATA MOURA XAVIER
Variações mensais dos metabólitos secundários de duas espécies
de plantas medicinais conhecidas como guaco: Mikania glomerata
Sprenguel e Mikania laevigata Schultz, ao longo de um ano.
CAMPINAS
2015
ORIENTADOR: Profa Dra Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Campinas, 06 de agosto de 2015.
AGRADECIMENTOS
A Deus pelas bênçãos concedidas, pelo conforto nas horas difíceis e por ter me encaminhado por sábios caminhos.
Ao meu pai e irmãos, que são meus verdadeiros amigos, pela educação, carinho e apoio dado durante todo o percurso da minha vida.
A minha professora, orientadora e amiga Dra Alexandra C H F Sawaya pelos ensinamentos, estímulos e apoios dados para desenvolvimento deste trabalho até a etapa final.
Aos professores Dra Ildenize, Dr Paulo e Dr Rafael pelas sugestões dadas para o melhoramento deste trabalho.
Ao Cepagri (UNICAMP) pelas informações fornecidas para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos amigos e colegas do Instituto de Biologia, em especial à Begoña e Cláudia pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho. E muito obrigada a todos os outros pelo apoio em momentos difíceis e por proporcionarem muitos momentos de descontração.
A todos os nossos amigos pelo apoio e momentos de alegria.
A todos os professores e amigos que nos encaminharam para o trabalho, para a cultura e para o progresso.
A todos aqueles que acreditaram em nossa capacidade de realização deste trabalho.
RESUMO
O uso de plantas medicinais e fitoterápicos na política de saúde do Brasil vem sendo incentivado de maneira crescente por diretrizes governamentais em todos os níveis. O xarope à base de Mikania glomerata Spreng é atualmente fornecido por postos do Sistema Único de Saúde (SUS) como fitoterápico para bronquite e tosse. Porém, variações nas concentrações de princípios ativos, afetando a segurança, qualidade e eficácia esperada dos fitoterápicos, podem ocorrer devido à época do ano que a droga é coletada e hora do dia da coleta.
O estudo realizado foi referente às variações mensais dos princípios ativos das duas espécies de guaco de interesse terapêutico (M. glomerata e Mikania laevigata Schultz). Como ambas constam do 1º Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira, aparentemente podendo ser usadas indiscriminadamente, elas foram estudadas em paralelo. As folhas de exemplares das duas espécies foram coletadas em três horários diferentes, em um dia por mês durante um ano, imediatamente congeladas, mantidas congeladas, liofilizadas e os metabólitos extraídos com água e com solução hidroalcoólica. A composição dos extratos foi avaliada por cromatografia líquida com espectrometria de massas, acompanhando o teor do seu marcador (cumarina) e do ácido clorogênico bem como o perfil dos outros componentes majoritários.
A maior variação entre os metabólitos secundários foi encontrada entre as duas espécies:
Mikania glomerata e Mikania laevigata, para os dois tipos de solventes extratores, sendo que o
solvente hidroalcoólico foi mais eficiente para extrair compostos bioativos das duas espécies de guaco. Maiores teores de cumarina em M. laevigata foram encontrados nos períodos mais frios, o que mostra um possível efeito da temperatura média do ar na produção dos metabólitos secundários para esta espécie. Já para M. glomerata foi possível notar a influência de fatores ambientais como chuva e temperatura média do ar na produção dos metabólitos secundários.
ABSTRACT
The use of medicinal plants and herbal medicine have been encouraged by Brazilian health politics, in a increasing manner, by government directives in all levels. The syrup of Mikania
glomerata Spreng, is currently provided by health care system (SUS) as a herbal medicine for
bronchitis and cough. However, variations of the active principle, affecting its safety, quality and effectiveness which is expected from herbal medicines, may occur because of the time of the year when the drug is collected and also the time of the day in which it´s collected.
The study was related to the monthly variation of the active principle of two species of the guaco of therapeutic interest (M. Glomerata and Mikania Laevigata Schultz). With both of them being in the 1st formulary of herbal medicines of the Brazilian Farmacopeia, apparently being used indiscriminately, they were studied in parallel. The leaves of the two species were collected in dat three different times of the day, once a month for a year, and immediately frozen and kept in such a manner, and finally extracted with water and in a hydro alcoholic solution. The composition the extracts were then analyzed by a liquid chromatography with a mass spectrometry, following the level of its marker(coumarin) as well as the profile of the other components.
The main variation between secondary metabolites was found between the species:
Mikania glomerata e Mikania laevigata, for both extractive solvents, but the hydroalcoholic
solvent extracted more efficiently the bioactive compounds of both species of guaco. M. laevigata seems to suffer principally the influence of air temperature on the production of secondary metabolites; higher yields of coumarin are found in the colder periods. Diversely, for M. glomerata it was possible to note the influence of rainy periods and temperature on the production of secondary metabolites.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Rota biossintética da cumarina e do ácido clorogênico. ---22
Figura 2. Plantas adultas de guaco das espécies Mikania glomerata (A) e Mikania laevigata (B)
cultivadas no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP. ---25
Figura 3. Temperatura do ar em °C (A) e acumulado de chuva em mm (B). Dados obtidos do
Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas a Agricultura (CEPAGRI) Unicamp, de dezembro de 2012 a novembro de 2013. ---29
Figura 4. Cromatogramas (UHPLC-MS) dos extratos aquosos e hidroalcoólicos das folhas de M. laevigata e M. glomerata coletadas no mês de dezembro de 2012, obtidos em modo positivo e
negativo. ---30
Figura 5. Análise dos componentes principais dos íons encontrados nos extratos aquosos e
hidroalcoólicos das folhas de M laevigata e M. glomerata. (A) Amostras vermelhas (extrato hidroalcoólico de M. glomerata); laranja (extrato aquoso de M. glomerata), azul (extrato aquoso de M. laevigata) e verde (extrato hidroalcoólico de M. laevigata) (B) loadings ou íons e seus tempos de retenção. ---31
Figura 6. Variação mensal das áreas dos picos referentes ao íon m/z 147 – cumarina, no extrato
hidroalcoólico das duas espécies de guaco. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade) dentro da mesma espécie. Resultados expressos em média e erro padrão. ---35
Figura 7. Variação mensal de cumarina no extrato aquoso de M. laevigata. As médias marcadas
pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---35
Figura 8. Relação entre temperatura média do ar no dia da coleta e teor de cumarina (μg / mL)
encontrados no extrato hidroalcoólico (A) e aquoso de Mikania laevigata (B) no período de dezembro de 2012 a novembro de 2013. ---37
Figura 9. Variação mensal de ácido clorogênico no extrato hidroalcoólico de M. glomerata e M. laevigata. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de
Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---38
Figura 10. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata
em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---40
Figura 11. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta e a área do pico do íon m/z
190 (A) e m/z 381 (B), e a relação entre o acumulado de chuva no mês da coleta no período de dezembro de 2012 a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 474 (C), encontrados no extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. ---41
Figura 12. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata
em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---42
Figura 13. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem
estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---43
Figura 14. Relação entre temperatura do ar no dia da coleta de dezembro de 2012 a novembro
de 2013 e área do pico do íon m/z 293(A), 287( B), 302 (C), 255 (D) e 177 (E), encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. ---45
Figura 15. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem
estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---46
Figura 16. Relação entre acumulado de chuva no mês da coleta no período de dezembro de
2012 a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 499 (A) e m/z 399 (B) encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo. ---47
Figura 17. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. laevigata
em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---48
Figura 18. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta no período de dezembro
de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 337e 251, encontrados no extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. ---49
Figura 19. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. laevigata
em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---50
Figura 20. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta no período de dezembro
de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 325 (C), m/z 433 (B), m/z 191 (A) e
m/z 487 (D), encontrados no extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo
negativo. ---51
Figura 21. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M.
