Capacidade antioxidante e efeito do consumo agudo de suco de uva integral e vinho tinto em humanos

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DOS ALIMENTOS. Cristiane Copetti. ESTUDO COMPARATIVO DE SUCO DE UVA E VINHO TINTO EM PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E DE ESTRESSE OXIDATIVO IN VIVO E EM HUMANOS. Santa Maria, RS 2017.

(2) Cristiane Copetti. ESTUDO COMPARATIVO DE SUCO DE UVA E VINHO TINTO EM PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E DE ESTRESSE OXIDATIVO IN VIVO E EM HUMANOS. Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Ciência e Tecnologia dos Alimentos. Orientadora: Profa. Dra. Neidi Garcia Penna. Santa Maria, RS 2017.

(3) ©2017 Todos os direitos reservados a Cristiane Copetti. A reprodução de partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita mediante a citação da fonte. Endereço: Travessa Germano Magrin, n. 35/405, Bairro Centro, Criciúma-SC. CEP: 88802-090. Fone (0xx) 51 980326657; E-mail: copetti.cris@gmail.com..

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(7) DEDICATÓRIA. Aos meus pais, Luiz Carlos e Alda pelos princípios, apoio e orientação, Aos meus “Antônios”, minha razão de viver, Com amor, dedico..

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(9) AGRADECIMENTOS A concretização deste trabalho ocorreu, principalmente, pelo auxílio, compreensão e dedicação de várias pessoas. Agradeço a todos que, de alguma forma, contribuíram para a conclusão deste estudo e, de uma maneira especial, agradeço: À Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), especialmente ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos (PPGCTA) pela oportunidade. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pela concessão da bolsa para o desenvolvimento deste trabalho. À minha orientadora Neidi Garcia Penna, pela acolhida, confiança no meu trabalho e aprendizado. À. professora. Dra Cláudia. Kaeller. Sautter. pela. acolhida,. amizade,. disponibilidade e por proporcionar o desenvolvimento de grande parte desse trabalho. À professora Dra Luísa Rychecki Hecktheuer pela oportunidade de realizar a docência orientada em sua disciplina e pelos conhecimentos partilhados. À professora Tatiana Emanuelli, pelo apoio, disponibilidade e todo o conhecimento partilhado. A todos os professores e funcionários do Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos que contribuíram para o meu crescimento. Às professoras Paula Augusti, Aline Fogaça de Oliveira, Gilberti Helena Hubscher Lopes, Cláudia Kaeller Sautter e ao técnico Miguel Roehrs pela disponibilidade em participar como banca de defesa de qualificação/tese e pelas valiosas considerações ao trabalho. À Fernanda e Eduarda, que foram muito mais que colegas, muito mais que amigas, muito mais que uma casa para me hospedar, muito mais que uma cabeça pensante e braços para execução das análises...elas definitivamente são parte essencial dessa tese, sem elas nada disso teria sido possível e palavras não são capaz de expressar toda a minha gratidão. “Sempre fica um pouco de perfume nas mãos de quem oferece rosas”. Aos queridos colegas e amigos que se colocaram disponíveis a participar como voluntários das intermináveis coletas sanguíneas: Eduarda, Ricardo, Elinéia, Marcela,.

(10) Gustavo, Ana, Jéssica, Marcelo, Jean, Jossiê, Carine, Luciano, Mariana, Simone, Karine, Hecson e Júlia. Obrigada! Pessoas como vocês fazem a diferença. Aos funcionários e alunos que participaram como responsáveis pelas coletas sanguíneas: Miguel, Eveline, Sebastian e Sr. Adolfo. Aos colegas do PPGCTA, em especial aos amigos do NIDAL e ao grupo da sala 109, Rodrigo, Clarissa, Márcia, Roberta, Taísa, Carine, Márcia Arenhart. Também às meninas do Laboratório 102, Andréia, Sabrina e Luana pela ajuda e troca de ideias. Às vinícolas, Casa Perini e o enólogo responsável Leandro Santini, e Casa Valduga e responsável técnica, pela concessão das amostras de suco e vinho, objetos deste estudo. À Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, onde realizei parte das análises que constam nessa tese. Ao Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, Professor José Cláudio Fonseca Moreira e mestrando Vitor Ramos Miranda. Ao Instituto de Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Professor Eliseu Rodrigues e bolsistas. Por fim, aos meu maiores amores... Aos meus pais Luiz Carlos e Alda e meus irmãos Luiz Rodrigo e Rafael, por serem minha base e meu exemplo. Minha cunhada Tati e meus amados sobrinhos Augusto e Enzo. Ao meu marido, Antônio, companheiro de boa parte dessa caminhada e que ao meu lado soube me fazer a minha melhor versão. E como fruto de tudo isso, nosso amado filho, que chegou ainda em tempo de pôr a mão na massa, mas também ver mamãe conquistar o prêmio dessa longa e desafiadora jornada..

(11) EPÍGRAFE. “Foi o tempo que dedicaste a tua rosa que fez a tua rosa tão importante.” (Trecho de "O Pequeno Príncipe) Antoine de Saint-Exupéry.

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(13) RESUMO CAPACIDADE ANTIOXIDANTE E EFEITO DO CONSUMO AGUDO DE SUCO DE UVA INTEGRAL E VINHO TINTO EM HUMANOS AUTORA: CRISTIANE COPETTI ORIENTADORA: NEIDI GARCIA PENNA. Os compostos fenólicos são as maiores fontes de antioxidantes consumidos na dieta humana e estão distribuídos amplamente em uvas e seus produtos derivados. Dentre estes compostos destacam-se os flavonoides (catequina, epicatequina, quercetina, antocianinas e procianidinas) e o resveratrol (3,5,4-trihidroxi-estilbeno), os quais são encontrados, principalmente, em produtos de uva tinta. Diversos estudos in vitro, em modelos animais e humanos vêm demonstrando que estes compostos possuem ação antioxidante e melhoram o metabolismo lipídico. No entanto, os compostos fenólicos presentes no vinho tinto e suco de uva apresentam diferenças em sua composição e quantidade. O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito do consumo agudo de suco de uva integral e vinho tinto de duas cultivares sobre os biomarcadores de estresse oxidativo em indivíduos saudáveis e o efeito antioxidante celular in vitro. Este estudo de intervenção, caracterizado como um ensaio clínico crossover, utilizou o suco de uva integral, vinho tinto e água (como controle), associado ou não à uma refeição, voluntários saudáveis foram avaliados antes e após o consumo. Cada sujeito foi submetido ao procedimento descrito acima, três vezes com intervalo de uma semana entre cada procedimento, recebendo em cada uma das vezes um dos três tratamentos. O sangue foi utilizado para análises bioquímicas e de potencial antioxidante. Em adição a isso, células neurais da linha SH-SY5Y foram induzidas ao estresse oxidativo com a adição de peróxido de hidrogênio e adicionadas de diferentes concetrações de suco e vinho afim de testar o potencial antioxidante das bebidas. Os resultados mostram que a grande quantidade de compostos fenólicos encontrados nas amostras de suco de uva e vinho Bordo contribuíram para o alto potencial antioxidante in vitro dessas bebidas. Além disso, a capacidade antioxidante in vitro pode ser reproduzida in vivo após a ingestão aguda por sujeitos saudáveis, o consumo de suco e vinho Bordo melhorou a capacidade antioxidante e reduziu a oxidação lipídica em voluntários saudáveis. Suco e vinho Bordo foram capazes de diminuir os.

(14) níveis de glicose e apenas o vinho aumentou os níveis de ácido úrico. Do mesmo modo, o vinho não teve efeito antioxidante na cultura celular mostrando ser tóxico em alta concentração, enquanto o suco teve efeitos antioxidantes contra o estresse oxidativo celular induzido por H2O2. O suco de uva e vinho podem ser utilizados para melhorar a saúde e na prevenção de doenças relacionadas ao estresse oxidativo, mas o vinho deve ser consumido em doses menores devido ao efeito pró-oxidante observado na cultura celular.. Palavras chave: compostos bioativos, atividade antioxidante, estresse oxidativo, ingestão aguda, suco de uva integral, vinho tinto, ensaio celular..

