UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
CAROLINE LANDIM PEIXOTO
POTENCIAL ANTITROMBÓTICO DE HIDROLISADO ÁCIDO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Hypnea musciformis (Wulfen) J.V.
Lamouroux
FORTALEZA 2020
CAROLINE LANDIM PEIXOTO
POTENCIAL ANTITROMBÓTICO DE HIDROLISADO ÁCIDO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Hypnea musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de
MESTRE em Bioquímica. Área de
concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira.
FORTALEZA 2020
CAROLINE LANDIM PEIXOTO
POTENCIAL ANTITROMBÓTICO DE HIDROLISADO ÁCIDO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Hypnea musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Ticiana Monteiro Abreu
A Deus.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
À Universidade Federal do Ceará pela formação acadêmica e à Universidade de Fortaleza pela estrutura física.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira, por me receber em seu laboratório, pela excelente orientação e tempo investido em mim e em meu trabalho.
Aos membros do Laboratório F-66, Hyldécia, Rachel, Nayanne, Rogênio, Larissa e Bruna, pela amizade e pelos momentos de descontração no laboratório. Em especial ao George Meredite e o Diêgo Chagas por me ensinar tudo que sei dentro do laboratório.
A todos os professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, que me formaram como profissional e como ser humano. Por amarem sua profissão e por transmitir essa paixão em forma de ciência.
À coordenação do curso, pela orientação e apoio.
Aos meus amigos científicos, Marcus Rafael, Lia Pinho, Larissa Queiroz, Artur Hermano, Wallady Barroso, Ellivelton Lima, Raíssa Lima, pela experiência acadêmica, ajuda em todo tipo de assunto, conversas e saídas.
A minhas amigas Victória Holanda e Tayná Fiúza, pelas incontáveis horas de estudo, pela parceria nos meus projetos, viagens e festas, e por acreditarem em mim sempre.
Ao meu companheiro João Filho, por me amar e apoiar em todas as horas, por me incentivar a ser a melhor versão de mim, por estar sempre por perto e me acolher em seu abraço. Aos meus familiares, em especial meus pais, Jaqueline Landim e Álvaro Peixoto, por acreditarem em mim e nas minhas escolhas, por me incentivarem não desistir dos meus sonhos, minha avó Francisca Landim, pelo carinho e cuidado, aos meus irmãos, Catherine, Álvaro, Giulia e Guilherme e aos meus tios Danielly e Júlio César por estarem sempre presentes e pelos momentos de descontração, e finalmente ao meu afilhado querido Caio por me mostrar um amor que eu não sabia que existia.
“Onde não puderes amar, não te demores” Frida Kahlo
RESUMO
Trombose venosa é a maior causa de morbimortalidade atual, Estima-se que 2/1.000 indivíduos sofram de tal doença. Medicamentos antitrombóticos são comumente utilizados como medida profilática por quem tem predisposição a formação de trombos. Os antitrombóticos mais conhecidos e utilizados são a Heparina Não Fracionada (HNF) e a Heparina de Baixo Peso Molecular (HBPM), sendo a segunda obtida pela despolimerização da primeira. Por estes medicamentos terem origem animal e apresentarem efeitos colaterais graves como hemorragia, há a demanda para a descoberta de novas drogas antitrombóticas de origem não-animal e com reduzidos efeitos colaterais. É conhecido na literatura que polissacarídeos sulfatados de algas marinhas vermelhas apresentam atividade antitrombótica. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antitrombótico do produto da hidrólise ácida de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marinha vermelha Hypnea musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux. Foi realizado um delineamento de hidrólise afim de obter galactanas sulfatadas de diferentes pesos moleculares. O peso molecular do hidrolisado foi estimado por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) e caracterizado quanto a presença de sulfatação e grupos funcionais característicos por Infravermelho. Foram selecionadas 4 amostras de pesos moleculares distintos para investigar sua atividade antitrombótica, os EX 1, 5 e 7 e o polissacarídeo íntegro. A atividade antitrombótica in vitro foi analisada pelos testes de tempo de tromboplastina parcialmente ativado (TTPA) e tempo de protrombina (TP), ambos usando a HBPM CLEXANE ® como controle positivo. Apenas o PS-Hm íntegro e o EX 5 prolongaram o tempo de coagulação no TTPA, e nenhuma das amostras analisadas apresentou efeito no TP. Foi feito o teste de tempo de sangramento para avaliar a tendência hemorrágica com o PS-Hm íntegro e o EX 5, usando a HBPM CLEXANE ® como controle positivo. As amostras analisadas não tiveram diferença significativa em relação ao controle negativo e ambas as amostras apresentaram uma tendência hemorrágica muito inferior ao controle positivo. Os resultados apontam que a atividade antitrombótica e anticoagulante tem relação ao peso molecular do polissacarídeo sulfatado, e que a redução no peso molecular é capaz de reduzir a tendência hemorrágica. Tais resultados sugerem que as amostras são candidatas para a novas drogas antitrombóticas, contudo mais ensaios se fazem necessários para confirmar a atividade, como o modelo de trombose venosa em ratos.
Palavras-chave: Anticoagulantes. Hidrólise. Macroalgas. Metodologia de superfície de resposta. Polissacarídeos sulfatados.
