PARTIÇÃO DE ANTOCIANINAS DA POLPA DE AÇAÍ (Euterpe
oleracea
M.)
EM
SISTEMA
AQUOSO
BIFÁSICO
ETANOL/SULFATO DE AMÔNIO
A. C. A. SIQUEIRA1, E. S. de BRITO2, I. J. SILVA Jr1, H. B. SANT’ANA1
1
Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Departamento de Engenharia Química
2
Embrapa Agroindústria Tropical E-mail para contato: hbs@ufc.br
RESUMO – Sistema aquoso bifásico (SAB) formado por etanol e sulfato de amônio foi utilizado na partição de antocianinas da polpa de açaí. O diagrama de fase foi obtido por cloud-point e densimetria para as linhas de amarração a 25 °C. A partição foi realizada com diferentes valores de comprimentos de linhas de amarração (CLA) e destes, o que apresentou maior coeficiente de partição, variou-se a razão de volume das fases (VR).
Após o equilíbrio, foram medidas as concentrações de antocianinas e açúcares totais de cada fase através das metodologias do pH diferencial e do fenol-sulfúrico, respectivamente. O CLA de 45,24% m/m apresentou o maior coeficiente de partição de antocianinas (KA = 2,30) e menor concentração de açúcares totais na fase topo (246,19
mg/L). Para VR < 2,08, foi obtido KA > 1. Através de LCMS, foi identificada a cianidina
3-O-rutinosídeo na polpa de açaí. Após a partição com CLA = 45,24% m/m e VR = 1,29,
o rendimento de antocianinas na fase topo foi de 74,76% m/m.
1. INTRODUÇÃO
Com o aumento dos consumidores que procuram alimentos obtidos a partir de fontes naturais, as indústrias de alimentos tem se dedicado a incluir ingredientes naturais em seus produtos, incluindo corante a base de antocianinas em alternativa a corantes sintéticos devido à cor atrativa das mesmas e suas características fisiológicas funcionais. As antocianinas constituem o maior e mais importante grupo dos pigmentos naturais hidrossolúveis (He e Giusti, 2010) e são responsáveis pela coloração vermelha, azul e roxa em frutas, legumes e plantas ornamentais (Brito et al., 2007; Pascual-Teresa et al., 2010) além de proporcionarem benefícios à saúde, pois possuem atividade antioxidante, atuam na prevenção de doenças cardiovasculares, possuem atividade anticarcinogênica e antimicrobiana e antitumoral, ajudam no controle da diabetes tipo 2 e melhoram a visão (He e Giusti, 2010).
Plantas tropicais podem ser fontes para alimentos de grandes benefícios à saúde do homem por apresentarem compostos antioxidantes, como ácido ascórbico e compostos fenólicos (Hanamura et al., 2005). O açaizeiro é uma palmeira bastante comum nas várzeas e margens dos rios na região amazônica e seu fruto, o açaí, ganhou destaque nos últimos anos por apresentar benefícios à saúde
devido a sua composição fitoquímica e sua capacidade antioxidante, uma vez que possuem compostos fenólicos como antocianinas, flavonas e ácidos fenólicos, além de ser rico em carboidratos, fibras, vitaminas E, proteínas, minerais e apresentar alto valor energético (Lichtenthäler et al., 2005; Pacheco-Palencia e Talcott, 2009).
Para a extração de antocianinas, geralmente utilizam-se solventes orgânicos como metanol ou acetona, o que exige um grande consumo de tempo e reagentes, além da toxicidade dos mesmos, limitando seu uso. Técnicas de extração como ultrassom, extração com fluido supercrítico e extração por membranas também tem sido utilizadas, mas são de alto custo, pois necessitam de equipamentos específicos e consomem muita energia. Sistemas aquosos bifásicos (SABs) tem sido uma alternativa a esses métodos. É considerada uma técnica atóxica por possuir alto teor de água. Sistemas formados por álcoois e sais tem substituído SABs formados por polímeros-polímeros e polímeros-sais devido à sua alta capacidade de extração, baixo custo e condições brandas de processo (Wu et al., 2011,Wu et al., 2014).
Esse trabalho tem como objetivo estudar o efeito do comprimento da linha de amarração e do volume das fases na partição de antocianinas da polpa de açaí utilizando um sistema aquoso bifásico formado por etanol e sulfato de amônio e identificar as antocianinas presentes após a partição por meio de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS).
