ROGÉRIO BARBOSA DE LIMA

ROGÉRIO BARBOSA DE LIMA

BIOSSÍNTESE DE MONOLIGNÓIS EM RAÍZES

DE SOJA

(Glycine max

L. Merr.) TRATADAS COM

ÁCIDO CINÂMICO E DERIVADOS

FENILPROPENOIDES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (área de concentração - Biologia Celular e Molecular), da Universidade Estadual de Maringá para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.

ROGÉRIO BARBOSA DE LIMA

BIOSSÍNTESE DE MONOLIGNÓIS EM RAÍZES DE SOJA

(Glycine max

L. Merr.) TRATADAS COM ÁCIDO

CINÂMICO E DERIVADOS FENILPROPENOIDES

Prof

. Dr

. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese

Orientadora

Prof. Dr. Osvaldo Ferrarese-Filho

Coorientador

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Lima, Rogério Barbosa de

L732b Biossíntese de monolignóis em raízes de soja

(Glycine max L. Merr.) tratadas com ácido cinâmico e

derivados fenilpropenoides / Rogério Barbosa de Lima. -- Maringá : [s.n.], 2009.

62 f. : figs., tabs.

Bibliografias: f.53-54.

Orientadora : Profª. Drª. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese.

Coorientador : Prof. Dr. Osvaldo Ferrarese-Filho. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de

Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, 2009.

1. Biossíntese de monolignóis - Glycine max L. Merr. 2. Monolignóis. 3. Lignina. 4. Fenilalanina amônia liase. 5. Frações H:G:S. I. Ferrarese, Maria de Lourdes Lucio, orient. II. Ferrarese-Filho, Osvaldo, coorient. III. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. IV. Título.

BIOGRAFIA

Rogério Barbosa de Lima nasceu em Maringá/PR em 05/09/1981. Possui graduação em Licenciatura Plena em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá (UEM) (2006). Tem experiência na área de Biologia Celular e Bioquímica, atuando principalmente, nos seguintes temas: alelopatia, avaliação da atividade enzimática e lignificação da parede celular. Iniciou o curso de Mestrado no Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas - área de concentração Biologia Celular e Molecular - em Março de 2007, desenvolvendo o trabalho “Avaliação da biossíntese de monolignóis em raízes de soja (Glycine max L. Merr.) tratadas com ácido cinâmico e

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais e irmãos que sempre me incentivavam e acreditaram em mim.

Aos meus professores da graduação que me mostraram o fascinante mundo da biologia, em especial ao professor Dr. Celso Rubin que sempre me incentivou e me enriqueceu com ótimas conversas, não somente sobre o estudo da vida, a biologia, mas também sobre a própria vida.

Aos meus colegas de laboratório, fico muito grato a todos que me receberam com muita amizade e sempre se propuseram a ajudar quando precisei: Ana Paula Ferro, Anderson Soares, Rita Siqueira, Paulo Böhm, Franciele Böhm, Daniele Zanardo, Gisele Bubna, Natália Fernandes, Victor Hugo, Rogério Marchiosi, Aline Finger e Wanderley Dantas.

Sou muito grato pela companhia e ajuda constante da Aparecida Dantas e Flausina Cenerini em todos os experimentos. Muito obrigado por me tratarem como um filho.

Aos meus orientadores Maria de Lourdes Lucio Ferrarese e Osvaldo Ferrarese-Filho pela atenção, amizade e confiança em mim depositada.

Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos. E a Universidade Estadual de Maringá.

APRESENTAÇÃO

Esta dissertação é composta de uma revisão e de um artigo científico. Inicia revisando o papel do ácido cinâmico e dos fenilpropenoides na alelopatia. Tem continuidade com o artigo “Biossíntese de monolignóis em raízes de soja tratadas com ácido cinâmico e seus derivados” que descreve a composição dos monômeros de lignina. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o artigo foi redigido de acordo com a revista Journal of Chemical Ecology.

