Estudo da atividade leishmanicida de derivados dialquilfosforilhidrazonas

Texto

(1)PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA. CAROLINA BARBOSA BRITO DA MATTA. ESTUDO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE DERIVADOS DIALQUILFOSFORILHIDRAZONAS. Maceió-AL 2016 1.

(2) PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA. CAROLINA BARBOSA BRITO DA MATTA. ESTUDO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE DERIVADOS DIALQUILFOSFORILHIDRAZONAS Tese de Doutorado apresentada ao programa de pós-graduação em Biotecnologia como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor Área de concentração: Biotecnologia em saúde Linha de pesquisa: Desenvolvimento de agentes profiláticos, terapêuticos e testes de diagnósticos Orientadora: Profa. Dra. Suzana Alexandre Moreira. Magna. Maceió-AL 2016 2.

(3) Catalogação na fonte Universidade Federal de Alagoas Biblioteca Central Divisão de Tratamento Técnico M435e. Matta, Carolina Barbosa Brito da. Estudo da atividade leishmanicida de derivados dialquilfosforilhidrazonas / Carolina Barbosa Britto da Matta. – 2016. 109 f. : il. tabs., grafs. Orientador: Magna Suzana Alexandre Moreira. Tese (doutorado na Rede Nordeste de Biotecnologia) – Universidade Federal de Alagoas. Instituto de Química e Biotecnologia. RENORBIO. Maceió, 2016. Bibliografia: f.93-107 1. Leishmaniose cutânea. 2. Leishmaniose visceral. 3. Leishmania sp. 5. Dialquilfosforilhidrazonas. I. Título.. CDU: 547.1:616.928.5. 3.

(4) 4.

(5) Dedico esse trabalho aos meus pais, Flávio e Janete, pelo amor incondicional, incentivo e compreensão durante esta trajetória.. 5.

(6) AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por iluminar os caminhos que percorri ao longo desse trabalho. Aos meus pais, Flávio Barbosa da Matta e Janete Barbosa de Brito, exemplos de sabedoria e honestidade. Os grandes espelhos da minha vida. Obrigada por todo amor, dedicação, incentivo e paciência em todas as horas. Palavras sempre serão muito pouco para demonstrar-lhes meus sinceros agradecimentos. Amo vocês! Aos meus irmãos, Carinne, Rafael e Gabriel, pelo carinho, paciência e compreensão. Amo vocês! Ao meu esposo Raphael por estar sempre ao meu lado, pelo carinho, companhia, paciência e compreensão. Obrigada por todo amor! Ao meu amor maior, Sophia Brito. Por me ensinar a cada dia o real sentido da vida. À minha querida e numerosa família: primos, primas, tios, tias e meus amados avós! Muito obrigada pela presença em minha vida. Pela confiança, amor, amizade, enfim, obrigada por ser a minha família. À minha querida orientadora, Profa. Dra. Magna Suzana Alexandre Moreira, que me orientou desde a iniciação científica buscando sempre extrair o meu melhor. Obrigada por todos os conhecimentos compartilhados, conselhos, incentivo, confiança e toda contribuição científica durante esse longo período que convivemos. À todos os animais utilizados, simplesmente essenciais para a realização deste trabalho, dedico todo o meu respeito e agradecimento. Aos queridos amigos, Luiz Henrique, Carla, Morgana, Thiago Matos, Karol, Renata, Débora, Elenise e Ediane, pelo carinho, conselhos, amizade, compreensão e por todos os momentos únicos que passamos juntas. Obrigada amigos! À Aline Queiroz pela colaboração extremamente importante no desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por tudo! Aos amigos do laboratório, que se tornaram grandes companheiros do dia a dia. Agradeço-os pela amizade, auxílio nos experimentos, conhecimentos compartilhados diariamente e momentos de descontração: Yolanda Karla, Aline Queiroz, Eliane Campesatto, Éverton Tenório, Thays Dias, Gabriela Muniz, Mariana Santos, Amanda Evelyn, Ellymaira, Ariane Priscilla, Anderson e Max Vianna. Cada um teve sua importância e sua participação, obrigada a todos por terem tornado esse trabalho possível.. 6.

(7) A todos os professores da Rede Nordeste de Biotecnologia, pela valiosa contribuição em minha formação acadêmica Aos professores Carlos Maurício R. Sant’Anna e João Batista Neves da Costa da UFRRJ pelo apoio técnico e científico na execução desse trabalho. A todos os membros do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fármacos e Medicamentos (INCT-INOFAR). Aos coordenadores do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA)FIOCRUZ- UFPE, Profs. Dr. Luiz Carlos Alves e Dr. Fábio André Brayner dos Santos pelo apoio técnico e científico e por cederem tão gentilmente as estruturas do LBCM/FIOCRUZ para execução dos meus experimentos. Agradeço ainda aos colegas Ana Paula, Amanda e Gabriel e ao excelente técnico Rafael Padilha por todo auxílio na execução dos ensaios de Microscopia Eletrônica de Varredura. A Profª Drª Valéria de Matos Borges do Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz/FiocruzBA e ao Prof. Dr. Eduardo Caio Torres dos Santos do Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz-RJ, por gentilmente cederem cepas de Leishmania spp; À Coordenaçãode Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL), bem como ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo auxílio financeiro para a realização deste trabalho; Agradeço, dessa forma, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, fazendo parte deste caminho de crescimento profissional e pessoal. Muito obrigada!. 7.

(8) RESUMO A leishmaniose é uma doença negligenciada mundialmente com alto impacto dentre a população menos favorecida, principalmente em países em desenvolvimento. O arsenal terapêutico é restrito, ultrapassado e provoca efeitos adversos graves, podendo causar até a morte. Além disso, estudos mostram que há grande resistência do parasita ao tratamento. Nesse sentido, foram racionalmente planejados e sintetizados 18 novos derivados dialquifosforilhidrazonas (4a - 4o) e avaliados contra espécies de Leishmania. Inicialmente, foi avaliado o efeito desses compostos contra formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis in vitro. Observou-se que todos os compostos apresentaram atividade contra esses parasitos, exceto os compostos 4a, 4c e 4e. Para avaliar a toxicidade destes compostos contra células de mamíferos, foi realizado o ensaio de MTT em macrófagos J774. Nesse ensaio nenhum derivado apresentou citotoxicidade na concentração avaliada (100 mM), exceto 4o, que foi tóxico para aproximadamente 20% das células tratadas. Em seguida, utilizando os parâmetros de CI50, Emax e citotoxicidade, foram escolhidos os compostos 4m e 4n para os testes subsequentes. Esses compostos foram avaliados in vitro no ensaio de amastigota. Nesse teste, a média do número de parasitas por macrófago, a porcentagem de macrófagos infectados e o índice de infecção dos macrófagos por L. amazonensis foram reduzidos de forma dependente de dose por ambos os compostos, semelhante ao fármaco padrão Miltefosina. Uma vez que estas moléculas apresentaram atividade leishmanicida in vitro, foi avaliado o efeito de 4m e 4n no modelo de leishmaniose cutânea em camundongos, que mimetiza a doença em humanos. O tratamento oral com ambos os compostos promoveu a cicatrização total de nódulos e úlceras nas orelhas de camundongos infectados com L. amazonensis, porém apenas o tratamento com 4n reduziu a carga parasitária no local do inóculo. Além disso, nenhum dos compostos interferiu na carga parasitária sistêmica, uma vez que eles não reduziram os níveis dos parasitas nos linfonodos drenantes. O efeito de 4m e 4n foi também avaliado contra L. chagasi, causadora da forma visceral da doença. Inicialmente, foram realizados ensaios in vitro contra as formas promastigotas e amastigotas de L. chagasi. Semelhante ao que foi observado anteriormente, 4m e 4n foram ativos contra ambas as formas de L. chagasi. Além disso, por meio de microscopia eletrônica de varredura, observou-se que as formas promastigotas tratadas com 4m apresentaram múltiplos flagelos, formas anômalas e múltiplos septos, enquanto o tratamento com 4n induziu uma redução do corpo celular das promastigotas e a formação de múltiplos septos. No modelo de leishmaniose visceral em hamsters (Mesocricetus auratus), 15 dias após os tratamentos, o peso dos órgãos viscerais (fígado e baço) foi avaliado. Embora esse tratamento não tenha reduzido o peso dos órgãos, reduziu a carga parasitária no baço, o que indica um efeito oral leishmanicida dos compostos 4m e 4n contra a forma visceral. Adicionalmente, foi observado que o tratamento com 4m e 4n não induziu hepatotoxicidade nem nefrotoxicidade, uma vez que os níveis de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), ureia e creatinina não estavam elevados após o tratamento. Em conjunto, esses dados indicam que os compostos dialquilfosforilhidrazonas são ativos contra espécies de Leishmania, principalmente os compostos 4m e 4n, que são foram ativos por via oral contra leishmaniose cutânea e visceral. Indicando que estes podem ser considerados novos protótipos para o tratamento da leishmaniose. Palavaras-chave: Dialquilfosforilhidrazonas; Leishmaniose Visceral.. Leishmania. sp.;. Leishmaniose Cutânea;. 8.