2. METODOLOGIA
2.1. Diagrama de fases
A curva binodal do sistema etanol + sulfato de amônio foi obtida através do método cloud-point e as linhas de amarração foram obtidas por densimetria. O comprimento da linha de amarração (CLA) foi calculado pela Equação 1
2
1/2 2 2 2 1 1 F T F T C C C C CLA (1) em que C1 é a concentração de etanol, C2 a concentração de sulfato de amônio e os sobrescritos T e Frepresentam a fase topo e fase fundo, respectivamente.
2.2. Partição em sistema aquoso bifásico
Foram pesadas quantidades predeterminadas de solução de sulfato de amônio, etanol, água e polpa de açaí, fazendo com que o sistema tivesse uma base de 100% m/m. Esses componentes foram agitados em vórtex por 1 min e deixados em repouso em banho termostatizado a 25°C por 24 horas até que houvesse completa separação das fases. As fases topo e fundo foram coletadas, seus volumes anotados e analisadas as concentrações de antocianinas e açúcares.
2.3. Concentração de antocianinas e açúcares
A concentração de antocianinas foi determinada pelo método do pH diferencial, como descrito por Fuleki e Francis, (1968) e foi calculada e expressa como cianidina-3-O-glicosídeo. Os açúcares foram determinados pelo método do fenol-sulfúrico como descrito por Dubois et al. (1956) e os resultados foram expressos em glicose.
3. RESULTADOS
3.1. Diagrama de fases
A Figura 1 nos mostra o diagrama de fases do sistema etanol e sulfato de amônio que foi determinado para predizer o volume e a razão das composições das duas fases. O comportamento do diagrama de fases foi similar ao diagrama obtido por Wu et al. (2011). A curva binodal divide o diagrama de fases em duas áreas, na qual, acima da curva, temos a região bifásica e abaixo, a região monofásica. O diagrama de fases nos fornece ainda, as linhas de amarrações com suas respectivas composições globais. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 40 50 % m/m E TAN OL % m/m SULFATO DE AMÔNIO
Figura 1 – Diagrama de fases para o sistema etanol + sulfato de amônio.
3.2. Efeito do comprimento da linha de amarração e razão de volume das fases
Comprimento da linha de amarração: Para avaliar o efeito do comprimento da linha de amarração na partição das antocianinas da polpa de açaí, foram realizadas partições cujos valores de CLA foram de 34,65, 41,77, 54,24 e 50,24 % m/m. Segundo Asenjo e Andrews (2011), o aumento do CLA aumenta o teor de etanol e sulfato de amônio no sistema, o que reduz o conteúdo de água no mesmo tornando-o mais hidrofóbico, como mostrado na Tabela 1. De acordo com Wu et al. (2011) e Wu et al. (2014), as antocianinas particionam para a fase rica em etanol (fase topo) porque possuem afinidade com solventes polares, portanto, o aumento da concentração de etanol na fase topo faz com que ocorra um aumento da concentração de antocianinas na mesma, mas como observado na Figura 2 (a) isso não ocorreu. Houve um aumento da concentração de antocianinas na fase topo, seguido de
uma queda nesses valores. Segundo Wu et al. (2011) e Wu et al. (2014), o aumento da concentração de etanol diminuiu o coeficiente de partição dos açúcares e aumentou o coeficiente de partição das antocianinas, como podemos observar na Figura 2 (c). Portanto, o CLA escolhido para estudar o efeito da razão de volume das fases foi o de 45,24%, que apresentou maior coeficiente de partição de antocianinas (2,30), menor concentração de açúcares na fase topo (246,19 mg/L) e maior rendimento de antocianinas na fase topo (74,76 % m/m), o que pode ser visto na Figura 2 (a) e (b).