laevigata em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente
entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---52
Figura 22. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta no período de dezembro
de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 350 (A) e m/z 286 (B), encontrados no extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. ---53
Figura 23 Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M. laevigata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem
estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. ---54
Figura 24. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta no período de dezembro
de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 191 (A) e m/z 433 (B), encontrados no extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo. ---55
LISTA DE TABELAS
Tabela1: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos aquosos das duas
espécies de guaco---32
Tabela 2: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos hidroalcoólicos das
duas espécies de guaco ---33
Tabela 3: Teor de cumarina em µg/ml encontrado nos extratos das duas espécies de
guaco---36
Tabela 4: Teor de ácido clorogênico em µg/ml encontrado no extrato hidroalcoólico de M. glomerata ---39
SUMÁRIO:
1 Introdução e Justificativa ---15
2 Revisão Bibliográfica ---17
2.1 Histórico e uso terapêutico ---17
2.2 Composição dos extratos e rota biossintética de dois componentes: cumarina e ácido clorogênico ---20
2.2.1 Via de biossíntese da cumarina e ácido clorogênico ---21
3 Objetivo ---24 3.1 Objetivo geral ---24 3.2 Objetivos específicos ---24 4 Materiais e Métodos ---25 4.1 Equipamentos ---25 4.2 Reagentes e Solventes ---25 4.3 Material Vegetal --- 25
4.4 Liofilização e Obtenção dos Extratos Aquosos e Hidroalcoólicos--- 26
4.5 Análise dos Extratos por UHPLC-MS ---26
4.6 Análise do teor de cumarina e ácido clorogênico ---27
4.7 Estatística ---28
5.1 Condições ambientais durante o período estudado ---29
5.2 Variação diária dos íons ---34
5.3 Variação mensal de cumarina m/z 147 e ácido clorogênico m/z 353 ---34
5.4 Cumarina ---34
5.5 Ácido clorogênico ---38
5.6 Variações mensais de outros íons nos extratos de M. glomerata ---40
5.6.1 Extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo ---40
5.6.2 Extrato Aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo ---42
5.6.3 Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo ---43
5.6.4 Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo ---46
5.7 Variações mensais de outros íons nos extratos de M. laevigata---48
5.7.1 Extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo ---48
5.7.2 Extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo ---50
5.7.3 Extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo ---52
5.7.4 Extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo ---54
6 Discussão das variações mensais ---56
7 Conclusões ---58
8 Referências Bibliográficas ---59
Anexo I ---65
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A procura por terapias utilizando plantas medicinais para a prevenção, tratamento e recuperação da saúde, vem sofrendo grande impulso no Brasil [Min. Saúde, 2006 b] [Min. Saúde, 2008]. Com isso cresce a procura por informações sobre o efeito dos fitoterápicos. Um bom exemplo é o xarope à base de Mikania glomerata Spreng que é atualmente fornecido por postos do Sistema Único de Saúde (SUS) como fitoterápico para bronquite e tosse. Porém, variações nas concentrações de princípios ativos, afetando a segurança, qualidade e eficácia esperada dos fitoterápicos, podem ocorrer devido à época do ano de coleta. Poucos estudos referentes às variações dos princípios ativos das duas espécies de guaco de interesse terapêutico, Mikania glomerata e Mikania laevigata Schultz, foram encontrados. Os estudos existentes referem-se apenas a variação de teor da cumarina e tratam apenas de uma das espécies, como ocorre nos estudos realizados por Passari (2014) e Pereira et al (2000).
Portanto este estudo teve como objetivo comparar a variação na composição de extratos de folhas de M. laevigata e M. glomerata coletadas ao longo do ano. Para evitar que as variações genéticas entre plantas da mesma espécie afetem os resultados, foram usadas mudas identificadas destas espécies cresceram no campo experimental do Instituto de Biologia da Unicamp. O estudo foi baseado na avaliação do teor de cumarina (seu marcador) e ácido clorogênico (substancia importante encontrada principalmente em M. glomerata) bem como o perfil dos outros componentes nos extratos de folhas de M. glomerata e M. laevigata. Feita a coleta as amostras das folhas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e posteriormente congeladas em freezer para serem todas analisadas ao mesmo tempo.
Além dos extratos hidroalcoólicos preconizados nas Farmacopeias, foram obtidos extratos aquosos para simular o chá de guaco usado popularmente, e ambos os extratos foram analisados por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência com espectrometria de massas. A
média (n=3) da área dos picos dos principais íons encontrados foram comparados estatisticamente, permitindo a identificação de possíveis diferenças significativas que podem ocorrer em diferentes épocas do ano.
Considerando que as duas espécies são frequentemente usadas indiscriminadamente, estas foram estudadas comparativamente ao longo do ano a fim de esclarecer dúvidas se apresentam diferenças na composição e teores de substâncias ativas que podem resultar em diferenças no tratamento terapêutico do paciente, devido à variabilidade sazonal.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Histórico e uso terapêutico
O gênero Mikania Wild. apresenta cerca de 430 espécies, distribuídas principalmente nas Américas do Sul e Central, e somente nove no Velho Mundo. [Barroso, 1958; Ritter; Miotto, 2005]. No Brasil encontra-se cerca de 170 espécies, localizadas entre o sudeste e o sul do Brasil, com algumas espécies se estendendo até a Argentina, Uruguai e Paraguai [Ritter; Miotto,2005]. Espécies do gênero Mikania são popularmente conhecidas no Brasil como guaco, coração de Jesus, guaco-cheiroso, cipó-caatinga, erva de cobra ou guaco trepador [Castro et al., 2003; Vidal et al., 2006; Bakir et al., 2004].
As duas espécies mais utilizadas pela medicina popular são Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker e Mikania glomerata Spreng. Tradicionalmente são usadas para várias condições inflamatórias e alérgicas do sistema respiratório [Freitas et al., 2008] como asma, bronquite e para acalmar a tosse. Também são usadas para tratar reumatismo [Graça et al., 2007], malária [Botsaris, 2007], nevralgias [Agra et al., 2008] e picada de cobras [Floriano et al., 2009]. Como essas espécies compartilham o mesmo habitat e geralmente são encontradas nas regiões neotropicais, dificilmente são distinguidas, uma vez que, possuem diversas características químicas, morfológicas e organolépticas em comum. [Gaspareto et al., 2010].