(9) ABSTRACT Leishmaniasis is a worldwide neglected disease with high impact among the underprivileged population, especially in developing countries. The therapeutic arsenal is limited, outdated and causes serious side effects and can even cause death. In addition, studies show that there is great resistance of the parasite to treatment. In this regard, 18 (4a - 4o) new dialkylphosphorylhydrazones compounds were synthesized and evaluated against the parasites Leishmania species. Initially, we evaluated the effect of these compounds against L. amazonensis and L. braziliensis promastigotes in vitro. It was observed that all of compounds showed activity against these parasite, except 4a, 4c and 4e. In order to assess a potential toxicity against mammalian cells, MTT assay were performed in J774 macrophages treated with compounds. All The compounds showed low cytotoxicity with LC50 values >100 mM, except for 4o, which was toxic to approximately 20% of the treated cells. Using the EC50, Emax and cytotoxicity parameters, 4m and 4n compounds were chosen for the subsequent tests. These compounds were tested antiamastigote assay in vitro. In this test, the average of the number of parasites per macrophage, the percentage of infected macrophages and infection index of L. amazonensis-infected macrophages were reduced dose dependently by both compounds, similar to standard drug miltefosine. Since these compounds showed antileishmania activity in vitro, later it was tested 4m and 4n anti-leishmania effect in mouse model of cutaneous leishmaniasis, that mimics human disease. In this assay, the oral treatment with both compounds caused a complete healing of nodules and ulcers in L. amazonensisinfected mice ears, but the control of parasite burden at the inoculation site was reduced only in the case of treatment with 4n. On the other hand, none of two compounds interfered in systemic parasite burden, once they did not reduce parasite levels in draining lymph nodes. Thereafter, we also evaluate 4m and 4n effect in L. chagasi-induced visceral leishmaniasis in hamsters (Mesocricetus auratus). Firstly, in vitro assays against promastigotes and amastigotes form of L. chagasi were performed. Similar to observed previously, 4m and 4n were active against both L. chagasi forms. In addition, by scanning electron microscopy, it was observed that promastigotes treated with 4m compound presented multiple flagellae, aberrant shapes and multi-septation; while 4n treatment caused cell body shrinkage and multiseptation. In in vivo test, 15 days after oral treatment with 4m and 4n, it was evaluated the visceral organs weight (spleen and liver). Despite this treatment did not reduce organs weight, it reduced the parasite burden in spleen, which indicate oral effect of 4m and 4n against visceral leishmaniasis in mice. Also, it was observed that 4m and 4n treatment did not induce hepatotoxicity and nephrotoxicity, since they did not increase the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), urea and creatinine. Taken together, these data indicate that dialkylphosphorylhydrazones compounds are active against Leishmania species, mainly 4m and 4n compunds, which are orally active against cutaneous and visceral leishmanisis. This indicate that 4m and 4n could be new lead compounds therapeutically useful against leishmaniasis. Key words: Dialkylphosphorylhydrazones leishamaniasis; visceral leishmaniasis.. compounds;. Leishmania. sp.;. cutaneous. 9.

(10) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1 Esquema do planejamento racional dos derivados dialquilfosforilhidrazona........................................................................................................15 Figura 2 - Lutzomyia longipalpis durante o repasto sanguíneo.................................... ..17 Figura 3 - Formas evolutivas do protozoário Leishmania. A: promastigota; B: amastigota................................................................................................................................19 Figura 4 - Ciclo biológico e modo de transmissão de Leishmania spp ............................... 21 Figura 5 - Endemicidade Mundial da Leishmaniose Cutânea (A) e Visceral (B) ............ 24. 10.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. ALT. Alanina transaminase. AST. Aspartato transaminase. CI50. Concentração que inibe 50% do crescimento. DTN. Doenças tropicais negligenciadas. DNA. Ácido desoxirribonucleico. Emax. Efeito máximo. G6P. Glicose-6-fosfato. HIV. Vírus da imunodeficiência humana. HK. Hexoquinase. IL. Interleucina. IFN-γ. Interferon γ. LC. Leishmaniose cutânea. LT. Leishmaniose tegumentar. LTA. Leishmaniose tegumentar americana. LV. Leishmaniose visceral. MEV. Microscopia eletrônica de varredura. MHC. Complexo de histocompatibilidade principal. MTT. Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5difeniltetrazólio. NK. “Natural killer” (matadoras naturais). NO. Óxido nítrico. OMS. Organização Mundial de Saúde. Th1. Célula T “helper” (auxiliar) 1. Th2. Célula T “helper” (auxiliar) 2. Th17. Célula T “helper” (auxiliar) 17. TNF. Fator de necrose tumoral. TGF-β. Fator de crescimento transformador β 11.

(12) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 13 2 REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................................. 16 2.1 Leishmanioses ................................................................................................................... 16 2.2 Vetores e hospedeiros ....................................................................................................... 17 2.3 Agente etiológico e Ciclo de vida ..................................................................................... 18 2.4 Interações com o hospedeiro............................................................................................ 20 2.5 Epidemiologia ................................................................................................................... 22 2.6 Aspectos clínicos e histopatológicos das leishmanioses ................................................. 25 2.6.1 Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). ................................................................ 25 2.6.2 Leishmaniose Visceral (LV). ........................................................................................... 26 2.7 Arsenal Terapêutico Atual ............................................................................................... 27 2.7.1 Antimoniais ..................................................................................................................... 28 2.7.2 Anfotericina B ................................................................................................................. 29 2.7.3 Pentamidina ..................................................................................................................... 30 2.7.4 Miltefosina ....................................................................................................................... 30 2.8 Resistência ao tratamento ................................................................................................ 31 2.9 Modelos experimentais utilizados em testes de novos fármacos para leishmaniose .. 32 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 36 3.1 Objetivo Geral .................................................................................................................. 36 3.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 36 4 ARTIGO I DERIVADO DA TESE.................................................................................... 37 5 ARTIGO II DERIVADO DA TESE .................................................................................. 49 6 DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 81 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................ 100 REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 101 ANEXO A..............................................................................................................................106 ANEXO B..............................................................................................................................107. 12.