(15) ABSTRACT ANTIOXIDANT CAPACITY AND ACUTE CONSUMPTION EFFECT OF INTEGRAL GRAPE JUICE AND RED WINE IN HUMANS AUTHOR: CRISTIANE COPETTI ADVISER: NEIDI GARCIA PENNA Phenolic compounds are the major sources of antioxidants consumed in the human diet and are widely distributed in grapes and their by-products. Among these compounds are the flavonoids (catechin, epicatechin, quercetin, anthocyanins and procyanidins) and resveratrol (3,5,4-trihydroxy-stilbene), which are mainly found in grape products. Several in vitro studies in animal and human models have been demonstrating that these compounds have antioxidant action and improve lipid metabolism. However, the phenolic compounds present in red wine and grape juice show differences in their composition and quantity. The objective of the present study was to evaluate the effect of the acute consumption of grape juice and red wine from two cultivars on the biomarkers of oxidative stress in healthy individuals and the antioxidant effect in vitro. This intervention study, characterized as a crossover clinical trial, used grape juice, red wine and water (control), where healthy volunteers were evaluated before and after consumption, associated or not with a meal. Each subject was submitted to the procedure described above, three times with a one-week interval between each procedure, receiving at each of the three treatments. The blood was used for biochemical analysis and antioxidant potential. In addition to this, SH-SY5Y neural cells were induced to oxidative stress with the addition of hydrogen peroxide and added to different concentrations of juice and wine in order to test the antioxidant potential of the beverages. The results showed that great amount of phenolic compounds found in the samples of grape juice and wine contributed to the high in vitro antioxidant potential of these beverages. In addition, in vitro antioxidant capacity can be reproduced in vivo following acute ingestion by healthy subjects, consumption of Bordo juice and wine improved antioxidant capacity and reduced lipid oxidation in healthy volunteers. Juice and wine were able to lower glucose levels and only wine increased uric acid levels. Likewise, the wine had no antioxidant effect on the cell culture showing to be toxic in high concentration, while the juice had antioxidant effects against the cellular oxidative stress induced by H2O2. Grape juice and wine can be.

(16) used to improve health and as a preventive for diseases related to oxidative stress, but wine should be consumed in smaller doses due to the pro-oxidant effect observed in cell culture.. Keywords: bioactive compounds, antioxidant activity, oxidative stress, acute intake, whole grape juice, red wine, cell assay..

(17) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Dados da evolução de quantidade de uvas processadas pelas empresas do RS (milhões de Kg). ............................................................................................. 27 Figura 2 - Tabela da Elaboração de Vinhos e Derivados no Rio Grande do Sul - 2006 a 2017 ....................................................................................................................... 28 MANUSCRITO 1 Figure 1 - Phenolic composition and in vitro antioxidant activity of the grape juice and wine .................................................................................................................... 41 Figure 2 - Effect of Cabernet Sauvignon juice and wine on H2O2-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells ....................................................................................................... 43 Figure 3 - Effect of Cabernet Sauvignon juice and wine on H2O2-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells ....................................................................................................... 44 Figure 4 - Principal componente analysis ploto f Cabernet Sauvignon juice and wine sample over the phenolic composition, the in vitro antioxidant activity and in SHSY5Y cells ................................................................................................................. 45 MANUSCRITO 2 Figure 1 -Flow chart of the selection of subjects in the controlled intervention study .................................................................................................................................. 58 Figure 2 - Changes in serum TBARS levels (A) and plasma antioxidant capacity assessed by the ABTS (B) and FRAP assays (C) in humans after consumption of Bordo juice, Bordo wine or water (control) ................................................................ 64 Figure 3 - Effect of Bordo grape juice and wine on H2O2-induced cytotoxicity in SHSY5Y cells. ................................................................................................................ 65 MANUSCRITO 3 Figure 1 - Relative changes in the parameters TAC (A), FRAP (B) and AOPP (C) after juice and wine consumption. ............................................................................. 87 Figure 2 - Relative changes in the parameters Glucose (A), Albumin (B), Uric Acid (C) and Triglycerides (D) after juice and wine consumption. ..................................... 88 Figure 3 - Relative changes in the parameters Cholesterol (A), HDL (B) and LDL (C) after juice and wine consumption. ............................................................................. 89.

(18) LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Estado da arte referente a estudos que utilizaram como variáveis o efeito do consumo de suco e vinho sobre a atividade antioxidante de indivíduos saudáveis. .................................................................................................................................. 23 MANUSCRITO 1 Table 1 - Phenolic composition and in vitro antioxidant activity of the grape juice and wine .......................................................................................................................... 41 MANUSCRITO 2 Table 1 - Selection criteria of study participants. ...................................................... 58 Table 2 - Baseline characteristics of subjects enrolled in the study .......................... 61 Table 3 - Phenolic composition and in vitro antioxidant activity of the Bordo grape juice and wine ........................................................................................................... 62 Table 4 - Glucose and uric acid levels in healthy individuals at baseline and after the interventions with Bordo grape juice, Bordo wine and water (control). ..................... 63 MANUSCRITO 3 Table 1 - Nutrition composition and caloric value of test meal .................................. 82 Table 2 - Biochemical parameters, total antioxidant and oxidant status of healthy individuals after meal with Control (water), Bordo juice or Bordo wine. .................... 85.

(19) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS °C µL AAPH ABTS AlCl3 CE CO2 DNA ERN ERO FeCl3 FRAP GAE h H2O2 HBA HCA HCl HDL HPLC L-1 LDL m M M-3-G ME mg min mL mM Na2CO3 NaNO2 NaOH nm ROS S SO2 TAC TE TPTZ TxB2 W. Graus Celsius microlitros 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride 2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium Cloreto de alumínio Equivalente em catequina Dióxido de carbono Ácido desoxirribonucleico Espécies reativas de nitrogênio Espécies reativas de oxigênio Cloreto de Ferro Ferric reducing antioxidant power Equivalente em ácido gálico horas Peróxido de hidrogênio Ácido hidroxibenzóico Acido hidroxicinâmico Ácido clorídrigo Lipoproteína de alta densidade Cromatografia líquida de alta eficiência Por litro Lipoproteína de baixa densidade metros Molar Malvidina-3-glicosídeo Equivalente em malvidina miligramas Minutos mililitros Milimolar Carbonato de sódio Nitrito de sódio Hidróxido de sódio nanometros Reactive oxygen species South Dióxido de enxofre Capacidade antioxidante Equivalente em trolox 2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine Thromboxane B2 west.

(20) LISTA DE ANEXOS ........... – Parecer do comitê de ética em pesquisas com Seres humanos da Universidade Federal de Santa MARIA (CEP-UFSM) ............................................ 104 – Trabalho parcial apresentado no "XXV Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos" em Gramado, RS/Brasil................................................. 107 - Artigo original “Acute consumption of Bordo grape juice and wine improve serum antioxidant status in healthy individuals and inhibit reactive oxygen species production in human neuron-like cells .................................................................... 108 APÊNDICE 1 – Questionário de inclusão dos sujeitos da pesquisa.............. .........109 APÊNDICE 2 – Orientações gerais para os sujeitos da pesquisa.............. ............110 APÊNDICE 3 – TCLE................................................................................ ............ 111.

(21) SUMÁRIO. 1. APRESENTAÇÃO .............................................................................................. 21. 2. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 22. 3. OBJETIVOS........................................................................................................ 24. 4. 5. 3.1.1. Objetivo geral ................................................................................................................ 24. 3.1.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 24. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 25 4.1. VITICULTURA ......................................................................................................................... 25. 4.2. POLIFENÓIS NA UVA, SUCO E VINHO .................................................................................... 28. 4.3. POTENCIAL ANTIOXIDANTE IN VIVO E IN VITRO DO SUCO E DO VINHO .............................. 30. 4.4. ESTRESSE OXIDATIVO E ESTADO PÓS-PRANDIAL .................................................................. 31. DESENVOLVIMENTO ........................................................................................ 33 5.1. Manuscrito 1 ......................................................................................................................... 33. 5.2. Manuscrito 2 ......................................................................................................................... 53. 5.3. Manuscrito 3 ......................................................................................................................... 78. 6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 95. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 96.