A extinta Central de Medicamentos (CEME) iniciou em 1980 um programa nacional para a pesquisa nas áreas de atividade de plantas medicinais; o Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais (PPPM). Devido à importância do uso tradicional, o PPPM-CEME avaliou a eficácia e segurança de M. glomerata, porém a M. laevigata não foi estudada [Ministério da Saúde, Brasil, 2006].
Na última década ressurgiu o interesse em usar medicamentos derivados de plantas medicinais. A ANVISA emitiu duas resoluções em 2004 referentes a fitoterápicos: a RDC 48
[ANVISA, 2004a] determinou como deve ser feito o registro de medicamentos fitoterápicos, comprovando sua eficácia, segurança e boas práticas de fabricação. A RE 89 [ANVISA, 2004b] definiu uma lista de 34 espécies de plantas medicinais cuja segurança e eficácia já se consideravam devidamente comprovados e por isso o registro de fitoterápicos usando estas plantas poderia ser simplificado. Nesta listagem constam de forma sucinta: o nome cientifico e nome vulgar da planta, parte usada, os marcadores, formas de uso, indicações, dose, vias de administração e restrições. Essa lista foi ampliada para 36 espécies na Instrução Normativa (IN-5) de 2008 [Min. Saúde, 2008]. Acompanhando este renovado interesse em fitoterápicos está a Portaria 971 [Min. Saúde, 2006] e o Decreto 5813 [Brasil, 2006] instituindo a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no SUS. O objetivo da proposta do PNPIC era ampliar as opções terapêuticas dos usuários do SUS (incluindo a Medicina Tradicional Chinesa, Acupuntura, Termalismo e Homeopatia), sendo que a Fitoterapia se destacou pela possibilidade de utilizar produtos e conhecimentos de origem nacional. Em 2011 foi lançado o 1º Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira [ANVISA, 2011] com a missão de fornecer formulações reconhecidas como oficiais que poderiam ser manipuladas para estabelecer um estoque mínimo em farmácias de manipulação e farmácias vivas. Nela constam 47 plantas medicinais, e algumas possíveis formulações. Aparecem, por exemplo, as duas espécies, M. glomerata e M, laevigata, com instruções para preparo de tintura exatamente na mesma proporção de folhas secas para solvente. Porém, estudos recentes mostraram que a quantidade do marcador (cumarina) varia de maneira expressiva entre estas duas espécies [Melo e Sawaya, 2015].
Em 2014 a ANVISA determinou a publicação do Guia de orientação para registro de Medicamento Fitoterápico e registro de notificação de Produto Tradicional Fitoterápico, desta forma criou-se uma nova classificação, conhecida como Produto Tradicional Fitoterápico. Nela encontram-se os extratos vegetais de uso tradicional e com efeitos comprovados no país. Logo, se a indústria escolher por registrar um produto nesta nova categoria, poderá considerar apenas o seu uso tradicional como critério de eficácia, ou seja, não será mais necessária a realização de
estudo clínico. Desde que, seja comprovado o uso seguro e efetivo da planta por um período mínimo de 30 anos.
Além dos estudos realizados pelo PPPM-CEME, vários ouros estudos avaliaram as atividades anti-inflamatórias e analgésicas da M. glomerata. O extrato aquoso desta espécie apresentou atividade analgésica e anti-inflamatória [Rupelt et al., 1991], inibiu o efeito de veneno de algumas espécies de cobra [Floriano et al., 2009; Maiorano et al., 2005], mas não todas [de Paula et al., 2010]. Para avaliar o efeito antialérgico do extrato etanólico de M. glomerata, este foi fracionado e a atividade das frações comparadas com o extrato inicial e com cumarina pura. A fração mais rica em cumarina, bem como o padrão puro, apresentou efeito menor que o extrato inicial, indicando que a cumarina não seria a única substância responsável por essa atividade [Fierro et al., 1999]. Apesar disso, a cumarina, ainda é considerada o único marcador químico para a espécie. Estudos da atividade bronco dilatadora do extrato de M. glomerata apresentaram um resultado similar, indicando que esta atividade era causada por cumarina e também outras substâncias [Moura et al.,2002 ]. Uma fraca atividade antibacteriana também foi observada [Holetz et al., 2002; do Amaral et al., 2003].
O ácido clorogênico, outra substância importante encontrada em M. glomerata [Melo e Sawaya, 2015] tem seu efeito terapêutico relacionado com a sua propriedade antioxidante, sendo muito utilizado como: anti-inflamatório, anti-hipertensivo e antidiabético. [Kempf et al., 2010; Watanabe et al., 2006].
Extratos de M. laevigata também apresentaram atividade anti-inflamatória [Suyenaga at al., 2002; Alves et al., 2009], relaxando a traqueia [Graça et al., 2007] e atividade antiulcerogênica [Bighetti et al., 2005]; estes dois últimos efeitos foram correlacionados com a presença de cumarina. Estudos comparativos indicaram que o efeito protetor do pulmão, avaliado nos extratos de ambas as espécies, pode ocorrer por mecanismos diferentes nas duas espécies [Freitas et al., 2008]
2.2 Composição dos extratos e rota biossintética de dois componentes: cumarina
e ácido clorogênico.
Vários estudos encontrados na literatura se referem ao material vegetal pelo nome popular de guaco, sem especificar a espécie. Notamos que, em diversos artigos e documentos, não há um consenso sobre a espécie a ser usada, nem se há paridade entre as espécies relativas às concentrações necessárias para seu uso correto. Nota-se, porém, que as duas espécies são usadas intercambiavelmente, inclusive pela população [ANVISA, 2011].
Todos os estudos que apresentaram a composição de somente uma espécie, ou que apenas indicaram o nome popular, nos fornecem apenas informações parciais. Resta sempre a dúvida se as duas espécies apresentam composição e teores parecidos.
A revisão mais recente [Gaspareto et al., 2010] relata um bom número de substâncias já identificadas nestas espécies, mas mostra a quase completa inexistência de estudos comparativos entre as 2 espécies. O fato de uma substância ter sido reportada em uma espécie e não em outra, não é definitivo, pois frequentemente os estudos usaram métodos diferentes. Santos et al.(2006) relataram que o extrato de M. glomerata tinha aproximadamente o dobro de cumarina do extrato de M. laevigata, e que o processo de liofilização afetou a composição e atividade dos extratos. Bolina et al. (2009) compararam o teor de cumarina em extratos das duas espécies por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e concluíram que, embora a
M. laevigata tenha apresentado maior teor de cumarina (0,43%) que a M. glomerata (0,30%), as
duas poderiam ser usadas indistintamente; outras substâncias não foram identificadas. Já Bertolucci et al. (2009) também pesquisaram outras substâncias por HPLC, observando a presença de terpenos como o ácido caurenóico, benzoilgrandiflórico e cinamoilgrandiflórico em proporções diferentes em ambas espécies, mas a ausência de ácido o-cumárico e de cumarina em M. glomerata e 0,30% de cumarina em M. laevigata. Os autores concluíram que havia
marcantes diferenças na composição dos extratos das duas espécies, o que contrasta com o estudo de Bolina et al. (2009). Estudos preliminares desenvolvidos por Melo e Sawaya (2015) também indicam uma marcante diferença na composição dos extratos das duas espécies, com baixos teores de cumarina em M. glomerata.