(13) 1. INTRODUÇÃO A Organização Mundial da Saúde (OMS) e a organização Médicos Sem Fronteiras propuseram há cerca de uma década o termo “Doenças Tropicais Negligenciadas” (DTNs), referindo-se àquelas enfermidades, geralmente transmissíveis, que apresentam maior ocorrência nas regiões tropicais dos países em desenvolvimento (WHO, 2015; DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI, 2010). As DTNs mais importantes incluem leishmanioses, doença de Chagas, hanseníase, dengue e malária, além de diversas parasitoses (MOREL, 2006). Estas doenças têm como características comuns a endemicidade elevada e são a principal causa de morbidade e mortalidade nas áreas rurais e urbanas menos favorecidas dos países da África, Ásia e América Latina, que concentram os maiores bolsões de pobreza do mundo. O impacto individual e coletivo das DTNs é grande: reduzem a qualidade de vida e a produtividade da população afetada, agravam a pobreza e contribuem para a manutenção do quadro de desigualdade (DIAS et al., 2009). Contudo, o prejuízo causado por estas doenças não pode ser calculado considerando apenas a mortalidade. Em geral, elas causam muito mais incapacidades, gerando custos a curto e longo prazo para os governos (DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI, 2010). Apesar da importância econômica e social destas enfermidades pouco tem sido o progresso feito no conhecimento básico, no desenvolvimento e na descoberta de novos fármacos para estas doenças, de maneira geral as opções terapêuticas são insuficientes, foram desenvolvidas na metade do século passado e apresentam problemas como baixa eficácia e elevada toxicidade (GUIDO, OLIVA, 2009). Além disso, as doenças infecciosas representam baixa prioridade para a indústria farmacêutica, o investimento em P&D de novos fármacos é muito alto e o retorno é baixo uma vez que essas doenças acometem uma parcela da população de pouco poder aquisitivo (TROUILLER et al., 2002). A negligência é também evidente em termos monetários, uma vez que estas doenças recebem uma proporção muito pequena dos recursos públicos para a saúde (LIESE; ROSENBERG; SCHRATZ, 2010). No caso particular da leishmaniose, que é uma doença que causa lesões na pele, deformações faciais e até mesmo a morte, na sua variante clínica mais grave, a terapêutica atual é composta por um arsenal restrito e ultrapassado. Os fármacos de primeira escolha são 13.

(14) antimoniais pentavalentes utilizados desde 1940, os quais além de apresentarem várias restrições para o uso devido aos graves efeitos colaterais possuem alto índice de resistência, dificuldades de administração e baixa adesão dos pacientes ao tratamento (RATH, 2003). Em alguns casos, outros fármacos como pentamidina, anfotericina B e paromomicina são usadas como segunda opção em casos resistentes, mesmo com baixa eficácia e a alta toxicidade desses compostos para o hospedeiro (AMEEN, 2010). Mais recentemente foi descoberta a miltefosina, inicialmente desenvolvida para o tratamento do câncer, licenciada em alguns países como primeiro fármaco oral para o tratamento da leishmaniose (KEDZIERSKI, 2009). No entanto, apesar de apresentar elevada eficácia para L. chagasi, também possui efeitos adversos graves como teratogenicidade e já apresenta inúmeros casos de resistência (MALTEZOU, 2009). Há também a anfotericina B liposomal que como a miltefosina apresenta alto custo e elevada toxicidade (ROY et al., 2011). Face ao panorama exposto, fica evidente a necessidade de buscar novas opções terapêuticas para a leishmaniose. A descoberta de novos fármacos, preferencialmente de administração oral, seguros, efetivos e de baixo custo, é um desafio colocado aos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de novos protótipos de fármacos aplicáveis na quimioterapia antiparasitária. Considerando este cenário foram desenvolvidos derivados dialquilfosforilhidrazonas para serem avaliados quanto à atividade leishmanicida. Tais moléculas foram planejadas e sintetizadas racionalmente segundo os conceitos de hibridação molecular, que é uma estratégia clássica de conjugação de estruturas de compostos bioativos distintos em uma única molécula, sendo uma alternativa eficaz para arquitetar racionalmente estruturas moleculares de novos compostos protótipos. Nesse sentido, foi conjugado o grupo funcional hidrazônico do nifurtimox, que é um antichagásico (não mais utilizado no Brasil) ativo contra tripanossomatídeos,. com. o. grupo. fosfato. da. miltefosina,. uma. droga anticâncer. alquilfosfolipídica ativa contra Leishmania. Tais compostos foram ativos numa triagem inicial realizada por Nogueira e colaboradores (2011) contra Leishmania amazonensis e Tripanossoma cruzi. No entanto, estudos de docking indicaram a necessidade de realizar melhorias. na. estrutura. molecular. inicial.. A. partir. daí,. uma. série. inédita. 14.

(15) dialquilfosforilhidrazonas foi sintetizada para serem avaliados quanto à atividade leishmanicida. Desta forma, em continuidade aos esforços de pesquisa que o Laboratório de Farmacologia e Imunidade (LaFI-UFAL) vem desenvolvendo na busca por novos protótipos imunomoduladores e antiparasitários úteis ao tratamento de doenças negligenciadas, bem como devido ao elevado potencial terapêutico de dialquilfosforilhidrazonas, realizou-se no presente trabalho a avaliação farmacológica de uma nova série de 18 derivados dialquilfosforilhidrazonas, planejados e sintetizados por pesquisadores da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), visando à descoberta de novos candidatos a protótipos de fármacos leishmanicidas, que constituam opções terapêuticas mais seguras ao tratamento da leishmaniose. Figura 1 - Esquema do planejamento racional dos derivados dialquilfosforilhidrazonas. Em destaque os grupos funcionais fosfato (azul) e hidrazona (vermelho).. 15.

(16) 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Leishmanioses As leishmanioses abrangem um grupo de doenças que são causadas pela infecção de protozoários do gênero Leishmania. A doença é transmitida aos seres humanos por flebotomíneos e exibe diferentes manifestações clínicas, que vão desde infecção assintomática ou subclínica a formas desfigurantes de leishmaniose cutânea ou mucosa. Além disso, há a forma visceral que é potencialmente fatal (ROSS, 1903; REMME et al., 2002; DESJEUX, 2004a). Devido ao vasto espectro de manifestações esta doença é considerada polimórfica e os sintomas estão relacionados com a espécie do parasito, fatores eco-epidemiológicos, efeitos imuno-reguladores da saliva do mosquito, características genéticas, imunidade e estado nutricional do hospedeiro (DE CAMPOS et al., 2010; LIMA, TITUS, 1996, MCMAHONPRATT & ALEXANDER, 2004). De maneira geral, tem havido ao longo dos anos uma intensa subestimação das leishmanioses como reais problemas de saúde, agravada pelas dificuldades enfrentadas por países que possuem escassos recursos para controlar doenças infecciosas, proporcionando o avanço destas enfermidades (WHO, 2010). Por esse motivo, as leishmanioses constituem atualmente, o segundo grupo mais comum de doenças infecciosas depois da malária, e estão entre as mais importantes doenças infecciosas tropicais combatidas pela OMS (ABATH, 2000; DESJEUX, 2001; DESJEUX, 2004a; DESJEUX, 2004b). Os encargos que as leishmanioses trazem persistem devido à existência de grandes obstáculos técnicos, gerenciais, financeiros e políticos ao controle dessas doenças, permitindo que elas se mantenham como grave problema da saúde pública, sendo bastante onerosas para o desenvolvimento social e para a economia de vários países (DIAS, DESSOY, 2009; HOMEDES, 1995; WHO, 2010). Por serem doenças negligenciadas pelas autoridades competentes, atualmente, as leishmanioses permanecem como doenças inevitáveis e incontroláveis. Para alguns autores o perfil epidemiológico está mudando para um aumento da prevalência e, portanto, novos instrumentos e abordagens para alcançar seu controle são urgentemente necessários (LORÍACERVERA, ANDRADE-NARVÁEZ, 2014). Além disso, as opções terapêuticas são insuficientes e apresentam uma série de problemas, tais como baixa eficácia, elevada toxicidade e emergência de cepas resistentes (GUIDO, OLIVA, 2009). 16.

