Tese de Doutorado
Estudo da degradação da vitamina E (
-tocoferol)
durante
as
etapas
do
refino
do
óleo
de
babaçu (
Orbignya phalerata, Mart.)
: validação de
um método
DJAVANIA AZEVÊDO DA LUZ
João Pessoa - PB - Brasil
2011
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Tese de Doutorado
Estudo da degradação da vitamina E (
-tocoferol)
durante
as
etapas
do
refino
do
óleo
de
babaçu (
Orbignya phalerata, Mart.)
: validação de
um método
Djavania Azevêdo da Luz
Tese apresent ada ao Program a de Pós-Graduação em Quím ica da Universidade Federal da Paraíba, em cum prim ent o às exigências para a obt enção do tít ulo de Dout or em Quím ica.
Orientadores: Prof. Dr. Fernando Carvalho Silva
Prof. Dr. Antonio Gouveia de Souza
João Pessoa - PB - Brasil
2011
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
L979e Luz, Djavania Azevedo da.
Estudo da degradação da vitamina E (α-tocoferol) durante as etapas do refino do óleo de babaçu (Orbignya phalerata, Mart.): validação de um método / Djavania Azevedo da Luz.- João Pessoa, 2011.
94f. : il.
Orientadores: Fernando Carvalho Silva e Antonio Gouveia de Souza
Tese (Doutorado) – UFPB/CCEN
1. Química. 2. Óleos vegetais. 3. Babaçu. 4. -tocoferol. 5. Óleo de babaçu – refino. 6. CLAE. 7. FTIR.
Com grande amor, Dedico.
Agradeço, em prim eiro lugar, a Deus, nosso Senhor, dono de t oda sabedoria, pelos livram ent os dos perigos da vida, pela força que m e t em dado diariam ent e para não desistir, pela sua const ant e presença em t odos os m om ent os de m inha vida, pois m e fez acredit ar e concretizar m ais est a im port ant e et apa da m inha vida acadêm ica. Obrigada Senhor, por TUDO!
Aos m eus queridos pais, Ant onio e Joana, pelo exem plo de dedicação e am or a fam ília, os quais sem pre m e incentivaram a est udar e nunca desistir dos m eus sonhos. Os agradeço t am bém , pela sincera confiança que em m im deposit aram desde os prim eiros anos de escola, sem pre colocando os m eus e os est udos do m eu irm ão, em prim eiro lugar nas suas vidas. Finalm ent e, os agradeço por t er m e dado à oport unidade de t er concluído m inha graduação, oport unidade est a, que agora se reflet e na conclusão da pós- graduação. Am o vocês!
Ao m eu irm ão Ricardo, pelo apoio e incentivo para nunca desistir dos m eus sonhos e obj etivos;
A m inha querida e am ada sobrinha Sophia Fernanda, um a bênção em m inha vida;
A t odos m eus fam iliares pelo apoio e am or dedicado durant e est e período e em t odos os out ros, e que firm am as bases para m inha cam inhada.
Ao prof. Dr. Fernando Carvalho Silva, por acredit ar em m im e sem pre oferecer oport unidades de novos conhecim ent os na vida acadêm ica. Obrigada por TUDO!
Aos professores Dr. Adeilt on Pereira Maciel e ao Dr. Thom as Bonierbale pelas inúm eras cont ribuições;
À profa. Dra. Kátia Marques, pelo apoio e incentivo a pesquisa.
À profa. Dra. Teresa Cristina (Depart am ent o de Tecnologia Quím ica – UFMA) por t er cedido gent ilm ent e o laborat ório para as análises crom at ográficas iniciais. Muit o Obrigada! !
A m inha am iga Moniquet e, presença const ant e em m inha vida, sem pre m e dando apoio e incentivo para nunca desanim ar dos m eus obj et ivos.
À Andrea Suam e, pela aj uda ao entendim ent o de refino de óleos veget ais.
À Lúcia (t écnica do LACOM) , por t er aj udado nos ensaios de Term ogravim et ria.
Aos secret ários da Pós- Graduação em Quím ica da UFPB, Marcos Pequeno e Glória pela am izade, at enção e pelas inform ações sem pre precisas;
Aos laborat órios LACOM/ UFPB e Núcleo de Biodiesel ( NuBI O-UFMA) , por t erem oferecido t oda est rut ura necessária para a realização desse t rabalho.
A “grande família” NuBIO pelo com panheirism o, para desenvolver um bom t rabalho em equipe, e pelos m om ent os alegres e descont raídos que com partilham os e em especial a m inha m iguxa
incentivos.
A OLEAMA S/ A, por t er cedido t odas as am ost ras de óleo brut o de babaçu, assim com o, as et apas iniciais de refino para o desenvolvim ent o dest e t rabalho, em especial aos Quím icos Alysson Alencar e Márcio Melo.
Ilumina a minha estrada, pois sempre que estás comigo, sou forte e capaz de suportar as lições a que me destinas. Orienta as decisões que deverei tomar.
Acompanha-me e certifica-me de que estarei indo ao encontro das minhas melhores opções.
Faz com que minha jornada tenha sucesso, Senhor.
Livra-me dos perigos, dos acidentes e de qualquer situação que possa me impedir de construir a minha felicidade.
Governa as minhas ações e comportamento daqueles que podem influenciar o meu destino.
Dirige a tua luz divina para esta filha tua, que ora com fervor e é motivada pelo teu amor.
Que assim seja, para sempre”
Para Chegar ao Coração do Senhor – Orações inspiradas nos Salmos de Davi Yara Beduschi Coelho
“Essa vitória custou-lhe momentos difíceis, noites de dúvidas, intermináveis dias de espera. Desde os tempos antigos, celebrar um triunfo faz parte do próprio ritualda vida: a comemoração é um rito de passagem. Celebrar hoje a sua vitória de ontem, para ter mais forças na batalha de amanhã”
Autora: Dj avania Azevêdo da Luz
Orientadores: Prof. Dr. Fernando Carvalho Silva Prof. Dr. Ant onio Gouveia de Souza
RESUMO
O Maranhão apresent a um grande pot encial agrícola para pr odução de óleos veget ais j á que várias espécies oleaginosas são adapt adas ao seu clim a e geografia. Dent re est as se encont ra a palm eira de babaçu
(Orbignya pharlerata, Mart.) , de onde é ext raído um óleo rico em
t riglicerídeos ( 95% ) e t ocoferois. Em óleos v eget ais, os t ocoferóis at uam com o agent es antioxidant es, inibindo a oxidação dos ácidos graxos insat urados. Nest e sentido, diversas m et odologias para quantificação dest e antioxidante t êm sido propost as, ent ret ant o, t ais procedim ent os geralm ent e dem andam elevados t em pos de análises e pré- t rat am ent o da am ost ra. Nest e cont ext o, o present e t rabalho propõe um m ét odo alt ernativo para quantificação de - t ocoferol em am ost ras de óleo de babaçu. Tam bém foi avaliado o grau de degradação dest a espécie durant e o processo de refino do óleo de babaçu, em escalas (indust rial e laborat orial) por crom at ografia líquida de alt a eficiência ( CLAE) e espect roscopia de infraverm elho com t ransform ada de Fourier ( FTI R) . Para t ant o, as am ost ras não foram subm etidas a qualquer t rat am ent o prévio, sendo apenas diluídas em 2- propanol ( CLAE) e clorofórm io ( FTI R) . Os dados espect roscópicos indicaram um a baixa resolução do m ét odo um a vez que não foi possível distinguir ent re os vários tipos de t ocoferois e/ ou tocotrienois ( , e δ) existentes nas amostras. Por outro lado, o m ét odo crom at ográfico desenvolvido apresentou um a excelent e separação e resolução do com post o em est udo, além de um a boa linearidade, precisão e exatidão, sendo est e validado.
