INSTITUTO DE BIOLOGIA
LETÍCIA MONTEIRO DE RESENDE
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E FARMACOLÓGICA
DE DUAS FOSFOLIPASES A
2ISOLADAS A PARTIR DA
PEÇONHA DE AGKISTRODON PISCIVORUS
LEUCOSTOMA
CAMPINAS 2016
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E FARMACOLÓGICA
DE DUAS FOSFOLIPASES A
2ISOLADAS A PARTIR DA
PEÇONHA DE AGKISTRODON PISCIVORUS
LEUCOSTOMA
Orientador: DR. SERGIO MARANGONI Coorientador: DR. SAULO LUIS DA SILVA
CAMPINAS 2016
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Funcional e Molecular na área de Bioquímica.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA LETÍCIA MONTEIRO DE RESENDE E ORIENTADA PELO PROFESSOR SERGIO MARANGONI..
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Gustavo Lebre de Marco - CRB 8/7977
Resende, Letícia Monteiro de,
R311c ResCaracterização bioquímica e farmacológica de duas fosfolipases A2 isoladas a partir da peçonha de Agkistrodon piscivorus leucostoma / Letícia Monteiro de Resende. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
ResOrientador: Sérgio Marangoni. ResCoorientador: Saulo Luis da Silva.
ResTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Res1. Fosfolipases A2. 2. Venenos de serpentes. 3. Agkistrodon piscivorus. I. Marangoni, Sérgio. II. Silva, Saulo Luis da. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Biochemical and pharmacological characterization of two
phospholipases A2 isolated from Agkistrodon piscivorus leucostoma venom
Palavras-chave em inglês:
Phospholipases A2 Snake venom
Agkistrodon piscivorus
Área de concentração: Bioquímica
Titulação: Doutora em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:
Sérgio Marangoni [Orientador] Daniel Martins de Souza
Ana Carolina de Santos Souza Galvão Flávia Vischi Winck
Juliana Silva Cassoli
Data de defesa: 28-11-2016
Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Sergio Marangoni (Orientador)
Prof.. Dr. Daniel Martins de Souza
Prof.(a) Dr(a). Ana Carolina Santos de Souza Galvão
Prof.(a) Dr(a). Flávia Vischi Winck
Prof.(a) Dr(a). Juliana Silva Cassoli
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do a
“O cientista não é o homem que fornece as
verdadeiras respostas,
é quem faz as verdadeiras perguntas”. (Claude Lévi-Strauss)
Dedico este trabalho aos meus pais que sempre
me incentivaram a buscar a realização dos
meus sonhos. De modo especial à minha mãe,
uma mulher guerreira que sempre se
dedicou a me dar uma boa educação, passando
desenvolvimento do trabalho e por me fazer acreditar que meu sonho seria possível.
Ao meu coorientador Saulo Luís da Silva por todo apoio, pela amizade e consideração. Obrigada por estar comigo desde a graduação.
Aos professores Daniel Martins de Souza, Denise Vaz de Macedo e Eneida de Paula pela orientação no Programa de Estágio Docência no qual eu pude viver novas experiências e aprender mais sobre Bioquímica.
Aos professores das bancas de qualificação e defesa de tese: Dra. Ana Carolina Galvão, Dra. Flávia Winck, Dra Juliana Cassoli, Dr. Daniel Martins, por participarem da avaliação do trabalho, auxiliando na melhoria e enriquecimento do mesmo.
Ao meu amigo e companheiro de laboratório Rafael Almeida que esteve ao meu lado desde o início do curso, nos momentos mais serenos e nos momentos difíceis, me apoiando e me incentivando a acreditar em mim mesma.
Aos meus colegas de laboratório pela cooperação e ajuda no desenvolvimento do trabalho. Também aos colegas do Laboratório de Neuroproteômica e do Laboratório de Junção Neuromuscular por todo o auxílio.
À minha amiga e companheira de pós-graduação Thais por todos os conselhos, pelas risadas e pelo companheirismo nos momentos bons e ruins.
Aos demais amigos que a vida me deu pelo apoio e por também acreditarem no meu sonho.
Ao Charles que nos momentos finais tornou-se muito importante, acalmando-me com seus conselhos, sua paciência e atenção.
À minha mãe pelo grande apoio e cumplicidade, pelas orações, pelo incentivo e por acreditar que tudo daria certo.
Ao meu pai pelo auxílio em alguns trabalhos, pelos momentos de descontração e por todo o apoio.
À CAPES pelo apoio financeiro, sem o qual não seria possível o desenvolvimento deste trabalho.
produzidas em uma glândula específica e que são naturalmente adaptados pela seleção natural para atuar em sistemas vitais da presa a fim de imobilizar e digerir a mesma. As fosfolipases A2 (PLA2s) são as principais e mais estudadas enzimas dos venenos de serpentes, sendo extremamente tóxicas e apresentando uma série de efeitos farmacológicos característicos dos envenenamentos. Neste trabalho foram isoladas e caracterizadas duas fosfolipases A2, uma básica (APL-TX-I) e outra ácida (APL-TX-II), a partir do veneno da serpente Agkistrodon piscivorus leucostoma, a fim de melhor compreender as características bioquímicas e os papéis das PLA2s em acidentes por animais peçonhentos.
Ambas as fosfolipases foram purificadas por meio de duas etapas cromatográficas, exclusão molecular em coluna Superdex-75 e cromatografia líquida de alta eficiência fase reversa (HPLC-FR) em coluna C-18. O grau de pureza das duas proteínas foi confirmado por uma recromatografia em coluna C-18, gel SDS-PAGE e espectrometria de massas. Tanto APL-TX-I quanto APL-TX-II apresentam-se como monoméricas e possuem massa molecular de 14003,2256 Da e 13885,7930 Da, respectivamente. O ponto isoelétrico calculado para APL-TX-I é 7,93, o que a caracteriza como uma proteína básica e para APL-TX-II é de 5,12, caracterizando-se como uma proteína ácida.
APL-TX-I e APL-TX-II possuem estruturas primárias bastante similares a outras fosfolipases já caracterizadas apresentando domínios altamente conservados característicos de fosfolipases de tipo A2 sendo ambas definidas como D49. APL-TX-II apresenta alta atividade enzimática sobre o substrato sintético não micelar ácido 4-nitro-3-octanoiloxibenzóico (NOBA), enquanto APL-TX-I apresenta atividade moderada sobre o mesmo substrato. APL-TX-II mostrou-se altamente neurotóxica em preparações musculares biventer
cervicis de pintainhos, provocando bloqueio da contração muscular. Em
contrapartida, APL-TX-I provocou atividade miotóxica baixa e atividade edematogênica moderada.
efeitos tóxicos do envenenamento por Agkistrodon piscivorus leucostoma. Essas informações são relevantes para o desenvolvimento de novas ferramentas moleculares e para a melhor compreensão dos mecanismos tóxicos e farmacológicos das fosfolipases A2 ácidas e básicas provenientes de venenos de serpentes, buscando as melhores formas de tratamento para acidentes com estes animais.
specific gland and that are naturally adapted by natural selection to act on vital systems of prey in order to immobilize and digest it. Phospholipases A2 (PLA2) are the first and most studied enzymes from snake venoms. They are extremely toxic and show a series of characteristic pharmacological effects of poisonings. In this work two phospholipases A2 were isolated from the venom of Agkistrodon piscivorus leucostoma and were biochemical and pharmacologically characterized, in order to better understand the biochemical characteristics and roles of PLA2 in envenomations.
Both phospholipases were purified by two chromatographic steps. First we used Superdex-75 column in the size exclusion and a C18 column in reverse phase high-performance liquid chromatography steps. The purity of proteins was confirmed by another C-18 reversed phase chromatography, SDS-PAGE gels and mass spectrometry. Both APL-TX-I and APL-TX-II present as monomeric and have a molecular weight of 14003,2256 Da and 13885,7930 Da, respectively. The theoretical isoelectric value APL-TX-I is 7.93, which characterizes it as a basic protein and for APL-TX-II is 5.12, characterized as acidic protein.
