Os acidentes com animais peçonhentos ainda exibem grande número de casos em todo o mundo, inclusive apresentando acidentes letais, o que os torna uma questão de saúde pública. A família Viperidae ocupa espaço de destaque no que se refere a animais peçonhentos, possuindo venenos extremamente potentes. Dentre os componentes mais tóxicos desses venenos estão as fosfolipases A2, que podem apresentar uma série de efeitos farmacológicos. Diversas PLA2s têm sido purificadas e caracterizadas a partir do veneno de viperídeos. No entanto, as informações a respeito do veneno de
Agkistrodon piscivorus leucostoma, seus componentes e toxicidade ainda são
limitadas.
No presente trabalho foi descrito o isolamento e a caracterização bioquímica e farmacológica de duas fosfolipases A2 a partir da peçonha de A.
p. leucostoma, uma básica e outra ácida denominadas, respectivamente, APL-
TX-I e APL-TX-II, a fim de melhor compreender a fisiopatologia do envenenamento ocasionado por esta serpente.
A técnica utilizada para purificação das toxinas mostrou-se bastante eficaz. A cromatografia de exclusão molecular utilizando duas colunas Superdex-75 acopladas em série possibilitou uma melhor separação e resolução das frações devido ao aumento da área de contato do veneno total com a resina cromatográfica (GUIOCHON et al, 2008; TOUPS et al, 2006). Após a segunda etapa cromatográfica (HPLC fase reversa em coluna C-18, as duas proteínas já se encontravam puras.
A pureza das amostras foi verificada por uma nova corrida em coluna C- 18, que apresentou um único pico para cada uma das fosfolipases e comprovada pela eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. As duas fosfolipases em questão, APL-TX-I e APL-TX-II, demonstraram uma única banda no gel por volta de 14 kDa tanto em condições redutoras (com DTT) quanto em condições não redutoras (sem DTT). Tal fato indica que ambas encontram-se na forma monomérica. Algumas fosfolipases A2 podem apresentar-se na forma de dímeros ou agregados. A formação desses
complexos pode ser mantida tanto por interações covalentes como não covalentes e possibilita a potencialização dos seus efeitos farmacológicos (BON, 1997). As β-bungarotoxinas, por exemplo, são as neurotoxinas pré- sinápticas mais bem estudadas isoladas a partir de serpentes do gênero
Bungarus e se apresentam na forma de duas cadeias polipeptídicas ligadas
covalentemente por uma ponte dissulfeto (KONDO et al., 1978; BON, 1997). Entretanto, a maioria é encontrada como monômeros, como é o caso aqui descrito das fosfolipases de A. p. leucostoma.
A pureza das fosfolipases influenciou na determinação da atividade das mesmas sobre o substrato sintético cromogênico ácido 4-nitro-3- octanoiloxibenzóico, o qual funciona como um substrato específico para fosfolipases A2 provenientes dos venenos de serpentes. A comparação entre as atividades do veneno total, com as frações da primeira etapa cromatográfica e as frações da segunda etapa cromatográfica, que deram origem às fosfolipases APL-TX-I e APL-TX-II evidencia que as proteínas puras possuem atividade catalítica muito maior que os pools APL-V e APL-VII, que por sua vez apresentam atividade maior que o veneno total. Além disso, ao se comparar as atividade das duas PLA2s entre si, pode-se observar que APL-TX-II apresenta uma maior atividade enzimática sobre o substrato NOBA do que APL-TX-I. No geral, as fosfolipases A2 ácidas apresentam alta atividade catalítica sobre substratos sintéticos. No entanto, as atividades tóxicas mais comumente relacionadas às PLA2 de serpentes, tais como miotoxicidade e edema, são raramente encontradas nessas isoformas ou se apresentam de maneira pouco significativa (SILVEIRA et al, 2013).
O princípio do método para a determinação da atividade enzimática consiste na liberação de um produto cromogênico (ácido 4-nitro-3 hidroxi- benzóico) a partir da hidrólise enzimática desse substrato, cuja formação é determinada por meio de um espectrofotômetro. Este ensaio é utilizado para detectar a atividade de fosfolipases A2 cataliticamente ativas do tipo Asp49, também chamadas PLA2s D49 (HOLZER e MACKESSY, 1996).
Para estudar o mecanismo de uma reação enzimática é fundamental a determinação da velocidade dessa reação e como ela varia em decorrência de
alterações nos parâmetros experimentais. Ensaios cinéticos foram realizados a fim de caracterizar bioquimicamente as PLA2s em estudo bem como a determinação de condições ótimas de trabalho dessas enzimas. Fatores como pH, temperatura, concentração de substrato e a presença ou ausência de cofatores influenciam amplamente a atividade enzimática. Tanto APL-TX-I quanto APL-TX-II demonstraram-se amplamente dependentes de suas condições ótimas para catálise.