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(23) 21. 1. APRESENTAÇÃO Essa tese segue as normas estabelecidas na Estrutura e Apresentação de. Monografias, Dissertações e Teses – MDT da UFSM (UFSM, 2015). Os resultados estão apresentados na forma de três artigos científicos que se encontram no ítem DESENVOLVIMENTO. As seções Materiais e Métodos, Resultados e Discussão encontram-se nos artigos científicos e representam a íntegra desse trabalho. Ao final dessa tese, encontra-se o item CONCLUSÕES, apresentando uma compilação de interpretações e comentários a respeito dos resultados demonstrados nos artigos científicos contidos nesse trabalho. As REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS referemse somente às citações que aparecem no item INTRODUÇÃO e REVISÃO BIBLIOGRÁFICA dessa tese..

(24) 22. 2. INTRODUÇÃO A uva é uma das frutas mais investigadas no mundo, sua composição e. propriedades tem sido extensivamente estudada quanto a presença de grandes quantidades de compostos fenólicos, sendo que a maioria desses compostos encontrados podem atuar como antioxidantes (ROCKENBACH et al., 2011). Os compostos fenólicos são as maiores fontes de antioxidantes consumidos na dieta humana e estão distribuídos amplamente em frutas, hortaliças e bebidas como o chá, a cerveja, o suco de uva e o vinho (AGUDO et al., 2007). Os vinhos tintos são fontes ricas em compostos fenólicos, e estes exercem um potente aumento da capacidade antioxidante em humanos, ao inibir a oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) humana in vitro e reduzir a susceptibilidade da peroxidação lipídica no plasma humano (GOLDE; SLOOTS; VERMEULEN, 1999; DOTAN; LICHTENBERG; PINCHUK, 2004). O suco de uva também é apontado como uma excelente fonte desses compostos. Em estudo realizado por Chou, Keevil e Aeschlimann (2001), estes demonstraram que o consumo de suco reduziu a agregação plaquetária, inibição da oxidação da LDL e agiu como relaxante do endotélio. No entanto, os compostos fenólicos presentes no vinho tinto e suco de uva apresentam diferenças em sua composição e quantidade (DAS; DAS, 2010). Além do mais, o mecanismo que envolve a proteção do vinho é bastante discutível, devido aos efeitos do álcool e dos componentes não alcóolicos do vinho. O álcool por si só possui efeitos favoráveis nos índices das lipoproteínas de alta densidade (HDL) e agregação plaquetária (ESTRUC; SCANELLA; BADÍA, 2004; IRITI; VARONI, 2014). Por tudo isso, muitos estudos sugerem os benefícios do consumo do vinho pela presença dos compostos fenólicos, como também sua associação ao álcool; por outro lado, alguns estudos ainda sugerem o consumo do suco de uva como fonte de compostos fenólicos e alternativa não alcóolica, e disponível para uma ampla faixa da população. Contudo, não foram encontrados na literatura, estudos conclusivos comparando o consumo do vinho e do suco integral (Tabela 1). Este estudo propõe também a correlação entre o potencial antioxidante in vitro e in vivo das bebidas, a fim de demonstrar se os benefícios são reprodutíveis em modelo humano..

(25) 23. Tabela 1 - Estado da arte referente a estudos que utilizaram como variáveis o efeito do consumo de suco e vinho sobre a atividade antioxidante de indivíduos saudáveis. Autores/Local. Objetivos. Ensaio experimental e parâmetros avaliados. Conclusão. Bub e colaboradores, 2001 - Alemanha. Comparar as alterações na malvidina-3-glucósido do plasma (M-3-G) e sua excreção urinária após ingestão de vinho tinto, vinho tinto desalcolizado e suco de uva tinto.. Seis homens saudáveis consumiram 500 mL de cada bebida. M-3-G no plasma e na urina foram mensurados por HPLC.. M-3-G é mal absorvido após uma única ingestão. Outros compostos polifenólicos podem ser responsáveis pela atividade antioxidante in vivo.. Frank e colaboradores, 2003 - Alemanha. Investigar os parâmetros farmacocinéticos após o consumo de vinho e suco de uva tinto.. Nove voluntários saudáveis ingeriram 400 mL de cada bebida. Antocianinas no plasma e urina foram mensuradas por HPLC.. Uma baixa biodisponibilidade não conseguiu explicar o efeito antioxidante das antocianinas.. Coimbra e colaboradores, 2005 - Brasil. Comparar os efeitos de suco de uva e vinho tintos sobre a reatividade arterial, agregação plaquetária, moléculas de adesão, glicose e lipídios plasmáticos em indivíduos hipercolesterolêmicos.. Dezesseis indivíduos hipercolesterolêmicos ingeriram 500 mL de suco de uva ou 250 mL de vinho tinto por dia durante 14 dias.. O suco protegeu contra a doença arterial coronariana sem os efeitos negativos adicionais do álcool.. Bitsch e colaboradores, 2004 - Alemanha. Investigar a biodisponibilidade e biocinética após o consumo de vinho e suco de uva tinto.. Análises de perfil lipídico e de agregação plaquetária. Nove indivíduos saudáveis ingeriram 400 mL de suco de uva ou vinho tinto. Antocianinas foram avaliadas no plasma e urina por HPLC.. A atividade antioxidante plasmática aumentou para níveis mais altos após a ingestão de suco em comparação com o vinho. Desta forma elaborou-se a seguinte pergunta de partida: Qual é o efeito do consumo agudo de suco e vinho na atividade antioxidante e biomarcador de dano oxidativo em indivíduos saudáveis?.

(26) 24. 3. OBJETIVOS. 3.1.1 Objetivo geral Comparar os efeitos do consumo de suco de uva integral e vinho tinto sobre os marcadores de estresse oxidativos em humanos.. 3.1.2 Objetivos específicos . Avaliar o efeito neuroprotetor de suco e vinho de uvas Cabernet Sauvignon em células SH-SY5Y.. . Avaliar o efeito de suco e vinho de uvas Bordo sobre o status oxidativo in vitro e em humanos.. . Avaliar o efeito de suco e vinho de uvas Bordo sobre alterações pós prandiais em parâmetros bioquímicos e oxidativos em humanos..

(27) 25. 4 4.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA VITICULTURA A videira pertence ao gênero Vitis, família Vitaceae. O gênero Vitis é composto. por mais de 60 espécies, cuja distribuição geográfica espontânea contempla os continentes asiático, europeu e americano. A espécie mais cultivada no mundo é a Vitis vinifera, apresentando grande número de cultivares, tanto de uvas para vinho como também de uvas de mesa e de uvas para a produção de passas. As cultivares desta espécie também são conhecidas como uvas europeias ou uvas finas. A segunda espécie em importância pela área cultivada no mundo é a Vitis labrusca e o número de variedades cultivadas desta espécie limita-se a algumas dezenas. As uvas de V. labrusca são utilizadas para o consumo in natura e processamento, em especial para a elaboração de suco de uva; em alguns países da América e da Ásia também são elaborados vinhos com uvas labruscas (CAMARGO, 2017). As uvas finas (V. vinifera) são usadas em todo o mundo para consumo in natura e processamento. Aproximadamente 70 cultivares compõem o elenco varietal brasileiro de uvas finas para processamento. As principais cultivares tintas, pelo volume processado, são Cabernet Sauvignon, Merlot, Cabernet Franc, Tannat, Ancellota, Pinot Noir e Egiodola, mais expressivas no sul do país, e as cvs. Syrah e Alicante Bouschet, mais importantes na Região Nordeste. As uvas comuns representam mais de 80% da produção brasileira de uvas para processamento e têm significativa importância também como uvas de mesa. Cerca de 40 cultivares entre labruscas, bourquinas e híbridas interespecíficas compõem o elenco varietal brasileiro. As principais cultivares tintas são Isabel, Bordô, Concord, pertencentes à espécie V. labrusca, com grande aptidão para a elaboração de suco, mas também utilizadas para a produção de vinhos (CAMARGO, 2017). No Brasil as variedades de uvas americanas Vitis labrusca L. são amplamente cultivadas, principalmente para a elaboração de sucos e vinhos. A variedade Bordô é uma das mais cultivadas nacionalmente e se destaca por sua excelente adaptação às condições climáticas brasileiras, apresentando em sua composição alta concentração de matéria corante e originando bebidas com intensa coloração (MAIA; CAMARGO, 2005). Embora a cultivar Cabernet Sauvignon tenha sido introduzida no Brasil em 1921, foi somente depois de 1980 que houve incremento de seu plantio na Serra.