SUMÁRIO

Resumo Geral...09

General Abstract...12

Revisão da Literatura...15

Alelopatia e compostos secundários...15

Efeitos alelopáticos dos fenilpropenoides...16

De fenilpropenoides à lignina...19

Centros de Nucleação...26

Composição monomérica da lignina...27

Considerações finais...29

Referências...30

Artigo: Biossíntese de monolignóis em raízes de soja tratadas com ácido cinâmico e derivados fenilpropenoides...42

Resumo...42

Introdução...43

Material e Métodos...44

Resultado...47

Discussão...49

Conclusões...52

Referências...54

RESUMO GERAL

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS – Plantas superiores regularmente liberam compostos orgânicos no ambiente. Estes compostos, frequentemente adicionados a matriz do solo, são liberados por lixiviação, exsudação pelas raízes e pela própria decomposição de partes da planta espalhados acima ou abaixo do solo. Estes compostos acumulam-se no solo e influenciam o crescimento e o desenvolvimento das plantas vizinhas, com efeitos positivos e negativos, em um fenômeno chamado alelopatia. Um grande número de compostos tem sido relacionado como aleloquímico, incluindo o ácido cinâmico e seus derivados como os ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico e

sinápico. Exsudados no solo, estes aleloquímicos podem ser rapidamente absorvidos por outras plantas, e eventualmente, causarem injúria no crescimento das raízes, e inibição do crescimento da plântula. Após absorção, eles reduzem a absorção de água, inibem a expansão foliar, reduzem o alongamento das raízes e a razão raiz:caule. Em nível celular, eles reduzem a taxa fotossintética, induzem a peroxidação lipídica e alteram certas atividades enzimáticas causando generalizado aumento na permeabilidade da membrana e respectiva redução na absorção de água e de nutrientes. Derivados do ácido cinâmico são metabólitos da via dos fenilpropenoides. Esta via está envolvida na síntese de uma ampla gama de compostos secundários em plantas tais como ácidos fenólicos, flavonóides, taninos, cumarinas e lignina. O primeiro passo nesta via é a desaminação da fenilalanina pela fenilalanina amônia liase (PAL) produzindo cinamato, que é o substrato para a P-450 hidroxilase, cinamato 4-hidroxilase (C4H). A enzima hidroxila a posição 4 do anel aromático do cinamato formando p-cumarato. O próximo passo é a

hidroxilação na posição 3 do p-cumarato pela p-cumarato 3-hidroxilase (C3H) para

produzir cafeato, ferulato, 5-hidroxiferulato e sinapato, respectivamente. Estes metabólitos são convertidos nos monolignóis correspondentes pela ação sequencial da 4-cumarato:CoA ligase (4-CL), cinamoil-CoA redutase (CCR) e cinamil álcool desidrogenase (CAD). No último passo da via, peroxidase (POD) catalisa a polimerização oxidativa dos três alcoóis p-hidroxicinamil (p-cumaril álcool, coniferil

fenilpropenoides, como PAL e POD, e aumento no conteúdo de lignina. Para testar a hipótese que aplicação exógena de ácido cinâmico e seus principais derivados seriam canalizados na via dos fenilpropenoides e, depois, aumentar o conteúdo de lignina reduzindo o crescimento das raízes, o objetivo da presente pesquisa foi analisar seus efeitos sobre a atividade da PAL, conteúdo de lignina e composição monomérica e o crescimento das raízes de plântulas de soja.

MÉTODOS – Plântulas de três dias foram cultivadas em solução nutritiva, pH 6,0, contendo ou não 1,0 mM de aleloquímico (ácidos cinâmico, p-cumárico, cafeico,

ferúlico e sinápico). Os experimentos foram realizados em câmara de germinação (25ºC, ciclo de 12 h claro/12 h escuro, irradiação de 280 mol m-2 s-1) durante 24 horas. As raízes foram medidas antes da incubação e no final dos experimentos, e o comprimento foi obtido pela diferença entre eles. A biomassa fresca das raízes foi determinada imediatamente após a incubação, e a biomassa seca foi estimada após secagem em estufa a 80 oC até alcançar valor constante. A atividade da PAL foi avaliada por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). O conteúdo de lignina foi avaliado por espectrofotômetro, e a composição monomérica por HPLC. Subsequentes determinações da lignina e da composição monomérica foram realizados em raízes crescidas em solução nutriente contendo inibidores da via dos fenilpropenoides (AIP, ácido 2-aminoindano-2-fosfônico; PIP, ácido piperonílico ou MDCA, ácido 3,4-metilenodioxi cinâmico). ANOVA foi aplicada para verificar as significâncias das variações observadas. O teste de Scott-Knott foi aplicado para avaliar as diferenças entre os parâmetros e valores de P ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente

significantes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO – A 1,0 mM, a aplicação exógena dos ácidos cinâmico, p-cumárico e ferúlico induziu cessação do crescimento das raízes associados

com significante aumento do conteúdo de lignina. Ácido cafeico estimulou o comprimento com pouca lignificação das raízes, e reduziu as biomassas frescas e secas. Ácido sinápico não afetou o crescimento e a lignificação. A atividade da PAL diminuiu pela ação dos ácidos cinâmico, p-cumárico e cafeico. Contrariamente, a atividade da

comparação com o controle. No entanto, quando aplicado conjuntamente com MDCA (um inibidor da 4-cumarato:CoA ligase, 4-CL), os ácidos cinâmico, p-cumárico e

ferúlico diminuíram os conteúdos de lignina, comparado com os correspondentes controles, i.e., tratamentos apenas com os aleloquímicos. Os ácidos cafeico e sinápico

aumentaram os conteúdos de lignina quando comparados com o controle. Estes resultados sugerem que a reação catalisada pela 4-CL está diretamente envolvida na possível entrada dos ácidos cinâmico, p-cumárico e ferúlico exógenos na via dos

fenilpropenoides. Subsequentes resultados revelaram mudanças nos conteúdos monoméricos de lignina, nas raízes tratadas. Aumentos significativos de unidades p

-hidroxifenil (H) foram verificados na lignina das raízes expostas aos ácidos cinâmico, p

-cumárico, cafeico e ferúlico. Por outro lado, foi observado aumentos significativos de unidades guaiacil (G) na lignina das raízes com os ácidos p-cumárico, cafeico e ferúlico.

Aumento significante de unidades sinapil (S) foi notado na lignina das plantas expostas ao ácido sinápico, em comparação com o correspondente controle. Em conjunto, estes resultados sugerem que o modo de ação dos aleloquímicos e a entrada na via dos fenilpropenoides como segue. 1) Inibições das atividades da C4H e da 4-CL e a composição monomérica da lignina indicam que o ácido cinâmico é canalizado na via dos fenilpropenoides formando, exclusivamente, unidades H. 2) O ácido p-cumárico é

canalizado na via produzindo principalmente unidades monoméricas H. 3) O ácido ferúlico, e possivelmente o ácido cafeico, pode ser canalizado na via dos fenilpropenoides (pela reação da 4-CL) formando monômeros de lignina G. 4) Ácido sinápico não alterou a lignificação, mas aumentou significantemente o monômero S da lignina sugerindo sua possível esterificação na parede celular.

CONCLUSÕES – Em resumo, os resultados obtidos no presente trabalho indicam, claramente, que a aplicação exógena dos ácidos cinâmico, p-cumárico e ferúlico

GENERAL ABSTRACT

INTRODUCTION AND AIMS – Higher plants regularly release organic compounds into the environment. These products, often added to the soil matrix, are released in soil by rainwater, by exudation from roots, and by the natural decay of parts of plants lying above or below the ground. These compounds accumulate in the soil environment and influence the growth and development of neighboring plants, with positive and negative effects, in a phenomenon called allelopathy. A large number of compounds have been referred to as allelochemicals, including cinnamic acid and its derivatives such as p

-coumaric, caffeic, ferulic and sinapic acids. Exuded into the soil, these allelochemicals may be rapidly absorbed by other plants and, eventually, may cause injury to the root growth and inhibit seedling growth. After uptake, they reduce water utilization, inhibit foliar expansion and root elongation and reduce the root-stem ratio. At cellular level, they reduce the rates of photosynthesis, induce lipid peroxidation, and alter certain enzymatic activities, causing a generalized increase in membrane permeability and a respective reduction on nutrient and water uptake. Cinnamic acid derivatives are phenylpropenoid pathway metabolites. The phenylpropenoid pathway is involved in the synthesis of a wide range of secondary products in plants such as phenolic acids, flavonoids, tannins, coumarins and lignin. The first step in this pathway is the deamination of phenylalanine by phenylalanine ammonia-lyase (PAL) to produce cinnamate, which is the substrate for a P-450 hydroxylase, cinnamate 4-hydroxylase (C4H). The enzyme hydroxylates the 4-position of the aromatic ring of cinnamate to produce p-coumarate. The next step is the hydroxylation at the 3-position of p