Cada proteína possui uma estrutura tridimensional característica, fundamental para desempenho de sua função. Essa estrutura é estabilizada por diversas interações fracas, tais como ligações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, e interações iônicas, responsáveis pela manutenção da integridade das proteínas, no geral. Tais interações fracas podem ser rompidas por alguns tratamentos, o que desencadeia a perda parcial ou total da integridade proteica, provocando o fenômeno conhecido como desnaturação. O aumento da temperatura, por exemplo, é um dos fatores que podem destruir essa integridade. As enzimas podem perder, algumas vezes reversivelmente, sua atividade se expostas a temperaturas muito acima de sua temperatura ótima. (NELSON e COX, 2000).
Da mesma maneira, em valores maiores ou menores que o pH ótimo a atividade enzimática diminui. Isso ocorre porque as cadeias laterais dos aminoácidos no sítio ativo podem atuar como ácidos e bases fracas e com funções cruciais que dependem da manutenção de determinado estado de ionização e, dependendo de onde se localizam na proteína, essas cadeias laterais ionizadas podem desempenhar um papel essencial na preservação da estrutura protéica nativa (NELSON e COX, 2000). A maioria das fosfolipases A2 são enzimas bastante estáveis, sendo resistentes a certas variações de temperatura e pH, apresentando atividade catalítica máxima em valores de pH entre 7 e 8 e temperaturas entre 35 e 45 ºC (HOLZER e MACKESSY, 1996; BREITHAUPT, 1976) No entanto, condições extremas promovem uma queda drástica em suas atividades, ocasionadas devido à perda da integridade do arranjo terciário nativo necessário para desempenho de suas funções.
Esses valores ótimos de pH (entre 7 e 8) podem estar relacionados ao aumento da atividade patológica das PLA2s nos envenenamentos ofídicos, pois produz uma elevação da reação enzimática por facilitar o mecanismo catalítico (ataque mediado por uma base). Este mecanismo que envolve o ataque sobre a ligação sn-2 através de uma molécula conservada de água, que atua como um nucleófilo (KANG et al., 2011). Este ataque é o primeiro entre os três passos essenciais na catálise por enzimas PLA2. Além do pH, a elevação da temperatura corporal das vítimas picadas pela serpente pode ser uma condição favorável para a PLA2 exercer sua função hidrolítica efetivamente. Isso ocorre porque o aumento da temperatura pode favorecer alterações na estrutura e fluidez das membranas celulares, facilitando a clivagem dos fosfolipídeos pelas fosfolipases (LOMONTE et al., 1994).
Além do pH e da temperatura, a atividade enzimática é amplamente dependente da concentração de substrato presente no meio de reação. Ao serem incubadas com o substrato sintético NOBA, APL-TX-I e APL-TX-II apresentaram uma curva de comportamento michaeliano. A cinética de Michaelis-Mentem postula que em concentrações muito baixas de substrato, a velocidade da reação (Vo) aumenta praticamente de maneira linear conforme o aumento na concentração de substrato. Já em altas concentrações, a velocidade se altera cada vez menos, até chegar a um ponto que se torna quase invariável, mesmo aumentando-se a [S]. Isto ocorre porque em baixas concentrações de substrato, a maior parte das moléculas de enzima encontra- se na forma livre. Conforme o aumento das moléculas de substrato haverá cada vez menos moléculas de enzima livres, até que praticamente todas estejam na forma de complexo enzima-substrato (ES). Em concentrações suficientemente altas de substrato, a enzima se encontrará ―saturada‖ e a velocidade não irá variar com o aumento na concentração de substrato. (NELSON e COX, 2000).
As duas PLA2s isoladas apresentam dependência do íon Ca2+ para desempenhar suas atividades. Como já descrito, o cálcio é um importante cofator das fosfolipases A2 e desempenha papel fundamental na estabilização da carga negativa do oxigênio da ligação éster sn-2 do fosfolipídeo, além de
coordenar o posicionamento exato do substrato (YANG, 1994, 1997). Consequentemente, a atividade catalítica de APL-TX-I e APL-TX-II responde ao aumento da concentração de Ca2+ e tem atividade reduzida quando ocorre substituição deste por outros íons divalentes como Cd2+, Zn2+, Mn2+ e Mg2+.
Nos últimos anos tem crescido a utilização de técnicas sensíveis de espectrometria de massas para o estudo de toxinas (DU et al, 2016; SCHRÖTER et al, 2015, CALVETE et al, 2007). Por meio desses experimentos foi possível confirmar novamente a pureza das fosfolipases isoladas no presente trabalho, além de determinar com precisão a massa molecular das mesmas. APL-TX-I apresenta massa molecular de 14003,2256 Da e Apl-TX-II apresenta 13885,7930 Da. Ambas as massas são características de fosfolipases A2 de peçonhas de serpentes que, no geral, são em torno de 14000 Da (KANG et al., 2011). Além disso, após redução, alquilação e posterior digestão de APL-TX-I e APL-TX-II com tripsina foi possível realizar a identificação de peptídeos que compõem suas sequências.