Author: Dj avania Azevêdo da Luz
Superviser: Prof. Dr. Fernando Carvalho Silva Prof. Dr. Ant onio Gouveia de Souza
ABSTRACT
Due t o it s t errit orial location and t he sort of oily plant adapt ed t o it s clam at e, Maranhão has a vast agricult ural pot ential for producing veget able oil and t heir bioderivat es. Am ong t hem is t he babassu palm
(Orbignya pharlerata, Mart.) , a veget al rich in oil that is com posed by
95% of t riglycerides and t races of t ocopherols. Such t ocopherols act as antioxidative agent s that prevent the degradat ion of unsat urat ed fat ty acids of veget al oils. Therefore, several m et hods have being proposed for quantifying these nat ural antioxidant s in bot h oil and bioderivat e product s; however, t hey oft en require long tim e of analysis and a pret reat m ent of the sam ple. Thus, t his paper aim s t o propose an alt ernative m et hod for quantifing - t ocopherol in babassu oil, as well as, evaluating it s degradation during the oil refining (indust rial and laborat orial scales) by m ean of high perform ance liquid chrom at ography ( HPLC) and Fourier t ransform infrared spect roscopy ( FTI R) . Hence, no previous sam ple t reat m ent s were perform ed, being t he sam ple only dilut ed in 2- propanol ( HPLC) or chloroform ( FTI R) solvent s. The use of t he spect roscopy t echnique was rat her lim it ed, once it was i ncapable of distinguish bet ween t he t ocopherols and/ or t ocot rienols ( , and δ) present ed in t he m edia. Conversely, t he developed chrom at ographic m et hod provided an efficient separation of such com pounds, yielding in a significant sensibility and good linearity, precision and accuracy of t he result s.
LISTA DE TABELAS ... LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... LISTA DE EQUAÇÕES ...
xiv xv xvii
1. INTRODUÇÃO ... 2
2. OBJETIVOS ... 5
2.1. Objetivo Geral ... 5
2.2. Objetivos Específicos ... 5
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 7
3.1. Contexto atual brasileiro de óleo vegetal ... 7
3.2. Babaçu ... 7
3.3. Processo de obtenção de óleos ... 15
3.4. Degradação dos óleos ... 17
3.4.1. Rancificação hidrolít ica ... 18
3.4.2. Rancificação oxidat iva ... 18
3.4.3. Autoxidação ... 19
3.4.4. Fot oxidação ... 21
3.5. Antioxidantes ... 21
3.5.1. Antioxidantes nat urais ... 22
3.5.2. Aplicação do - t ocoferol... 24
3.5.3. Mecanism o de ação do - tocoferol nas reações de oxirredução ... 24
3.5.4. Antioxidantes sint ét icos ... 26
3.6. Métodos para a determinação de -tocoferol em óleos 28 3.7. Cromatografia liquida de alta eficiência – CLAE ... 29
3.8. Espectroscopia por infravermelho com transformada de Fourier – FTIR ... 32
3.9.Tratamento estatístico – Validação da metodologia .... 34
3.9.1. Precisão ... 35
3.9.2. Lim it e de det ecção e lim ite de quantificação ... 36
3.9.3. Exatidão ... 37
3.9.4. Repet it ividade ... 38
3.9.5. Reprodutibilidade ... 38
3.9.6. Linearidade ... 38
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ... 40
4.1. Equipamentos e acessórios ... 41
4.1.1. Equipam entos ... 41
4.1.2. Acessórios ... 41
4.2. Reagentes ... 41
4.3. Coleta e armazenagem de amostras ... 42
4.4. Cuidados ao manipular -tocoferol ... 42
4.5. Caracterização físico-química do óleo bruto de babaçu 42 4.5.1. Índice de acidez ( 325/ IV- I AL) ... 43
4.5.2. Índice de iodo ( 329/ IV- I AL) ... 43
4.5.3. Índice de saponificação ( 328/ I V- IAL) ... 44
4.5.4. Índice de peróxido ( 326/ I V- IAL) ... 45
4.5.5. Um idade ( 334/ I V- I AL) ... 46
4.5.6. Densidade ( 337/ I V- IAL) ... 46
4.7.1. Neutralização ... 48
4.7.2. Branqueam ento ( Clarificação) ... 48
4.7.3. Clarificação ... 49
4.8. Análises de -tocoferol ... 49
4.8.1. Identificação e quantificação de - tocoferol por CLAE ... 49
4.8.1.1. Preparo da solução est oque de - tocoferol ( 1000 m g. L-1) ... 49
4.8.1.2. Preparo da solução padrão de t rabalho de - tocoferol ( 100 m g. L-1) ... 49
4.8.1.3. Preparação das am ost ras de óleo bruto de babaçu e das et apas de refino para as análises crom atográficas ... 50
4.8.2. Equipam entos e condições operacionais – CLAE ... 50
4.9. Análises por infravermelho com transformada de Fourier – FTIR ... 51
4.10. Tratamento estatístico – Validação da metodologia.... 52
4.10.1. Precisão ( Repetitividade) ... 52
4.10.2. Exat idão ... 52
4.10.3. Lim it e de det ecção e lim ite de quantificação ... 52
4.10.4. Linearidade ... .. 53
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 54
5.1. Características físico-químicas do óleo bruto de babaçu 55 5.2. Estudo da degradação do óleo de babaçu – Análise térmica ... 56
5.3. Identificação e quantificação do -tocoferol nas amostras de óleo bruto e refinado de babaçu ... 58
5.3.1. Const rução da curva analít ica – CLAE ... 60
5.4. Análises das amostras por cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE ... 63
5.5. Análises das amostras por espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier – FTIR ... 66
5.6. Tratamento estatístico – Validação da metodologia (CLAE) ... 73
5.6.1. Precisão ( Repetitividade) ... 73
5.6.2. Exatidão ... 74
5.6.3. Lim it e de det ecção ( LD) e lim it e de quantificação ( LQ) .. 74
5.6.4. Linearidade ... 75
6. CONCLUSÃO ... 76
Figura 3.1. Produção de oleaginosas no Brasil ... 7
Figura 3.2. Palm eira de babaçu ... 8
Figura 3.3. Com posição física do fruto de babaçu ... 9
Figura 3.4. Produção nacional das am êndoas de babaçu ... 10
Figura 3.5. Exportações do óleo bruto de babaçu ... 11
Figura 3.6. Fluxogram a sim plificado do processo de refino de óleos vegetais ... 16
Figura 3.7. Estruturas quím icas naturais da vitam ina E ... 23
Figura 3.8. Mecanism o de ação do - t ocoferol nas reações de oxirredução ... 25
Figura 3.9. Estruturas fenólicas dos antioxidantes sintét icos ... 27
Figura 5.1. Curvas TG e DTG do óleo bruto de babaçu em at m osfera de ar sintét ico ... 57
Figura 5.2. Crom at ogram as da solução padrão de - tocoferol ( 0,5 m g.L- 1) ( A) e do óleo bruto de babaçu (B) ... 60
Figura 5.3. Curva analít ica para - t ocoferol – CLAE ... 61
Figura 5.4. Crom at ogram as dos óleos brutos, neutralizado e clarificado – industriais ... 63
Figura 5.5. Crom at ogram as dos óleos brutos, neutralizado e clarificado – bancada ... 64
Figura 5.6. Espect ros na região do infraverm elho do padrão de -tocoferol puro (a) e do óleo de babaçu (b) ... 67
Figura 5.7. Espect ros das am ostras na região do infraverm elho das etapas de refino do óleo de babaçu via industrial ... 68
Figura 5.8. Espect ros das am ostras na região do infraverm elho das etapas de refino do óleo de babaçu via bancada ... 69
Tabela 3.1. Quantidades produzidas e participação relativa e acum ulada de babaçu (am êndoa) , dos 20 m aiores m unicípios produtores e respect ivas Unidades de Federação do Estado
do Maranhão, em ordem crescente ... 12
Tabela 3.2. Com posição de ácidos graxos do óleo de babaçu ... 14
Tabela 3.3. Característ icas físico- quím icas do óleo de babaçu ... 14
Tabela 5.1. Característ icas físico- quím icas do óleo bruto de babaçu ... 55
Tabela 5.2. Com paração das condições operacionais para determ inação de - t ocoferol em óleo vegetal ... 59
Tabela 5.3. Dados da curva analít ica para - tocoferol – CLAE ... 61
Tabela 5.4. Análise de variância para os dados da curva analítica – CLAE 62 Tabela 5.5. Concentrações de - tocoferol a partir das etapas de refino do óleo de babaçu ... 65
Tabela 5.6. Valores das freqüências vibracionais na região do IV do padrão de - tocoferol e da am ostra de óleo de babaçu bruto 67 Tabela 5.7. Análise de variância para os dados da curva analítica – FTIR 71 Tabela 5.8. Concentrações de - tocoferol a partir das etapas de refino do óleo de babaçu – CLAE e FTIR ... 72
Tabela 5.9. Valores de concentração obtidos pela repetitividade para o - t ocoferol ... 73
ANOVA – Análise de variância.