-coumarate by the p-coumarate 3-hydroxylase (C3H) to produce caffeate, ferulate,

5-hydroxyferulate and sinapate, successively. These metabolites are subsequently converted to the corresponding monolignols by the sequential action of 4-coumarate:CoA ligase (4-CL), cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD). In the last step of the pathway, peroxidase (POD) catalyzes the oxidative polymerization of the three p-hydroxycinnamil alcohols (p-coumaryl alcohol,

coniferyl alcohol and sinapyl alcohol). They give rise to the p-hydroxyphenyl (H),

test the hypothesis that exogenously applied cinnamic acid and its main derivatives may be channeled into the phenylpropenoid pathway and, later on, to increase lignin reducing root growth, the aim of the current research was to analyze its effects on PAL activities, lignin content and monomeric composition and root growth of soybean seedlings.

METHODS – Three-day-old seedlings were cultivated in nutrient solution, pH 6.0, containing or not 1 mM of allelochemical (cinnamic, p-coumaric, caffeic, ferulic and

sinapic acids). Experiments were carried out in a growth chamber (25 °C, 12-hours light/12-hours dark cycle, irradiance of 280 mol m-2 s-1) during 24 hours. Roots were measured before incubation and at the end of experiments, and the lengths were obtained by difference among them. The fresh root weight was determined immediately after incubation, and the dry weight was estimated after oven-drying at 80 °C until it reached a constant weight. PAL activity was assayed by high performance liquid chromatography (HPLC). Lignin content was assayed by spectrophotometry, and the monomeric composition was determinated by HPLC. Subsequent determinations of lignin and monomeric composition were made in roots growing in nutrient solution containing inhibitors of the phenylpropenoid pathway (AIP, 2-aminoindan-2-phosphonic acid; PIP, piperonylic acid or MDCA, 3,4-methylenedioxy cinnamic acid). ANOVA was applied to test the significance of measured differences. Scott-Knott’s test was applied to evaluate the difference between parameters and P values ≤ 0.05 were considered

statistically significant.

RESULTS AND DISCUSSION – At 1.0 mM, exogenously supplied cinnamic, p

-coumaric and ferulic acids induced cessation of root growth root associated with significant increase of lignin content. Caffeic acid stimulated the root length with few lignification, and reduced fresh and dry weights. Sinapic acid did not affect root growth and lignification. PAL activities decreased by the action of cinnamic, p-coumaric and

caffeic acids. On the contrary, PAL activities increased after ferulic and sinapic acids treatments. When applied jointly with PIP (an inhibitor of the cinnamate 4-hydroxylase, C4H), the allelochemicals (except sinapic acid) increased the lignin contents in comparison to the control. However, when applied jointly with MDCA (an inhibitor of the 4-coumarate:CoA ligase, 4-CL), cinnamic, p-coumaric and ferulic acids prompted a

with the allelochemical alone. Caffeic and sinapic acids increased the lignin contents when compared to control. These results suggest that the reaction catalyzed by the 4-CL is directly involved in the possible entry of exogenous cinnamic, p-coumaric and ferulic

acids into the phenylpropenoid pathway. Subsequent results revealed changes in the lignin monomer contents of treated roots. Significant increases of p-hydroxyphenyl (H)

units have been verified in root lignin from cinnamic, p-coumaric, caffeic and ferulic

acids exposed plants. On other hand, significant increases of guaiacyl (G) units have been observed in root lignin from p-coumaric, caffeic and ferulic acids. Significant

increase of sinapyl (S) units has been noted in root lignin from sinapic acid exposed plants in comparison to the corresponding controls. Taken together, these results suggest that allelochemical´s mode of action and the entry via the phenylpropenoid pathway as follows. 1) Inhibition of the C4H and 4-CL activities and lignin monomer composition indicate that cinnamic acid is channeled into the pathway forming exclusively H units. 2) p-Coumaric acid is channeled into the pathway producing

mainly H lignin monomers. 3) Ferulic acid, and possibly the caffeic acid, may be channeled into the phenylpropenoid pathway (by the 4-CL reaction) forming G lignin monomers. 4) Sinapic acid did not alter the lignification, but it significantly increased the S lignin monomers suggesting a possible esterification of this allelochemical in the cell wall.

CONCLUSIONS – In brief, results obtained in the present work clearly indicates that exogenously applied cinnamic, p-coumaric and ferulic acids induce premature cessation