Estas incongruências entre os resultados de diversos estudos sobre as duas principais espécies de guaco, M. laevigata e M. glomerata, podem ser o resultado de erros na identificação botânica das amostras, variabilidade genética das espécies com diferentes quimiotipos, diferenças nas condições de cultivo, diferenças no modo de secagem e extração. Diferenças na composição química das plantas medicinais devido à época do ano em que é feita a coleta também devem ser consideradas.
Os princípios ativos de plantas medicinais são produtos do metabolismo secundário, cuja composição e teores sabidamente variam de acordo com fatores intrínsecos e extrínsecos [Gobbo-Neto e Lopes, 2007]. As plantas com desenvolvimento rápido (como as Mikanias) tendem a ter uma concentração maior de metabólitos secundários. Para a utilização de plantas para fins medicinais é fundamental saber como os teores dos princípios ativos podem variar e, portanto, influenciar na atividade terapêutica dos fitoterápicos nos pacientes.
Via de biossíntese da cumarina e ácido clorogênico
A biossíntese da cumarina ocorre pela via do ácido o-cumárico [Gestetner & Conn, 1974]. Após a formação do ácido cinâmico, pela enzima fenilalanina amônia-liase (PAL), ele é então
orthidroxilado pela ação da enzima cinamato 2-hidroxilase (C2H) produzindo o ácido
o-cumárico. Em seguida, este ácido é então glicosilado e passa por uma isomerização cis-trans da dupla ligação da cadeia lateral [Kosuge & Conn, 1961] e a formação da cumarina se dá por lactonização espontânea [Dewick, 1997].
Para biossíntese do acido clorogênico, a primeira reação é a desaminação do aminoácido fenilalanina, por essa enzima, gerando o ácido trans-cinâmico. Esse ácido é então
para-hidroxilado pela enzima cinamato 4-hidroxilase (C4H) para produzir o ácido p-coumárico, que é ativado pelo tio éster CoA correspondente, pela enzima 4-coumarato CoA ligase (4CL), resultando no ρ-coumaroil CoA, seguido da hidroxilação do coumaroil pela enzima C3’H, formando o ácido clorogênico [Schilmiller et al., 2009].
Os núcleos benzo-2-pirona comuns na biossíntese da cumarina e do ácido clorogênico derivam do esqueleto fenilacrílico do ácido cinâmico.
N H2 O OH O OH OH O OH
Fenilalamina Ácido cinâmico Ácido o- cumárico
O OH O H O OH OH O O H SH O O O H OH O H O OH O O OH OH
Figura 1. Rota biossintética da cumarina e do ácido clorogênico.
NH2 PAL Fenilanina amônia liase C2H Glicose
Β-D-glicosideo do ácido cumárico
Cumarina
Lactonização espontânea Ácido p-cumárico CoA P-cumaril quinatoÁcido clorogênico
C3H C4H C4Cl P-cumaril CoA HCT 2 coumaratoA produção de metabólitos secundários é o reflexo da interação química entre a planta e fatores ambientais, desta forma, como já foi citado por Gobbo-Neto e Lopes (2007), a síntese é frequentemente afetada pelas condições ambientais tais como:
Nutrientes: a deficiência de nutrientes como carbono e nitrogênio no solo, pode levar a uma menor taxa de desenvolvimento da planta.
Chuva: que afeta diretamente o processo de fotossíntese, a mobilização de reservas e o crescimento.
Temperatura do ar e do solo: talvez estes sejam os fatores de maior influência sobre a produção de metabólitos secundários, uma vez que, está diretamente relacionado com o desenvolvimento da planta.
Altitude: muitas vezes em maiores altitudes as plantas ficam mais susceptíveis a exposição da radiação ultravioleta.
Índice de radiação ultravioleta: os compostos fenólicos possuem a função de protegerem as plantas contra a foto destruição, estando presentes em maior quantidade quando a incidência de luz é maior (Waterman, Mole, 1994; Tatini et al , 2004).
Poluição atmosférica: pode alterar o metabolismo de alguns derivados fenólicos devido ao aumento nos teores de O3 e CO2.
Ciclo dia - noite: podem ocorrer variações circadianas, principalmente em óleos voláteis.
Ataque de patógenos ou indução por estimulo mecânico: as plantas tendem a produzir mais de alguns metabólitos em resposta ao ataque sofrido como forma de defesa.
Todos estes fatores citados, muitas vezes podem influir em conjunto no metabolismo secundário das plantas, não atuando isoladamente [Gobbo-Neto e Lopes, 2007]. Para as plantas cujo estudo é realizado no campo devemos ainda considerar as alterações que ocorrem devido ao metabolismo primário (por exemplo, as alterações hormonais) e devem ser consideradas em conjunto.
Para evitar que as variações genéticas entre as plantas da mesma espécie afetem os resultados, foram usadas plantas identificadas destas espécies e que cresceram no campo experimental do Instituto de Biologia da Unicamp.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Acompanhar a variação dos metabólitos secundários de duas espécies de plantas medicinais conhecidas popularmente como guaco: Mikania glomerata Sprenguel e Mikania
laevigata Schultz, ao longo de um ano.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Comparar a composição de extratos hidroalcoólicos e aquosos de folhas de Mikania
laevigata e Mikania glomerata coletadas mensalmente.
Comparar as variações mensais de metabólitos secundários nas duas espécies.
Determinar as concentrações de cumarina e ácido clorogênico nos extratos de folhas de
Mikania laevigata e Mikania glomerata coletadas mensalmente.
Avaliar a relação das variações observadas nos metabolitos secundários com a temperatura do ar e chuva na região.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Equipamentos
٭ Liofilizador Liotop®modelo L1O1
٭ Banho ultrassônico Unique®
USC1400 ٭ Balança analítica Marte modelo AM 550
٭ Balança semi-analítica BEL Enginnering®modelo Mark 500
٭Cromatógrafo a Líquido de Ultra-Alta Eficiência - UPLC - TQD Acquity (Waters - USA) acoplado a Espectrômetro de massas TQD ESI Acquity (Waters - USA)
4.2 Reagentes e solventes
٭Álcool etílico grau PA (Ecibra ®)
٭Ácido fórmico 85% grau PA (Synth ®)
٭Acetonitrila grau HPLC (J.T. Baker ®)
٭Padrão de cumarina (Sigma Aldrich ®)
٭Padrão de ácido clorogênico (Sigma Aldrich ®)
4.3 Material vegetal:
Matrizes de plantas adultas de guaco, das espécies Mikania glomerata e Mikania laevigata, obtidas do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da Unicamp – CPQBA – Unicamp (Paulínia – SP), foram adaptadas e cresceram no campo experimental do Instituto de Biologia, UNICAMP. Suas exsicatas estão depositadas no herbário da Universidade Estadual de Campinas sob egistro nº 102046 para a M. laevigata e nº 102047 para a M.
glomerata.