ANVI SA – Agência Nacional de Vigilância Sanit ária. BHA – Hidroxi- butil- anisol
BHT- t- butil- hidroxihidroquinona CG – Crom at ografia gasosa
CLAE – Crom at ografia líquida de alt a eficiência CV% - Coeficient e de variação
DSC – Calorim et ria explorat ória diferencial
F1,n- 2 – Valor t abelado da dist ribuição do t est e F a 95 % de incert eza com 1 e n- 2 graus de liberdade.
Fcalculado – Razão ent re a m édia quadrática devido ao m odelo de regressão e a m édia quadrática residual MQreg / MQr.
I BGE – I nstit ut o Brasileiro de Geografia e Est atística
I NMETRO - I nst itut o Nacional de Met rologia, Norm alização e Qualidade I ndust rial
LDM – Lim it e de det ecção do m ét odo LQM – Lim it e de quantificação do m ét odo
MDI C – Minist ério do Desenvolvim ent o, I ndúst ria e Com ércio Ext erior MQr – Média quadrática residual.
MQreg – Média quadrática devido ao m odelo de regressão ODPVA – Oct adecil polivinil álcool
PAD – Phot odiode- array ( Det ect or) PFPS - Pent afluorofenil
PG – 3,4,5 ácido t riidroxibenzóico PVDF –Difluoret o de polivinilideno
r – Coeficient e de correlação da curva analítica. R% - Í ndice de recuperação.
R2 – Coeficiente de det erm inação é a razão ent re a som a quadrática explicada pela regressão e a som a quadrát ica t ot al SQreg / SQt.
sxo – Desvio padrão do m ét odo
sy – Desvio padrão residual ou erro padrão TBHT – t - butil- hidroquinona
TG - Term ogravim et ria
UV- Visível – Região de absorção na região do ult raviolet a – visível. Vxo – Coeficient e de variação do m ét odo
- T – Alfa- t ocoferol
Equação 1 ...35
Equação 2 ...35
Equação 3 ...37
Equação 4 ...37
Equação 5 ...38
Equação 6 ...43
Equação 7. ...44
Equação 8. ...45
Equação 9. ...46
Equação 10 ...46
INTRODUÇÃO
C
1. INTRODUÇÃO
O babaçu (Orbignya phalerata, Mart) é um a palm eira nativa das regiões Nort e, Nordest e e Cent ro Oest e do Brasil, sendo dist ribuídos nos Est ados do Maranhão, Piauí, Tocantins, Goiás, Mat o Grosso, Am azonas, Pará, Rondônia, Ceará, Bahia e Minas Gerais, ao longo de aproxim adam ente 279 m unicípios. ( I BGE, 2009) .
Mesm o present e em diversos Est ados, o Maranhão ainda continua sendo o m aior produt or de babaçu, envolvendo 149 m unicípios e represent ando 94,7% da produção nacional, concent rando 10 m ilhões de hect ares. Junt o com o Piauí, envolve 66 m unicípios e represent a 4,4% da produção nacional, apresent a zonas de alt a densidade, por apresent arem populações superiores a 200 palm eiras por hect are ( I BGE, 2009) .
Apesar da possibilidade de se utilizar est a palm eira de diversas form as e em diversos processos indust riais, é na am êndoa, em função da produção do óleo, onde se encont ra a sua m aior im port ância econôm ica. Segundo dados do I BGE ( 2009) , a produção nacional dest as foi de aproxim adam ente 114.874 t oneladas.
Os óleos veget ais brut os são const ituídos por m ais de 95% de t riglicerídeos e por com post os m inorit ários t ais com o: fosfolipídios ( fosfatídeos) , carboidrat os, ácidos graxos livres e produt os de degradação dos ácidos graxos. Logo, sua ut ilização diret a com o alim ent ação hum ana não é adequado, devendo est e ser refinado ( degom agem ; neut ralização; braqueam ent o ou clarificação e desodorização) , para que o m esm o est ej a em condições adequadas de consum o.
radicais livres lipídicos, int errom pendo a propagação da cadeia ( SI LVA, 2008) .
I nfelizm ent e, devido as concent rações de t ocoferóis em óleos veget ais serem baixas há necessidade de um a pré- concent ração das am ost ras a serem analisadas.
A lit erat ura recom enda dois m ét odos de pré- concent ração de am ost ras oleosas: prim eiro t em - se a inj eção diret a do óleo, que consist e da diluição dest e em um solvent e apropriado, ant es das análises crom at ográficas; j á o segundo m ét odo, t rat a- se da análise da fração insaponificável, que consist e em saponificar a am ost ra para elim inar os lipídeos, liberando assim , os t ocoferóis nat urais das células e hidrolisar ést eres de t ocoferóis a t ocoferóis livres e a seguir inj eção no crom at ográfo ( LI MA e GONÇALVES, 1997) .
Apesar da saponificação apresent ar- se com o um a t écnica m uit o difundida quant o ao isolam ent o das vit am inas lipossolúveis encont radas na fração insaponificável dos alim ent os, para a det erm inação de t ocoferóis ( vit am ina E) , norm alm ent e abre- se m ão dest a, por ser m uit o dem orada e ocasionar perdas significativas dest e antioxidante, devido ao alt o grau de m anipulação da am ost ra ( PAI XÃO e STAMFORD, 2004) .
OBJETIVOS
C
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Est e t rabalho t em com o obj et ivo geral, propor um m ét odo para avaliar a est abilidade quím ica do - t ocoferol durant e o processo de refino do óleo de babaçu.
2.2. Objetivos Específicos
Analisar o óleo brut o de babaçu, segundo parâm et ros de índice de acidez, índice de peróxido, índice de saponificação, índice de iodo, densidade e um idade;
Refinar o óleo brut o de babaçu por processos de neut ralização e branqueam ent o ( clarificação) , em nível de bancada;
Est abelecer um m ét odo para quantificação de - t ocoferol por crom at ografia líquida de alt a eficiência (CLAE) ;
Est abelecer um m ét odo para quantificação de - t ocoferol por Espect roscopia de I nfraverm elho com Transform ada de Fourier ( FTI R);
Avaliar est atisticam ent e o m elhor m ét odo para a análise de -t ocoferol, quan-t o à precisão ( repe-ti-tividade) , exa-tidão, lim i-t e de det ecção e quantificação e linearidade;
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
C
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. Contexto atual brasileiro de óleo vegetal
O Brasil apresent a um a grande área t errit orial, estim ada em 90 m ilhões de hect ares, com clim as adequados para o favorecim ent o de cultivo de várias sem entes oleaginosas ( Figura 3.1) , caract erizando-se com o um país com grande pot encial para a exploração de biom assa para fins alim entícios e energéticos, dent re est as se dest aca o babaçu.
Figura 3.1.Produção de Oleaginosas no Brasil
Fonte: SANTOS, 2008
3.2. Babaçu
teixeirana Bondar ( perinão) e Orbignya microcarpa Martius. O segundo gênero abrange espécies encont radas principalm ente nos est ados de Goiás, Minas Gerais e Bahia, dent re as quais se dest acam : Attalea oleifera
Barb. Rodr. ( cat olé- de- pernam buco) e Attalea pindobassu Bondar
( pindobaçu) . A Orbignya phalerata é a espécie de m aior dist ribuição, de m aior variação m orfológica e de m aior im port ância econôm ica. Est a espécie ocupa regiões ext ensivas no Brasil, na Bolívia e no Surinam e. ( Figura 3.2) . Com crescim ent o espont âneo nas m at as da região am azônica. Cada Palm eira pode produzir anualm ent e 2.000 frut os ( CHAVES et al., 2006) .
Figura 3.2. Palm eira de babaçu
Fonte:< htt p: / / www.infoescola.com / plant as/ babacu>
Teixeira ( 2008) , relat a que os frut os apresent am um form at o elipsoidal, m ais ou m enos cilíndrico, pesando ent re 90 a 280 g, apresent ando de 3 a 5 am êndoas em cada frut o, onde apresent a um a cam ada externa denom inada epicarpo, que envolve um a cam ada secundária rica em am ido, denom inada m esocarpo. O endocarpo é a cam ada m ais rígida que contém as am êndoas de onde é ext raído o óleo ( Figura 3.3) . Est as apresent am bast ant e aplicabilidade, daí a idéia do aproveit am ent o e de um rendim ent o de quase 100% de sua m assa.