(28) 26. Gaúcha e na Fronteira Oeste do Rio Grande do Sul. Atualmente, é a cultivar de Vitis vinifera com maior demanda para a implantação de novos vinhedos (CAMARGO, 2017). A viticultura, ciência que estuda a produção da uva, é uma atividade tradicional, a qual se desenvolveu, no Brasil, com base em uvas americanas da variedade Vitis labrusca e Vitis bourquina, usadas para a elaboração de vinho de mesa. Só a partir do século XX, passou a produzir vinhos finos, com uvas da variedade Vitis vinífera (CAMARGO, 2009). A viticultura brasileira se destaca em 13 regiões brasileiras, sendo subdivididas quanto as condições climáticas, zona temperada, subtropical e tropical. A zona temperada é composta por 9 regiões, Fronteira, Serra do Sudeste, Centro e Norte do RS, Serra Gaúcha, Campos de cima da Serra, Planalto Norte e Carbonífera, Planalto Serrano e Vale do Rio do peixe, Sudeste de São Pauto e Sul de Minas. A região do Norte do Paraná é a única integrante da Zona Subtropical. E as regiões Noroeste de SP, Norte de Minas e Vale do Submédio do São Francisco (Pernambuco e Bahia) caracterizam-se como zonas tropicais, com sistemas de manejo adaptado as suas condições ambientais específicas (IBRAVIN, 2012). A produção de uvas no Brasil vem aumentando a cada ano, apenas no Rio Grande do Sul, responsável por cerca de 90% da produção nacional de vinhos, sucos e derivados, a quantidade de uvas processadas passou de 434,9 para 753,3 milhões de Kg nos últimos 10 anos. Só no ano de 2017 obteve-se uma produção de 77,9 milhões de Kg de uvas viníferas, enquanto que a produção de uvas híbridas americanas atingiu a marca de 675,4 milhões de Kg (Figura 1) (IBRAVIN, 2017). A produção de uvas é especialmente importante na serra gaúcha pois, quase a totalidade da produção se destina à agroindústria do suco e do vinho e é essencialmente produzida por pequenos agricultores de agricultura familiar. Nos últimos anos, com a implementação das Indicações Geográficas no Brasil, a viticultura tem contribuído fortemente para o desenvolvimento dos territórios envolvidos, promovendo agregação de valor aos produtos e a valorização de seus respectivos fatores naturais e culturais (EMBRAPA, 2016)..

(29) 27. Figura 1 - Dados da evolução de quantidade de uvas processadas pelas empresas do RS (milhões de Kg).. Fonte: IBRAVIN/MAPA/SEAPI-RS Cadastro Vinícola, 2017.. Segundo dados do informativo da EMBRAPA no ano de 2016, os vinhos de mesa, elaborados com uvas americanas e híbridas, mostraram aumento de 7,21% na sua produção, com alta de 7,63% para os tintos e de 5,66% para os brancos. O suco de uva apresentou incremento de produção de 9,63%, sendo o maior aumento de suco de uva integral (20,54%). A produção de suco concentrado aumentou em 6,79%. Cabe destacar também o aumento de produção de mosto simples em 75,24%, o qual pode ser usado tanto para vinificação quanto para a elaboração de suco e outros derivados. O segmento de suco tem sido uma alternativa para a sustentabilidade da vitivinicultura gaúcha pois tem absorvido uma boa parte da produção de uvas americanas e híbridas que tradicionalmente eram absorvidas pelos vinhos de mesa (MELLO, 2015). Além do mais, dados desse ano mostraram que a produção de vinhos, sucos e derivados no Rio Grande do Sul, foi de 485,44 milhões de litros, cerca de 2,4 vezes maior que no ano anterior (Figura 2)..

(30) 28. Figura 2 - Tabela da Elaboração de Vinhos e Derivados no Rio Grande do Sul - 2006 a 2017. Fonte: IBRAVIN/MAPA/SEAPI-RS - Cadastro Vinícola (2017). 4.2. POLIFENÓIS NA UVA, SUCO E VINHO Os compostos fenólicos são importantes metabólitos de plantas, os quais estão. presentes em uvas e derivados como o vinho e o suco e desempenham um papel importante nas características sensoriais destes, pois são responsáveis por algumas propriedades organolépticas, tais como aroma, cor, sabor, amargura e astringência (LINSKENS; JACKSON, 1988; SCALBERT et al., 1993). Além das características sensoriais, essas substâncias estão relacionadas com a estabilidade química que proporcionam diversos benefícios para a saúde (CAMARGO et al., 2014; GARRIDO; BORGES, 2013; TOALDO, 2015). Estes compostos podem se dividir em dois grandes grupos: flavonóides e não flavonóides. Em termos de quantidade, os principais fenólicos presentes em vinhos e sucos pertencem às famílias dos flavonóides, tais como flavanóis, antocianinas e ácidos fenólicos (GRANATO et al., 2015; LEEUW et al., 2014; LIMA et al., 2014). Os principais flavanóis encontrados em vinhos e sucos de uva são as catequinas, epicatequinas, epigalocatequinas e procianidinas, compostos estes associados ao sabor e várias propriedades antimicrobianas, antiinflamatórias e bioativas como atividade antioxidante in vitro e in vivo (GRANATO et al., 2016; LEEUW et al., 2014;.

(31) 29. SCOLA et al., 2010). As antocianinas são as substâncias responsáveis pela cor característica de vinhos e sucos de uva, e as principais encontradas são: malvidina, cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina e pelargonidina, as quais nas variedades Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L. predominam nas formas de 3-monoglicosideo e 3,5diglicosideo, respectivamente (GARRIDO; BORGES, 2013; LAMBRI ET AL., 2015; NIXDORF; HER MOSÍN-GUTIÉRREZ, 2010). Os principais compostos não flavonóides em vinho são os ácidos fenólicos e são divididos em hidroxibenzóico (HBA) e hidroxicinâmico (HCA). Os principais ácidos HBA presentes em sucos e vinhos são protocatequina, vanilina, ácido gálico e siríngico, e os principais HCA são q-cumárico, cafeína, ferulico, ácido cis e trans cinâmico (GARRIDO; BORGES, 2013; GRANATO et al., 2016; LEEUW, et al., 2014; TOALDO, 2015). Estes compostos desempenham um papel primordial na definição das características sensoriais dos vinhos, dando o sabor de "madeira de carvalho" típico dos vinhos envelhecidos, além de serem em grande parte responsáveis pela adstringência e amargor dos vinhos jovens (MONAGAS; BARTOLOMÉ; GÓMEZCORDOVÉS, 2005; SOMERS; EVANS, 1987; VRHOVSEK, 1998). Os ácidos hidroxicinâmicos e os seus ésteres tartáricos são a principal classe de fenólicos não flavonóides nos vinhos tintos. Eles estão envolvidos nas reações de ressonância de mosto e vinho e são precursores de fenóis voláteis (VRHOVSEK, 1998). O ácido gálico é o principal ácido hidroxibenzóico no vinho tinto. Vinhos envelhecidos em carvalho apresentam altos níveis de derivados de ácido hidroxibenzóico, principalmente ácido elágico (LOPES et al., 2006). O conhecimento da relação entre a qualidade de um determinado vinho e a sua composição fenólica são, no presente, um dos maiores desafios na pesquisa enológica. O perfil de antocianinas, por exemplo, foi proposto como uma ferramenta analítica na certificação de varietais de vinhos (KENNEDY, 2008; KONTOUDAKIS et al., 2011). É conhecido, também, que os padrões de algumas classes de flavonóides, como antocianinas, estão sob rigoroso controle genético e que sua distribuição varia consideravelmente entre diferentes cultivares de uva (REVILLA et al, 2001). Pode, ainda, ajudar a avaliar a autenticidade dos produtos regionais e a predição das propriedades sensoriais e estabilidade oxidativa do vinho (LOPES et al., 2006). Além disso, os fenólicos são utilizados como marcadores da tecnologia de processamento de vinhos ou envelhecimento do vinho (RIBÉREAU-GAYON et al., 1998; VRHOVSEK, 1998)..