APL-TX-I and APL-TX-II have very similar primary structures with other phospholipases characterized by presence of conserved domains characteristic of phospholipase A2. Thus, they were classified as D49. APL-TX-II has high activity on the non micellar synthetic substrate 4-nitro-3-octanoyloxybenzoic acid (NOBA) while APL-TX-I shows moderate activity on the same substrate. Enzyme APL-TX-II was highly neurotoxic in muscle preparations biventer cervicis chicks, leading to blockage of muscle contraction. In contrast, APL-TX-I caused low myotoxic activity and moderate edema activity.
The results of this study show that both proteins studied play an important role in inducing toxic effects of poisoning Agkistrodon piscivorus
leucostoma. This information is relevant to the development of new molecular
tools and a better understanding of toxic and pharmacological mechanisms of acidic and basic phospholipase A2 from snake venoms.
Figura 1. Agkistrodon piscivorus leucostoma...26
Figura 2. Representação de uma PLA2...28
Figura 3. Mecanismo catalítico das PLA2s...30
Figura 4. Representação da alça de ligação ao cálcio...31
Figura 5. Contribuição enzimática de uma enzima PLA2 para os efeitos farmacológicos...40
Figura 6. Mecanismo não enzimático de uma PLA2 que produz efeitos farmacológicos...41
Figura 7. Ação de uma PLA2 sobre o substrato ácido 4-nitro-3-octanoiloxibenzóico (NOBA)...47
Figura 8. Perfil cromatográfico do veneno total de A. p. leucostoma em um sistema de duas colunas superdex-75 acopladas em série...58
Figura 9. Atividade enzimática PLA2 das frações obtidas após cromatografia de exclusão molecular...59
Figura 10. Perfil cromatográfico em HPLC fase reversa, coluna C-18...60
Figura 11. Comparação entre as atividades catalíticas...61
Figura 12. Cromatografia em HPLC de fase reversa utilizando coluna Supelco C18...62
Figura 13. Eletroforese em SDS-PAGE realizado em condições redutoras (DTT) e não redutoras...63
Figura 14. Efeito do pH sobre a atividade enzimática de PLA2...64
Figura 17. Gráfico de Linewaever-Burk (duplo recíproco)...67
Figura 18. Efeito de diferentes íons divalentes na atividade fosfolipásica...68
Figura 19. Espectro de massa intacta de APL-TX-I...69
Figura 20. Espectro de massa intacta de APL-TX-II...70
Figura 21. Alinhamento múltiplo de APL-TX-I com outras PLA2s de venenos de serpentes...72
Figura 22. Alinhamento múltiplo de APL-TX-II com outras PLA2s de venenos de serpentes...73
Figura 23. Atividade miotóxica local...74-75 Figura 24. Comparação entre a miotoxicidade induzida por APL-TX-I e APL-TX-II...75
Figura 25. Cortes histológicos do músculo gastrocnêmio...76
Figura 26. Atividade miotóxica sistêmica...77
Figura 27. Atividade edematogênica...78
Figura 28. Registro miográfico da incubação de preparação de biventer cervicis...79
Tabela 1. Número de acidentes por animais peçonhentos...22 Tabela 2. Massas moleculares experimentais e sequências de aminoácidos de
peptídeos trípticos obtidos da fosfolipase A2 APL-TX-I...71
Tabela 3. Massas moleculares experimentais e sequências de aminoácidos de
peptídeos trípticos obtidos da fosfolipase A2 APL-TX-II...71
Tabela 4. Ação antibacteriana da fosfolipase A2 APL-TX-I...81
PLA2 Fosfolipase A2
PLA2 D49 Fosfolipase A2 cataliticamente ativa PLA2 K49 Fosfolipase A2 cataliticamente inativa
sPLA2 Fosfolipase A2 secretória
cPLA2 Fosfolipase A2 citosólica
iPLA2 Fosfolipase A2 independente de cálcio PAF-AH Fator ativador de plaquetas - acetil-hidrolase
PDB Protein Data Bank
TFA Ácido trifluoroacético
FPLC Cromatografia líquida rápida de proteínas HPLC-FR Cromatografia liquida de alta eficiência fase reversa
NOBA Acido 4-nitro-(3-octanoiloxi) benzoico
DTT Ditiotreitol
ANOVA Analise de variância
PBS Tampão fosfato salina
CK Creatina quinase
SDS-PAGE Eletroforese em gel poliacrilamida – dodecil sulfato de sódio
MK Marcador de peso molecular
VT Veneno total
ESI Ionização por eletrospray
Gly, G Glicina Ala, A Alanina Pro, P Prolina Val, V Valina Leu, L Leucina Ile, I Isoleucina Met, M Metionina Phe, F Fenilalanina Tyr, y Tirosina
Thr, T Treonina Cys, C Cisteína Asn, N Asparagina Gln, Q Glutamina Lys, K Lisina His, H Histidina Arg, R Arginina
BCp Preparação Biventer cervicis
ACh Acetilcolina
KCl Cloreto de potássio
pI Ponto isoelétrico
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
APL-TX-I Toxina PLA2 I de Agkistrodon piscivorus leucostoma APL-TX-II Toxina PLA2 II de Agkistrodon piscivorus leucostoma
1.1 . Família Viperidae...24
1.2 . Agkistrodon piscivorus leucostoma...25
1.3 . Fosfolipases A2 (PLA2)...27
1.3.1. Mecanismo catalítico...29
1.3.2. Efeitos farmacológicos...32
1.3.2.a.Atividade miotóxica...34
1.3.2.b. Efeito anticoagulante...35
1.3.2.c. Ação inflamatória...36
1.3.2.d. Ação antibacteriana...37
1.3.2.e. Atividade neurotóxica...38
1.3.3. Papel da atividade catalítica sobre os efeitos farmacológicos...39
1.3.4. Fosfolipases A2 ácidas e fosfolipases A2 básicas...43
2. OBJETIVOS...45 2.1 . Objetivo geral...45 2.2 . Objetivos específicos...45 3. MATERIAIS E MÉTODOS...46 3.1 . Veneno...46 3.2 . Animais...46
3.3 . Purificação e caracterização bioquímica das fosfolipases A2 APL-TX-I e APL-TX-II...46
3.3.1. Gel filtração...46
3.3.2. Atividade enzimática de PLA2...47
3.3.3. HPLC fase reversa...48
3.3.4. Eletroforese SDS-PAGE...48
3.3.5. Ensaios cinéticos...49
3.3.5.d. Efeito da presença de íons divalentes...50
3.3.6. Análise por Espectrometria de massas...50
3.3.6.a. Determinação da massa de I e APL-TX-II...50
3.3.6.b. Digestão das amostras...51
3.3.6.c. Análise das proteínas digeridas...52
3.4. Caracterização farmacológica...53
3.4.1. Atividade miotóxica local...53
3.4.2. Análise histológica do músculo gastrocnêmio...54
3.4.3. Atividade miotóxica sistêmica...54
3.4.4. Atividade inflamatória (Edema de pata)...55
3.4.5. Atividade Neurotóxica...55
3.4.6. Efeito sobre a coagulação...56
3.4.7. Atividade Antibacteriana...57
3.5. Análise Estatística...57
4. RESULTADOS...58
4.1. Purificação a partir do veneno total de Agkistrodon piscivorus leucostoma de APL-TX-I e APL-TX-II e atividade fosfolipásica...58
4.2. Caracterização Bioquímica das fosfolipases A2 Apl-TX-I e Apl-TX-II...62
4.2.2. Ensaios cinéticos...63
4.2.2.a. Efeito do pH...64
4.2.2.b. Efeito da temperatura...65
4.2.2.c. Efeito da concentração de substrato...66
4.2.2.d. Efeito da presença de íons divalentes...68
4.3. Análise Estrutural...69
4.3.1. Determinação das massas moleculares por Espectrometria de Massas de APL-TX-I e APL-TX-II...69
4.3.2. Peptídeos trípticos das PLA2s APL-TX-I e APL-TX-II...70
4.3.3. Alinhamento múltiplo das sequências de APL-TX-I e APL-TX-II...72
4.4. Caracterização farmacológica das fosfolipases A2 Apl-TX-I e Apl-TX-II...74
4.4.1. Atividade Miotóxica...74
4.4.1.a. Atividade miotóxica local...74
4.4.1.b. Análise histológica...76
4.4.1.c. Atividade miotóxica sistêmica...77
4.4.2. Atividade Edematogênica...78
4.4.3. Atividade Neurotóxica...79
4.4.4. Efeito sobre a coagulação...80
4.4.5. Atividade Antibacteriana...81
1. INTRODUÇÃO
A capacidade de produção de substâncias tóxicas de diversos animais intriga os seres humanos há milênios. Com o passar dos anos o interesse e o estudo de toxinas cresceu e se tornou o que hoje é conhecido como toxinologia. No entanto, ainda existe uma extrema necessidade de pesquisa de base na área, tendo em vista que muitas substâncias e venenos ainda são desconhecidos (MACKESSY, 2009).