(17) 2.2 Vetores e hospedeiros A leishmaniose é transmitida, em mamíferos, principalmente por vetores da família Psychodida, hematófagos pertencentes aos gêneros Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo (READY, 2010; SHUKLA et al., 2010). São insetos dípteros denominados flebotomíneos e popularmente conhecidos como mosquito-palha, asa-dura, birigui ou cangalhinha. Eles possuem coloração clara e o corpo revestido por pêlos, medindo de 1 a 3 mm de comprimento (Figura 1). Ambos os sexos necessitam de carboidratos como fonte energética, mas apenas as fêmeas se alimentam de sangue para o desenvolvimento de seus ovos (FORATTINI, 1973). Estes vetores se distribuem principalmente em regiões de climas quentes e temperados, apresentam atividade crepuscular e pós-crepuscular e abrigamse durante o dia em lugares úmidos, escuros e protegidos dos ventos (BORASHI & NUNES, 2007). Figura 2 - Lutzomyia longipalpis durante o repasto sanguíneo.. Fonte: Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Lutzomyia. O gênero Lutzomyia é responsável pela transmissão das leishmanioses nas Américas. Dentro deste gênero 350 espécies já foram catalogadas e se encontram distribuídas desde o sul do Canadá até o norte da Argentina, das quais pelo menos 200 ocorrem na bacia amazônica (GILL et al., 2003). As principais espécies envolvidas na transmissão da leishmaniose tegumentar americana são: Lutzomyia flaviscutellata, Lu. whitmani, Lu. umbratilis, Lu. intermedia, Lu. wellcome e Lu. migonei. Havendo, entretanto, o registro de infecção natural de outras espécies, como Lu. neivai e Lu. fischeri (PITA-PEREIRA et al., 2009; ROCHA et al., 2010). O principal vetor da leishmaniose visceral no Brasil é o Lutzomyia longipalpis 17.

(18) (BASANO; CAMARGO, 2004). Algumas espécies além de estarem envolvidas na transmissão da leishmaniose, são hospedeiras de outros microrganismos, como vírus, nematoides, bactérias e fungos (SHAW et al., 2003). Além de um vetor invertebrado, o parasito necessita de um hospedeiro vertebrado que atua como reservatório. Existem várias discussões sobre os conceitos de hospedeiros e reservatórios (ASHFORD, 1996; CHAVES et al., 2007; HAYDON et al., 2002). O termo hospedeiro é bem abrangente e diz respeito a uma espécie que abriga ocasionalmente um parasito oportunista que pode ou não comprometer sua sobrevivência (AVILA-PIRES, 2005). De acordo com Ashford (1996), a relação reservatório-parasito é extremamente complexa, haja vista que diversos fatores ambientais podem interferir nela, tornando-a então dinâmica. Os reservatórios para a doença variam de acordo com a espécie de Leishmania envolvida na transmissão. Pequenos roedores, marsupiais e endentados são encontrados infectados naturalmente pelo parasito (ARIAS, NAÏFFI, 1981; BRANDÃO-FILHO et al., 1994, 2003; SILVEIRA et al., 1991), assim como primatas (LAINSON, SHAW, 1998). Ao mesmo tempo, o homem e alguns animais domésticos como cães (TOLEZANO et al., 2007), equinos (BRANDÃO-FILHO et al., 2003) e felinos (DANTAS-TORRES et al., 2006) são considerados hospedeiros acidentais. 2.3 Agente etiológico e Ciclo de vida O. gênero. Leishmania. (Filo. protozoa:. Ordem. Kinetoplasticida:. Família:. Trypanossomatidae) descrito por Ross em 1903 é formado por protozoários unicelulares e heteróxenos, com cerca de 30 espécies catalogadas, das quais 20 infectam o homem e causam a doença (ASHFORD, 2000). Estes parasitos são classificados em dois subgêneros: Viannia e Leishmania, de acordo com o tipo de desenvolvimento dos flagelados no trato digestivo dos flebotomíneos (LAINSON, RYAN, SHAW, 1987). O subgênero Viannia possui desenvolvimento predominante no intestino posterior dos vetores e depois migram para o intestino médio e anterior (secção peripilária). Já os do subgênero Leishmania desenvolvemse apenas no intestino anterior e médio (secção suprapilária) (LAINSON, SHAW, 1998). Durante o seu ciclo de vida digenético (heteroxênico), que inclui uma fase no tubo digestivo do vetor flebotomíneo, e outra em diferentes hospedeiros vertebrados, a Leishmania apresenta-se sob duas formas evolutivas: promastigotas e amastigotas (Figura 2). A primeira 18.

(19) caracteriza-se por ser alongada, móvel, provida de flagelo livre, se desenvolve naturalmente apenas no inseto vetor e multiplica-se por divisão binária longitudinal dentro do seu tubo digestivo. A amastigota é imóvel, arredondada, com flagelo rudimentar não exteriorizado, que se localizam em vacúolos parasitóforos de células fagocitárias de vertebrados, sobretudo macrófagos (BALANCO et al., 1998). Figura 3 - Formas evolutivas do protozoário Leishmania. A: promastigota; B: amastigota.. A. B. A. Promastigotas de L. amazonensis aderidas ao intestino do inseto vetor. Fonte: FIOCRUZ – Portal de Periódicos:. http://www.periodicos.fiocruz.br/pt-br/content/semana-nacional-de-controle-e-combate-. %C3%A0s-leishmanioses B. B. Amastigotas de L. amazonensis (em vermelho) dentro de vacúolos parasitóforos em macrófago de camundongo (cinza). Fonte: Blog da Sociedade Brasileira de Parasitologia: https://blogdeparasitologia.wordpress.com/2014/05/06/parasita-da-leishmaniose-enngana-o-sistemaimunologico. A manutenção da infecção por Leishmania nos hospedeiros vertebrados se dá por meio da multiplicação de formas amastigotas dentro de células do sistema fagocítico mononuclear. Embora formas amastigotas possam circular no sangue dentro de células que fazem parte desse sistema, é na pele sã ou lesionada que estão presentes a maior parte das células infectadas (ALMEIDA et al., 2003; CRUZ et al., 2005). O ciclo começa quando o inseto vetor se contamina com sangue de um hospedeiro contendo macrófagos infectados com amastigotas. Devido às peças bucais relativamente curtas dos flebotomíneos não é possível uma penetração profunda nem punção direta dos 19.

(20) vasos. Por isso, os vetores rasgam a pele da vítima e dilaceram os tecidos provocando uma pequena hemorragia, da qual drenam o sangue, células e linfa dos pequenos capilares rompidos. Dessa maneira, estes insetos podem ingerir amastigotas de Leishmania ali presentes (LEIBY, 1994; SOARES & TURCO, 2003). As formas amastigotas, ingeridas durante o repasto sanguíneo, logo se diferenciam em promastigotas ainda no meio da massa de sangue por digerir. Tal transformação irá permitir que os parasitos sobrevivam à digestão que logo se iniciará (SACKS, KAMHAWI, 2001). A sobrevivência intracelular do parasito pode estar relacionada à rapidez de sua transformação em amastigota (LEWIS, 1987), uma vez que estas formas se encontram melhor dotadas bioquimicamente e enzimaticamente para resistirem aos mecanismos leishmanicidas dos macrófagos (MITTRA et al., 2013; PEARSON et al.,1983). Durante esse processo de transformação, as promastigotas aderem às microvilosidades do intestino médio do inseto. Nesta fase, os parasitos são denominados procíclicos, e caracterizam-se por se multiplicarem rapidamente por divisão binária. Após alguns dias transformam-se em promastigotas metacíclicos, estes são mais móveis, porém não têm a mesma capacidade de se multiplicar. As promastigotas metacíclicas, infectantes, migram para a probóscita do inseto e são inoculadas com a saliva durante o próximo repasto sanguíneo (SACKS; KAMHAWI, 2001). As promastigotas sobrevivem aos mecanismos de defesa inatos do hospedeiro e então infectam os macrófagos. Dentro dos macrófagos forma-se o fagossomo, local onde as promastigotas metacíclicas sobrevivem e estabelecem condições favoráveis para a sua diferenciação em amastigotas, que se dividem, lizam o macrófago parasitado e infectam novas células repetindo o ciclo (BATES, 1994; GANTT et al., 2001; SACKS; KAMHAWI, 2001). 2.4 Interações com o hospedeiro A evolução da doença infecciosa em um indivíduo envolve interações complexas de muitas moléculas (CHAKRABARTY, 1996; HICKS et al., 2000; ILG, 2000), bem como tipos celulares distintos entre os parasitas e o hospedeiro (WRIGHT; EL AMIN, 1989). O sistema imune é capaz de responder de maneira particular e especializada a diferentes parasitas, sendo variável a magnitude e o tipo de resposta e frequentemente 20.