(32) 30. A composição fenólica não volátil do vinho depende de inúmeras fatores como variedade de uva e maturidade, fatores ambientais nos vinhedos (clima, solo e estágio sanitário) e a tecnologia vinícola, bem como condições de fermentação e envelhecimento (FANG et al., 2008). Práticas de pré-fermentação, como adição de SO2 e ácido ascórbico antes do esmagamento de uvas ou operações como maceração, fermentação alcoólica, inoculação de diferentes cepas de fermento, fermentação maloláctica, fenômenos de precipitação, oxidação ou adsorção, em conjunto com atividade da β-glucosidase e esclarecimento com alguns agentes de compensação (usado nas operações de esclarecimento e filtração do vinho) também podem influenciar o níveis de compostos fenólicos durante o processo de vinificação (BALÍK, et al, 2008; KENNEDY, 2008; LINSKENS; JACKSON, 1988; SAUCIER, 2010; SCALBERT et al., 1993).. 4.3. POTENCIAL ANTIOXIDANTE IN VIVO E IN VITRO DO SUCO E DO VINHO A uva e seus derivados, conforme já visto, são ricos em compostos fenólicos e. diferentes estudos vêm demonstrando que essas substâncias possuem atividade biológica benéfica para a saúde dos consumidores (KRIKORIAN et al., 2012; VAUZOUR et al., 2010). Os compostos fenólicos, principalmente flavonóides (flavanóis, flavonóis e antocianinas) estão associados com uma melhora na saúde, juntamente com outros compostos que não são flavonóides, como os ácidos fenólicos e o estilbeno resveratrol (ALI et al., 2010; KRIKORIAN et al., 2012; SAUTTER et al., 2005; XIA et al., 2010). Os flavonóis receberam interesse considerável devido às suas propriedades antioxidantes (MUDNIC et al., 2010). Entre eles, (+)-catequina, (-)-epicatequina e as procianidinas ganharam atenção devido a sua atividade antioxidante, antimicrobiana e bactericida (XIA et al., 2010). As principais antocianinas encontradas, malvidina, cianidina, delfinidina, petunidina, peonidina e pelargonidina e seu consumo está associado a atividades biológicas, como capacidade antioxidante e prevenção de doenças cardiovasculares (XIA et al., 2010). Ácidos fenólicos, como o gálico, caféico e clorogênico, foram estudados por sua capacidade antioxidante e atuação como dilatadores venosos (MUDNIC et al., 2010). Além disso, estilbenos, particularmente o trans-resveratrol (trans-3,5,40-trihydroxystilbene), tem sido associado com muitos benefícios para a saúde incluindo ação bactericida, fungicida, cardio-protetora,.

(33) 31. atividade anticancerígena, assim como um aumento na longevidade em humanos (ALI et al., 2010). Estudos in vitro mostraram que o suco de uva tem significativa atividade antioxidante e pode inibir a oxidação de LDL (ABU-AMSHA et al., 1996; WANG, 1996; DURAK et al., 1999). Estudos em humanos mostraram resultados promissores, mas foram limitados pela curta duração de suplementação (MIYAGI, 1997; DAY, et al, 1997; FREEDMAN et al., 2001; STEIN et al., 1999), até o presente momento, existem poucos estudos sobre os efeitos de consumo crônico de suco de uva em estado antioxidante e marcadores de danos oxidativos em lipídios e proteínas. Estudos in vitro, conforme descrito por O’byrne et al. (2002), sugerem que os flavonóides de suco de uva fornecem uma proteção antioxidante in vivo mais potente que antioxidantes lipofílicos, tal como o tocoferol. O estudo comprovou que a suplementação com 400 µL de tocoferol ao dia é suficiente para diminuir a oxidação de LDL e F2-isoprostanos urinários que são marcadores de peroxidação lipídica. O consumo moderado de vinho tinto, em particular, demonstrou ter um efeito positivo sobre risco de doença cardiovascular, que não pode ser meramente atribuído ao seu teor de etanol (DELL’AGLI, 2004). Para vinho tinto e suco de uva (STEIN et al., 1999; PARK, 2004; PAPAMICHAEL et al., 2004; LOPEZ-SEPULVEDA et al., 2008), vários estudos de intervenção apoiam os efeitos benéficos sobre os parâmetros relacionados à função cardiovascular como vasodilatação, pressão sanguínea, resistência à insulina e lipídios plasmáticos. A composição de polifenóis do vinho tinto e das uvas é complexa e está cada vez mais tornando-se claro que em seres humanos e animais a biodisponibilidade de muitos polifenóis alimentares é baixa, o que foi sugerido como verdadeiro para proantocianidinas e antocianinas presentes em uva e vinho tinto (VAN DORSTEN et al., 2010).. 4.4. ESTRESSE OXIDATIVO E ESTADO PÓS-PRANDIAL. As espécies reativas (ER) são produzidas nos organismos vivos como resultado do metabolismo celular normal. Estas espécies constituem substâncias reativas e instáveis, geradas in vivo, tanto em condições fisiológicas quanto em condições patológicas.. Em concentrações baixas a moderadas, funcionam em. condições celulares fisiológicas, mas em altas concentrações, elas produzem.

(34) 32. modificações adversas aos componentes celulares. A proteção do organismo contra os danos oxidativos abrange um sistema de defesa antioxidante, que pode ser produzido pelo próprio corpo ou absorvido através da dieta, atuando contra o excesso de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de espécies reativas de nitrogênio (ERN) (HALLIWELL, 2012). O termo estresse oxidativo é caracterizado pelo desequilíbrio entre as concentrações das espécies reativas e os mecanismos de defesa antioxidante do organismo, que resulta em dano oxidativo a biomoléculas como DNA, lipídeos e proteínas. Esta situação pode ocorrer pelo aumento dos agentes pró-oxidantes (ERO e ERN) sem simultâneo aumento das defesas antioxidants. Porém em outras ocasiões, os antioxidantes podem apresentar-se em concentrações diminuídas sem elevação das ERO e ERN; ou ainda, os fatores anteriormente citados podem ocorrer de forma concomitante, denotando situação mais severa (SIES, 1986; DOTAN; LICHTENBERG; PINCHUK, 2004). O estresse oxidativo está associado a diversas doenças tais como a carcinogênese, mutagênese, doenças crônicas, entre outros (FANG; YANG; WU, 2002). O papel de espécies reativas na origem e/ou progressão da maioria das doenças humanas ainda não é claro, apesar de serem importantes no processo de carcinogênese e doenças neurodegenerativas (HALLIWELL, 2012). O estado pós-prandial é um período do metabolismo oxidativo ativo e formação de ROS. A hiperlipidemia e hiperglicemia pós-prandial induzidas por refeições ricas em lipídios e carboidratos induz um estresse oxidativo relativo e que é exagerado e prolongado em indivíduos obesos ou diabéticos (CHUNG et al., 1998). O estresse oxidativo pós-prandial geralmente é acompanhado de inflamação e alteração da função endotelial. Hiperlipidemia e hiperglicemia pós-prandiais são fatores de risco para doença cardio-metabólica, que está fortemente associada a desequilíbrio oxidativos (CERIELLO et al., 2002). A fim de amenizar o quadro de estresse oxidativo, antioxidantes provenientes de determinados alimentos vêm sendo estudados, dentre eles destacam-se os compostos fenólicos. O consumo de alimentos ricos polifenóis concomitante com as refeições podem ter várias vantagens no estado pós-prandial, em primeiro lugar, através de suas propriedades antioxidantes inerentes e potencial para modular o equilíbrio oxidativo (redox) celular (BOURTON-FREEMAN, 2010)..

(35) 33. 5. DESENVOLVIMENTO. 5.1. Manuscrito 1. NEUROPROTECTIVE EFFECT OF CABERNET SAUVIGNON GRAPE JUICE AND WINE AGAINST HYDROGEN PEROXIDE-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN HUMAN NEURON-LIKE CELLS (SH-SY5Y) Este manuscrito está em processo de revisão para submissão no periódico Free Radical Biology Medicine.