Figura 3.3. Com posição física do frut o de babaçu
Figura 3.4. Produção nacional das am êndoas de babaçu
Fonte: ( I BGE, 2009)
Figura 3.5. Export ações de óleo brut o de babaçu
Fonte: ( CONAB, 2011)
Observa- se, por m eio da Figura 3.5., que os valores auferidos com as export ações brasileiras de óleo de babaçu brut o t êm se elevado significativam ent e, passando de U$$ 104.976 em 2003 para U$$ 232.189 em 2009. Atualm ent e, am pliou- se as export ações realizadas com apelo social e am bient al ( com ércio j ust o, solidário, et c.) , pois há em presas im port adoras localizadas na Europa e nos Est ados Unidos, que se propõem a pagar um preço m elhor para se diferenciar no m ercado. ( CONAB, 2011) .
Tabela 3.1. Quantidade produzida e part icipação relativa e acum ulada de babaçu ( am êndoa) , dos 20 m aiores m unicípios produt ores e respect iv as Unidades de Federação do Est ado do Maranhão, em ordem decrescent e – 2009
Municípios produtores e
respectivas Unidades
Federativas do Estado
do Maranhão Babaçu (amêndoa) Quantidade produzida (t) Participações (%)
Relativa Acumulada
Brasil 109.299 100 -
Vargem Grande – MA 5.863 5,4 5,4
Pedreiras – MA 5.700 5,2 10,6
Poção de Pedras – MA 4.723 4,3 14,9
Bacabal – MA 4.023 3,7 18,6
São Luis Gonzaga do Maranhão – MA
3.635 3,3 21,9
Bom Lugar – MA 3.550 3,2 25,2
Codó – MA 3.102 2,8 28
Chapadinha – MA 2.880 2,6 30,6
Lago da Pedra – MA 2.868 2,6 33,6
Caj ari– MA 2.621 2,4 35,7
Coroatá – MA 2.428 2,2 37,9
Vit orino Freire – MA 2.325 2,1 40,0
Lago dos Rodrigues - MA 2.244 2,1 42,1
Penalva – MA 2.042 1,9 43,9
Paulo Ram os – MA 2.020 1,8 45,8
Joselândia– MA 2.011 1,8 47,6
Lago Verde – MA 1.832 1,7 49,3
Bernardo do Mearim - MA 1.651 1,5 50,8
Alt o Alegre do Maranhão - MA
1.503 1,4 53,6
Percebe- se at ravés da Tabela 3.1, que a grande quantidade dest a palm eira encont rar- se no Est ado do Maranhão, o que m ot ivou à inst alação de várias em presas processadoras de óleo com estível e láurico obt ido a partir da am êndoa do babaçu (LAGUNA et. al., 2010) .
O m ercado para o óleo de babaçu é propriam ent e o nacional, o qual se dá principalm ent e por m eio de corret oras. Apenas 0,19% da produção nacional de óleo vêm sendo export ada. Em 2008, segundo o MDI C ( ALI CEWEB, 2009) , o Brasil só export ou 143 t oneladas de óleo de babaçu.
Quim icam ent e, o óleo de babaçu possui um a am pla diversidade de ácidos graxos, com alt as concent rações dos ácidos, láurico ( 40- 55% ) e m irístico (11- 27% ) , que favorecem a sua utilização ( CODEX ALI MENTARI US, 2003; PORTO, 2004) . Cont êm ácidos insat urados em pequenas quantidades, o que faz com que os óleos pert encent es a est a fam ília t enham um t em po de arm azenam ent o m uit o grande ( OLI VEI RA, 2007) .
Tabela 3.2. Com posição de ácidos graxos do óleo de babaçu
Ácidos Graxos Valores de referência (%)
Ácido Caprílico ( C 8: 0) 2,6 – 7,3 Ácido Cáprico ( C 10: 0) 1,2 – 7,6 Ácido Láurico ( C 12: 0) 40,0 – 55,0 Ácido Mirístico ( C 14: 0) 11,0 – 27,0 Ácido Palm ítico ( C 16: 0) 5,2 – 11,0 Ácido Est eárico ( C 18: 0) 1,8 – 7,4
Ácido Oléico ( C 18: 1) 2,0 – 9,0 Ácido Linoléico ( C 18: 2) 1,4 – 6,6
Fonte: ANVI SA, 2006.
De acordo com a ANVI SA ( 2006) , o óleo de babaçu brut o e refinado apresent a as seguint es caract erísticas, conform e m ost ra a Tabela 3.3.
Tabela 3.3. Caract erísticas físico- quím icas do óleo de babaçu
PROPRIEDADES LIMITES
Massa Específica, 40 º C/ 25 º C 0,911 - 0,914 Í ndice de refração ( n D 40) 1,448 - 1,451 Í ndice de saponificação 245 – 256 Í ndice de iodo ( Wij s) 10 – 18 Mat éria insaponificável, g/ 100g Máxim o 1,2 %
Acidez ( g de ácido oléico/ 100g)
Óleo de babaçu Máxim o 0,3 % Óleo de babaçu
brut o Máxim o 5,0 % Í ndice de peróxido, m eq/ kg Máxim o 10
Fonte: ANVI SA, 2006.
um det erm inado lipídeo at ravés da análise do conj unt o dos vários índices que lhe são específicos. Além disso, esse conhecim ent o t am bém possibilit a um a estim ativa do tipo de ácidos graxos present es (índice de saponificação) e o seu grau de insat uração ( índice de iodo) ( BENÍ CI O et al., 2010) .
3.3. Processos de obtenção de óleo vegetal
A ext ração do óleo brut o ocorre at ravés de m ét odos t radicionais a part ir das sem ent es das oleaginosas por m eio de prensagem ou de utilização de solvent es e at é m esm o com a com binação das duas t écnicas ( MORETTO e FETT, 1998) . Quant o ao uso de solvent es, o óleo é ext raído das sem ent es com solventes polares com pont o de ebulição at é 70 ° C, pois t em perat uras superiores podem ocasionar a form ação de ácidos graxos livres devido à quebra de ligação ent re ácidos graxos e glicerol. O processo de ext ração por prensa m ecânica realiza o esm agam ent o das sem entes rem ovendo parcialm ent e o óleo. Est e procedim ent o pode ser precedido de um aquecim ent o cont rolado dos grãos, visando assim aum ent ar o rendim ent o de ext ração ( MORAI S et al., 2001) .
Figura 3.6. Fluxogram a sim plificado do processo de refino de óleos veget ais.
O óleo ent ra na refinaria com o óleo brut o agregado a com ponent es que devem ser rem ovidos at ravés de um a pré-lim peza, a qual tem com o principal obj etivo a retirada dos sólidos em suspensão. Os óleos veget ais brut os apresent am geralm ent e grandes quantidades de fosfatídeos, ceras, carot enóides e im purezas, daí a necessidade da et apa da degom agem que é realizada pela adição de ácido fosfórico para hidrat ar os fosfatídeos não hidrat áveis (FREI RE, 2009) .
t ornam - se solúveis em água e a part e insolúvel é com binada com o m at erial coagulado ( REI PERT, 2005) . Em seguida o óleo ent ra no branqueador, onde são adicionadas ao óleo neut ralizado subst âncias adsorvent es com o argila ácida ativada, t erra diat om ácea, t erras neut ras e carvão ativo ( MORAI S et al., 2001) .
O branqueam ent o t em com o finalidade a rem oção de pigm ent os, produt os de oxidação, m et ais e out ros. Após o t em po de adsorção é realizada um a filt ração para a ret enção dessa subst ância adsorvent e e o óleo é retirado pela aplicação de água quent e ou vapor ant es da elim inação com o um rej eit o sólido. Logo a seguir, o vapor da desodorização decom põe os peróxidos rest ant es, rem ovendo pigm ent os com o os carot enóides, constit uint es responsáveis pelos odores e sabores e reduz os ácidos graxos livres ( REI PERT, 2005) .
Segundo Moret t o e Fet t ( 1998) , durant e o processo de refinação, há um a inevit ável perda de at é 6% do t eor de t ocoferois t ot ais, nas et apas de neut ralização e de clarificação.