Acidentes por animais peçonhentos em todo o mundo continuam a ser uma fonte significativa de morbidade e mortalidade para os seres humanos e animais domésticos em muitos países. No Brasil ocorrem em média 20.000 casos de envenenamento por ano, com letalidade de aproximadamente 0,4%, (LIMA, 2009; FUNASA, 2001). A tabela 1 apresenta o número de casos de acidentes por estes animais em cada estado brasileiro nos últimos trinta anos. Os répteis, em especial os pertencentes à ordem Squamata (escamados), são os principais vertebrados causadores de acidentes por envenenamento. Dentre eles destacam-se as serpentes, possuindo peçonhas extremamente potentes. Os acidentes por animais peçonhentos e, em particular, os acidentes ofídicos foram incluídos, pela Organização Mundial da Saúde, na lista das doenças tropicais negligenciadas que acometem na maioria dos casos populações pobres que vivem em áreas rurais. Em agosto de 2010, o agravo foi incluído na Lista de Notificação de Compulsória (LNC) do Brasil, publicada na Portaria Nº 2.472 de 31 de agosto de 2010 (ratificada na Portaria Nº 104, de 25 de janeiro de 2011).
S É RIE HIS T ÓRICA DE CA S OS AC IDE NT E P OR ANIM AIS P E ÇONH E NT OS Região e UF 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013* 2014* 2015* TOTAL Região Norte 522 1864 2.134 2.115 2.383 2.383 2.517 2.878 2.436 2.570 2.957 1.891 3.092 1.806 3.468 5.279 7.146 9.312 10.038 11.576 11.805 11.091 12.111 13.870 13.705 14.386 15.091 16.117 16.427 14.442 18.543 Rondônia 128 429 335 434 371 401 548 576 513 547 343 --- 189 254 430 541 669 1.103 1.016 1.061 871 669 592 675 737 737 870 901 1.084 962 17.986 Acre 42 132 178 119 107 92 99 85 147 145 83 66 150 1 121 111 200 251 309 415 433 419 581 665 787 809 887 957 963 985 10.339 Amazonas 98 341 394 291 257 183 234 318 331 214 554 4 57 118 349 328 720 1.089 1.572 2.018 2.046 1.583 1.959 2.248 1.955 1.958 2.444 2.681 2.634 2.038 31.016 Roraima 16 37 66 61 75 72 45 30 --- 43 41 45 33 2 21 92 219 193 272 272 393 396 328 496 369 491 645 616 627 445 6.441 Pará 205 776 1.020 765 886 1.149 1.121 1.252 942 1.017 1.207 1.114 1.996 1.375 2.038 3.498 4.202 5.281 5.388 6.124 6.273 6.359 6.681 7.388 7.251 7.609 7.430 8.198 7.917 7.022 113.484 Amapá 33 149 141 145 194 137 165 207 120 230 161 151 212 3 26 22 140 281 372 387 454 425 417 439 349 404 484 474 629 485 7.836 Tocantins # # ... 300 493 349 305 410 383 374 568 511 455 53 483 687 996 1.114 1.109 1.299 1.335 1.240 1.553 1.959 2.009 2.098 2.073 2.290 2.573 2.505 29.524 Região Nordeste 2.091 4.310 3.067 2.558 2.819 2.890 2.677 3.368 3.500 3.876 3.315 4.047 3.082 3.886 11.784 14.698 18.388 18.464 20.965 24.836 27.937 29.317 29.235 36.492 30.654 45.816 43.636 52.721 59.086 47.850 565.725 Maranhão 69 256 255 225 291 228 89 106 212 273 259 302 ... 71 370 805 1.293 1.443 1.296 1.684 1.696 1.760 1.705 1.801 2.039 2.251 1.981 2.403 2.462 2.089 29.714 Piauí 63 230 75 68 57 34 78 65 84 178 219 155 129 73 446 565 470 561 480 648 665 586 670 1.016 924 1.120 1.268 2.435 2.218 1.946 17.526 Ceará 251 413 387 282 166 144 304 196 228 426 234 477 344 49 80 673 1.113 1.180 1.556 1.821 1.349 1.489 1.336 1.875 2.189 3.489 3.330 4.330 4.383 3.460 37.554 Rio Grande do Norte 539 537 287 233 250 249 150 113 62 95 27 81 62 560 1.642 1.669 188 1.736 1.978 1.950 1.990 1.727 2.086 3.381 3.666 4.357 4.289 4.739 5.610 5.247 51.197 Paraíba 165 488 345 289 203 177 206 150 ... 472 469 368 226 5 307 200 664 627 767 1.321 1.559 1.767 1.788 2.101 2.231 2.918 3.292 3.805 4.399 3.618 34.927 Pernambuco 114 344 234 175 131 126 175 144 199 209 187 372 332 119 962 1.575 2.151 3.258 4.662 5.406 7.992 8.466 6.962 6.853 6.757 7.729 7.808 10.336 12.818 9.821 106.417 Alagoas 11 39 12 47 48 94 9 11 14 75 36 13 59 2.555 2.829 2.488 2699 2.531 2.826 2.811 3.161 3.759 4.454 4.940 6.003 6.637 6.556 8.151 9.667 7.343 79.878 Sergipe 142 268 263 187 227 153 208 160 182 178 219 263 207 80 28 62 80 57 116 126 235 568 637 820 1.058 1.157 1.048 1.203 1.244 1.274 12.450 Bahia 737 1.735 1.209 1.052 1.446 1.645 1.458 2.423 2.519 1.970 1.665 2.016 1.723 374 5.120 6.661 8.033 7.071 7.284 9.069 9.290 9.195 9.597 13.705 13.416 15.254 13.268 15.319 16.285 13.052 193.591 Região Sudeste 4.712 9.392 8.391 8.836 7.943 8.183 8.183 7.652 9.027 7.003 5.275 5.652 6.334 9.390 10.744 18.461 22.151 24.062 29.603 32.308 30.541 30.170 34.244 40.503 40.308 44.571 50.717 58.055 58.544 53.617 684.572 Minas Gerais 606 1.764 1.613 1.791 1.664 1.665 1.985 1.276 1.839 1.413 1.242 1.249 1.143 1.674 2.137 8.962 11.305 12.621 15.455 16.841 16.329 16.108 17.770 21.299 20.063 22.538 25.109 29.420 29.931 27.538 314.350 Espirito Santo 1.667 4.356 3.542 3.608 3.390 3.617 3.259 3.527 4.187 2.892 1.717 2.162 3.034 519 1.315 1.191 1.538 1.383 2.352 2.490 2.108 2.302 2.770 2.778 2.981 3.944 4.083 4.517 4.735 3.639 85.603 Rio de Janeiro 482 1.174 974 1.024 733 924 974 971 979 906 724 734 513 14 483 593 573 858 961 1.042 1.131 1.109 1.119 1.175 1.168 1.006 1.375 1.411 1.295 1.062 27.487 São Paulo 1.957 2.098 2.262 2.413 2.156 1.977 1.965 1.878 2.022 1.792 1.592 1.507 1.644 7.183 6.809 7.715 8.735 9.200 10.835 11.935 10.973 10.651 12.585 15.251 15.379 16.413 19.362 22.707 22.583 21.378 254.957 Região Sul 1.269 3.079 2.867 3.593 3.343 3.341 3.919 3.846 3.087 3.711 3.734 2.979 2.765 2.277 3.464 12.629 14.745 17.927 19.608 20.759 20.821 27.001 25.110 26.558 27.304 28.209 25.540 27.429 28.300 27.132 396.409 Paraná 431 988 924 1.179 1.163 959 1.247 1.249 1.197 1.107 1.047 862 779 197 565 8.328 8.823 10.546 11.678 12.051 11.730 15.604 13.947 14.252 13.621 13.666 12.290 13.559 14.416 13.798 202.203 Santa Catarina 283 873 643 1.095 859 1.080 1.108 1.170 971 1.014 1.042 849 742 2.041 2.286 2.881 3.826 5.001 5.233 6.046 6.202 7.690 7.422 8.065 8.803 9.204 8.677 9.344 8.907 8.400 121.757 Rio Grande do Sul 555 1.218 1.300 1.319 1.321 1.302 1.564 1.427 919 1.590 1.645 1.268 1.244 39 613 1.420 2.096 2.380 2.697 2.662 2.889 3.707 3.741 4.241 4.562 5.031 4.278 4.589 4.977 4.934 71.528 Região Centro-Oeste 1.016 2.919 3.368 3.861 3.186 2.669 3.670 3.214 3.213 2.799 2.730 3.150 2.786 225 2.286 2.891 3.518 4.073 4.548 5.003 4.895 4.180 5.366 6.243 6.728 7.302 8.748 8.462 9.210 6.963 129.222 Mato Grosso do Sul 300 716 844 854 745 512 1.354 838 728 734 539 649 620 223 362 315 390 470 630 742 776 542 1.099 1.156 1.147 1.641 2.255 1.854 2.252 1.911 27.198 Mato Grosso 150 489 586 798 687 501 755 666 806 569 840 1.244 809 2 88 591 931 1.105 1.404 1.518 1.584 1.655 1.799 2.139 2.321 2.161 2.311 2.397 2.138 1.198 34.242 Goiás 392 1.300 1.700 1.817 1.549 1.400 1.375 1.453 1.245 1.258 1.232 1.138 1.226 0 1.387 1.549 1.923 2.126 2.173 2.424 2.232 1.726 2.061 2.482 2.588 2.643 3.214 3.344 3.926 3.148 56.031 Distrito Federal 174 414 238 392 205 256 186 257 434 238 119 119 131 0 449 436 274 372 341 319 303 257 407 466 547 699 790 867 894 706 11.290 Brasil 9.610 21.564 19.827 20.963 19.674 19.426 20.966 20.958 21.263 19.959 18.011 17.719 18.059 17.584 31.146 53.958 65.948 73.838 84.762 94.482 95.999 101.759 106.066 123.666 127.099 140.284 143.732