(21) determina a evolução e o prognóstico da infecção (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000). Diversos eventos levam ao desenvolvimento para a cura espontânea ou progressão dessas doenças (GRIMALDI JR; TESH, 1993; RIVAS et al., 2004), devendo-se salientar que a atuação dos fatores genéticos do hospedeiro vertebrado infectado são extremamente importantes durante o desenvolvimento das patologias resultantes da infecção com Leishmania spp. (RITTER et al., 2004; ROBERTS; HANDMAN; FOOTE, 2000; MURRAY et al., 2005; CABRERA et al. 1995; GRAB et al. 2004). Figura 4 - Ciclo biológico e modo de transmissão de Leishmania spp - A figura mostra o repasto sanguíneo dos flebotomíneos e a aspiração de células de Leishmania spp. no sangue do hospedeiro infectado (humano ou animal). As células de Leishmania spp. se desenvolvem dentro do trato digestivo do inseto vetor até se transformarem na forma infectante. Esta forma é transmitida a outros hospedeiros durante um novo repasto sanguíneo, podendo causar as diferentes formas da doença.. Fonte: WHO: http://www.who.int/tdr/diseases-topics/leishmaniasis/en/. Modelos de animais empregados no estudo da fisiopatologia das leishmanioses têm mostrado que essa enfermidade é mediada por imunidade adaptativa com a participação de células T. Um subtipo específico de linfócito T, denominado linfócito T auxiliar, está diretamente comprometido com a resposta imune desenvolvida contra esses parasitas. Este subtipo de linfócito T, caracteristicamente chamado de célula T CD4+, pode ser subdividido. 21.

(22) em duas subpopulações celulares, a Th1 e a Th2, que são de fundamental importância para a defesa e susceptibilidade do hospedeiro contra as infecções, respectivamente. Inicialmente, as leishmanias multiplicam-se no interior dos macrófagos, podendo ser mortas no interior dessas células quando ativadas pelo interferon γ (IFN-γ) ou diretamente pelo contato com células T CD4+ específicas. A morte do parasito é promovida por mecanismo monoxidativos, intermediado pelo óxido nítrico e por seus metabólitos. O IFN-γ produzido pelas células Th1 ativa os macrófagos a destruir as amastigotas intracelulares. A IL-12, citocina importante produzida por células apresentadoras de antígeno, como as células dendríticas, tem participação importante na resposta Th1 protetora, pois promove a diferenciação dos linfócitos Th1. Por outro lado, a resposta Th2, que predomina em um microambiente rico em IL-4, suprime a resposta Th1 e a respectiva ativação dos macrófagos (SILVA, 2003). A subpopulação Th1 é capaz de eliminar os parasitas e conferir imunidade, prevenindo uma possível infecção posterior. Adicionalmente a essas, outras células especificamente envolvidas, após ativação via moléculas secretadas pelas células Th1, são as células T citotóxicas ou CD8+ e as “Natural Killers” (NK), que também estão envolvidas na imunidade contra as diferentes espécies de Leishmania (ROITT; BROSTOFF; MALE, 1999). De maneira contrária, a subpopulação Th2 proporciona susceptibilidade à infecção e a progressão das doenças (AHMED et al., 2003; GAMA et al. 2004; GRIMALDI JR; TESH, 1993; MURRAY et al., 2005; ROBERTS; HANDMAN; FOOTE, 2000; SOUSSI et al., 2000). 2.5 Epidemiologia De acordo com a OMS, as leishmanioses são um grupo de doenças endêmicas com altos índices de morbidade e mortalidade, prevalentes em todos os países das regiões tropicais e subtropicais do mundo (GONTIJO & CAMARGO, 2003), exceto na Austrália, Nova Zelândia e algumas ilhas do Pacífico (Figura 4). Estima-se, para esta doença, uma prevalência de 12 milhões de casos no mundo, sendo que 350 milhões de pessoas estão ameaçadas de contrair a doença em 98 países (WHO, 2014). A leishmaniose visceral (LV) é encontrada em quase todos os continentes, com cerca de 500.000 mil casos novos registrados anualmente causam em torno de 30.000 mortes por ano. Infelizmente, esses dados são subestimados, uma vez que a afecção não é de notificação 22.

(23) compulsória em todos os países em que ocorre, e muitos não realizam vigilância ou outras investigações e não possuem um sistema de armazenamento de dados (ALVAR et al., 2012). Apesar disso, sabe-se que sua distribuição mundial é irregular, do total de casos mais de 90% ocorrem em apenas seis países: Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Sudão do Sul e Sudão (WHO, 2014). Na América do Sul e Central, a LV ocorre desde o sul do México até o norte da Argentina, sendo o Brasil responsável por 90% dos casos registrados ocorridos no continente americano (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Já a forma tegumentar é mais amplamente disseminada, com cerca de 1,2 milhões de casos registrados por ano, distribuídos especialmente entre as regiões das Américas, Bacia do Mediterrâneo e a Ásia Ocidental. No entanto, dez países apresentam o maior número de casos estimados: Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Etiópia, Irã, Peru, Sudão e Síria, e, juntos, representam 70 a 75% da incidência global estimada (ALVAR et al., 2012; WHO, 2014). Apesar desta forma da doença não apresentar comumente ameaça a morte, durante a Guerra Irã-Iraque um milhão de pessoas foi infectada e os avanços do Estado Islâmico ficaram prejudicados. Estas doenças são zoonoses em franca expansão geográfica no Brasil. Sua distribuição é assegurada em todo o território nacional com registros em todos os Estados. Devido à demora com que o paciente procura o serviço de saúde e o difícil diagnóstico por parte do próprio sistema, os números notificados talvez não traduzam a evolução destas doenças no País (BRASIL, 2000; NEGRÃO, FERREIRA, 2014). Além disso, a situação epidemiológica das Leishmanioses está mudando e se expandindo para as áreas urbanas de médio e grande porte. Inicialmente os estudos sobre a epidemiologia das leishmanioses a caracterizavam como doenças exclusivamente rurais. Estas doenças, que eram restritas a comunidades com baixo grau de instrução, com o passar do tempo, também se tornaram comuns em áreas suburbanas e urbanas (GAMA et al., 1998; GONTIJO, C.; MELO, 2004). Essa nova distribuição resultou de problemas que envolvem aspectos ambientais, sociais e econômicos, possivelmente associados aos processos de fluxos populacionais em massa das áreas rurais para os centros urbanos, gerando um potente fator de risco para a disseminação da doença: a urbanização descontrolada (DESJEUX, 2004a; DESJEUX, 2004b; GONTIJO, C.; MELO, 2004; WHO, 2010). 23.

(24) Dentro desse contexto, a migração tem sido a principal causa da disseminação da leishmaniose, e, na ocorrência de sérias epidemias que afetam principalmente crianças. As péssimas condições sanitárias e os inadequados serviços de saúde a disposição de indivíduos pobres ampliam o problema da desnutrição que incrementam as chances de infecção, e, consequentemente, a alta taxa de mortalidade entre os menores de 5 (cinco) anos de idade (ARIAS et al., 1996; CAMPOS JR, 1995; DYE; WILLIAMSON, 1993; REY et al., 2005). Figura 5 - Endemicidade Mundial da Leishmaniose Cutânea (A) e Visceral (B).. A. B. Fonte: World Health Organization: http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps. 24.

