Caracterização farmacológica

Para a determinação da atividade miotóxica local ocasionada pelas PLA2s em questão, grupos de cinco camundongos (18 a 20 g), sendo um grupo controle, receberam injeções intramusculares (músculo gastrocnêmio) de três concentrações (5, 10 e 20 µg) de cada uma dessas PLA2s. Cada uma dessas concentrações foi dissolvida em 50 μL de tampão PBS. Os animais do grupo controle receberam 50 µL de PBS, cada.

Após a aplicação das toxinas, amostras de sangue foram coletadas da cauda em capilares heparinizados em diversos intervalos de tempo (0, 1, 3, 6, 9, 12 e 24 horas). Logo após, o sangue passou por uma centrifugação e o plasma foi removido para a determinação dos níveis plasmáticos de creatina- quinase (CK) (GUTIÉRREZ et al., 2008a).

Esta atividade enzimática foi medida através do ensaio cinético utilizando o kit CK–NAC UV unitest (Wiener lab). Para tal, 200 μL do substrato foram pré-incubados por 4 minutos a 37ºC, logo foram acrescentados 5 μL de plasma obtido por centrifugação do sangue caudal do camundongo. A mistura foi incubada por 6 minutos, registrando as leituras dos minutos 3, 4, 5 e 6. A diferença média de absorbância por minuto (ΔA/min) foi determinada, diminuindo-se cada leitura da anterior e tirando-se a média dos valores. A média foi multiplicada pelo fator 8095 (Kit de CK Winer lab). As leituras foram feitas a 340 nm, monitorando a formação do produto NADPH (A atividade da creatina quinase é monitorada através de 3 reações acopladas onde o produto final é o NADPH). A atividade foi expressa em U/L, definida como a fosforilação de 1 mmol de creatina/min a 25 ºC.

3.4.2. Análise histológica do músculo gastrocnêmio

A atividade miotóxica foi também investigada com base nas alterações morfológicas causadas pela injeção de 20 μg/animal de cada toxina purificada (Apl-TX-I e Apl-TX-II) no músculo gastrocnêmio em um grupo de 6 camundongos machos (18-20 g). O grupo de animais controle recebeu uma injeção de mesmo volume contendo apenas PBS. Uma hora após a injeção os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e uma região central do músculo removida para análise histológica. O material excisado foi preservado em uma solução de 10% de formaldeído em PBS (v/v), por um período de 48 horas. Após a fixação, o material foi desidratado em soluções crescentes de álcool etílico (50, 70, 80 e 95%) e processados para inclusão em parafina. Para diafanização, foram realizados dois banhos de xilol com duração de uma hora cada, seguido de dois banhos de parafina líquida (60ºC), também de uma hora cada, para impregnação da parafina na peça. Em seguida, a inclusão em parafina foi realizada à temperatura ambiente. Os blocos resultantes do preparado muscular parafinizados foram cortados em micrótomo Leica RM 2035 (secções de 6,0 μm de espessura). O material foi coletado em lâminas de vidro e corado com hematoxilina e eosina e avaliados qualitativamente usando microscópio de luz. As análises foram realizadas no Laboratório de Patologia Experimental da Universidade Federal de São João del Rei (UFSJ).

3.4.3. Atividade miotóxica sistêmica

Para a determinação da atividade miotóxica sistêmica ocasionada pelas PLA2s estudadas, grupos de cinco camundongos (18 a 20 g) receberam injeções intravenosas (veia caudal) de três concentrações (5, 10 e 20µg) da toxina. Cada uma dessas concentrações foi dissolvida em 50 μL de tampão PBS. Os animais do grupo controle receberam apenas PBS (50 µL por animal).

Após a aplicação das toxinas, amostras de sangue foram coletadas da cauda em capilares heparinizados em diversos intervalos de tempo (0, 1, 3, 6,

9, 12 e 24 horas). Posteriormente o plasma foi removido após centrifugação para a determinação dos níveis plasmáticos de creatina quinase (CK) (GUTIÉRREZ et al., 2008a), conforme descrito para a miotoxicidade local.

3.4.4. Atividade inflamatória (Edema de pata)

Para a determinação da atividade formadora de edema, ocasionada pelas toxinas em estudo, grupos de cinco camundongos (18 - 20 g) receberam a PLA2 isolada por injeção via subplantar de uma das patas traseiras de camundongo. Inoculou-se diferentes concentrações das toxinas (5, 10 e 20 µg) dissolvidos em 50 μL de tampão PBS de cada tratamento de toxina no coxim plantar da pata posterior direita do camundongo; a pata posterior esquerda foi injetada com o mesmo volume de PBS (50 μL) como controle.