162.847 171.567 150.004 1.962.471
Peçonhas de animais são secreções extraordinariamente complexas produzidas em uma glândula específica e que são naturalmente adaptados pela seleção natural para atuar em sistemas vitais da presa a fim de imobilizar e digerir a mesma (VONK et al., 2008; CALKOSINSKI et. al., 2010). São compostos por inúmeras moléculas, tais como proteínas, enzimas, carboidratos, lipídeos e de peptídeos biologicamente ativos que apresentam diferentes atividades farmacológicas e bioquímicas (BIEBER, 1979; EGGERTSEN, et al., 1979; PEREZ e SANCHEZ, 1990). Entretanto, a maior parte dos componentes das peçonhas é formada por peptídeos e proteínas, sendo estes os principais responsáveis pela vasta gama de propriedades tóxicas (KOH et al., 2006). A literatura tem relatado diferentes níveis de variação no que diz respeito a: composição dos venenos em relação aos grupos taxonômicos, entre diferentes indivíduos de uma mesma população, durante as diferentes idades do animal, variando também de acordo com o tamanho, peso e/ou local de ocorrência, dentre vários outros fatores. Apesar dessa tamanha complexidade, as proteínas presentes nas peçonhas de serpentes pertencem a um número relativamente pequeno de famílias proteicas (CALVETE et al., 2007, CHIPPAUX et al., 1991).
Por um lado, peçonhas de algumas serpentes do mar (família Elapidae) podem ser extremamente simples na composição, contendo apenas duas famílias principais de proteínas. Por outro lado, peçonhas de muitas serpentes, como mambas (família Elapidae) e cascavéis (família Viperidae), podem conter de cinquenta a cem componentes proteicos, representando de dez a vinte famílias de proteínas (PERKINS et al, 1993; PERKINS e TOMER, 1995; SANZ
et al, 2006).
Muitas dessas substâncias ainda são incógnitas no que diz respeito à sua relação entre estrutura e função, tendo em vista que, apesar de possuírem estruturas muito semelhantes, apresentam diferentes atividades farmacológicas. Além disso, o estudo de peçonhas tem contribuído fortemente para o desenho e desenvolvimento de novos fármacos.
Muitos compostos isolados a partir de fontes naturais têm sido utilizados como drogas altamente eficazes para o tratamento de doenças humanas (FOX e SERRANO, 2007). Um caso clássico é o fármaco Captopril, um peptídeo
potencializador de bradicinina isolado a partir do veneno de Bothrops jararaca, amplamente utilizado em todo o mundo para o tratamento de hipertensão arterial. (FERREIRA, 1964; OPIE e KOWOLIK, 1995; SMITH e VANE, 2003; LEWIS e GARCIA, 2003).
Embora a composição do veneno varie, muitas vezes de forma significativa (TU, 1982, 1991; MÉNEZ, 2002), espécies mais estreitamente relacionadas, por exemplo, ao nível da família, tendem a ter peçonhas que são mais similares em sua composição. No entanto, o componente filogenético de variação na composição da peçonha ainda não foi completamente elucidado.
1.1. Família Viperidae
Viperidae é uma extensa família de serpentes venenosas, incluindo cerca de 270 espécies distribuídas pelo mundo. São facilmente identificadas pela cabeça triangular, recoberta por pequenas escamas em forma de quilha de aspecto similar às do corpo, pupila em forma de fenda, além da presença de fosseta loreal entre os olhos e a narina. Estas serpentes são caracterizadas por seu tamanho e espessura grandes, sendo notadamente lentas em seus movimentos (MALLOW et al., 2003). Possuem o aparato de veneno mais sofisticado entre as serpentes com dentição solenóglifa, que se caracteriza pela presença de dentes inoculadores retráteis posicionados na parte anterior do maxilar superior móvel, contendo um canal no interior do dente por onde passa o veneno durante o ataque. Tal aparato é associado com a história de vida de tais indivíduos como predadores de emboscada, ativos principalmente à noite, predominantemente sedentários que se alimentam de presas relativamente grandes (GREENE, 1992; WÜSTER et al., 2008).
As serpentes da família Viperidae representam um problema de Saúde Pública, pois são responsáveis pela maioria e pelos mais graves acidentes ofídicos registrados, não só no Brasil, mas também em outros países americanos. A peçonha dessas serpentes tem uma composição química muito complexa, com presença de diversas toxinas e enzimas que afetam múltiplos processos fisiológicos (ROJAS et al., 2001). Os envenenamentos provocados por estas serpentes possuem efeitos locais e sistêmicos (GUTIÉRREZ et al., 2005; WHITE, 2005), ou seja, acometem tanto a região da picada quanto os
tecidos e órgãos afastados do local. Tais efeitos se manifestam por volta de 2-3 horas após a inoculação do veneno, através de coagulopatias, choque cardiovascular e insuficiência renal (ROJAS et al., 2001; FRANÇA e MÁLAQUE, 2003).
A família Viperidae inclui duas grandes subfamílias: Viperinae e Crotalinae, sendo esta última a maior e mais importante delas. As serpentes da subfamília Crotalinae são conhecidas como serpentes de fosseta ‗pit viper‘, que possuem a forma característica de fosseta térmica, formadas principalmente por vários gêneros venenosos estendidos pelas Américas e algumas espécies na Ásia (CHAVES et al., 1996; MCDIARMID et al., 1999). A subfamília agrega 27 gêneros, dos quais se pode destacar: Agkistrodon, Bothriechis, Bothriopsis,
Bothrops, Crotalus, Lachesis, Porthidium, Trimeresurus, dentre outros (VIDAL et al., 2007).