(25) Outro agravante são as alterações nos perfis epidemiológicos das leismanioses, sobretudo a LV, paralelo à epidemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV). A associação entre as enfermidades é relativamente recente e os casos têm aumentado Brasil e no mundo (ALBUQUERQUE et al., 2014). Muitos autores relatam uma superposição simultânea entre o aparecimento de indivíduos com leishmaniose e a ocorrência da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) especialmente entre os usuários de drogas intravenosas (DESJEUX, 2004a; HANDMAN, 2001; HERWALDT, 1999; ROBERTS et al., 2000). Este fenômeno tem ocorrido devido a ruralização da AIDS concomitante a urbanização das leishmanioses, que indica a emergência desta doença parasitária como uma importante infecção oportunista ao HIV. O impacto epidemiológico desta coinfecção é tão significativo que a OMS cogita introduzir a LV como doença indicadora de AIDS (MALAFAIA, 2008; SOUSA-GOMES et al., 2011). 2.6 Aspectos clínicos e histopatológicos das leishmanioses Considerando que diferentes espécies do parasito podem ser transmitidas por várias espécies do vetor, para diferentes hospedeiros vertebrados em diversos ecossistemas, a infecção pode manter-se de forma assintomática ou resultar em um leque espectral de manifestações clínicas, histopatológicas e imunológicas que pode variar desde as formas cutâneas até a forma visceral. 2.6.1 Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) A LTA é uma doença infecciosa, não contagiosa, de evolução crônica, causada por diferentes espécies de parasitos do gênero Leishmania. No Brasil, esta doença é uma das afecções dermatológicas que merece atenção, devido à sua magnitude, o risco de ocorrência de deformidades que podem produzir no ser humano e o envolvimento psicológico, com reflexos no campo social e econômico, uma vez que, na maioria dos casos, pode ser considerada uma doença ocupacional (BRASIL, 2007). As manifestações clínicas da LTA são diversas e o processo infeccioso depende de fatores relacionados tanto ao parasito quanto ao hospedeiro (GRIMALDI, TESH, 1993). A sobrevivência do parasito está relacionada à evasão deste ao sistema imune do hospedeiro, podendo causar doença assintomática ou apresentar um espectro de aspectos clínicos (SACKS, SHER, 2002; ZAMBRANO-VILLA et al., 2002). A LTA pode ocorrer de forma 25.

(26) localizada, caracterizada por lesão única; disseminada, quando apresenta numerosas lesões em diferentes regiões do corpo; difusa, em que as lesões se apresentam de forma nodular; e na forma mucocutânea em que pode ocorrer a destruição do septo nasal e boca, resultando em deformidades severas. Há ainda a forma recidivante, com lesão ativa na área próxima a borda da lesão curada que se desenvolve com ou sem tratamento após um período de tempo variável. Na maioria dos casos, observa-se uma doença com lesão ulcerada única (GONTIJO, CARVALHO, 2003; MARZOCHI, 1992). A leishmaniose cutânea (LC) pode ser causada por diversas espécies do parasito. Nas Américas é freqüentemente causada pelas espécies L. brasiliensis, L. amazonensis, L. mexicana, L. peruviana, L. panamensis e L. guyanensis; no Velho Mundo as espécies L. major, L. tropica e L. aethiopica são as responsáveis por esta forma clínica (GRIMALDI, TESH, 1993; WILLIAMS, 1995). Esta doença é caracterizada por úlceras rasas, localizadas exclusivamente na pele, com bordas elevadas em moldura, fundo granulomatoso, com ou sem exsudato e, em geral, são indolores (DA-CRUZ et al., 2002; GONTIJO, CARVALHO, 2003). Aparecem, predominantemente, nas áreas corpóreas descobertas e iniciam-se no local em que as formas promastigotas infectantes foram inoculadas. Normalmente, apresentam cura espontânea ou uma boa resposta ao tratamento (GRIMALDI e TESH, 1993; DESJEUX, 2004). No entanto, a forma cutânea pode se tornar crônica e disseminar progressivamente afetando linfonodos e causando metástases (ASHFORD, 2000; HEPBURN, 2000). A forma cutânea-difusa é caracterizada por lesões nodulares ou papulosas sobre toda região do corpo, são graves e deformantes, ricas em parasitos. É uma enfermidade crônica, altamente resistente à quimioterapia, não existindo cura. É comum ocorrer em indivíduos com deficiência imunológica e está associada a L. (L.) amazonensis (BOMFIM et al., 1996; CÁCERES-DITTMAR et al., 1993). A leishmaniose mucocutânea é a forma mais agressiva e mutilante, caracterizada por infiltração, ulceração e destruição dos tecidos da cavidade nasal, faringe e/ou laringe. É na maioria das vezes, secundária as lesões cutâneas, surgindo por disseminação hematogênica meses ou anos após a resolução das lesões de pele. O risco de deformidades permanentes é considerável e o diagnóstico precoce é essencial para a eficácia terapêutica e para evitar sequelas (FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2002; MARSDEN, 1986; MARZOCHI, 1992). 26.

(27) A leishmaniose mucocutânea caracteriza-se por lesões tardias, que surgem geralmente meses ou anos após a cura de uma lesão cutânea (WALTON, 1987), preferencialmente na região auricular ou nasal que se estende progressivamente aos tecidos moles com inflamação e ulceração. Posteriormente, a lesão se aprofunda para destruir o tecido em vários anos. Nestas lesões, poucos parasitas são encontrados (MARKELL et al., 2003). A espécie mais destrutiva, causadora da forma mucocutânea é a L. brasiliensis (ABRAMSON et al., 1995). 2.6.2 Leishmaniose Visceral (LV) Diferentes espécies de Leishmania, como L. donovani (comumente encontrada na Índia e África), L. infantum (observada na região do Mediterrâneo, Oriente Médio e Ásia) e L. chagasi, normalmente presente na América do Sul, apresentam tropismo pelas vísceras da cavidade abdominal dos indivíduos humanos, o que leva a alterações marcantes nas funções de órgãos vitais como baço, fígado e medula óssea (BAILY; NANDY, 1994). No Brasil esta doença é uma importante causa de morbidade e mortalidade em áreas endêmicas, como a região Nordeste (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Com relação aos sintomas a LV é caracterizada principalmente por surtos irregulares de febre e esplenomegalia. Os sintomas variam, podendo ocorrer palidez, anemia, trombocitopenia, hemorragias digestivas e perda de apetite com desnutrição grave (FURTADO, 1994). O curso da doença pode ser lento durante anos ou surgir de maneira aguda, rápida e fatal (HANDMAN, 2001; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2004). De acordo com o Ministério da Saúde a LV pode ser classificada em cinco classes: 1) Inaparente: sem manifestações clínicas, porém com resultados sorológicos ou parasitológicos positivos; 2) Oligossintomática: com presença de febre baixa intermitente, prostração e discreta esplenomegalia, quando detectada; 3) Aguda: com manifestação súbita e febre como o primeiro sintoma, observando-se hepatoesplenomegalia, prostração, emagrecimento e hemorragia; 4) Clássica: com quadro clínico prolongado, apresentando comprometimento do estado nutricional, palidez mucocutânea, hepatoesplenomegalia acentuada, edema de membros inferiores, astenia, prostração e caquexia, além de leucopenia, plaquetopenia, hiperglobulinemia e hipoalbunemia; 5) Refratária: evolução da manifestação clássica, a qual não responde ou responde parcialmente ao tratamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). 27.