No ent ant o, para Masuchi et al., ( 2008) , a et apa de desodorização é considerada com o et apa de m aior perda de t eor de t ocoferol chegando a níveis de at é 30% em relação a concent ração inicial encont rada no óleo brut o. Est a perda depende das condições de t em perat ura e do vácuo em pregados.
3.4. Degradação dos óleos
( CARVALHO, 2007) . A atividade antioxidant e pode ser result ado de um a ligação específica com radicais livres reativos, com com post os cont endo oxigênio ou um a ação com plexant e de m et ais. Essas subst âncias encont ram - se presentes naturalm ent e em óleos de origem veget al e incluem os t ocoferóis, prot eínas, enzim as e um a série de pequenas m oléculas.
Existem fat ores que afet am esses processos, sendo os m ais im port ant es a presença de insat uração nos ácidos graxos, luz, t em perat ura, enzim as, m icrorganism os e condições de arm azenam ent o ( LEUNG et al., 2006 e KAPI LAN et al., 2009) .
3.4.1. Rancificação hidrolítica
Est e tipo de oxidação, t am bém conhecido por lipólise ou rancidez lipolítica ( MORETO e ALVES, 1986) , pode ocorrer por m eio enzim ático ou não- enzim ático. O enzim ático ocorre pela ação da lipase, que pode est ar present e nas sem ent es das oleaginosas, ou pela atividade m icrobiana ( processo de ferm ent ação) , que hidrolisam os óleos e gorduras produzindo ácidos graxos livres ( MORETTO e FETT, 1998) .
3.4.2. Rancificação Oxidativa
Ant es que ocorra a reação do ácido graxo insat urado com o oxigênio, um dos reagent es precisa ser at ivado. Assim , ou a olefina é convertida em um radical alílico estabilizado por ressonância, ou o oxigênio é convertido a um a espécie m ais reativa, com o o oxigênio singlet e. Est as duas reações ocorrem por m eio de diferentes m ecanism os, em bora result em em produt os sem elhant es ( GUSTONE, 1984) .
elet rônica ext erna em um prim eiro est ado de excit ação, ou apresent ando um elét ron em cada orbit al com spins opost os, num segundo est ado energético. A vida m édia dest e segundo est ado ( 10- 11 s) é m uit o m ais curt a que a do prim eiro que é 10- 6 s, sendo assim m enos est ável ( LI MA e ABDALLA, 2001 e KAPI LA, 2009) .
Pelo expost o, a reação do oxigênio t riplet e com um ácido graxo insat urado é lim it ada. Essa rest rição deixa de existir quando o oxigênio m olecular est á na form a de oxigênio singlet e, ou parcialm ent e reduzido ou ativado, com o por exem plo, H2O2, O2•, HO•, complexos ferro- oxigênio ( LI MA e ABDALLA, 2001) . O oxigênio singlete pode ser form ado por processos enzim áticos, quím icos e fot oquím icos.
3.4.3. Aut oxidação
Dent re os processos oxidativos, o de aut o- oxidação é o m ais com um . Est e conform e m ost rado na Figura 3.6, envolve um a reação em cadeia com as et apas de iniciação, propagação e t erm inação ( RAMALHO e JORGE, 2006) .
I niciação
O ácido graxo RH é ent ão at acado e form a um radical livre R•
m uit o ativo:
Propagação
Na propagação, os radicais livres R•,reagem com m oléculas de oxigênio, t ransform am - se em radicais peroxil ROO•.Os radicais peroxil são capazes de at acar out ro ácido graxo RH, result ando em um peróxido ROOH e um novo radical livre que pode, por sua vez, at uar:
Term inação
A quantidade de com ponent es alt am ent e reativos aum ent a de m aneira const ant e at é o m om ent o em que com eçam a reagir ent re eles. Ent ão, ocorre a dim inuição da concent ração dos radicais peroxil (ROO·), com form ação de peróxidos, originando produt os est áveis de degradação:
linolêico (ligações duplas em C-9 e em C- 12) e o linolênico (ligações duplas em C-9, C- 12 e em C- 15) , são m ais susceptíveis à oxidação. As posições CH2- alílicas e bis- alílicas em relação as duplas, present es nas cadeias dos ácidos graxos são m ais sujeit as a oxidação. Est e fat o deve- se a razões m ecanísticas para a est abilização do radical livre form ado durant e o processo.
Para evit ar a aut oxidação de óleos e gorduras há a necessidade de dim inuir a incidência de t odos os fat ores que a favorecem , m ant endo ao m ínim o os níveis de energia (t em perat ura e luz) , responsáveis pelo desencadeam ent o do processo de form ação de radicais livres, evit ando a presença de t raços de m et ais no óleo, bem com o o cont at o com oxigênio. É possível t am bém bloquear a form ação de radicais livres por m eio de subst âncias antioxidant es, as quais, em pequenas quantidades, at uam int erferindo nos processos de oxidação de lipídeos ( RODRI GUES FI LHO, 2010) .
3.4.4. Fot oxidação
A fot oxidação é um processo de degradação m uit o m ais rápido que a aut oxidação, por envolver reações com o oxigênio em seu est ado m ais excit ado ou singlet e.
Tant o na fot oxidação quant o na aut oxidação os produt os finais derivam da decom posição dos hidroperóxidos alílicos gerando aldeídos, ácidos e out ros com post os oxigenados com o produt os dos processos ( CANDEI A, 2008) .
3.5. Antioxidantes
dos produt os oriundos de gorduras, óleos e alim ent os gordurosos. Dent ro dest e cont ext o, os ant ioxidant es ocupam lugar de dest aque, cuj a efetividade com o inibidor das reações aut oxidativas durant e arm azenam ent o, processam ent o e utilização de gorduras é indiscutível e conduz sua aut orização com o adit ivos usados em quantidades lim it adas ( LUZI A, 2008; RI OS e PENTEADO, 2003) . Mesm o est es apresent ando pouca est abilidade frent e à exposição a alt as t em perat uras, nas indúst rias de óleos, é im port ant e a utilização de antioxidant es que sej am est áveis em tem perat uras elevadas, com a finalidade de perm itir a est abilidade e um prolongam ent o da vida útil dos óleos ( LUZI A, 2008) .
Os ant ioxidant es são classificados em dois grupos: os antioxidantes nat urais, represent ados pelos t ocoferóis, ácidos fenólicos e ext rat os de plant as com o o alecrim e sálvia e os ant ioxidant es sint éticos, represent ados por Hidroxi- butil- anisol ( BHA) , t - Butil- hidroxihidroquinona ( BHT) e t- Butil- hidroquinona ( TBHQ) ( NI MET, 2009) .
3.5.1. Antioxidant es Nat urais
Segundo pesquisas, o óleo de girassol parece ser o m ais rico em - t ocoferol, seguido pelo algodão, palm a, canola, am endoim , oliva, soj a e coco. O δ- t ocoferol é o com post o predom inant e em óleos de soj a e de m ilho, enquant o que o óleo de palm a é o que apresent a m aior teor de t ocot rienois. ( JORGE e RAMALHO, 2006).
Os t ocoferois ( Figura 3.7) são com post os cont endo grupam ent os m etil- substit uint es e cadeia lat eral sat urada, enquant o que os t ocot rienois apresent am est rut ura idêntica, exceto pela presença de t rês duplas ligações na cadeia carbônica (GUI NAZI , 2004) .
Figura 3.7. Est rut uras quím icas naturais da vit am ina E
residindo apenas ao fat o das substit uições de grupos m et il serem feit as em locais diferent es do anel arom ático pode det erm inar quais com post os serão (, , e δ t ocoferois e / ou t ocot rienois) ( AZZI e STOCKER, 2000; CERQUEI RA et al., 2007) .
3.5.2. Aplicação do - t ocoferol
Pode- se ressalt ar a utilização do - t ocoferol na área de alim ent os com a função de conservant e ( CARVALHO, 2007); com o fárm acos devido a sua função de capt adores e liberadores de energia ( PAI XÃO e STAMFORD, 2004) ; cosm éticos at ravés de t rat am ent o cont ra o envelhecim ent o cut âneo ( ALMEI DA, 2008) ; na inibição de doenças do coração – o - t ocoferol exerce função im port ant e com o inibidor da oxidação dos radicais livres, reagindo com o oxigênio e im possibilit ando a t ransform ação dos ácidos graxos insat urados em aldeídos ( FREI TAS, 2007) .