1.2. Agkistrodon piscivorus leucostoma
Identificadas e classificadas pelo geólogo norte-americano Gerard Troost em 1836, serpentes da espécie Agkistrodon piscivorus leucostoma, também são conhecidas como ―serpentes ocidentais boca de algodão‖ (do inglês ―western cottonmouth snake‖). São jararacas de grande porte típicas de zonas temperadas do sudeste dos Estados Unidos, sendo muito comum no estado do Texas. Como serpentes semiaquáticas, vivem preferencialmente em zonas úmidas, ocupando fontes de água doce (geralmente salobras), corpos de água, baías, restingas, lagoas, riachos, valas, e até mesmo no fundo dos rios (Mitchell, 1994; Wilson, 1995). Podem ser encontradas também debaixo de ramos e troncos de árvores localizados em estreita proximidade com a água. Dentro da sua área geográfica é possível encontrar um número abundante de indivíduos dessa espécie. (Conant e Collins, 1991; Gloyd e Conant, 1990).
Indivíduos da espécie A. p. leucostoma podem chegar a até 2,0 m de comprimento e pesar em torno de 1,7-2,0 Kg. Os machos são geralmente mais longos, mais pesados, e tem um maior número de escamas subcaudais que as fêmeas. Geralmente apresentam-se nas cores preta, marrom e verde-oliva, mas sua característica mais marcante é a parte interna da boca de coloração
branco brilhante (figura 1), o que lhes dá seu nome popular, ―boca de algodão‖ ou ―cottonmouth‖ (Means, 2004; Mitchell, 1994).
Indivíduos da espécie A. p. leucostoma são solitários, de hábito noturno e não costumam ir muito longe de seu habitat, locomovendo-se em no máximo 1,0 ha. Cerca de 7% de todos os casos de envenenamento ofídico do Texas envolvem A. p. leucostoma. Nos Estados Unidos, menos de 1% de todas as mortes causadas por picada de cobra são associadas a essas serpentes (DIXON e WERLER, 2005). Apesar disso, assim como a maioria dos viperídeos, são muito perigosas, agressivas e picam quando são perturbadas ou provocadas. Detectam presas principalmente por meio do olfato, seu sentido mais apurado, geralmente preferem animais de sangue quente e são capazes de consumir presas muito maiores que seu tamanho a fim de estocar energia, visto que se alimentam com pouca frequência (SECOR et al, 1994; SECOR e DIAMOND, 1995). Antes do ataque dão sinais de alerta, agitam a cauda para frente e para trás, fazendo um barulho sussurrante, elevando a cabeça do chão e enrolando-se enquanto expõe sua boca branca aberta. Como um mecanismo de defesa em uma situação em que são ameaçadas elas liberam um mau cheiro característico (GIBBONS e DORCAS, 2002; MITCHELL, 1994; ROTH e NOBLE, 2005).
1.3. Fosfolipases A2 (PLA2)
As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) estão entre os principais e mais estudados componentes protéicos das peçonhas de serpentes e exercem uma variedade de atividades farmacológicas, incluindo a agregação plaquetária, atividade pró-inflamatória, anticoagulante, hipotensiva, hemolítica e bactericida, bem como miotoxicidade e neurotoxicidade(CALVETE et al., 2009 KINI, 2003). São encontradas de maneira ubíqua na natureza e podem ser: secretórias (sPLA2), citosólicas (cPLA2), Ca2+ independentes (iPLA2), acetil-hidrolases - fator ativador de plaquetas (PAF-AH). As sPLA2s possuem baixa massa molecular, são dependentes da presença de Ca2+ e apresentam uma histidina em seu sítio ativo. Em contraste, as demais PLA2 (cPLA2, iPLA2, e PAF-AH) são de elevado peso molecular, independentes de Ca2+ e possuem um resíduo de serina no sítio ativo (SIX e DENNIS, 2000).
As PLA2s de mamíferos não apresentam toxicidade e desempenham um papel importante em diversos processos fisiológicos, tais como proliferação celular, fertilização, contração do músculo liso, hipersensibilização, dentre outros, (KINI, 2003) e em algumas patologias, como reumatismo, osteoartrite, asma, e psoríase. Por outro lado, as PLA2s de peçonhas de serpentes estão entre as proteínas tóxicas mais agressivas e desempenham função importante na imobilização e morte da presa (GHAZARYAN et al, 2015). Tais proteínas interferem em processos fisiológicos das presas ou vítimas, desencadeando uma série de efeitos farmacológicos, como neurotoxicidade, miotoxicidade, efeitos anticoagulantes, atividade hemolítica, indução de edema, atividade hipotensiva, atividade bactericida, dentre outros.
As PLA2s secretórias são encontradas em diversas fontes, tais como venenos de cobras, escorpiões, componentes de sucos pancreáticos, fluido sinovial de artrite e em muitos tecidos de mamíferos diferentes. São caracterizadas por um baixa massa molecular (em torno de 14 kDa), possuem entre 115 e 133 resíduos de aminoácidos em sua cadeia polipeptídica, histidina no sítio catalítico, Ca2+ ligado ao sitio ativo. Além disso, essas proteínas apresentam quatorze resíduos de cisteína, responsáveis pela formação de uma
rede rígida de sete ligações dissulfeto, estabilizando, assim, sua estrutura terciária (KINI, 2003; MAGRO et al., 2009; SCOTT, 1997). Além disso, apresentam alguns domínios bastante conservados (figura 2), tais como uma hélice N-terminal (hélice 1), uma alça de ligação ao cálcio e um canal hidrofóbico, formado pelas hélices 2, 3 e pelo sítio catalítico (KINI, 2003; SCOTT, 1997).
Figura 2. Representação de uma PLA2. Isoforma CB1 da crotoxina B do
veneno de Crotalus durissus terrificus (PDB id: 2QOG) – programa ―PyMol‖ (DeLano, 2002). A esfera preta representa íon Ca2+.
As PLA2s catalisam a hidrólise dos fosfolipídeos de membrana através do mecanismo de captação de um próton a partir de uma molécula de água, que é ativada pela presença de uma histidina juntamente com a presença de um ácido aspártico. Em seguida, ocorre um ataque nucleofílico sobre a ligação sn-2 do grupamento acila (daí a denominação A2). (SCOTT et al, 1990; YU e DENNIS, 1991). As PLA2s têm papel fundamental no metabolismo de lipídeos e estão intimamente relacionadas com a liberação do ácido araquidônico, um precursor de lipídeos bioativos tais como prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos.
As primeiras PLA2s identificadas receberam o nome de hemolisinas, devido à sua capacidade de hemolisar hemácias indiretamente e foram purificadas a partir do veneno de Naja naja e Naja tripudians (DE, 1944). A partir de então, centenas de PLA2s de veneno de serpente foram purificadas e caracterizadas. Essas PLA2s partilham de 40 a 99% de identidade em suas sequências de aminoácidos, e, portanto, apresentam similaridade em sua estrutura tridimensional (SCOTT, 1997). No entanto, elas diferem significativamente nas suas propriedades farmacológicas. A capacidade comum de catalisar a hidrólise de fosfolipídios na posição sn-2 e a falta de correlação entre a atividade enzimática e a toxicidade ou potência farmacológica (ROSENBERG, 1997a, 1997b), tornam intrigantes os mecanismos pelos quais essas enzimas induzem um amplo espectro de efeitos farmacológicos. Assim, as diferenças funcionais entre as PLA2s e a relação estrutura-função são sutis, complicadas e desafiadoras.
1.3.1. Mecanismo catalítico
As fosfolipases A2 representam um modelo para as reações enzimáticas dependentes de cálcio numa interface lipídeo-água. São as únicas enzimas que apresentam alta solubilidade em água e atuam, no entanto, em substratos insolúveis na mesma (KINI, 2003). Desempenham suas atividades hidrolíticas preferencialmente quando o substrato encontra-se na forma de agregados, ao invés da forma monomérica, tais como micelas, monocamadas, vesículas e membranas. (SCOTT et al, 1990; BURKE e DENNIS, 2008).