(28) Esta variedade de manifestações clínicas semelhantes à de outras enfermidades infectocontagiosas dificulta o diagnóstico precoce desta doença (GONTIJO, MELO, 2004). 2.7 Arsenal Terapêutico Atual A falta de interesse das companhias farmacêuticas no desenvolvimento de novos fármacos faz com que a terapêutica da leishmaniose seja, em geral, realizada com medicamentos pouco eficazes e com alta toxicidade aguda (SHI et al., 2011). Até o presente momento, o tratamento básico é feito com fármacos de primeira geração tais como o estibogluconato sódico e o antimoniato de meglumina. Embora esses fármacos tenham sido utilizados pela primeira vez em 1912 eles têm sido até hoje a base da quimioterapia em países endêmicos, especialmente no subcontinente indiano (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). Outros fármacos como anfotericina B (convencional ou lipossomal) e miltefosina estão sendo utilizados no tratamento da doença com maior eficácia e potencial para a cura, entretanto, são comparativamente mais caros do que o antimônio genérico. Além destes, a paromomicina e a pentamidina têm mostrado alguma utilidade e podem ser um suplemento potencial no regimento de drogas, mas a sua utilização e disponibilidade em regiões endêmicas da doença são limitadas (DAVIS, KEDZIERSKI, 2005; MISHRA et al., 2009). A seguir, serão apresentados cada um destes. 2.7.1 Antimoniais Dentre os compostos de antimoniais utilizados no tratamento da leishmaniose destacam-se os complexos de antimônio trivalentes (SbIII), tais como o tartarato antimonial de. potássio. (Tártaro. emético),. antimoniato. de. bis-catecol-3,5-dissulfonato. sódico. ®. (Stibophen ), tioglicolato de sódio e antimônio (RATH et al., 2003). No entanto, devido a cardiotoxicidade e intolerância gastrintestinal dos antimoniais trivalentes são os antimoniais pentavalentes (SbV) que apresentam maior uso terapêutico (SERENO et al., 2000). Dentre os antimoniais mais consumidos em nível mundial estão o estibogluconato de sódio (Pentostan®) e antimoniato de meglumina (Glucantime®) (RATH et al., 2003). Embora estes fármacos permaneçam a base da terapia leishmanicida há décadas, é ainda incerto o seu mecanismo de ação, a sua estrutura e até mesmo a identidade do componente biologicamente ativo (ROBERTS, RAINEY, 1993). 28.

(29) Alguns trabalhos sugerem que o antimônio compromete o potencial redox tiol da célula, induzindo o efluxo de tióis intracelulares e inibição de tripanotiona redutase (WYLLIE, CUNNINGHAM, FAIRLAMB, 2004). Além disso, segundo Chai e colaboradores (2005) o SbV forma complexos com purinas do parasito levando a eventos deletérios em toda bioquímica do DNA. Outra hipótese diz respeito à capacidade do SbV em formar complexos com nucleotídeos, inibindo a topoisomerase e interferindo no metabolismo do parasito (DEMICHELI et al., 2002). Foi também observado que para o SbV ser ativo contra Leishmania é preciso entrar na célula hospedeira, atravessar a membrana fagolisossomal e agir contra amastigotas intracelulares. É também muito provável que o SbV seja convertido em sua forma trivalente (SbIII) para se tornar ativo, o que sugere que o SbV seja um pró-fármaco (SHAKED-MISHAN et al., 2001). No entanto, não está claro o local exato de onde ocorre esta conversão. De acordo com alguns trabalhos é possível que ocorra tanto nos macrófagos do hospedeiro como nas formas amastigotas do parasito (ROBERTS, RAINEY, 1993; SERENO et al., 1998). Ao longo dos anos diferentes regimes de dosagens foram propostos numa tentativa de alcançar a menor dose terapêutica eficaz e com menos efeitos colaterais. Atualmente a OMS preconiza que as doses de antimoniais não sejam maiores que 20 mg/kg/dia, não ultrapassando o limite de 850 mg de antimônio, devido à sua elevada toxicidade. Mialgias, dores abdominais, alterações hepáticas e distúrbios cardiológicos e renais são efeitos colaterais freqüentemente associados ao uso destes fármacos (BALAÑA-FOUCE et al., 1998). Ainda que o antimoniato de metilglucamina seja bastante eficaz em regredir rapidamente as manifestações clínicas e hematológicas da doença a crescente incidência de casos de resistência tem sido uma séria preocupação para a sua utilização em áreas endêmicas (SINGH, PANDEY, SUNDAR, 2006). Devido às baixas dosagens e tratamentos descontínuos, começaram a ocorrer falhas na terapia e conseqüente aumento de formas de parasitos resistentes (RATH et al., 2003; SERENO; LEMESRE, 1997). O aumento da incidência de falha terapêutica nos últimos anos vem se tornando uma grande ameaça, principalmente aos pacientes co-infectados com Leishmania e HIV. A principal causa dessa emergência é o mau uso dos fármacos, que leva à seleção de pequenas populações resistentes (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). Esse fenômeno de falha 29.

(30) terapêutica é complexo, uma vez que há vários fatores envolvidos: características do hospedeiro, como genética e resposta imunológica; fatores técnicos, como a qualidade do fármaco e a via de administração parenteral; a duração do tratamento; e a biologia do parasito, como uma variabilidade intrínseca em relação à susceptibilidade ao antimônio (GROGL et al., 1989). Sendo assim, os principais pontos negativos da terapia com antimoniais são os altos índices de desenvolvimento de resistência, os regimes de tratamento com altas doses por longos períodos, administração parenteral, além de elevada toxicidade renal e cardíaca (PLANO et al., 2011). 2.7.2 Anfotericina B É um antimicrobiano macrolídeo largamente utilizado para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas que pertence ao grupo de fármacos leshmanicidas de segunda linha usada extensivamente no caso de falhas no tratamento com compostos antimoniais. Nos Estados Unidos da América a anfotericina B é o único fármaco aprovado pelo FDA para o tratamento da leishmaniose (VAN-GRIENSVEN e DIRO, 2012). O mecanismo de ação, assim como da toxicidade, envolve a formação de poros artificiais ao longo da membrana celular do parasito e hospedeiro, alterando a permeabilidade da membrana plasmática, levando à morte do parasito (COHEN, 1998). Apesar de sua eficácia a anfotericina B também é tóxica e está associada a efeitos secundários graves. Apesar disso, em áreas em que existem níveis elevados de resistência ao SbV, a anfotericina B permanece como fármaco de escolha (LANIADO-LABORIN; VERGAS, 2009). Os efeitos colaterais adversos que ameaçam a vida e dificultam seu uso são a hipocalemia, nefrotoxicidade e anafilaxia na primeira dose, que não são incomuns. No entanto, alterações em sua formulação, encapsulada em lipossomas, mostraram reduzir a toxicidade, porém o alto custo limita sua utilização (PLANO et al., 2011). 2.7.3 Pentamidina A pentamidina pertence ao grupo das diaminas aromáticas e sua atividade terapêutica foi descoberta casualmente. Basselin e colaboradores em 1996 descreveram que este fármaco,. 30.

(31) utilizado na clínica contra casos de leishmaniose resistente aos antimoniais pentavalentes, apresenta bons resultados em pacientes imunodeprimidos (BERMAN, 1997). Apesar de ser menos tóxica que os antimoniais têm sido observados efeitos adversos significantes após sua administração. (AMATO et al, 2000). Dentre os principais efeitos estão hipoglicemia, hipotensão, mialgias, alterações cardiológicas e nefrotoxicidade. Outros efeitos colaterais comuns são dor no local da injeção, gosto metálico na boca, dor de cabeça, congestão e dispnéia. Além disso, há relatos de morte repentina e também foram descritos casos de resistência ao tratamento, o que limita seu emprego terapêutico (RATH et al., 2003; BRAY et al., 2003). O regime terapêutico consiste na administração de uma dose de 4mg/kg/dia deste fármaco, por via intramuscular, três vezes por semana em dias alternados, até que haja a cura do paciente, não excedendo a dose total recomendada de 2g (OURIVES-NEVES et al, 2011). Embora o mecanismo preciso pelo qual a pentamidina age não esteja claro, tem sido relatado que este fármaco entra em promastigotas através de transportadores de argina ou de poliamina, acumulando-se, principalmente, na mitocôndria, agindo sobre o genoma do parasito, dificultando a replicação e transcrição em nível mitocondrial (MUKHERJEE et al., 2005; PORCHEDDU et al., 2012). Além disso, outra teoria bastante aceita tem proposto que ocorre inibição da topoisomerase mitocondrial (KRAMP et al., 2005). Já o mecanismo de resistência pode estar associado à redução do potencial da membrana mitocondrial e redução do acúmulo do fármaco em terapias prolongadas (MUKHERJEE et al., 2006). 2.7.4 Miltefosina A miltefosina é um antineoplásico alquilfosfolipídico que se mostrou eficaz contra Leishmania spp. in vitro e in vivo. No entanto, a grande vantagem do uso desse fármaco é o fato de ser o primeiro e único usado por via oral quer seja para tratar a LV ou LC. A dose de miltefosina atualmente recomendada, como monoterapia, é de 2,5 mg/kg/dia durante 28 dias, embora na prática clínica outras doses sejam administradas. A toxicidadevgastrointestinal grave, o aumento significativos nos níveis de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e creatinina, além do seu potencial teratogênico dificultsm seriamente a sua utilização generalizada na clínica e em programas nacionais de eliminação (KAPOOR et al., 1999; DORLO, HUITEMA, BEIJNEN, 2012). 31.