Pesquisas revelam que diet as a base de alim ent os ricos em vit am ina E, podem aj udar a com bat er o m al de Alzheim er ( TAI PI NA, 2009) , na prevenção de danos fot ooxidativos ( ROPKE et al., 2003) , utilização em veículos cosm éticos associados com filt ros solares ( SASSON, 2006) , condim ent os com função antioxidante em produt os cárneos ( MARI UTTI e BRAGAGNOLO, 2007) , atuando ainda na função cognitiva ( GUI MARÃES e VI ANNA, 2009) e avaliador de n íveis séricos de anim ais ( REI S et al., 2007) .
3.5.3. Mecanism o de ação do - t ocoferol nas reações de oxiredução
lipídico de m aneira acentuada devido a sua caract erística lipofílica. Além disso, a est rut ura da vit am ina E est á localizada ent re os com ponentes da m em brana celular e assim , é um a das responsáveis pela linha de defesa prim ária das células cont ra o at aque dos radicais livres. Possui ainda, a caract erística de ser o único antioxidant e que tem habilidade de regenerar- se continuam ent e pela ação da vit am ina C ( GUI NAZI , 2004) .
Durant e as reações de oxiredução, o núcleo crom ano do -t ocoferol (- T) se abre ent re o oxigênio 1 e o carbono 2 para form ar o -t ocoferilquinona (- TQ) . O - TQ pode ser reduzido a -t ocoferilhidroquinona (- THQ) que pode por sua vez regenerar o - T por desidrat ação, de acordo com a Figura 3.8.
Figura 3.8. Mecanism o de ação do - t ocoferol nas reações de oxiredução.
O principal m ecanism o de ação da vitam ina E result a de suas propriedades antioxidant es.
Na qual, o radical t ocoferoxil form ado (-T•) é muito instável e reage com um segundo radical peroxil.
3.5.4. Antioxidant es Sint éticos
Os ant ioxidant es sint éticos m ais utilizados na indúst ria alim entícia são BHA, BHT, PG e TBHQ.
Figura 3.9. Est rut uras fenólicas dos antioxidant es sint éticos
BHT e BHA apresent am propriedades sem elhant es, são antioxidant es m ais efetivos na supressão da oxidação em gorduras anim ais que em óleos veget ais. Com o a m aior part e dos ant ioxidantes fenólicos, sua eficiência é lim it ada em óleos insaturados de veget ais e sem entes. Apresent am pouca est abilidade frent e a elevadas t em perat uras, m as são particularm ente efetivos no cont role de ácidos graxos de cadeia curt a, com o aqueles contidos em óleo de coco e palm a ( GODI M, 2009) .
O PG é um ést er de 3,4,5 ácido t riidroxibenzóico, que apresent a um a concent ração ótim a de atividade com o antioxidant e, e quando usado em níveis elevados pode atuar com o pró- oxidant e.
frit ura, pois resist e ao calor e proporciona um a excelent e est abilidade para os produt os acabados ( RAMALHO et al., 2006) .
3.6. Métodos para a determinação de -tocoferol em óleos
Na t ent ativa de se encont rar m ét odos m ais eficient es na identificação e quantificação de t ocoferóis em m at rizes alim ent ares, inúm eras pesquisas vêm sendo realizadas nas áreas de crom at ografia líquida de alt a eficiência ( CLAE) e da Espect roscopia na região do infraverm elho com Transform ada de Fourier ( FTI R) ( SI LVA, 2003; SOUSA, 2005; GUI NAZI et al., 2009; SI LVA et al., 2009; MAN et al., 2005; )
Geralm ent e, as concent rações de t ocoferóis são baixas fazendo com que haj a a necessidade de pré-concent ração das am ost ras. Um a alt ernativa para a análise de t ocoferóis por crom at ografia líquida de alt a eficiência dar- se por via diret a, que consiste em um m ét odo onde a am ost ra não necessit a de um a pré- concent ração ( saponificação) , ist o é, som ent e com a diluição dest a em um solvent e iner t e. Um dos problem as que pode ocorrer nest a t écnica é a cont am inação do inj et or e/ ou da coluna crom at ográfica. Um a saída seria a lim peza profunda da coluna utilizada para a separação dos com ponent es est udados ( LI MA e GONÇALVES, 1997; CARVALHO, 2007; RAMALHO et al., 2006) .
cont rapart ida, essas vit am inas podem ser dest ruídas por exposição contínua a algum as condições de saponificação, ou ainda, pela presença de im purezas nos solvent es utilizados na ext ração. At ravés dest e procedim ent o, as form as est erificadas das vit am inas A e E são convertidas exaustivam ent e em form as alcoólicas livres.
3.7. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE
A CLAE é um im port ante m em bro de t oda um a fam ília de t écnicas de separação, um a vez que se consegue separar m isturas que cont êm um grande núm ero de com post os sim ilares. Dat am de 1968 os prim eiros t rabalhos publicados, os quais relat aram result ados experim ent ais com provando a possibilidade de se ut ilizar equipam ent os, que favorecessem análises de subst âncias com m aior rapidez, operando com um a fase m óvel líquida de alt a pressão e obt endo- se result ados satisfat órios ( COLLI NS et al., 2007) .
É usada em casos em que a am ost ra a ser analisada est á em solução, sendo os constit uint es a serem separados cham ados de solut os. A separação result a em um equilíbrio de dist ribuição do solut o ent re duas fases: um a fase fixa sólida ( fase est acionária) , em pacot ada no int erior de um a coluna, e um a fase m óvel, que at ravessa a fase fixa contida na coluna. Durant e a passagem da fase m óvel sobre a fase est acionária, os com ponent es da m istura são dist ribuídos ent re as duas fases, de t al form a que cada um dos com ponent es é seletivam ent e retido pela fase est acionária, result ando em m igrações diferenciais dest es com ponent es ( CI OLA, 1998) .
- t ocoferol/ fase, m uda de solvente para solvent e ( SALGADO et al., 2008; RAMALHO et al., 2006; FREI TAS, 2007; GUI NAZI , 2009; RI OS e PENTEADO, 2003; CARO, 2002; SI LVA, 2003; MARTI NS, 2006) .
Possui inúm eras vant agens em relação aos out ros m ét odos exist ent es: rapidez, precisão, reprodut ibilidade, sim plicidade, sensibilidade, m enor exposição a agentes ext ernos e separações eficientes ( COLLI NS et al., 2007)
A CLAE t em superado a crom at ografia gasosa ( CG) em virt ude da grande flexibilidade e aplicabilidade a diferentes m at rizes de am ost ras com o produt os farm acêuticos, alim entos, fluídos e tecidos biológicos e t ablet es m ulti- vit am ínicos. I st o acont ece porque, na CG, requer a derivação da am ost ra a com post os volát eis com o os ést eres t rim etilsilil acet at o, propionat o e t rifluoroacet at o, fazendo com que est as passem por et apas pré- crom at ográficas m uit o t rabalhosas ( SI LVA, 2003) . Por out ro lado, a CLAE pode ser execut ada a t em perat ura am bient e e sem derivação das am ost ras ( GI ACOMI NI , 2006) .
Para colunas de fase reversa a fase m óvel m ais em pregada é basicam ent e m et anol puro ou m ist uras de m et anol- água cont endo at é 10% de água ( SÁNCHEZ- PÉREZ et al., 2000) . Alguns analist as t rabalham com m ist uras de água- acet onit rila-m et anol, acet at o de etila e clorofórm io, n- hexano e isopropanol, em várias proporções ( RI OS e PENEDO, 2003; SOUSA, 2005; LI ANG et al., 2011; BOSCHI N e ARNOLD,2011) .
As colunas de fase norm al são capazes de separar os isôm eros - e - t ocoferol e t ocot rienóis e apresent am com o vant agens a habilidade de t rabalharem com solvent es orgânicos perm itindo um a alt a solubilidade de lipídeos, suport arem alt a concentração de lipídeos, os quais são facilm ent e elim inados por solvent es não polares, e habilidade de prover am pla faixa de seletividade com o uso de diferent es m odificadores polares na fase m óvel ( SI LVA, 2003) .