O mecanismo de catálise das PLA2s foi proposto por Verheiji e colaboradores (1980) com base na comparação estrutural com serino proteases. sPLA2s exibem especificidade para uma ampla gama de fosfolipídeos, com diferentes grupos de cabeça polar e cadeias de ácidos graxos. Fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico são seus substratos mais comuns que induzem à formação de diferentes lisofosfolipídeos (de PAULA et al., 2009). O mecanismo pelo qual a enzima hidrolisa o fosfolipídeo envolve a interação
altamente específica entre a histidina do sítio ativo, fortemente conservada na posição 48 das sPLA2s, a concentração de Ca2+, seu importante cofator, uma molécula de água, que atua como nucleófilo, e o substrato glicerofosfolipídeo.
Figura 3. Mecanismo catalítico das PLA2s (JANSSEN et al., 1999). O
fosfolipídeos está destacado em azul.
Além das His48 no sítio ativo, Asp99 e dois resíduos de Tyr (Tyr 52 e Tyr73) também estão envolvidos na formação da rede catalítica. Durante a catálise, a His48, assistida por Asp99, polariza a molécula de água, que, por sua vez, ataca a ligação sn-2 do fosfolipídio, formando um intermediário oxiânion tetraédrico (SCOTT, 1997). O cálcio atua como eletrólito durante a catálise e é coordenado pelo átomo de oxigênio do Asp49 (ROGERS et al., 1996; SCOTT, 1997; EDWARDS et al, 2002). No mecanismo completo de catálise (figura 3), o próton presente na posição 3 do anel imidazólico da His-48 apresenta forte interação com o grupo carboxilato do Asp-99, fixando o anel imidazólico e permitindo que o nitrogênio da posição 1 deste anel (envolvido na catálise) esteja em posição espacial apropriada. Ocorre, então, um ataque nucleofílico ao carbono do grupo éster do substrato, promovido por uma
molécula de água. Subsequentemente, o anel imidazólico da His-48 recebe um próton da molécula de água, facilitando a reação. Este próton é posteriormente doado pelo anel imidazólico para o oxigênio do fosfolipídeo, que forma então o grupo álcool do lisofosfolipídeo a ser liberado (BERG et al, 2001; VERHEIJ et
al., 1980 a, b). Por fim, após a protonação do lisofosfolipídeo formado,
juntamente com a desprotonação do nitrogênio δ1 da histidina, observa-se que o sítio catalítico é regenerado às condições iniciais e ocorre a formação de produtos não ionizados, liberados após a sequência de reações (JANSSEN et
al., 1999).
Para o devido êxito da catálise, o mecanismo das PLA2s de baixa massa molecular envolve resíduos que estão presentes na alça de ligação ao Ca+2; são eles: Tyr-28 Gly-30, Gly-32 e Asp49. Durante o mecanismo de catálise, o cálcio tem dupla função: dirigir o posicionamento estereoespecífico do fosfolipídeo e estabilização da carga negativa do oxigênio do grupo carbonil da ligação éster da posição sn-2 deste substrato (YANG, 1994, 1997). A amida NH da Gly-30 também foi sugerida como um fator importante na estabilização do estado de transição (VERHEIJ et al., 1980b).
Figura 4. Representação da alça de ligação ao cálcio. (a) PLA2 D49
cataliticamente ativa; o íon cálcio é mostrado com suas coordenações. (b) Região análoga na PLA2 K49, cataliticamente inativa; o nitrogênio da Lys49 ocupa a posição do cálcio, formando duas ligações com os oxigênios da cadeia principal e uma ligação com uma molécula de água (WARD et.al., 1998).
Um resíduo de ácido aspártico na posição 49 da sequência de aminoácidos das PLA2s desempenha, como mencionado anteriormente, um papel crítico na catálise sendo responsável, juntamente com outros aminoácidos, pela fixação do substrato ao sítio enzimático. Este aminoácido é conservado na estrutura de PLA2s enzimaticamente ativas de veneno de serpente que, por esta razão, são denominadas D49. No entanto, em algumas PLA2s este aminoácido é substituído por lisina, serina, asparagina ou a arginina, e as enzimas são classificadas como K49, S49, N49 e R49, respectivamente. A substituição do resíduo de D49 provoca alterações críticas na alça de ligação ao cálcio (figura 4) e, como consequência, estas proteínas não são mais capazes de se ligar ao Ca2+ perdendo, assim, sua atividade catalítica (DOLEY et al, 2010; WARD et al, 2002).
As PLA2s K49 são consideradas homólogas por não possuírem atividade catalítica diante de substratos lipídicos. No entanto, estas isoformas cataliticamente inativas exibem efeitos tóxicos por um mecanismo que não requer hidrólise de fosfolipídeos (FERNÁNDEZ et al, 2013; LOMONTE et al, 2003). São proteínas básicas e hidrofóbicas, que apresentam elevada atividade miotóxica in vitro (LIU et al., 1990; FRANCIS et al., 1991, DENNIS, 1994; GUTIÉRREZ e LOMONTE, 1997).
1.3.2. Efeitos farmacológicos
Apesar da grande semelhança em suas estruturas primárias, secundárias e terciárias, as PLA2s de veneno de serpente, como mencionado anteriormente, desencadeiam uma ampla variedade de efeitos farmacológicos, tais como: neurotoxicidade pré e pós-sináptica, miotoxicidade, atividades edematogênica, anticoagulante, hipotensiva, hemorrágica, hemolítica, dentre outras (KINI, 2003: GUTIÉRREZ et al., 2008b). Esta multiplicidade de efeitos pode ser explicada devido a substituições de alguns aminoácidos em regiões moleculares específicas, sobretudo, na região superficial dessas proteínas, o que deriva de um acelerado processo micro evolutivo. (RANDAZO-MOURA et
Em PLA2s caracterizadas como D49, a maioria dos efeitos farmacológicos é uma consequência de sua atividade enzimática sobre os fosfolipídeos de membrana, e a modificação de determinados resíduos catalíticos diminui ou anula tais efeitos. Entretanto, algumas atividades podem ser mantidas, o que indica a existência de certas regiões que são diferentes do sítio catalítico e respondem por seus efeitos tóxicos e farmacológicos (SOARES et al., 2001).
Por outro lado, as PLA2s K49, não apresentam atividade catalítica diante dos fosfolipídeos, devido à substituição do resíduo D49 por K49, o que afeta drasticamente a ligação do Ca2+. Segundo Lomonte e colaboradores, (2003) tais PLA2s K49 homólogas seriam capazes de se ligar a determinadas regiões com uma carga parcial negativa, que serviriam como um sítio de ancoragem para essas PLA2s. Uma vez unidas à membrana celular, poderiam gerar uma desorganização dessa membrana, desencadeando uma alteração em sua permeabilidade e, consequentemente, provocando destruição celular predominantemente devido à desorganização celular do que pela toxicidade da PLA2.
De acordo com Kini (2003) as PLA2s provenientes de venenos de serpentes compartilham uma determinada similaridade com as enzimas de mamíferos no que diz respeito à estrutura e função. Entretanto, propõe-se que as PLA2s de venenos apresentam uma habilidade de associação a um ―sítio específico‖, em virtude de sua alta afinidade por proteínas específicas presentes nas membranas das células-alvo que atuam como receptores. Essa ligação específica de PLA2 ocorre graças à presença de um sítio ―farmacológico‖ em sua superfície, que é independente do sítio catalítico.
A interação de alta afinidade da PLA2 com seu receptor (proteína alvo) deve-se provavelmente à complementaridade de carga, hidrofobicidade e/ou forças intermoleculares entre o sítio farmacológico da PLA2 e o sítio alvo na superfície do receptor proteico na membrana celular. A PLA2 pode induzir seus efeitos farmacológicos por mecanismos dependentes ou independentes de sua atividade enzimática (KINI, 2003).
1.3.2.a. Atividade miotóxica
São denominadas miotoxinas as moléculas que induzem toxicidade à células musculares esqueléticas. As PLA2s são os componentes desse tipo mais importantes e abundantes dos venenos de serpentes. Tal particularidade torna essas enzimas importantes ferramentas no estudo de patologias musculares, permitindo o desenvolvimento de modelos de eventos degenerativos e regenerativos (GUTIÉRREZ e OWNBY, 2003).