Foram feitas medições em diferentes intervalos de tempo (0; 0,5; 1; 3; 6; 9; 12 e 24 horas) após da injeção das toxinas. O edema foi expresso e baseado na porcentagem de edema produzido, mediante comparação entre o aumento em milímetros da pata inoculada com a toxina e o aumento da pata inoculada com solução de PBS. A concentração mínima de formação de edema foi definida como a concentração de toxina que induz 30% de edema (LOMONTE et al., 1993).

3.4.5. Atividade neurotóxica

O músculo biventer cervicis de pintainhos foi isolado e preparado de acordo com o método de Ginsborg e Warriner (1960). Os pintainhos foram anestesiados com halotano e, após o isolamento, o músculo foi suspenso em um banho de 5mL (Automatic organ multiple-bath LE01 Letica Scientific Instruments. Barcelona, Spain), contendo solução nutritiva de Krebs, com a seguinte composição em mM: NaCl 118,6; KCl 4,69; CaCl2 1,88; KH2PO4 1,17; MgSO4 1,17; NaHCO3 25,0 e C6H12O6 11,65. A solução foi aerada de modo constante com carbogênio (mistura 95% O2 e 5% CO2) e mantida a 37ºC. A

preparação foi submetida a uma tensão constante de 1 g e estimulada por meio de eletrodos bipolares (estimulação de campo).

Foram aplicados pulsos supramaximais de 0,1 Hz de frequência e 0,2 ms de duração (estimulador MAIN BOX LE 12404 Panlab s.l. Powerlab AD Instruments Barcelona, Spain). As contrações musculares máximas resultantes de estímulos elétricos e as contraturas em resposta à adição de KCl (20 mM) e ACh (110 μM) foram registradas por meio de transdutores isométricos (Model MLT0201 Force transducer 5 mg – 25 g Panlab s.l. AD Instruments Pty Ltd. Spain) conectados a um PowerLab/4SP (OUAD Bridge AD Instruments, Barcelona, Spain).

Foram realizados registros das contraturas para cloreto de potássio (KCl) e acetilcolina (ACh) com ausência de estimulação elétrica, no início (antes da adição das toxinas). Posteriormente foram adicionados 30 µg/mL de APL-TX-I e APL-TX-II em preparações distintas. Ao final do experimento (após 120 minutos de incubação com cada uma das toxinas) foram realizados novos registros da contratura para KCl e ACh.

3.4.6. Efeito sobre a coagulação

Amostras de sangue retiradas de camundongos Swiss foram adicionadas a 1 mL de citrato de sódio (Na3C6H5O7) a 3,8% e centrifugadas a 2500 g a 4ºC durante 15 minutos a fim de obter-se um plasma rico em plaquetas (PRP). Foram utilizados como controles positivos 20 U de trombina e 40 µg do veneno de Bothrops jararaca e como controle negativo foi utilizado solução salina. Diferentes concentrações de APL-TX-I e APL-TX-II foram testadas (20, 40, 50, 80, 100, 150 e 160 µg).

Inicialmente foi avaliada a atividade coagulante, determinada pelo tempo necessário para a coagulação ao adicionar a toxina. Caso a amostra não promova coagulação do plasma em até 600 seg (10 min), considera-se que a mesma não apresentou atividade coagulante do plasma. Posteriormente foi

avaliada a atividade anticoagulante, onde logo após a incubação do PRP com as toxinas a coagulação foi estimulada através da adição de 20 U de trombina.

3.4.7. Atividade Antibacteriana

Foi testada a ação antibacteriana de APL-TX-I e APL-TX-II através do método de difusão em ágar descrito por Bauer e seu colaboradores (1966). Para o ensaio, foram utilizadas cepas de bactérias gram-negativas de

Escherichia coli (E. coli ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 27853; P. aeruginosa 31 NM). Foram também utilizadas

cepas de bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus (S. aureus ATCC 25923; S. aureus BEC9393; S. aureus Rib1). Antibióticos de uso comercial Ofloxacin e Imipenem foram usados como controle positivo. As análises foram realizadas no Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual, Instituto de Biologia, UNICAMP.