ABSTRACT
Venous thrombosis is the main cause of current morbidity and mortality. It is estimated that 2 / 1,000 individuals suffer from this disease. Antithrombotic drugs are commonly used as a prophylactic measure by those who are predisposed to thrombus formation. The most well-known and used antithrombotics are Unfractionated Heparin (UFH) and Low Molecular Weight Heparin (LMWH), the second being obtained by depolymerizing the first. Because these drugs are produced in animals and have serious side effects such as hemorrhage, there is a demand for the discovery of new antithrombotic drugs of non-animal origin and with reduced side effects. It is known in the literature that sulfated polysaccharides from red marine algae have antithrombotic activity. This work aimed to evaluate the antithrombotic potential of the acid hydrolysis product of sulfated polysaccharides extracted from the red seaweed Hypnea musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux. A hydrolysis design was carried out to obtain sulfated galactans of different molecular weights. The molecular weight of the hydrolyzate was estimated by Gel Permeation Chromatography (GPC) and characterized by the presence of sulfation and functional groups characteristic by Infrared. Four samples of different molecular weights were selected to investigate their antithrombotic activity, the EX 1, 5 and 7 and the intact polysaccharide (PS-Hm). The in vitro antithrombotic activity was analyzed by the tests of partially activated thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (TP), both using LMWH CLEXANE ® as a positive control. Only the intact PS-Hm and the EX 5 prolonged the clotting time in the APTT, and none of the analyzed samples influenced the TP. The bleeding time test was performed to assess the bleeding tendency with intact PS-Hm and EX 5, using LMWH CLEXANE ® as a positive control. The analyzed samples had no significant difference in relation to the negative control and both samples showed a hemorrhagic tendency much lower than the positive control. The results indicate that the antithrombotic and anticoagulant activity is related to the molecular weight of the sulfated polysaccharide, and that the reduction in molecular weight can reduce the hemorrhagic tendency. Such results suggest that the samples are candidates for new antithrombotic drugs, however more tests are needed to confirm the activity, such as the model of venous thrombosis in rats.
Keywords: Anticoagulants. Hydrolysis. Macroalgae. Response surface methodology. Sulfated polysaccharides.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 − Modelo clássico da cascata de coagulação. Este modelo representa a sequência ordenada de transformações de moléculas precursoras de suas formas inativas para suas formas cataliticamente ativas ... 30 Figura 2 − Heparina (A) Uma unidade de dissacarídeo tetra-aniônico de heparina
composta de ácido a-1-idopiranosidurônico (1 → 4) ligado a N-sulfo-d-glucosamina. (B) Uma unidade dissacarídica de heparina composta de ácido β-d-glucopiranosidurônico (1 → 4) ligado a N-acetil-d-glucosamina. (C) A sequência de pentassacarídeo de ligação à antitrombina encontrada na
heparina... 31 Figura 3 − Estrutura química representando a unidade repetitiva da agarose ... 33 Figura 4 − Estruturas químicas representando as unidades repetitivas de a)
κ-carragenana; b) ɩ-carragenana e c) λ-carragenana ... 34 Figura 5 − Hypnea musciformis ... 35
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS HBPM Heparina de Baixo Peso Molecular
HNF Heparina Não Fracionada PS Polissacarídeo Sulfatado
PS-Hm Polissacarídeo Sulfatado de Hypnea musciformis TTPA Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativado
TP Tempo de Protrombina
DCCR Delineamento Composto Central Rotacional MSR Metodologia de Superfície de Resposta
LISTA DE SÍMBOLOS α Alfa β Beta ι Iota κ Kappa λ Lambda μ Micro KHz Quilohertz kDa Quilodalton mm Milímetros nm Nanômetros M Molar
g.L-1 Gramas por litro G Gravidade h Horas min Minutos °C Graus Celsius % Porcentagem ® Marca Registrada
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 13 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 14 2.1 Hemostasia e Coagulação ... 14 2.1.1 Cascata de coagulação ... 15 2.1.2 Trombose... 16 2.1.3 Antitrombóticos ... 17 2.2 Algas Marinhas ... 18
2.3 Atividade Biológica de Polissacarídeos Sulfatados ... 21
2.4 Hidrólise ... 22
3 INTRODUCTION ... 24
4 MATERIAL AND METHODS ... 25
4.1 Extraction of SP-Hm ... 25
4.1.1 Quantification of contaminant protein content ... 25
4.2 Animals ... 26
4.3 Hydrolysis ... 26
4.4 Biochemical characterization ... 26
4.4.1 Molecular weight determination by Gel Permeation Chromatography (GPC) 26 4.4.2 Chemical characterization by infrared spectroscopy ... 27
4.4.3 Quantification of reducing sugars by DNS ... 27
4.5 Antithrombotic and anticoagulant activities ... 27
4.5.1 Activated partial thrompoblastin time (APTT) ... 27
4.5.2 Prothrombin time (PT) ... 28
4.6 Tail transection bleeding time ... 28
4.7 Statistical analysis ... 28
5 RESULTS AND DISCUSSION ... 28
5.1 Extraction and purity of SPHm ... 29
5.2 Molecular weight determination by Gel Permeation Chromatography (GPC) ... 29
5.3 Chemical characterization by infrared spectroscopy ... 29
5.5 Anticoagulant and antithrombotic in vitro assays ... 31
5.5.1 Activated Partial Thrompoblastin Time ... 31
5.5.2 Prothrombin Time ... 31
5.6 Tail transection bleeding time ... 31
6 CONCLUSION ... 32
REFERÊNCIAS ... 33
ANEXO A – TABLES ... 39
ANEXO B – GRAPHS ... 43