O sítio primário de atuação das fosfolipases na célula muscular é a membrana plasmática. Evidências apontam para o fato de que lipídios e lipopolissacarídeos carregados negativamente auxiliam no processo de ancoragem dessas enzimas na camada externa da bicamada lipídica (RADVANYI et al., 1989; PÁRAMO, et al., 1998). No entanto é provável que outras substâncias possam agir como ligantes das PLA2s com variados níveis de afinidade, como glicolipídeos específicos, como a fosfatidilserina, por exemplo (DÍAZ et al., 2001). Após ligar-se à membrana celular, o dano induzido pela PLA2 miotóxica pode se dar por dois mecanismos diferentes: um dependente e outro independente de atuação enzimática direta sobre os fosfolipídios da bicamada lipídica.
O mecanismo de danos às células musculares por ação enzimática se caracteriza pela hidrólise da membrana plasmática, com liberação de ácidos graxos e lisofosfolipídeos (GUTIÉRREZ et al.,1984). Além da ação catalítica direta, os próprios produtos podem causar danos à membrana por efeito detergente, formando de agregados micelares a partir dos lipídeos de membrana (PESTRONK et al., 1982). Nesses casos, ocorre uma queda drástica na atividade miotóxica quando há eliminação do cálcio do meio por adição de EDTA (BULTRON, et al., 1993) ou alquilação de resíduos importantes do sítio catalítico (CARREGARI, et al., 2013).
O segundo meio pela qual as PLA2s podem causar danos à membrana das células musculares é através do colapso de sua organização macromolecular. A comparação da distribuição de cargas de fosfolipases A2 miotóxicas e não miotóxicas levou à identificação de uma região na porção
C-terminal dessas enzimas que seria responsável pelo efeito. A combinação de aminoácidos básicos e hidrofóbicos entre os resíduos 79 e 87, ou após o resíduo 88 (KINI e EVANS, 1989a) seria a chave para desencadear miotoxicidade: a porção básica interagiria com a cabeça polar dos fosfolipídios e alteração conformacional de interface levaria à penetração da região hidrofóbica da enzima na bicamada (AMBROSIO et al., 2005).
A ação de uma PLA2 miotóxica sobre uma célula muscular esquelética pode causar a ruptura do sarcolema. A partir daí, é possível observar a formação de lesões com extravasamento de conteúdo citosólico, como creatinina quinase (CK), lactato desidrogenase, creatina, mioglobina, entre outros. Além disso, a ruptura do sarcolema permite que a PLA2 acesse o interior das células, afetando as membranas das organelas celulares (GUTIÉRREZ e OWNBY, 2003).
1.3.2.b. Efeito anticoagulante
Assim como outras propriedades das PLA2s, esse efeito pode ocorrer com potências variadas e pode estar associado ou não à ação enzimática. (DOLEY et al, 2010). Em 1976, Boffa estudou uma PLA2 isolada do veneno de
Vipera berus com alta capacidade anticoagulante. Além de estudar as
propriedades cinéticas do processo de inibição da coagulação promovido pela enzima, o autor observou que a inibição da coagulação era independente da atividade fosfolipolítica. Boffa então inferiu que o processo ocorreria por ligação do ―inibidor‖ a fosfolipídios envolvidos na coagulação sanguínea, através de cargas positivas presentes na superfície da molécula.
Esse comportamento foi confirmado posteriormente por Verheij (1980a), que, ao testar 25 fosfolipases A2 diferentes de diversas fontes, observou que todas aquelas com capacidade anticoagulante eram básicas, possuindo ponto isoelétrico acima de 9,0. Além disso, nenhuma das fosfolipases neutras ou ácidas apresentou efeito anticoagulante. No entanto, a característica básica da PLA2 não se apresentava como requisito para demonstrar capacidade
anticoagulante, uma vez que foi verificado que algumas das fosfolipases que não apresentaram o efeito eram básicas.
Nos casos em que a ação anticoagulante é dependente da atividade enzimática, o processo parece ocorrer pela depleção de fosfolipídios pró-coagulantes presentes no plasma (VERHEIJ et al., 1980a). No entanto, fosfolipases consideradas fortemente anticoagulantes, exercem o seu efeito não só por ação enzimática, mas também por via não enzimática, através de ligação com proteínas envolvidas na via extrínseca da cascata de coagulação, comportando-se como um inibidor não competitivo desses fatores (KINI, 2006). Além disso, algumas PLA2s podem exercer ação sobre mais de uma etapa na cascata de coagulação. (STEFANSSON 1989).
1.3.2.c. Ação inflamatória
A ação catalítica das PLA2s libera no meio reacional lisofosfolipídeos e ácidos graxos, conforme descrito anteriormente. Um desses ácidos graxos liberados pela catálise dos fosfolipídios de membrana é o ácido araquidônico. Esse produto da reação faz parte do grupo dos ácidos graxos essenciais da série ω-6, um substrato para formação de mediadores de resposta inflamatória, os eicosanóides (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos) e fator de agregação plaquetária (PAF) (PARENTE, 2001).
A formação dos eicosanóides e PAF ocorre através da ação dos complexos enzimáticos das ciclooxigenases e 5-lipoxigenase, respectivamente. As prostaglandinas possuem ação vasodilatadora e potencializam a permeabilidade vascular juntamente com histamina e bradicinina, o que promove o acúmulo de exsudado e consequente edema inflamatório. (PARENTE, 2001). O uso de drogas inibidoras das ciclooxigenases e 5-lipoxigenase e antagonistas do FAP provoca a redução de efeitos locais inflamatórios e hiperalgesia (TEIXEIRA et al., 1994).
Além dos mediadores inflamatórios já mencionados, fosfolipases A2 isoladas de venenos de serpentes possuem a propriedade de estimular a
produção de interleucina-1, interleucina-6 e TNF-α, que associados induzem resposta inflamatória da fase aguda de uma infecção ou agressão tecidual (ZULIANI et al., 2005; MOREIRA et al., 2008; HUANCAHUIRE-VEGA et al., 2011).
A atividade enzimática não é o único meio pelo qual as PLA2s iniciam efeitos inflamatórios. O aumento da permeabilidade dos vasos e a formação de edema estão também relacionados diretamente com a liberação de mediadores inflamatórios pela degranulação de mastócitos. Esse mecanismo é mais importante para as PLA2s homólogas destituídas de atividade catalítica (CHAVES et al., 1998; LANDUCCI et al., 1998), ou com pouca atividade residual, como as K49. O mecanismo pelo qual as PLA2s induzem a degranulação dos mastócitos é provavelmente através de interações eletrostáticas entre as cargas catiônicas da enzima com sítios aniônicos presentes nos mastócitos (MURAKAMI et al., 1993).
1.3.2.d Ação antibacteriana
A capacidade das sPLA2s de permeabilizar e romper membranas vai além das células eucarióticas e pode, em alguns casos, conferir capacidade antibacteriana à essas moléculas. Diversas fosfolipases secretadas de fontes distintas já foram reportadas como antimicrobianas ou bactericidas, muitas delas isoladas de venenos de serpentes (NEVALAINEN et al., 2008; SAMY et
al., 2013).
Em 1994 foi descrito que a região C-terminal da miotoxina II de Bothrops
asper era a principal responsável por desencadear efeitos citotóxicos (Lomonte et al., 1994). Uma sequência de 13 peptídeos foi sintetizada e utilizada isolada
da proteína total, demonstrando tal essa capacidade citotóxica independia da atividade catalítica da PLA2. Alguns anos mais tarde, esse mesmo peptídeo foi reconfirmado como responsável pela atividade antimicrobiana da toxina, capaz de reduzir significativamente a quantidade de unidades formadoras de colônias de bactérias gram-positivas e negativas (PÁRAMO et al., 1998). Os autores
ainda sugerem que o efeito seria causado por desestabilização externa da superfície da membrana dessas bactérias e não por internalização da enzima.