(36) 34. NEUROPROTECTIVE EFFECT OF CABERNET SAUVIGNON GRAPE JUICE AND WINE AGAINST HYDROGEN PEROXIDE-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN HUMAN NEURON-LIKE CELLS (SH-SY5Y) Cristiane Copetti1*, Eduarda da Rosa Machado1, Fernanda Wouters Franco1, Carine Gláucia Comarella1, Caroline Sefrin Speroni1, Vitor Miranda Ramos2, José Cláudio Fonseca Moreira2, Cláudia Kaehler Sautter1 and Neidi Garcia Penna1 1Department. of Food Technology and Science, Center of Rural Sciences, Federal University of Santa Maria (UFSM). Santa Maria, RS, Brazil. 2Center. of Oxidative Stress Research (CEEO), Department of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), 2600, Ramiro Barcelos Street - Annex, CEP 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil. *Correspondence: copetti.cris@gmail.com (C. Copetti).; Tel.: +55 55 3220-8547. Abstract: The antioxidant capacity of grape juice and wine has been demonstrated in biological systems in vitro and in vivo, being usually attributed to some bioactive compounds present in beverages, such as polyphenols, since they behave as reactive oxygen species-scavengers and metal-chelators. However, there have been few reports comparing and discussing the antioxidant capacity effects of developed in juice and wine from the same species and cultivar. Therefore, the objectives of this study were to evaluate the total phenolic, flavonoid and anthocyanin contents as well as total antioxidant capacity of Cabernet Sauvignon juice and wine. In addition, the neuroprotective effects using SH-SY5Y cells insulted with H2O2 in vitro. Cellular-based measurements of antioxidante capacity exhibited that the juice and wine extracts had cellular antioxidant capacities. Furthermore, juice increased the viability of SH-SY5Y cells, in contrast with wine that as the doses increased the cell viability decreased. Our findings suggest that juice and wine are potential antioxidant and have positive effect against reactive species generated in SH-SY5Y cells, suggesting a neuroprotective effect.. Keywords: Vitis vinifera, antioxidant capacity, dichlorofluorescein-diacetate assay, metabolic mitochondrial viability assay, reactive oxygen species..

(37) 35. 1. INTRODUCTION Oxidative stress is caused by the insufficient capacity of biological systems to. neutralize reactive species produced in excess. A serious imbalance between the generation of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant protection in favor of the former causes excessive oxidative damage in cells and tissues (HALLIWELL, 2011) because the ROS excessive production is associated with disruption of cell cycle regulatory mechanisms (GASPAROTTO et al., 2014). Furthermore, excessive or prolonged ROS generation cause various health problems, such as cardiovascular disease, insulin resistance, type 2 diabetes, osteoporosis, arthritis, asthma, and inflammatory bowel disease (HALLIWELL et al., 1995; DRÖGE, 2002; RANKIN, 2004), therefore, regulation of ROS levels is critical for reducing the risk of related chronic diseases (WANG; CAO; PRIOR, 1996). Towards the end of 20th century, epidemiological studies and associated metaanalyses strongly suggested that long term consumption of diets rich in plant polypehonols offered some protection against development of cancers, cardiovascular diseases, diabetes, osteoporosis and neurodegenerative diseases (PANDEY; RIZVI, 2009). Polyphenols are naturally occurring compounds found largely in the fruits, vegetables, cereals and beverages because they are secondary metabolites of plants and are generally involved in defense against ultraviolet radiation or aggression by pathogens (BECKMAN, 2000). In food, polyphenols may contribute to the bitterness, astringency, color, flavor, odor and oxidative stability. Fruits and vegetables are rich in dietary antioxidants, such as vitamins and phenolics (WANG; CAO; PRIOR, 1996). Fruits like grapes, apple, pear, cherries and berries contains up to 200–300 mg polyphenols per 100 grams fresh weight. The products manufactured from these fruits, also contain polyphenols in significant amounts, typically a glass of red wine or a cup of tea or coffee contains about 100 mg of polyphenols (SCALBERT et al., 2005; SPENCER et al., 2008). In this sense, grapes and their products are rich in antioxidant compounds such as flavonoids, anthocyanins, tannins, phenolic acids, among others (ABE et al., 2007; CAPANOGLU et al., 2013). Grapes are rich in phenolic compounds and different studies have demonstrated that these substances possess biological activity related to health benefits for the consumers (KRIKORIAN et al., 2012; VAUZOUR et al., 2010) and its bioactive compounds can reduce the damage caused by oxidative stress,.

(38) 36. helping to the prevention of many chronic and neurological diseases (CASTILLA et al., 2006; DANI, 2007; CANTOS et al., 2002; LACERDA et al, 2014). The phenolic compounds in grapes and derivatives, mainly the flavonoids, flavanols, flavonols and anthocyanins, are associated with improved health, along with other compounds which are not flavonoids, such as phenolic acids and the stilbene resveratrol (SAUTTER et al., 2005; XIA et al., 2010; ALI et al., 2010; KRIKORIAN et al, 2012; GRIS, 2013). The phenolic content of wine has been extensively studied, mainly in relation to providing beneficial effects on health, since in addition to antioxidante capacity it also has anti-inflammatory and anticarcinogenic effects, among others. Polyphenols from wine can be classified into two groups: non-flavonoid compounds (hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids and their derivatives and stilbenes) and flavonoid compounds (anthocyanins, flavanols and flavonols) (FRANKEL et al., 1998; BURIN et al., 2011). The flavonoid composition of red wines includes anthocyanins, catechins, and flavonols. The main flavonols are myricetin, quercetin, kaempferol, syringetin and laricitrin (MATTIVI et al., 2006). Anthocyanins are the main phenolic compounds associated with the color of red wines and are antioxidants (RICE-EVANS, MILLER, PAGANGA, 1996; ROSSETTO et al., 2004). Besides these functions, the chemical structure of polyphenols, mainly flavonoids and stilbenes (resveratrol), makes them suitable to act as antioxidants, trapping and neutralizing free radicals. Among these derivatives, the grape juice can be highlighted because it is a product that can be included in the diet of all people, from children to elderly, where the wine is not indicated. However, there have been few reports comparing and discussing the antioxidant capacity effects of developed in juice and wine from the same species and cultivar. Therefore, the objectives of this study were to evaluate the total phenolic and flavonoid contents, and antioxidante capacity of juice and wine from cultivar Cabernet Sauvignon, Vitis vinifera, and to investigate the intracellular antioxidant capacities of juice and wine using SH-SY5Y neuron-like cells..

(39) 37. 2. MATERIALS AND METHODS. 2.1. SAMPLES The commercial samples of grape juice and wine cultivar Cabernet Sauvignon. were produced by a winemaker (Casa Valduga, Bento Gonçalves, RS, Brazil). The grape fruits used to prepare juice and wine were harvested in Bento Gonçalves (29° 10’ 17” S, 51° 31’ 09” W, altitude 691 m), in the State of Rio Grande do Sul, Brazil, on January 2014. Cabernet grape juice was prepared by the enzymatic method, in which grape is crushed and then heated to at least 65°C in a hot macerator. Next, commercial pectolytic enzymes are added and must is kept between 55 and 60 °C during 1-2 h. The extracted juice is then clarified, pasteurized and bottled (RIZZON; LINK, 2006). Cabernet wine was obtained from vinification process by the coupled dispositive to the crushing machine that is called dewaxing. In winemaking of red wine, grape skin remains inside tanks during fermentation for extraction of phenolic pigments (PSZCZÓLKOWSKI; LECCO, 2011).. 2.2. BIOACTIVE COMPOUNDS. 2.2.1 Determination of Total Phenolic Content The total phenolic content of juice and wine was measured using a colorimetric method with Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (SINGLENTON; ROSSI, 1965). Each extract (200 μl) was diluted by mixing with 2.6 mL of deionized water followed by adding 200 μl of Folin-Ciocalteu’s phenol reagent. After a 6 min in incubation, 2.0 mL of 7% (w/v) Na2CO3 solution was added to the reaction mixture. At 90 min, absorbance was measured at 760 nm. Total phenolic content was expressed as mg of gallic acid equivalents (GAE) L-1.. 2.2.2 Determination of Total Flavonoid Content The total flavonoid content of the juice and wine was measured using a modified method of Zhishen et al. (1999). Briefly, 500 μl of beverages or catechin standards were mixed with 3.2 mL of deionized water. Five minutes after adding 150 μl of 5%.