O entendimento do mecanismo de ação das peçonhas de serpente e sua toxicidade requer a investigação de informações quantitativas e qualitativas a respeito da ocorrência de toxinas individuais e seus efeitos farmacológicos (CALVETE et al., 2009). Com este propósito, foi investigado um perfil de possíveis atividades tóxicas induzidas por APL-TX-I e APL-TX-II, tais como miotoxicidade local e sistêmica, indução de edema, atividade paralisante muscular, efeito sobre a coagulação, atividade antibacteriana e neurotoxicidade.
As fosfolipases A2 encontradas nas peçonhas de serpentes da família Viperidae são conhecidas por agirem principalmente no músculo, causando danos locais e produzindo uma mionecrose acentuada (LOMONTE et al., 2003; GUTIÉRREZ et al., 2008a). Esta mionecrose pode ser caracterizada através de alterações teciduais identificadas em análises histológicas ou pelo aumento na atividade plasmática de enzimas encontradas do músculo tais como, creatina quinase (CK) e lactato desidrogenase, que são liberadas no plasma quando
ocorre algum dano tecidual (biomarcadores de lesão muscular). (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 1989; WEI et al., 2006).
Entretanto, estudos prévios utilizando a peçonha de Agkistrodon
piscivorus leucostoma evidenciaram que o mesmo apresenta baixos níveis de
miotoxicidade local (LOMONTE et al, 2014). Isto foi observado em nossos resultados que demonstram uma miotoxicidade muito inferior à apresentada por outras PLA2s purificadas a partir de venenos de viperídeos. (ALMEIDA et
al, 2016; HUANCAHUIRE-VEGA et al, 2011; ZAMUNÉR et al, 2004), tanto para
APL-TX-I quanto para APL-TX-II. De qualquer maneira, foi possível notar uma diferença significativa ao se comparar a indução de danos musculares dessas duas toxinas. A fosfolipase básica (APL-TX-I) apresenta atividade miotóxica maior que a ácida (APL-TX-II). Como já observado na literatura (MARQUES et
al, 2015; SILVEIRA et al, 2013, NUNES et al, 2011), é comum PLA2s ácidas apresentarem nenhuma ou baixa miotoxicidade quando comparadas ao controle (PBS) ou a outras PLA2s básicas.
A miotoxicidade local foi também observada por meio de cortes histológicos do músculo gastrocnêmio após uma hora da aplicação das toxinas. As imagens realizadas sob a luz de microscópio óptico confirmaram a atividade miotóxica observada pela mensuração dos níveis de creatina quinase (CK) para as duas toxinas em estudo. A análise histopatológica dos danos teciduais locais promovidos por APL-TX-I mostrou destruição celular (necrose) das miofibrilas, edema moderado e infiltrado inflamatório. Por outro lado, as análises de APL-TX-II demonstraram poucos danos teciduais, condizendo com o que foi observado em relação aos níveis de CK.
Dentre os efeitos patológicos desencadeados por peçonhas de serpentes viperídicas, a inflamação local também ocupa lugar de destaque (GUTIÉRREZ et al., 2009). Tanto APL-TX-I quanto APL-TX-II foram capazes de induzir resposta inflamatória local de início rápido de forma similar a outras toxinas isoladas a partir de peçonhas de serpentes da família Viperidae (NUNES et al., 2011; NÚÑEZ et al., 2004). Uma toxina é considerada capaz de estimular a atividade edematogênica ao induzir um aumento igual ou superior a
30% no tamanho da pata de camundongos (LOMONTE et al., 1993). A atividade edematogênica máxima foi atingida nos primeiros 30 minutos após a injeção das toxinas. Os mecanismos bioquímicos por trás da atividade edematogênica baseiam-se na hidrólise de fosfolipídeos, ativação do fator ativador de plaquetas e liberação de histamina por mastócitos, no caso de PLA2s D49, cataliticamente ativas (TEIXEIRA et al., 2009).
No presente trabalho, foi avaliada a atividade paralisante neuromuscular
ex vivo das PLA2s APL-TX-I e APL-TX-II, utilizando a preparação do músculo
biventer cervicis isolado de pintainhos. A APL-TX-I não induziu bloqueio
neuromuscular significativo. Por outro lado a ácida APL-TX-II induziu intenso bloqueio neuromuscular, sendo este irreversível, diminuindo a resposta contrátil após a aplicação da toxina.