Em coluna de fase norm al usualm ent e são utilizados na separação de com post os t ocol eluent es com post os por um alcano com o hexano, hept ano, iso- oct ano, com um a pequena quantidade de m odificador polar que pode ser um álcool com o et anol, m et anol, but anol, ou um éter com o t et rahidrofurano, m etil, t- butil, isopropil, ou um clorohidrocarbono com o diclorom et ano, clorofórm io ( GUI NAZI , 2009; GI MENO et al., 2000; GOTOR et al., 2007; CARO, 2002; SI LVA, 2003; PYKA e SLI WI OK, 2001; CHUN et al., 2006; CARVALHO, 2007) .
Norm alm ent e, a quantificação é feit a por padronização ext erna com uso de curvas de padronização, independent e do tipo de coluna ou det ect or usado, em vários tipos de m at rizes, desde alim ent os processados ou não, óleos, sem ent es ou m esm o t ecidos e fluídos biológicos ( I WASE, 2000; GI MENO et al., 2000; TURNER e MATHI ASSON, 2000; CARLUCCI et
al., 2001; BRUNI et al., 2002; SCHI EBER et al., 2002; ESCRI VÁ et al.,
2002; SI LVA, 2003) . Segundo Rupérez et al., ( 2001) a quantificação t am bém pode ser feit a por padronização interna utilizando com o padrão int erno 5,7 dim etilt ocol e o t ocol ( crom anol desm etilado obtido dos t ocoferóis) ou o - t ocoferol acet at o em crom at ografia em coluna de fase reversa e o o-hidroxibifenil em coluna de fase norm al.
3.8. Espectroscopia por infravermelho com transformada de
Fourier - FTIR
A espect rom et ria é o processo analítico- inst rum ent al baseado nas propriedades de absorção, em issão e reflexão de energia elet rom agnética em região específica do espect ro ( SI LVERSTEI N, 2007) .
A espect roscopia de infraverm elho ( I V) com preende a região do espect ro elet rom agnético de com prim ent o de onda variando de 0,75 a 1000 µm . A região do infraverm elho ent re 2,5 e 14,9 µm ( 690 cm- 1 a 4000 cm- 1) é a região que concent ra o int eresse da m aioria das pesqu isas quím icas, em bora as regiões do infraverm elho próxim o ( 0,75 a 2,5 µm ) e do infraverm elho dist ante (14,9 a 50 µm ) venham ganhando dest aque ( MI LMAN, 2006) .
O uso de espect roscopia por infraverm elho e t ransform ada de Fourier (FTI R) para a quantificação de - t ocoferol em m at rizes alim ent ares utilizando diversos solvent es ( MEN et al., 2005; SI LVA, 2009; SOARES et al., 2006) .
A part ir da década de 80 que a t écnica de infraverm elho vem evoluindo, dest acando- se a substit uição gradual de espect rôm et ros dispersivos, por espect rôm et ros com t ransform ada de Fourier ( FTI R) e o desenvolvim ent o de aplicações nas análises analíticas result ando em espect ro com um a m elhor resolução na região do infraverm elho próxim o e dist ant e. Com isso, int ensificaram - se os est udos em t orno de t écnicas m ais acessíveis para est udo com subst âncias viscosas, onde se inseri a vit am ina E ( t ocoferóis e t ocot rienóis) ( SOARES et al., 2006) .
A criação de vários acessórios viabilizou a aplicação do I V a am ost ras sólidas, líquidas e gasosas. No ent ant o, o uso adequado dest e equipam ent o, requer além da prensa hidráulica, a confecção de pastilhas de KBr ( brom et o de pot ássio) que pode ser realizada com utilização de m olde evacuável, alm ofariz e pistilo (idealm ent e de ágat a) além de out ros acessórios út eis em rotinas de cont role de qualidade, t ais com o, as células desm ont áveis para líquidos e m at eriais viscosos, células seladas para líquidos, células para gases, cart ões de am ost ras, kit para produção de film es de polím eros, et c ( SKOOG, 2002; SOARES et al., 2006; SI LVERSTEI N, 2007) .
No ent ant o, exist em algum as dificuldades quando se t rabalha na análise FTI R com subst âncias viscosas, t ant o na confecção de pastilhas de KBr, quant o na utilização das pastilhas pré- pront as ( past ilhas com erciais, que j á est ão pront as, apenas a espera da am ost ra) , a ser descrit as a seguir:
m aceração do KBr com o obj et ivo de m ant er o m ais hom ogêneo possível; ou adicioná-la na pastilha pront a antes da análise, ent ret ant o, exist e a possibilidade de que a am ost ra não se espalhe uniform em ent e por t oda a dim ensão da pastilha, fazendo assim , com que análise sej a efet uada de m aneira errada, evidenciando um a concent ração m aior ou m enor dependendo da localização da got a da am ost ra ( SI LVERSTEI N, 2007) .
Soares et.al., ( 2006) , realizou um estudo com base na ut ilização de film e PVC com ercial com o suporte para subst âncias viscosas. As análises foram feit as com parando- se os espect ros de am ost ras de lanolina e vit am ina E em film e de PVC e com pastilhas de KBr, bem com o dados da lit erat ura. Os result ados com provaram que o uso de film e de PVC m ost rou- se m ais efetivo do que as pastilhas de KBr, devido a obt enção de um espalham ent o em cam adas delgadas das am ost ras facilit ado.
Silva et al., (2009) , analisaram em 13 am ost ras de óleos com erciais ( soj a, m ilho e am endoim ) e m istura dest es em pastilhas de KBr, a presença do - t ocoferol, ut ilizando a t écnica da FTI R. Os result ados m ost raram que o espect ro obt ido para - t ocoferol exibiu absorção do esquelet o fenólico em 1.450 cm- 1.
Ahm ed et al., ( 2005) , t am bém fizeram um estudo de t ocoferois utilizando a t écnica de FTI R, onde puderam observar que a região ( m odos vibracionais) que m elhor absorvia est es analit os era a de 1500- 1000 cm- 1.
3.9. Tratamento estatístico – Validação de Metodologia
validação, logo exist e um processo int erativo, onde os result ados da validação podem indicar m udanças no procedim ent o analítico. Os parâm et ros de desem penho utilizados na avaliação de um m ét odo est ão vinculados às especificações requeridas para o m esm o. Ent re esses parâm et ros est ão: a precisão, a exatidão, os lim it es de det ecção e de quantificação do m ét odo e a linearidade ( LEI TE, 2008) .
3.9.1. Precisão
A precisão de um m ét odo é avaliado at ravés do desvio padrão absolut o ( s) que utiliza um núm ero significativo de m edições. Ent ret ant o, na validação de m ét odos, o núm ero de det erm inações é geralm ent e pequeno e o que se calcula é a estim ativa do desvio padrão absolut o ( S) , dada pela Equação (1) .
= ∑ � − �
− (1)
na qual, � é a m édia arit m ética de um pequeno núm ero de m edições ( m édia das determ inações) , X é o valor individual de um a m edição e N é o núm ero de m edições.
Out ra expressão da precisão é at ravés da est im ativa do desvio padrão relativo ( RSD) , t am bém conhecido com o coeficient e de variação ( CV) em t erm os percent uais com o m ost ra a Equação (2) .
=
� . (2)
Norm alm ent e, m ét odos que quantificam com post os em m acro quantidades requerem um RSD de 1 a 2% . Em m ét odos de análise de t raços ou im purezas, são aceit os RSD de at é 25% , dependendo da com plexidade da am ost ra. Um a m aneira sim ples de m elhorar a precisão é aum ent ar o núm ero de replicat as ( MENDHAM et al., 2000) .
3.9.2. Lim ite de Detecção e Lim it e de Quantificação
O lim it e de det ecção ( LD) corresponde à m enor quant idade de um analit o det ect ada. Na prát ica, é det erm inado com o a m enor concent ração do analit o a qual pode ser diferenciada do ruído do sist em a, com segurança ( SKOOG et al.,2002) .
Segundo Ribani et al., ( 2004) , o LD pode ser calculado de t rês m aneiras diferentes: m ét odo visual, m ét odo relação sinal - ruído, m ét odo baseado em parâm et ros da curva analítica, que serão descrit os a seguir:
Método visual – É utilizado para det erm inar o lim it e de det ecção utilizando a m at riz com adição de concent rações conhecidas da subst ância de interesse, de t al m odo que se possa distinguir ent re ruído e sinal analítico pela visualização da m enor concent ração visível ( det ect ável) . Est e procedim ent o t am bém pode ser fei t o at ravés do inst rum ent o utilizando parâm et ros de det ecção no m ét odo de int egração.
det ect ada. A relação sinal- ruído pode ser 3: 1 ou 2: 1, proporções geralm ent e aceit as com o estim ativas do lim it e de detecção.