(40) 38. (w/v) NaNO2, an equal volume of 10% (w/v) AlCl3 was added. After 6 min of incubation, the reaction was stopped by adding 1 mL of 1 M NaOH. The absorbance of the solution was measured immediately at 510 nm. Total flavonoid content was expressed as mg catechin equivalents (CE) 100 L-1.. 2.2.3 Determination of Total Anthocyanin Content The total anthocyanin content was assessed by the difference of absorbance before and after sample decoloration (RIBÉREAU-GAYON; STONESTREET, 1965). Two samples were prepared, each containing 1 ml of the sample to 1 ml of ethanol acidified with 0.1% HCl. Briefly, 10 mL of 2% HCl (pH 0.7) was added to the first sample and 10 ml of pH 3.45 buffer solution was added to another sample. After 15 minutes the absorbance of the solution was measured immediately at 520 nm. Total anthocyanin content in juice and wine was expressed as mg malvidin equivalents (ME) 100 L-1.. 2.3. ANTIOXIDANT CAPACITY ASSAYS. 2.3.1 Determination of Antioxidant Capacity using ABTS assay The total antioxidant capacity of juice and wine was evaluated using ABTS radicals (RE et al., 1999). Fresh ABTS radical solution was prepared by dissolving 1.0 mM of AAPH and 2.5 mM of ABTS in 100 ml of phosphate buffer solution, pH 7.4, and allowing the mixture to react for 30 min at 70°C. To measure the antioxidante capacity of beverages, diluted samples (10 μl) were reacted with the ABTS radical working solution (990 μl) at 37°C for 10 min. The absorbance of the mixture was measured at 734 nm. The results were expressed as Trolox equivalents (TE) L-1.. 2.3.2 Determination of Antioxidant Capacity using FRAP assay The antioxidant capacity of juice and wine was determined using the ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay as described by Benzie and Strain (1996). In this procedure, the antioxidants present in the serum are evaluated as reducers of Fe3+ to Fe2+, which is chelated by 2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine (TPTZ) to form a.

(41) 39. complex (Fe2+ –TPTZ) with maximum absorbance at 593 nm. Beverages samples were mixed with 1 mL of reagent containing 1.7 mM FeCl3 and 0.8 mM TPTZ, prepared in 300 mM sodium acetate, pH 3.6. The samples were incubated for 15 min at 37 °C and the absorbance was measured at 593 nm. The results were expressed as µmol Trolox equivalents (TE) L-1.. 2.4. CELL CULTURE ASSAYS Human neuron-like cell line SH-SY5Y obtained from the European Collection of. Authenticated Cell Cultures (ECACC) were maintained in 75-cm2 flasks containing DEMEM/F12 medium (1:1) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1× antibiotic/antimycotic solution (Sigma-Aldrich). Cells were cultured in a humidified incubator set at 37°C with 5% CO2. When cultures reached confluence, cells were trypsinized and seeded at a density of 30 × 103 cells/cm2 in 96-well culture plates. Treatments started 24 horas after seeding. All treatments were performed using 1% FBS supplemented medium. Juice and wine were freeze-dried to remove water and alcohol and then dissolved in culture medium at the desired concentration (w/v). Cells were exposed to these juice and wine solutions or vehicle (culture medium).. 2.4.1 Determination of Intracellular ROS Production Intracellular ROS production was detected using the 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA, Sigma) as described by Wang and Joseph (1999). Cells were pre-treated with Cabernet juice or wine (solutions in culture medium, see section 2.4) or vehicle (culture medium) during 2 h and then incubated in the absence (control) or presence of H2O2 (100µM) for 3h before monitoring DCF fluorescence. H2O2 was used as a positive control to induce ROS generation (RABELO et al., 2012). DCFH-DA stock solution was dissolved in DMSO at a final concentration of 10 mM and stored at −20°C protected from light. Before cells were treated, DCFH-DA was diluted to 100 μM using 1% FBS supplemented medium solution. After addition of DCFH-DA, cells were incubated at 37°C, with 5% CO2, and protected from light exposure for 1 h. After DCFH internalization, the medium was replaced by fresh 1% FBS supplemented medium solution. When internalized, ROS cause DCFH oxidation and it becomes a fluorophore (DCF), which was quantified using a SpectraMAX i3 (Molecular Devices) fluorescence.

(42) 40. plate reader (Ex/Em = 485/532 nm). Fluorescence was monitored and the area under the curve (AUC) of fluorescence vs. time was calculated. The results are expressed as the percentage of DCF fluorescence. Trolox_ (250 lM) dissolved in dimethyl sulfoxide was used as standard antioxidant.. 2.4.2 Metabolic Mitochondrial Viability Metabolic mitochondrial viability was assessed by the MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay as previously described by Gelain and Moreira (2008). SH-SY5Y cells were plated onto 96-well plates and exposed to Cabernet juice or wine (solutions in culture medium, see section 2.4) or vehicle (culture medium) during 24 h. Parallel sets of wells were run in the absence or presence of H2O2 (100 µM) (co-exposure scheme with juice/wine), which was used as a positive control to induce cell death (Ferrari et al., 1990). Then, cells were incubated with MTT for 45 min at 37°C in a humidified 5% CO2 atmosphere. The medium was then removed and plates were shaken with DMSO for 30 min. The optical density of each well was measured at 550 nm (test) and 690 nm.. 2.5. STATISTICAL ANALYSIS All the measurements for the levels of bioactive compounds were carried out in. triplicate and the results are expressed as mean ± standard deviation. The data were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s test. The cell culture experiments were performed with n=6 (6 wells per group). The experiments were repeated thrice and the results are expressed as mean ± standard error of the mean (SEM). The diferences among the data were evaluated by the analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s test. In addition, the Principal Component Analysis (PCA) was applied to verify the association between the anti-oxidative stress responses and the phenolic composition of juice and wine. In all cases, the differences were considered significant when p<0.05. Data analyses were performed using Statistica 7.0 software (Statsoft Inc.,Tulsa, USA)..

(43) 41. 3. RESULTS AND DISCUSSION. 3.1. BIOACTIVE COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT CAPACITY The contents of phenolics, flavonoids and anthocyanins and the antioxidant. activity (measured through ABTS and FRAP assays) in the Cabernet Sauvignon juice and wine sample are presented in Table 1. Table 1 - Phenolic composition and in vitro antioxidant activity of the grape juice and wine. Cabernet Sauvignon cultivar. Total Phenolics (GAE mg L-1). Total Flavonoids (CE mg L-1). Total Anthocyanins (ME mg L-1). Total Antioxidant Capacity (µmol TE L-1) ABTS FRAP. Juice. 466.88±51.6b. 245.13±1.4b. 2.73±0.2b. 1.67±0.3b. 21.18±0.1b. Wine. 4448.55±8.5a. 6205.66±49.9a. 101.61±2.6a. 3.54±0.3a. 265.00±0.1a. Data are presented as the mean ± standard deviation (n = 3). GAE, CE, ME, and TE stand for gallic acid equivalents, catechin equivalents, malvidin equivalents and trolox equivalents, respectively. Different superscripts in the same column indicate significant differences by Tukey’s post hoc test (p<0.05).. Significant differences in polyphenol content and antioxidant activity were found between juice and wine (p<0.001) and the highest total phenolic content was found in the wine. According to other previous study (BURIN et al., 2011), the total phenolic content of different clones of Cabernet Sauvignon wine, showed values between 2111.95 – 2569.81 mg GAE L-1, which corroborates with the hight phenolic concentration in Cabernet Sauvignon wine in the present study, since different clones, crop year and type of cultivation can vary the phenolic composition. In order to compare the results in the juice, we searched for references of rosé and white juice, according to the method used to elaborate the juice studied. Dani et al. (2009) found in rosé Goethe juice, 156.60 mg CE L-1 of total phenolics. In the other study, 487,3 mg EAG L-1 of total phenolic were found in white juice without varietal identification (VARGAS; HOELZEL; ROSA, 2008). The wine showed the highest total flavonoid and anthocyanins content compared to juice (Table 1). Similars results also were finding by Burin et al. (2011) of total monomeric anthocyanins in different clones of Cabernet Sauvignon wine (164.08 – 209.33 mg L-1). Anthocyanins are flavonoids responsible for the pigmentation in.