Figura 2. Plantas adultas de guaco das espécies Mikania glomerata (A) e Mikania laevigata (B) cultivadas no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP.
Amostras das folhas foram coletadas de manhã entre 08:00 e 9:00, no meio do dia entre 12:00 e 13:00 e a tarde entre 15:30 e 16:30 em um mesmo dia do mês. Este procedimento foi repetido mensalmente entre os meses de dezembro de 2012 e novembro de 2013. As folhas das duas espécies de guaco coletadas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e mantidas em freezer a -80°C.
4.4 Liofilização e obtenção dos extratos aquosos e hidroalcoólicos
O processo de secagem das folhas foi realizado com estas ainda congeladas, em liofilizador por 50 horas, como já foi realizado no estudo realizado por Melo (2015) e apontou não interferir no teor de metabolitos encontrados. Posteriormente, as mesmas foram trituradas em gral de porcelana e tamisadas a fim de se obter a droga vegetal com granulometria inferior a 0,84 mm, sendo esta utilizada para o preparo dos extratos.
Avaliamos os extratos hidroalcoólicos das folhas por ser a extração preconizada nos compêndios oficiais [ANVISA, 2011]. Desta forma, 1g das folhas pulverizadas foi extraído com 10 mL de uma solução de com etanol 70% em banho de ultrassom por 30 minutos e filtradas. Depois de preparados os extratos hidroalcoólicos estes foram diluídos em água purificada milli-Q na proporção 1:2 extrato-água.
Os extratos aquosos foram obtidos mantendo 1 g de folhas pulverizadas em infusão com 10 mL de água purificada milli-Q aquecida a 60°C em banho de ultrassom por 30 minutos e filtradas. Depois de preparados os extratos aquosos foram diretamente injetados para serem analisados por UPLC-MS.
4.5 Análise dos extratos por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (UHPLC-MS)
Uma alíquota de 2µL de cada extrato foi analisada por cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas triplo-quadrupolar TQD Acquity (Waters - USA). Utilizou-se uma coluna C18 (50 mm x 2,1mm x1,7µm). A detecção foi feita por um espectrômetro de massas (TQD-Acquity da Waters) com fonte de ionização por eletrospray (ESI), realizando varredura em modo positivo e modo negativo nas seguintes condições: capilar de ± 3000 V, cone de ± 35 V, extrator de 1,0 V, temperatura da fonte de 150 °C e temperatura de dessolvatação de 300 °C. As análises UHPLC-MS adquiridas em modo de varredura, entre m/z 100 a 1000, em modo positivo e negativo, obtendo assim o perfil cromatográfico da composição do extrato. Os cromatogramas resultantes foram comparados entre si para determinar a relação
massa/carga (m/z) dos principais íons e picos encontrados nos cromatogramas das amostras, seguida da extração das áreas dos picos e finalmente a fragmentação (MS-MS) dos principais íons marcadores. As injeções de cada amostra foram feitas em duplicata.
Como os extratos trabalhados aqui possuem moléculas em solução que são compatíveis com os solventes mais frequentemente usados em HPLC por fase reversa (metanol, água e acetonitrila), a ionização por ESI foi escolhido neste estudo pode ser usada como interface entre separações por HPLC ou UHPLC e identificação dos compostos por espectrometria de massas simples (MS) ou sequencial (MS/MS). Para analisar moléculas [M] com sítios básicos como a cumarina foi adicionado 0,1 % de ácido fórmico na solução facilitando a protonação do analito, formando íons [M + H]+ e sua análise foi feita em modo positivo. Para moléculas contendo sítios ácidos como o ácido clorogênico ocorreu a perda de um próton da molécula, formando [M - H]- e análise foi feita em modo negativo [Sawaya, 2006].
4.6 Análises do teor de cumarina e ácido clorogênico
A validação do método desenvolvido para a quantificação da cumarina e do ácido clorogênico foi realizado com base nos critérios da RE n° 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA e já havia sido realizada por Melo e Sawaya (2015).
Após a avaliação qualitativa inicial dos extratos preparados (extrato aquoso e hidroalcoólico), o teor da cumarina foi quantificado, comparando a área dos picos encontrados com uma curva de calibração construída a partir da diluição seriada de uma solução estoque dos padrões, preparadas na concentração de 1 mg.mL-1 ( diluições de 1 μg.mL-1 a 100 μg.mL-1) em solução do extrato isento dos analitos de interesse. A quantificação foi feita comparando a média da área (n=3) dos picos dos íons com uma curva de calibração (R2=0,9908) para a cumarina e com uma curva de calibração (R²=0,9863) para o ácido clorogênico.
4.7 Estatística
O tratamento estatístico foi realizado para as áreas de picos encontrados por UHPLC-MS em modo TIC nos cromatogramas dos extratos aquosos e dos extratos hidroalcoólicos de ambas as espécies.
Os dados resultantes das áreas dos picos dos principais íons foram agrupados e tabulados de diferentes formas no programa Microsoft Office Excel 2010, obtendo gráficos para visualizar se houve variação ao longo dos meses na composição dos extratos aquosos e hidroalcoólicos. Ainda foi calculada a média (n=3) e o erro padrão da área de cada um dos íons principais.
Foi realizada uma análise multivariada PCA, com o software The Unscrambler 10.2, com todas as áreas geradas pelos picos resultantes dos principais íons obtidos pelos cromatogramas. Os dados encontrados foram previamente autoescalados e normalizados pelas médias para que pudéssemos padronizá-los.
Para complementar os resultados, os dados obtidos da área do pico do íon por UHPLC-MS foram submetidos à análise de variância (ANOVA), sendo cada média obtida de três coletas realizadas em três horários de um mesmo dia, uma vez ao mês Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e foram comparados pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade (p < 0,05).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Condições ambientais durante o período estudado:
Segundo a classificação de Köppen, o clima na região de Campinas é do tipo Cfa, ou seja, clima temperado subtropical, com as estações de inverno e verão bem definidas e chuvas distribuídas durante todo ano com intensidade maior nos meses de verão [Peel, Finlayson, McMahon, 2007].
A Figura 3 mostra que no período de realização das coletas, de dezembro de 2012 a novembro de 2013, houve períodos chuvosos durante todos os meses do ano, sendo que, os meses com maiores volumes de chuva foram dezembro 2012 com 153 mm, março com 362 mm, janeiro com 220 mm O mês mais seco foi maio com 5 mm de precipitação. Quanto ao regime térmico, o mês com maior temperatura média foi dezembro com 31°C, cujo valor máximo chegou a 37°C. O mês de menor temperatura média foi julho com temperatura média de 20°C e o valor mínimo do período foi registrado no mês de agosto (6,5°C).
Deste modo, vemos que, em geral, a temperatura e regime de chuvas durante o período avaliado se encaixaram na classificação. Porem nos dias de coleta em fevereiro e março as temperaturas médias foram de 25°C, sendo que em maio a temperatura média no dia da coleta foi de 27°C, ou seja maior que no verão. Portanto as condições climáticas em certos dias nem sempre seguem o padrão da classificação de Köppen.