Método baseado em parâmetros da curva analítica– O lim it e de det ecção ( LD) pode ser expresso, segundo a Equação ( 3) .
= , . (3)
na qual, s é a estim ativa do desvio padrão da respost a, que pode ser a estim ativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação e S é a inclinação (“slope”) ou coeficient e angular da curva analítica.
Já o lim it e de quantificação ( LQ) corresponde à m enor quantidade de um analit o que pode ser quantificada com exatidão e com confiabilidade det erm inada ( MI LLER e MI LER, 1993) . O lim it e de quantificação t am bém pode ser baseado em parâm et ros da curva analítica, at ravés da Equação ( 4) .
= . (4)
na qual, S é o desvio padrão das concent rações do padrão de - t ocoferol
e b o valor do coeficient e angular da curva analítica.
3.9.3. Exatidão
am ost ra, ou com o a diferença porcent ual ent re as m édias e o valor verdadeiro aceit o (LEI TE, 2008) .
A exatidão que é expressa pelos ensaios de recuperação é a relação ent re a concent ração m édia det erm inada experim ent alm ent e (CME) e a concent ração t eórica experim ent al correspondent e (CT) ,
conform e a Equação ( 5) .
� � ã = . ( 5)
3.9.4. Repetitividade
A repet itividade represent a a concordância ent re os result ados de m edições sucessivas de um m esm o m ét odo, efetuadas sob as m esm as condições de m edição, cham adas de condições de repetitiv idade. Sendo m esm o procedim ent o, m esm o analist a, m esm o inst rum ent o usado sob as m esm as condições, m esm o local, repetições em curt o int ervalo de t em po.
3.9.5. Reprodutibilidade
A reprodut ibilidade é o grau de concordância ent re os result ados das m edições de um a m esm a am ost ra, efet uada sob condições variadas ( m udança de operador, laborat ório, equipam ent os, et c.) .
3.9.6. Linearidade
PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL
C
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1. Equipamentos e acessórios
4.1.1. Equipam ent os
Balança analítica ( Shim adzu) ; Agit ador m agnético ( FANEM) ; Mant a aquecedora (FANEM) ;
Analisador t érm ico m odelo SDT 2960, m arca TA I nst rum ent s; Analisador t érm ico DSC 2920, m arca TA I nst rum ent s;
Crom at ografo Líquido – m odelo ( Shim adzu) , com det ect or ( UV- SPD 20A - Shim adzu) , com software LC Solution;
Espect rofot ôm et ro de I nfraverm elho com Transform ada de Fourier ( FTI R) - ( Shim adzu) , m odelo I RPrestige, com soft ware I RSolution I R.
4.1.2. Acessórios
Coluna de fase reversa RP- 18 CLC-ODS (5μm x 4,6 mm x 150 mm) com fase est acionária oct adecil e um a coluna de guarda CLC-GODS com fase est acionária de superfície oct adecil - Shim adzu;
Mem branas filt rant es de difluoret o de polivinildeno ( PVDF – Millipore) , com 13 m m de diâm et ro com 0,45 µm de t am anho de poro;
4.2. Reagentes
Todos os reagent es utilizados foram de grau analítico e / ou grau crom at ográfico, sendo est es:
( Vet ec) ; Ácido clorídrico ( Quim ex); Carvão ativado ( CHEMCO) com granulom et ria de 325 m esh; Padrão de -tocoferol (≥ 96% HPLC – Sigm a Aldrich) ; Met anol grau HPLC ( Carlo Erba Reagenti) ; Acet onit rila grau HPLC ( Carlo Erba Reagenti) ; N- propanol grau HPLC ( Carlo Erba Reagenti) ; Clorofórm io grau HPLC ( Merck); Hexano grau HPLC (Carlo Erba Reagenti); Hept ano grau HPLC ( Carlo Erba Reagenti) ;
4.3. Coleta e armazenagem de amostras
As am ost ras do óleo brut o de babaçu, assim com o, as et apas de refino ( neut ralização e clarificação) foram cedidas pela em presa Oleaginosas do Maranhão ( OLEAMA) , sendo arm azenadas sob refrigeração (≈4º C) por um período de at é 25 dias, no Laborat ório Núcleo de Biodiesel ( NuBI O- UFMA) , para post erior análise.
4.4. Cuidados ao manipular -tocoferol
Devido à alt a sensibilidade do - t ocoferol à luz e à oxidação, foram t om adas algum as m edidas operacionais de precaução: t odas as atividades operacionais foram realizadas sob condições reduzidas de exposição à luz, utilizando vidrarias prot egidas por papel alum ínio, evit ando exposição prolongada ao ar, sendo as soluções padrões preparadas e inj et adas no m esm o dia das análises por CLAE e / ou FTI R.
4.5. Caracterização físico-química do óleo bruto de babaçu
Para as análises físico- quím icas realizadas nest e t rabalho adot aram - se os m ét odos do I nstitut o Adolfo Lut z ( I AL, 1985) .
4.5.1. Í ndice de acidez ( 325/ I V- I AL)
Na det erm inação do índice de acidez, foram pesados 2,0 g da am ost ra e adicionou- se 25,0 m L de solução de ét er- álcool ( 2: 1) , neut ra. A seguir, adicionou- se 2,0 got as do indicador fenolft aleína. Titulou- se com solução de hidróxido de pot ássio 0,1 m ol.L- 1 at é coloração rósea. Fez- se um branco.
O cálculo do índice de acidez foi feit o pela Equação ( 6) :
� = . . .
. ( 6)
na qual, Ia é o índice de acidez; V é o volum e ( m L) de solução de hidróxido de pot ássio 0,1 m ol.L- 1 gast o na t itulação da am ost ra pela diferença do gast o na tit ulação com o branco; N é a concent ração da solução de KOH usada na tit ulação; f é o fat or da solução de hidróxido de pot ássio;PM é o peso m olecular do ácido graxo em m aior proporção ( no óleo de babaçu é o ácido láurico = 200);P é a m assa( gram as) da am ost ra.
4.5.2. Í ndice de iodo ( 329/ I V–I AL)
Na det erm inação do índice de iodo, pesou- se 0,25g da am ost ra, adicionou- se 10,0m L de tet racloret o de carbono. A seguir acrescent ou- se 20,0 m L da solução de Wij s ( que consist e de um a solução de cloret o de iodo (ICℓ) em ácido acético glacial, com concent ração de 0,1 m ol.L- 1, podendo ser obt ida at ravés da dissolução de aproxim adam ent e 13 ,0 g de iodo ( I
cloro seco (Cℓ2) , na solução ( ASTMD 5554- 95( 06)) , ou pela solubilização
diret a de aproxim adam ent e 8,0 g de t ricloret o de iodo e 9,0 g de iodo ( I 2) em um 1,0 lit ro de ácido acético glacial (DI N 53241- 1) ) ,sendo cuidadosam ent e agit ado por rot ação m ecânica. Deixou- se em repouso por 30 m inut os ao abrigo da luz e à t em perat ura de aproxim adam ent e25º C. Adicionou- se 10,0 m L da solução de iodet o de pot ássio a 15 % e 100,0 m L de água. Tit ulou- se est a solução com tiossulfat o de sódio 0,1 m ol.L- 1, adicionando- o lent am ent e (got a a got a) e, com agit ação const ant e, at é um a fraca coloração am arela. Adicionou - se ent ão 1,0 a 2,0 m L da solução de am ido (indicador) e continuou- se a titulação at é que cor azul desaparecesse. Preparou- se um a det erm inação em branco, para cada grupo de am ost ras.
O cálculo do índice de iodo foi feit o pela Equação ( 7):
��= − . . , (7)
na qual, Ii é o índice de iodo; A é o volum e ( m L) de solução de tiossulfat o de sódio 0,1 m ol.L- 1, gast o na tit ulação do branco; B é o volum e ( m L) de solução de tiossulfat o de 0,1 m ol.L- 1 gast o na t itulação da am ost ra; f é o fat or da solução de tiossulfat o de sódio 0,1 m ol.L- 1 e P é a m assa ( gram as) da am ost ra.
4.5.3. Í ndice de saponificação ( 328/ I V- I AL)