(44) 42. several different fruits. In grapes, they are found almost exclusively in the skins (LIAZID et al., 2011). Choi et al. (2010) showed that anthocyanins are primarily responsible for the antioxidant activity of this grape variety, which was also reported in other grape varieties. In animal studies, anthocyanins have been shown to cross the blood−brain barrier (KALT et al., 2008) to accumulate in a number of brain regions including those essential to cognitive function, and to enhance memory performance (ANDRESLACUEVA et al., 2005). The wine had the highest antioxidant capacity (Table 1). We hypothesize that the main reason for this significative difference is due to the different processing to obtain the beverages. The juice manufacturing process originated a rosé product, which there isz less contact of the grape skin with the must. Furthermore, this difference occurs because phenolic compounds are secondary metabolites produced and accumulated in plant tissues, and changes in phytopathogenesis, among other factors, may result in different concentrations of these compounds in plant organs (FERGUSON, 2001, DANI et al., 2009).. 3.2. NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF CABERNET SAUVIGNON JUICE AND. WINE Cell culture has often been used to study the cellular effects of reactive species and of antioxidants, and many useful data have resulted (HALLIWELL, 2011). Hydrogen peroxide is a physiological constituent of living cells and is continuously produced via diverse cellular pathways. Intracellular steady-state concentrations of H2O2 above 1 μM are considered to cause oxidative stress inducing growth arrest and cell death (ANTUNES; CADENAS, 2001; STONE; YANG, 2006). In experimental models used to investigate physiological functions and toxic effects of H2O2, oxidative stress responses of cells, or cytoprotection by antioxidant agents, cultured cells are often exposed to H2O2 added as a bolus into the culture medium (GÜLDEN et al., 2010). We investigated whether grape juice and wine could prevent H2O2-induced (100 μM) intracellular ROS production in SH-SY5Y cells and promote neuroprotective actions (Figures 1 and 2). To determine whether Cabernet Sauvignon juice and wine could protect against oxidative stress-induced cell death, the SH-SY5Y cell line was used as an in vitro model and H2O2 as pro-oxidant insult. After 24 h of H2O2 exposure in combination with.

(45) 43. Cabernet juice we observed that all tested concentrations (250-1000 μg/mL) were able to increase the cellular viability in relation to the 0 μg/mL concentration (Figure 1A; p<0.001). Cabernet wine at 250 μg/mL significantly increase the cell viability in the absence of H2O2, compared to 0 μg/mL, whereas 1000 μg/mL significantly increase the cell death (Figure 1B; p<0.001). In the presence of H2O2, only 250 μg/mL of Cabernet wine protected against cytotoxicity (p<0.01), while 500 and 1000 μg/mL induced further cytotoxicity compared to vehicle-H2O2 (Figure 1B, p<0.001). Figure 1 - Effect of Cabernet Sauvignon juice and wine on H2O2-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells. (A). (B) MTT Juice. MTT Wine. (A): Cell viability of cells treated with juice. (B): Cell viability of cells treated with wine. Cells were exposed to 0 (vehicle), 250, 500 and 1000 µg/mL of juice or wine during 24 h. Two-way ANOVA was applied to all data. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001; vs. the respective vehicle group. MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide).. Similar results were found by Xiang et al. (2014), when SH-SY5Y cells were treated with 100 µM H2O2, a significant loss in cell viability was observed as compared with control. However, when cells were treated with 4 mg mL-1 red wine extracts or red wine adding 10-fold resveratrol, all wine varieties showed significant neuroprotective effect against H2O2-induced oxidative stress. Furthermore, no significant differences on cell viability were observed between those cells treated with red wine adding 10fold resveratrol extra and red wine separately in all varieties. Results of the intracellular antioxidant capacity measurements of the juice and wine samples using the DCFH-DA assay were showed in figure 2. In Cabernet Sauvignon juice, all tested concentrations (250-1000 μg/mL) reduced the H2O2induced intracellular ROS production (Figure 2A; p<0.001). In the other hand, Cabernet wine had a pro-oxidant effect per se by increasing the DCF levels in the absence of H2O2 (Figure 2B; p<0.001). Whereas, 250 and 500 µg/mL of wine significantly reduced.

(46) 44. H2O2-induced production of ROS (Figure 2B; p<0.001). According Torma et al. (2017), no protective effects of açaí extracts on reactive species generation were observed in the absence of a pro-oxidant agent (H2O2). However, when cells were insulted with H2O2, there was an increase in the intracelular reactive species generation compared to untreated cells. These authors believe that H2O2 exhibits good permeability within and between cells, and in combination with metal ions (Fe and Cu), generates hydroxyl radicals (HALLIWELL, 2015). Figure 2 - Effect of Cabernet Sauvignon juice and wine on H2O2-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells. (A). (B) DCF AUC Juice. DCF AUC Wine. (A): DCF fluorescence measured of cells treated with juice. (B): DCF fluorescence of cells treated with wine. Cells were exposed to 0 (vehicle), 250, 500 and 1000 µg/mL of juice or wine during 5 h. Two-way ANOVA was applied to all data. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001; vs. the respective vehicle group. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide).. There are two possible mechanisms for the intracellular antioxidant capacity of Cabernet juice and wine. First, the beverages extract could directly eliminate ROS generated from cells macrophages through radical scavenging activity, as was previously shown by Sittisart and Chitsomboon (2014). Non-fluorescent DCFH-DA crosses cell membranes and is hydrolyzed by intracellular esterase to non-fluorescent DCFH, which can be further oxidized to fluorescent DCF by hydroxyl radicals converted from hydrogen peroxide (GIRARD-LALANCETTE; PICHETTE; LEGAULT, 2009). Based on our results, the juice and wine extracts may have been absorbed into the cells and removed cellular hydroxyl radicals so that the production of fluorescent DCF was inhibited. These cells elicit a functional response similar to human neurons, such as outgrow neurites and undergo morphological changes when challenged by oxidative stress in vitro (RABELO et al., 2012)..

(47) 45. In order to evaluate the association of the phenolic composition, in vitro antioxidant capacity and in SH-SY5Y cells H2O2-induced of the Cabernet Sauvignon juice and wine were assessed by principal components analysis (PCA) as demonstrated in Figure 3. The first two principal components explained 85.9% of the total variance, whereas Factor 1 and Factor 2 explained 59.9% and 26.0% of the total variability, respectively. The first principal component (PC1) separated juice from wine sample, perfectly distinguishing between cell viability (MTT assay) and antioxidant activity (DCFH-DA assay). Also, the phenolic composition and in vitro antioxidante capacity of wine and the antioxidante acvity in cell response showed similar scores, whereas, the cell viability in juice showed similar scores as described by the PC1. The second principal component (PC2) separated the cell viability (MTT assay) and antioxidant activity (DCFH-DA assay) associated the control and H2O2 group, thus corroborating with the results from analysis previously described (Figures 1 and 2). Figure 3 - Principal componente analysis plot of Cabernet Sauvignon juice and wine sample over the phenolic composition, the in vitro antioxidant activity and in SHSY5Y cells.. H2O2, C and values (250, 500 and 1000) means the hydrogen peroxide, control and concentrations in µg mL-1.

(48) 46. The phenolic composition and in vitro antioxidant capacity were positively scored in PC1 and were associated with the wine. In addition, the improvement on the anti-oxidative responses, verified by the decrease on EROs production, were associated with the phenolic compounds in the PCA plot, such as flavonoids, phenolics and anthocyanins, as well as the ABTS and FRAP assay. In the other hand, the cell viability can be better explicated by juice, which were quantified in juice and wine.. 4. CONCLUSIONS This study analysed the phenolic composition and antioxidant activity of juice. and wine from Vitis vinifera, cultivar Cabernet Sauvignon, and demonstrated the significantly higher concentration of phenolic constituents in wine, as well as, in the antioxidant activity (mainly in FRAP and DCFH-DA assays) and neuroprotective effects on SH-SY5Y cells. However, despite the low concentration of phenolics in the juice, it showed an important response in cell viability, which can be explained by other compounds present in the grape and not found only in the skin. These results incite further in vitro and in vivo research in order to elucidate the therapeutic potential of these beverages, especially the Cabernet Sauvignon juice, still little explored by the wineries. Acknowledgements The authors are grateful to Casa Valduga Winery for kindly providing the juice and wine, and also to the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) for financial support.. 5. REFERENCES. ABE, L.T., et al. Compostos fenólicos e capacidade antioxidante de cultivares de uvas Vitis labrusca L. e Vitis vinifera L. Food Science and Technology (Campinas), v. 27, p. 394–400, 2007. ALI, K., et al. Metabolic constituents of grapevine and grape – derived products. Phytochemistry Reviews, v. 9, p. 357–378, 2010..