Figura 3. Temperatura do ar em °C (A) e acumulado de chuva em mm (B). Dados obtidos do
Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas a Agricultura (CEPAGRI) Unicamp, de dezembro de 2012 a novembro de 2013.
Os extratos aquosos e hidroalcoólicos obtidos a partir das folhas de M. glomerata e M.
laevigata foram analisados através de UHPLC-MS, com ionização em eletrospray (ESI) com
varredura em modo positivo e negativo e foram obtidos os cromatogramas abaixo.
Comparando os cromatogramas da Figura 4 podemos notar que o perfil cromatográfico (UHPLC-MS) dos extratos aquosos e hidroalcoólicos obtidos em modo positivo e negativo das folhas de M. glomerata e de M. laevigata não apresenta semelhança entre as espécies.
Figura 4. Cromatogramas (UHPLC-MS) dos extratos aquosos e hidroalcoólicos das folhas de M. laevigata e M. glomerata coletadas no mês de dezembro de 2012, obtidos em modo positivo e
negativo.
Extrato Aquoso de M. laevigata em modo -
Extrato Hidroalcoólico de M. glomerata em modo + Extrato Hidroalcoólico de M. laevigata em modo +
Extrato Hidroalcoólico de M. glomerata em modo - Extrato Hidroalcoólico de M. laevigata em modo -
Extrato Aquoso de M. glomerata em modo + Extrato Aquoso de M. laevigata em modo +
Extrato Aquoso de M. glomerata em modo -
Cumarina
A cumarina (m/z 147, tempo de retenção 3.8 min) é o principal pico observado no cromatograma UHPLC-MS (modo positivo) do extrato aquoso e hidroalcoólico de M. laevigata (Figura 4). Considerada marcador químico destas espécies, a cumarina foi claramente encontrada nos extratos aquosos e hidroalcoólicos de M. laevigata, confirmando a presença de cumarina em grande abundância nesta espécie, como já citado por Melo e Sawaya (2015). Já nos extratos da M. glomerata, este íon não se distinguia do ruído, portanto estava em baixa concentração ou ausente nestes extratos.
Na Figura 5 observamos uma análise de componentes principais de todas as corridas cromatográficas realizadas. Este estudo foi feito em uma tabela com todas as áreas geradas pelos picos resultantes dos principais íons obtidos pelos cromatogramas e permite observar a variação de metabólitos secundários encontrados nas duas espécies de guaco estudadas aqui. A maior diferença é observada entre as duas espécies (Fig. 5A) e essa diferença está relacionada principalmente a presença de cumarina (m/z 147) em grande quantidade na M.
laevigata (Fig. 5B). As amostras de M. glomerata foram divididas em dois grupos de acordo com
o solvente extrator, mostrando a maior eficiência do solvente hidroalcoólico.
Figura 5. Análise dos componentes principais dos íons encontrados nos extratos aquosos e
hidroalcoólicos das folhas de M laevigata e M. glomerata. (A) Amostras vermelhas (extrato hidroalcoólico de M. glomerata); laranja (extrato aquoso de M. glomerata), azul (extrato aquoso de M. laevigata) e verde (extrato hidroalcoólico de M. laevigata) (B) loadings ou íons e seus tempos de retenção.
B A
Os principais picos e seus respectivos íons foram selecionados. Desta forma, foi possível identificar alguns compostos que já são conhecidos nas duas espécies, por comparação com padrões ou dados da literatura, como mostram as tabelas 1 e 2.
Tabela1: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos aquosos das duas
espécies de guaco.
Compostos marcados por * não foram detectados
Estrutura Química Referências
mz / tr (modo) Composto M. glomerata M. laevigata
147/3,84 (+) Cumarina * Detectado
Alves et al., 2009 , Biavatti et al., 2004 , Bighetti 2005 , FB04, Fernandes and Vargas 2003, Ferreira and Oliveira 2010, Muceneeki et al., 2009- , Pedroso 2007-, Rufatto et al., 2013, Yatsuda et al., 2005,
325/2,51 (-) Cis ou Trans melilotosídeo * Detectado Ferreira ; Oliveirra 2010
133/0,81 (-) Ácido Málico Dectectado Detectado
163/3,48 (-) Ácido o ou p cumárico * Detectado
Braz 2012, Peregrino and Leitão, 2005 , Taleb contini -2006, Veneziani and Oliveira., 1999 Muceneeki et al., 2009, Pedroso 2007, Rufatto et al., 2013.
Compostos Encontrados no Extrato Aquoso
O O OH O O O OH OH O H OH O OH OH O OH O H OH O
Tabela 2: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos hidroalcoólicos das duas espécies de guaco.
Compostos marcados por * não foram detectados
Estrutura Química Referências mz / tr (modo) Composto M. glomerata M. laevigata
147/3,84 (+) Cumarina Detectado Detectado
Alves et al., 2009 , Biavatti et al., 2004 , Bighetti 2005 , FB04, Fernandes and Vargas 2003, Ferreira and Oliveira 2010, Muceneeki et al., 2009- , Pedroso 2007-, Rufatto et al., 2013, Yatsuda et al., 2005,
325/2,51 (-) Cis ou Trans melilotosídeo * Detectado Ferreira ; Oliveirra 2010
133/0,81 (-) Ácido Málico Dectectado Detectado
163/3,48 (-) Ácido o ou p cumárico * Detectado
Braz 2012, Peregrino and Leitão, 2005 , Taleb contini -2006, Veneziani and Oliveira., 1999 Muceneeki et al., 2009, Pedroso 2007, Rufatto et al., 2013.
353/3,36 (-) Ácido clorogênico Detectado Detectado da Silva , 2006.
121/3,60 (-) p hidroxibenzaldeido * Detectado Ferreira; Oliveira, 2010
515/3,35 (-) Ácido dicafeoilquínico Detectado *
Compostos Encontrados no Extrato Hidroalcoólico
O O OH O O O OH OH O H OH O OH OH O OH O H OH O H O OH O O OH OH OH O H O H OH O O H O H O O O H OH O O OH O O H O H
5.2 Variação diária dos íons
Para as duas espécies, nos extratos aquosos e hidroalcoólicos, não houve diferença significativa nos picos dos principais íons m/z encontrados em três diferentes horários de um mesmo dia (ver anexo I, figuras 1 a 8). Deste modo as amostras obtidas nos três períodos do mesmo dia foram usadas como replicatas biológicas (n=3) para fins estatísticos em todas as análises.
5.3 Variação mensal de cumarina m/z 147 e ácido clorogênico m/z 353
Considerando que a cumarina é o marcador químico das duas espécies de guaco aqui estudadas [ANVISA, 2011] e os ácidos cafeoilquínicos, dentro destes o ácido clorogênico, são os principais compostos encontrados em M. glomerata [Melo e Sawaya, 2015]. Estes foram avaliados separadamente nos extratos aquosos e hidroalcoólicos das duas espécies.