Os resultados de APL-TX-II mostraram que o bloqueio obtido com 30 µg/mL da toxina não foi acompanhado pela inibição significativa das respostas contraturais à acetilcolina (ACh) e nem ao potássio (KCl). Isto significa que esta toxina apresenta efeito neurotóxico preponderantemente pré-sináptico na preparação. Neurotoxinas ativas pré-sinapticamente são capazes de abolir a resposta contrátil sem afetar a resposta aos agonistas colinérgicos (LEWIS e GUTMANN, 2004).
Um provável mecanismo para a ação neurotóxica pré-sináptica das PLA2s cataliticamente ativas foi proposto por Montecucco e Rosseto (2000), onde, de acordo com os autores, as moléculas de PLA2 penetram no lúmen das vesículas sinápticas do terminal nervoso na junção neuromuscular, no momento da exocitose da acetilcolina para a fenda sináptica. Após a liberação do neurotransmissor, a vesícula se interioriza no terminal nervoso por endocitose e as PLA2s no seu interior hidrolisam os fosfolipídeos do folheto interno da membrana das vesículas gerando ácidos graxos e lisofosfolipídeos. As vesículas sinápticas utilizam bombas de prótons para gerar um gradiente de pH transmembrana, o que possibilita a recaptação da acetilcolina e reabastecimento das vesículas. Este gradiente de pH direciona a translocação
dos ácidos graxos para a monocamada citosólica, permanecendo os lisofosfolipídeos na camada luminal (MONTECUCCO e ROSSETO, 2000)
Assim as atividades combinadas da bomba de prótons e da PLA2 criam uma distribuição assimétrica dos ácidos graxos e lisofosfolipídeos. Os ácidos graxos insaturados na monocamada lipídica contactante e os lisofosfolipídeos na monocamada distal promovem a fusão da membrana (CHERNOMORDIK et
al., 1995,1997). Desta forma, tais vesículas se tornam altamente fusogênicas e
liberam o neurotransmissor após a fusão com a membrana pré-sináptica em qualquer ponto, mesmo onde não ocorre normalmente a exocitose da ACh no terminal nervoso, mas não podem ser restauradas devido à alta concentração de ácidos graxos e lisofosfolipídeos, os quais impedem o fechamento do lúmen das vesículas, levando ao bloqueio da neurotransmissão.
A preparação neuromuscular biventer cervicis possui fibras musculares com inervações multifocais. Esta preparação pode ser estimulada indiretamente através de pulsos breves no nervo motor, ou diretamente no músculo. Isto permite discriminar entre efeitos neurotóxicos e miotóxicos de um veneno ou toxina. Enquanto a neurotoxicidade causa só a inibição dos estímulos indiretos, a miotoxicidade induz inibição dos estímulos diretos e indiretos (HARVEY et al., 1994).
6. CONCLUSÃO
As PLA2s presentes nas peçonhas de serpentes são enzimas pequenas responsáveis por uma série de efeitos farmacológicos que alteram os processos fisiológicos normais da presa. Essas moléculas são um desafio aos químicos de proteínas, a fim de poder estabelecer as mais difíceis relações de estrutura-função.
Neste trabalho foram purificadas e caracterizadas duas fosfolipases A2 a partir da peçonha da serpente Agkistrodon piscivorus leucostoma, sendo uma básica (APL-TX-I) e outra ácida (APL-TX-II). Ambas apresentaram uma única cadeia polipeptídica, sendo caracterizadas como monoméricas, e são pertencentes ao grupo de fosfolipases D49. A metodologia utilizada para purificação de APL-TX-I e APL-TX-II se mostrou bastante eficiente, promovendo alto grau de pureza sem que houvesse perda dos efeitos farmacológicos.
APL-TX-I apresentou atividade catalítica intermediária e baixa toxicidade nos ensaios realizados, tendo como principal efeito um moderado dano tecidual muscular e um discreto efeito inflamatório observado por meio de edema de pata. Em contrapartida, APL-TX-II demonstrou alta atividade catalítica e forte toxicidade neuromuscular, apresentando bloqueio total da contração muscular.
O estudo concomitante de uma fosfolipase A2 básica e outra ácida possibilitou uma comparação possibilitando um maior entendimento das diferenças funcionais entre esses dois tipos de proteína bem como da relação estrutura-função. As informações adquiridas neste trabalho são relevantes para o desenvolvimento de novas ferramentas moleculares e para a compreensão dos mecanismos tóxicos e farmacológicos das fosfolipases de venenos de serpentes.
Como perspectivas, seria interessante a realização de experimentos combinatórios das duas fosfolipases A2 aqui purificadas a fim de estudar a existência de sinergismo dessas toxinas no veneno de Agkistrodon piscivorus
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