(32) Atualmente, a miltefosina tem sido utilizada principalmente no Sul da Ásia em regiões de focos de LV em um programa de estratégia governamental de eliminação realizado pela Índia, Bangladesh e Nepal. Nesses países a recomendação é a monoterapia com miltefosina como tratamento de escolha para o tratamento da LV (SUNDAR, 2008). No entanto, ainda não se sabe se o medicamento será utilizado no leste da África, não só para LV, mas também na co-infecção HIV/LV e LC causada por L. aethiopica. De fato, pois atualmente a miltefosina só é recomendada em LC causada por L. mexicana, L. guyanensis ou L. panamensis (WHO, 2010). O mecanismo de ação da miltefosina não é conhecido com precisão, mas está associado a alterações no metabolismo alquil-lipídico e com a biossíntese de fosfolípidos (LUX et al., 2000). Devido à recente introdução de miltefosina no campo, parasitas clinicamente resistentes ainda não foram relatados. No entanto, a resistência pode ser facilmente induzida in vitro e alguns dos mutantes resultantes já foram caracterizados (PEREZ-VICTORIA et al., 2003; SEIFERT et al., 2003). Como observado, os fármacos utilizaos no tratamento atual da leishmaniose apresentam diversos problemas incluindo a alta toxicidade e diversos efeitos colaterais levando os pacientes a abandonarem o tratamento, o que consequentemente gera linhagens de leishmanias resistentes. Além disso, o alto custo dos compostos torna o tratamento muitas vezes inviável e longe de ser o ideal (YARDLEY et al., 2002; SINGH e SIVAKUMAR, 2004). 2.8 Resistência ao tratamento Como já citado anteriormente poucas drogas têm surgido nos últimos 50 anos, e a resistência às drogas tem aumentado muito, de modo que a taxa de cura não ultrapassa os 80% dos casos na maioria dos estudos (TUON et al., 2008). As leishmanias, como outros parasitos, são capazes de desenvolver resistência às drogas usadas contra elas, tais mecanismos relacionam-se com a adaptabilidade genética destes organismos (BORST, OUELLETTE, 1995). Sobre a resistência aos antimoniais, em alguns casos mais graves como observado em Bihar na Índia, cerca de 60% dos parasitos isolados são resistentes a estas substâncias (SUNDAR et al., 2001). Um dos mecanismos de resistência induzida aos antimoniais já 32.

(33) identificados é a amplificação do gene que codifica um transportador do tipo ABC, responsável pela extrusão da droga (HAIMEUR, OUELLETTE, 1998). Este transportador ABC é uma proteína transmembrana, localizada dentro da célula, e está relacionada com as vias endocíticas e exocíticas do parasito. Além da resistência aos antimoniais este mecanismo de defesa também foi desenvolvido durante o tratamento com Pentamidina (COELHO, 2007). Casos isolados de resistência à anfotericina B não parecem ser um problema, embora as recidivas sejam por vezes encontradas após o tratamento, especialmente em pacientes soropositivos. Um estudo demonstrou que o sucesso do tratamento com anfotericina B depende grandemente do estado imunitário do paciente e indicou que recaídas sucessivas poderiam aumentar o aparecimento de resistência contra a droga (GIORGIO et al., 1999; LACHAUD et al., 2009). Registros de resistência aos compostos como paromomicina, azóis e bifosfonatos são raros, possivelmente devido a seu uso limitado. Entretanto, sabe-se que a obtenção de cepas resistentes in vitro à Miltefosina é bastante fácil (PEREIRA, 2011). Os estudos in vitro dos mecanismos de resistência com células de L. donovani resistentes a miltefosina revelaram uma correlação entre a resistência e a acumulação reduzida da droga (PEREZ-VICTORIA et al., 2003). Esta acumulação diminuída foi causada por um defeito na translocação para o interior do fármaco, isto é, o movimento a partir do exterior para a região interna da membrana plasmática. Para alguns autores uma sugestão para reduzir a possibilidade de aparecimento de parasitas resistentes, pode ser usar miltefosina em combinação com outros medicamentos (OUELLETTE, DRUMMELSMITH, PAPADOPOULOU, 2004). 2.9 Modelos experimentais utilizados em testes de novos fármacos para leishmaniose A utilização de modelos experimentais em pesquisas sobre a leishmaniose aponta questões importantes relacionadas à evolução da doença e desenvolvimento da resposta imune de resistência e susceptibilidade. Tais modelos admitem a avaliação de componentes do sistema imune envolvidos na resolução da infecção e permitem obter e ampliar as perspectivas e propor novas estratégias terapêuticas e vacinais (HOMMEL et al., 1995; CARRÍON et al., 2006).. 33.

(34) Diferentes sistemas experimentais para o estudo da leishmaniose foram desenvolvidos, cada um com suas peculiaridades, a fim de caracterizar a resposta imune para espécies de Leishmania. Sejam roedores, cachorros ou macacos, nenhum destes reproduz bem a patologia observada na doença humana. Ademais, diversos fatores como o tamanho e natureza do inoculo, a rota de infecção e a linhagem do hospedeiro ou cepa do parasito contribuem com as diferenças entre modelos animais e a infecção natural em humanos. Apesar disso, os modelos animais são ainda a melhor alternativa para se estudar vacinas ou tratamentos para a doença, já que por razões éticas não poderiam ser realizados em humanos (LORÍA-CERVERA, ANDRADE-NARVÁEZ, 2014). Os ensaios in vitro constituem uma primeira etapa para avaliação da eficácia de novos compostos que têm atividade direta sobre o parasito. Entretanto, compostos que são eficazes após a metabolização ou aqueles cujas ações são mediadas através de um sistema de defesa do hospedeiro não mostram qualquer atividade nestes ensaios. Portanto, os resultados obtidos in vitro, por vezes, não podem ser extrapolados para sistemas in vivo (GUPTA, NISHI, 2011). Apesar disso, estes testes têm muitas vantagens, por exemplo, (I) poucos animais são suficientes para fornecer os parasitas para testar diversos compostos; (II) a quantidade do composto a ser testado é muito mínima; (III) o volume de resultados por triagem é alto e rápido; e (IV) as repostas são consistentes. No entanto, os resultados dos testes de um sistema in vitro sempre precisam ser verificados em animais (GUPTA, NISHI, 2011). Os ensaios in vitro com leishmania são realizados com o parasito tanto na sua forma promastigota como amastigota. Segundo Croft os requisitos necessários para a realização destes ensaios são: uma população de células em divisão, medidas reprodutíveis e quantificáveis da atividade da nova substância e do fármaco padrão. Além disso, é interessante utilizar pequenas quantidades do composto, e que a técnica seja de rápida execução e baixo custo (CROFT et al., 1986, 2006). Com relação à forma parasitária usada nos ensaios in vitro a promastigota é a mais popular, pois cresce em meio simples, são fáceis de cultivar e os ensaios utilizados para avaliar a atividade farmacológica de novos compostos são de fácil mensuração e rápida execução, sendo um modelo bastante utilizado para triagem. No entanto, diferenças observadas em sua susceptibilidade a drogas padrão em comparação com as formas amastigotas, e as diferenças bioquímicas que existem entre as duas formas, tornam esse 34.