5.4 Cumarina
O estudo permitiu compararmos a variação mensal das médias das áreas dos picos encontrados do íon m/z 147 – cumarina, nas duas espécies de guaco. Na análise dos dados, foi aplicado o Teste de Tukey e considerados como significativas diferenças de p<0,05. As médias marcadas na Figura 6 pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Podemos notar que o teor de cumarina (expressos como áreas dos picos nos cromatogramas) nos extratos hidroalcoólicos das duas espécies estudadas variam significativamente entre espécies, como já foi observado anteriormente por Melo (2015). As espécies foram marcadas por bolas (M.
laevigata) e quadrados (M. glomerata), desta forma nota-se que a espécie Mikania laevigata
possui maior teor de cumarina que a Mikania glomerata durante todo o ano.
Nota-se ainda que dentro da mesma espécie (representados pelas letras maiúsculas A-D) o teste não demonstrou haver variação mensal significativa no teor de cumarina para M.
glomerata, ou seja, o mês em que foi realizada a coleta não interferiu no teor de cumarina
encontrado no extrato hidroalcoólico. Já para M. laevigata, o teste aplicado indicou haver diferenças significativa entre os teores de cumarina encontrados em diversos meses do ano. Podemos ver que nos meses de novembro, dezembro e janeiro as áreas encontradas eram semelhantes entre si (meses marcados com a letra D), porém, reduzem de forma significativa dos meses de fevereiro, abril, maio e junho (A). Já o teor de cumarina encontrada nos meses de março, agosto (mês de floração) e setembro não apresentaram diferenças significativas quando comparados entre si e nem quando comparados com os outros meses.
Figura 6. Variação mensal das áreas dos picos referentes ao íon m/z 147 – cumarina, no extrato
hidroalcoólico das duas espécies de guaco. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade) dentro da mesma espécie. Resultados expressos em média e erro padrão.
Conforme foi mostrado na figura 4 a cumarina foi o principal pico observado no cromatograma do extrato aquoso de M. laevigata. Já nos extrato aquosos de M. glomerata, este íon não se distinguia do ruído, portanto, estava em baixa concentração ou ausente neste extrato. Desta forma não foi possível quantificá-lo e nem analisar variações mensais significativas.
A cumarina no extrato aquoso de M. laevigata apresentou variações significativas com p< 0,05 entre o mês de fevereiro (maior pico) e os meses de outubro e novembro (menor pico) como podemos ver na Figura 7. O extrato aquoso obtido mês de fevereiro apresentou a maior área correspondente à cumarina do ano, da mesma forma que o extrato etanólico obtido no mesmo mês.
Figura 7. Variação mensal de cumarina no extrato aquoso de M. laevigata. As médias marcadas
pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão.
Após a avaliação qualitativa inicial dos extratos preparados (extrato aquoso e hidroalcoólico), o teor da cumarina foi quantificado, comparando a área dos picos encontrados
com uma curva de calibração construída a partir da diluição seriada de uma solução estoque dos padrões, preparadas na concentração de 1 mg.mL-1 ( diluições de 1 μg.mL-1 a 100 μg.mL-1) em solução do extrato isento dos analitos de interesse. A quantificação foi feita comparando a área dos picos com uma curva de calibração (R2=0,9908), conforme mostrado na tabela 3.
Tabela 3: Teor de cumarina em µg/ml encontrado nos extratos das duas espécies de guaco.
A tabela 3mostra presença de cumarina em menor quantidade no extrato hidroalcoólico de
M. glomerata, o que confirma a diferença entre as duas espécies estudadas aqui. Confirma
também a maior solubilidade da cumarina em extratos hidroalcoólicos, onde podemos observa que o teor de cumarina encontrado em M. laevigata em todos os meses mostrou-se significativamente maior quando comparado com o extrato aquoso, confirmando novamente a maior solubilidade de cumarina no solvente hidroalcoólico.
Como no extrato hidroalcoólico de M. laevigata, foi observada variação significativa do teor de cumarina (p<0,05) entre diversos meses (Figura 6); foi efetuado um estudo para verificar a influência de fatores climáticos (Figura 8) no teor de cumarina desta espécie, sendo eles: temperatura média do ar no dia da coleta, e índice pluviométrico no mês da coleta.
Pode-se notar que no extrato aquoso e principalmente do extrato hidroalcoólico de M.
laevigata ficou nítido que a época de coleta das folhas de guaco influenciou no teor de cumarina
encontrado nas folhas desta espécie. Ao correlacionarmos com alguns fatores climáticos nota-se que as folhas coletadas no período de inverno e em meses que ocasionalmente foram mais frios como, por exemplo, fevereiro e maio, houve um maior teor de cumarina, demonstrando influencia da temperatura média no dia da coleta com o teor de cumarina. Estes dados vem de encontro com o estudo realizado por Pereira et al (2000), onde também foi observado maior rendimento de cumarina nos meses mais frios, com condições climáticas semelhantes às de Campinas, SP com temperaturas mais baixas e sem a presença de chuva.
Dez Jan Fev Mar Abr Maio Jun Jul Ago Set Out Nov
179 173 305 164 234 188 233 204 211 227 162 164
300 283 823 580 708 738 753 656 552 507 291 393
56 58 61 59 55 58 55 55 57 55 58 57
Extrato Hidroalcoólico de M. glomerata
Teor de Cumarina µg/ml
Extrato / Espécie
Extrato Aquoso de M. laevigata Extrato Hidroalcoólico de M. laevigata
Figura 8. Relação entre temperatura média do ar no dia da coleta e teor de cumarina (μg / mL)
encontrados no extrato hidroalcoólico (A) e aquoso de Mikania laevigata (B) no período de dezembro de 2012 a novembro de 2013.
Embora no extrato aquoso tenha se observado a influência da temperatura sobre o teor de cumarina, notamos que no extrato hidroalcoólico essa influência foi mais nítida, pois a água tende a extrair componentes com polaridade mais alta e menor teor de cumarina. Para o extrato hidroalcoólico de M. glomerata não foi feita a correlação entre as variáveis porque nesta espécie, não houve diferença significativa mensal.
5.5 Ácido clorogênico
A Figura 9 mostra a variação mensal das médias das áreas dos picos encontrados do íon
m/z 353 – ácido clorogênico, nos extratos hidroalcoólicos das duas espécies de guaco. Na
análise dos dados, foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade (p <0,05). As médias (n=3) marcadas pela mesma letra dentro da mesma espécie não diferem estatisticamente entre si, podemos notar que entre as duas espécies estudadas há variação significativa na área do pico encontrado de ácido clorogênico; mostrando que a espécie Mikania
laevigata possui menor teor de ácido clorogênico quando comparada a Mikania glomerata.
Percebe-se também que dentro da mesma espécie não houve diferenças significativa entre extratos das folhas de M. laevigata, ou seja, o mês em que foi realizada a coleta não interferiu no teor de ácido clorogênico encontrado. Já na M. glomerata, o teste aplicado indicou uma variação significativa entre os meses do ano. Podemos ver que, no mês de julho, que também foi o mês mais frio e ainda ocorreu floração, houve redução significativa da média da área do pico deste íon. O teste apontou variação significativa entre o mês de julho e os meses de janeiro, março, junho, agosto e setembro, apresentando (p<0,05).