Uma característica que parece ser comum à fosfolipases A2 capazes de exercer ação bactericida ou antimicrobiana independente de ação enzimática é uma combinação de resíduos básicos e hidrofóbicos na porção C-terminal da proteína (Lomonte et al., 1994).
1.3.2.e. Atividade neurotóxica
As serpentes desenvolveram através de diferentes mecanismos genéticos evolutivos, a capacidade de expressar potentes toxinas inibitórias da transmissão neuromuscular pré-sináptica (β-neurotoxinas) ou pós-sináptica (α-neurotoxinas) em sítios específicos. A neurotoxicidade pré-sináptica está na maioria das vezes associada a fosfolipases A2 (HODGSON e WICKRAMARATNA, 2002). Um pequeno grupo de PLA2s (β-neurotoxinas) provenientes de venenos de serpentes evoluiu como neurotoxinas mais potentes do que as α -neurotoxinas no bloqueio da transmissão neuromuscular, principalmente pela modificação na liberação do neurotransmissor acetilcolina (TU, 1991). Estas fosfolipases A2 que apresentam neurotoxicidade pré-sináptica têm sido identificadas nas peçonhas das três maiores famílias de serpentes venenosas: Elapidae, Hydrophiidae e Viperidae. (HODGSON e WICKRAMARATNA, 2002).
Duas classes de β-neurotoxinas provenientes de venenos de serpentes têm sido reconhecidas, as β-neurotoxinas caracterizadas pela presença da atividade catalítica PLA2 e encontradas nos venenos de serpentes das famílias Elapidae e Viperidae e as β-neurotoxinas facilitatórias, incluindo a dendrotoxina, que bloqueia o canal de potássio dependente de voltagem, e a toxina anticolinesterásica, a fasciculina. As toxinas do segundo grupo são próprias de veneno de Dendroaspis sp. A ação neurotóxica caracterizada pelo bloqueio neuromuscular não altera significantemente a sensibilidade da placa motora ou sarcolema para a acetilcolina ou o KCl, respectivamente, ou seja,
quando uma neurotoxina pré-sináptica age, não há, necessariamente, destruição da fibra muscular.
1.3.3. Papel da atividade catalítica sobre os efeitos farmacológicos
Embora as PLA2s possam induzir uma grande variedade de efeitos farmacológicos, nem todos esses efeitos são encontrados em todas as enzimas desse tipo. Tais enzimas induzem seus efeitos farmacológicos através de mecanismos que podem ser dependentes ou independentes da atividade enzimática. Em mecanismos que são dependentes da atividade enzimática, tanto a hidrólise de fosfolipídeos intactos quanto os produtos liberados (tais como lisofosfolipídeos e ácidos graxos) podem causar os efeitos farmacológicos (KINI e EVANS, 1989b).
A hidrólise de fosfolipídeos pode alterar aspectos como a fluidez da membrana, o que desfaz empacotamento ideal de seus fosfolipídeos e a torna seletivamente permeável a drogas e íons. Os lisofosfolipídeos e ácidos graxos originados a partir da hidrólise também podem atuar como precursores para alguns mediadores derivados de lipídeos que apresentam uma diversificada gama de atividades biológicas (GELB et al, 1999; DENNIS, 2000). Os lisofosfolipídeos podem ser metabolizados, por exemplo, pelos fatores ativadores de plaquetas (PAF), potentes mediadores inflamatórios (KUME e SHIMIZU, 1997; JACKSON et al., 1998). Além disso, tais lisofosfolipídeos podem também provocar lise celular, ocasionando a liberação do conteúdo interno da célula-alvo. Ácidos graxos, em particular o ácido araquidônico, atuam como precursores da síntese de mensageiros secundários, como prostaglandinas e tromboxanos. Ademais, os produtos de hidrólise também podem alterar o comportamento das células viabilizando a interação com vários ligantes, receptores, ou enzimas (figura 5).
Figura 5. Contribuição enzimática de uma enzima PLA2 para os efeitos farmacológicos (Adaptado de DOLEY et al, 2010).
Para enzimas que apresentam mecanismos que são independentes da atividade enzimática (Figura 6), a ligação à proteína alvo pode causar o efeito farmacológico, agindo como um agonista ou um antagonista. Nas interações do tipo antagonista, as PLA2s seriam capazes de competir com o ligante natural ou mensageiro primário do receptor alvo, levando à diminuição na produção e/ou liberação de mensageiros secundários, como, por exemplo, AMPc, Ca2+.
Em contrapartida, nas interações do tipo agonista as PLA2s poderiam induzir à transdução de sinais e elevar o número de mensageiros secundários na célula-alvo (KINI e EVANS, 1989b). No entanto, mesmo nestes casos, as enzimas PLA2s são capazes de hidrolisar os fosfolipídeos nas proximidades de suas proteínas-alvo. Contudo, esta hidrólise é relativamente irrelevante para promover o efeito farmacológico observado (STEFANSSON et al, 1990;
EVANS e KINI, 1997; MOUNIER et al, 2000). É importante notar que alguns dos efeitos farmacológicos podem ocorrer em consequência à combinação de ambos os mecanismos, enzimáticos e não enzimáticos (KINI e EVANS, 1989b), o que torna crucial a determinação do papel da atividade enzimática na indução dos efeitos farmacológicos.
Uma maneira de determinar o papel da atividade enzimática é estudar que efeito causa o aumento do tempo de incubação com PLA2 sobre o sistema fisiológico completo em questão (KINI e EVANS, 1988; STEFANSSON et al., 1990). Caso a hidrólise de fosfolipídeos auxilie a ocorrência do(s) efeito(s) farmacológico(s), a intensidade desse(s) efeito(s) deve aumentar conforme o tempo de incubação. Por outro lado, mecanismos não enzimáticos não irão promover um aumento na intensidade do efeito farmacológico ao longo tempo de incubação.
Figura 6. Mecanismo não enzimático de uma enzima PLA2 que produz efeitos
Visto que as PLA2s necessitam de Ca2+ para a seu funcionamento, a inserção de agentes quelantes, tais como EDTA, afetam as funções enzimáticas normais, muitas vezes inibindo-a. (KINI e EVANS, 1988). Contudo, o Ca2+ também pode ser substituído por outros íons metálicos divalentes. (KELLY et al, 1979). Ocasionalmente, esses íons podem suportar as funções normais do sistema, mas não mantêm a atividade fosfolipolítica da enzima PLA2. No caso de mecanismos não enzimáticos, não há interferência nos efeitos farmacológicos por adição de EDTA ou outros íons, ao passo que na contribuição enzimática há um comprometimento significativo nesses efeitos.
O resíduo de His48 é altamente conservado em PLA2s e desempenha um papel extremamente relevante na hidrólise de fosfolipídeos. A alquilação da His48 induz à perda completa da atividade enzimática (SCOTT, 1997). Dessa forma, a modificação química das PLA2 pode ser adequada para estudar o papel da atividade enzimática, tanto in vitro e in vivo. Existe uma tendência geral em correlacionar a capacidade de uma enzima PLA2 em hidrolisar fosfolipídeos in vitro com os efeitos farmacológicos. Estudos in vitro podem fornecer excelentes informações a respeito da capacidade da enzima em hidrolisar fosfolipídeos específicos, com base na especificidade por certo grupo cabeça ou seletividade um determinado grupo acil graxo. Eles também auxiliam a determinação da eficiência catalítica da enzima. Todavia, em experimentos in
vivo a atividade enzimática é grandemente influenciada por diversos fatores,
tais como a concentração de proteínas específicas, a disponibilidade de diferentes classes de fosfolipídeos nas proximidades da proteína alvo, bem como a capacidade de penetração da enzima (ROSENBERG, 1997a, 1997b).
Penetrabilidade é outro fator que desempenha um papel importante no que diz respeito à indução dos efeitos farmacológicos (KINI, 1997). Fosfolipídeos em membranas plasmáticas são empacotados em densidades mais elevadas do que os fosfolipídeos em vesículas e lipossomos, e as PLA2s hidrolisam fosfolipídeos nas vesículas e lipossomos de maneira bem mais eficiente do que em membranas plasmáticas. As PLA2s que possuem maior