Figura 9. Variação mensal de ácido clorogênico no extrato hidroalcoólico de M. glomerata e M. laevigata. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de
Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão.
Após a avaliação qualitativa inicial dos extratos preparados (extrato aquoso e hidroalcoólico), o teor da cumarina foi quantificado, comparando a área dos picos encontrados
com uma curva de calibração construída a partir da diluição seriada de uma solução estoque dos padrões, preparadas na concentração de 1 mg.mL-1 ( diluições de 1 μg.mL-1 a 100 μg.mL-1) em solução do extrato isento dos analitos de interesse. A quantificação foi feita comparando a área dos picos com uma curva de calibração (R2=0,9863), obtendo-se os teores da tabela 4.
Tabela 4: Teor de ácido clorogênico em µg/ml encontrado no extrato hidroalcoólico de M.
glomerata.
A tabela 4 mostra o teor de ácido clorogênico encontrados nos extratos hidroalcoólicos de
M. glomerata. Nota-se que este ácido está claramente presente nesta espécie. Já na outra
espécie estudada aqui, M. laevigata, apesar de detectados em algumas amostras, o mesmo estava em quantidades muito baixas ou fora do limite de detecção e não foi possível a sua quantificação.
Foram obtidas informações climáticas de temperatura e precipitação em Campinas durante o período, porém, o ácido clorogênico não apresentou correlação com estes dois fatores. Não foi possível obter dados sobre a radiação incidente, apesar da radiação incidente em determinadas épocas do ano poder influenciar o teor de ácido clorogênico. Segundo Waterman e Mole (1994) a rota biossintética dos fenilpropanoides é influenciada pela luz e desta forma induzindo as enzimas evolvidas na rota de sua biossíntese. Portanto compostos como o ácido clorogênico são produzidos na planta com a finalidade de protegê-la da foto destruição, uma vez que, estes compostos são capazes de absorver e ou dissipar a energia solar, agindo como uma barreira para se evitar danos nos tecidos interno, ou seja, como um filtro UVB (Waterman, Mole 1994; Tatini et al, 2004).
Dez Jan Fev Mar Abr Maio Jun Jul Ago Set Out Nov
253 453 346 534 162 385 483 86 416 422 235 341
Teor de ácido clorogênico µg/ml
Extrato / Espécie5.6 Variações mensais de outros íons nos extratos de M. glomerata
5.6.1 Extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo
positivo
Ao analisarmos os principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata por UHPLC-MS em modo positivo, notamos que em alguns íons ocorre variação mensal, apresentando diferenças significativas (p<0,05) na área dos picos encontrados entre alguns meses, como ocorre com os íons 291, 381, 219, 294, 190, 474 e 369. Já os íons m/z 350 e 412 não apresentaram variação significativa, dados apesentados na Figura 10.
Figura 10. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata
em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão.
Para os íons que apresentaram variações significativas nas áreas em diversos meses foi avaliado se havia correlação entre a área dos picos com a temperatura média do ar no dia da coleta ou com o volume de chuva no mês. As relações estão expressas na Figura 11. O íon m/z 190 apresentou correlação positiva entre a temperatura do ar e área do íon encontrada, ou seja, a área do pico do íon obtido por UHPLC aumenta conforme o aumento da temperatura média. Já o íon m/z 382 apresenta uma correlação negativa, onde a área do pico do íon encontrado tende a diminuir com o aumento da temperatura média do ar. Dos íons encontrados no modo positivo o único que apresentou correlação com a chuva foi o m/z 474 que tende a aumentar a área do pico do íon em meses mais chuvosos.
Figura 11. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta e a área do pico do íon m/z
190 (A) e m/z 381 (B), e a relação entre o acumulado de chuva no mês da coleta no período de dezembro de 2012 a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 474 (C), encontrados no extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.
Ár ea do pic o do íon Ár ea do pic o do íon Ár ea do pic o do íon
5.6.2 Extrato Aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo
A figura 12 mostra que nos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata ocorrem variações mensais significativas com p<0,05 ao longo do ano.Figura 12. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão.
Para os íons que apresentaram variações significativas nas áreas em diversos meses foi avaliado se havia correlação entre a área dos picos com a temperatura média do ar no dia da coleta ou com o volume de chuva no mês. Em nenhum destes íons houve uma correlação nítida com estes dois fatores ambientais, quando avaliados isoladamente. Neste caso a correlação com fatores ambientais podem estar ocorrendo com mais de um fator ao mesmo tempo e ainda devemos considerar as alterações endógenas ocorridas nas plantas em determinadas épocas.
5.6.3
Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivoA Figura 13 apresenta como os principais íons encontrados em modo positivo no extrato hidroalcoólico de M. glomerata variam mensalmente ao longo do ano. Nota-se que dentre os íons selecionados o único que não apresentou variação significativa mensal foi a cumarina como já foi discutida anteriormente. Os demais íons apresentaram diferenças significativas p<0,05 entre os meses do período estudado.
Figura 13. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem
estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão.
Os íons que apresentaram diferenças significativas (p<0,05) nas áreas dos picos mensais foram comparados com as variáveis climatológicas de chuva e temperatura no período da coleta, como mostra a Figura 14. Os íons que apresentaram correlações com variáveis climáticas estão apresentados a seguir.
O íon m/z 293 apresentou aumento significativo na área média do pico encontrado nos meses de junho, julho (mês de floração) e agosto de 2013, como mostram as Figuras 13 e 14. Na Figura 14 podemos ver que no período de inverno como temperaturas médias mais baixas no dia da coleta e que variaram de 21 a 24 oC, foram encontrados as maiores áreas médias do pico do íon. Nota-se que no mês mais quente, em dezembro de 2012 a temperatura média no dia da coleta foi de 31 oC, foi encontrado a menor área média do pico do íon m/z 293, sinalizando que a quantidade deste metabólito pode estar sendo influenciado pela temperatura do ar. Já os íons
m/z 287, 255, 302 e 177 apresentaram diminuição significativa nas áreas medias nos meses de
junho e julho, meses mais frios, mostrando que a temperatura no dia da coleta pode estar influenciando a área do pico do íon encontrado. Ou seja, nos meses com temperaturas medias mais baixas a área encontrada tende a ser menor que nos meses com temperaturas médias mais elevadas como mostra a Figura 14.
Figura 14. Relação entre temperatura do ar no dia da coleta de dezembro de 2012 a novembro
de 2013 e área do pico do íon m/z 293(A), 287( B), 302 (C), 255 (D) e 177 (E), encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.
Não houve correlação observada entre a área do pico dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata vistos em modo positivo com os volumes de chuva ocorridos ao longo do período estudado.
5.6.4 Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo
negativo
Nota-se na Figura 15 que no extrato hidroalcoólico de M. glomerata quando visto em modo negativo, todos os íons apresentam alguma diferença significativa (p<0,05) entre as médias mensais ao longo do ano.
Figura 15. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem
estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão.
Ao correlacionarmos a variabilidade identificada mensalmente nos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata em modo negativo com as variações climáticas ocorridas durante o período experimental (Figura 16) é possível notar que, o volume