Tabela 1 – Composição global e composição das fases em função do CLA
CLA (%m/m) Composição Global Composição Fase topo Composição Fase fundo Etanol (%m/m) Sulfato de amônio (%m/m) Etanol (%m/m) Sulfato de amônio (%m/m) Etanol (%m/m) Sulfato de amônio (%m/m) 35,65 25,2 17,5 39,70 7,07 11,66 27,42 41,77 26,4 17,9 43,84 5,43 9,89 29,76 45,24 27,2 18,0 45,94 4,72 9,04 30,87 50,24 28,4 18,3 49,16 3,77 7,85 32,36 (a) 34 36 38 40 42 44 46 48 50 6 8 10 12 14 16 CLA (% m/m) C A (mg/ L) 0 100 200 300 400 500 C S (mg/ L) (b) 34 36 38 40 42 44 46 48 50 20 30 40 50 60 70 80 CLA (% m/m) R A (% m/ m) 20 30 40 50 60 R S (% m/ m) (c) 34 36 38 40 42 44 46 48 50 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 CLA (% m/m) K A 0,56 0,58 0,60 0,62 0,64 0,66 0,68 0,70 K S
Figura 2 – (a) efeito do CLA nas concentrações de antocianinas (CA) e açúcares (CS) (b) efeito do
CLA no rendimento de antocianinas (RA) e açúcares (RS); Símbolos (■ antocianinas fase topo, ■
antocianinas fase fundo, ■ açúcares fase topo, ■ açúcares fase fundo); (c) efeito do CLA nos
coeficientes de partição de antocianinas e açúcares; Símbolos (■ antocianinas, ■ açúcares)
Razão do volume das fases: De acordo com Wang et al. (2010), a fração mássica de etanol na fase topo aumenta com a adição de sulfato de amônio, o que podemos observar na Tabela 3. A Figura 3 (a) mostra que ocorreu um aumento na concentração de açúcares na fase fundo (de 351,16 para 710,44 mg/L) com o aumento de VR (de 0,23 para 7,77). Chandrasekhar e Raghavarao (2015), em seu estudo
de separação e concentração de antocianinas de jamelão em SAB composto por polietileno glicol e sulfato de magnésio, observaram que o aumento da VR aumentou o rendimento de antocianinas e
diminuiu os coeficientes de partição das antocianinas e dos açúcares. Isso pode ser observado na Figura 3 (b), onde o aumento de VR aumentou o rendimento de antocianinas na fase topo (de 36,41
para 86,66% m/m) e da Figura 3 (c), cujo aumento de VR causou diminuição no coeficiente de
partição das antocianinas (de 2,60 para 0,83) e no coeficiente de partição dos açúcares (de 0,89 para 0,50).
Tabela 3 – Composição global e composição das fases da VR
VR Composição Global Composição Fase topo Composição Fase fundo Etanol (%m/m) Sulfato de amônio (%m/m) Etanol (%m/m) Sulfato de amônio (%m/m) Etanol (%m/m) Sulfato de amônio (%m/m) 7,77 38,74 9,66 39,71 7,07 11,41 27,75 2,08 31,87 14,56 40,24 6,84 10,98 28,32 0,56 21,89 21,62 41,20 6,40 10,51 28,95 0,23 15,79 25,81 41,73 6,23 10,19 29,37 (a) 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 VR C A (mg/ L) 200 300 400 500 600 700 C S (mg/ L) (b) 0 2 4 6 8 10 20 30 40 50 60 70 80 90 VR R A (% m/ m) 10 20 30 40 50 60 70 R S (% m/ m)
(c) 0 2 4 6 8 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 VR K A 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 K S
Figura 3 – (a) efeito do VR nas concentrações de antocianinas (CA) e açúcares (CS) (b) efeito do
VR no rendimento de antocianinas (RA) e açúcares (RS); Símbolos (■ antocianinas fase topo, ■
antocianinas fase fundo, ■ açúcares fase topo, ■ açúcares fase fundo); (c) efeito do VR nos
coeficientes de partição de antocianinas e açúcares; Símbolos (■ antocianinas, ■ açúcares)
3.3. Perfil de antocianinas na polpa de açaí após extração em SAB
O CLA escolhido para a avaliação do das antocianinas foi o de 45,24% m/m. A Figura 4 (a) e (b) mostra os cromatrogramas da polpa de açaí e da polpa de açaí após extração em SAB, respectivamente. Foi identificado a ciadinida-3-O-rutinosídeo com íon molecular m/z 595 e fragmentos m/z 287 e 449. A cianidina-3-O-rutinosídeo foi identificada em polpa de açaí liofilizada por Gôuvea et al. (2010) e em morus, por Wu et al. (2011). Estudos como os de Gallori et al.(2004), Lichtenthäler et al. (2005) e De Rosso et al. (2008) identificaram as principais antocianinas presentes no açaí como cianidina-3-O-glicosídeo e cianidina-3-O-rutinosídeo. Segundo De Rosso et al. (2008), a cianidina-3-O-rutinosídeo representa 88% do conteúdo total de antocianinas e a cinidina-3-O-glicosídeo, representa 12%. Não foi detectada a cianidina-3-O-glicosídeo na polpa de açaí.
(c)
Figura 4 – (a) Cromatograma do LC-MS da polpa de açaí; (b) cromatograma do LC-MS da polpa de açaí após extração em SAB – fase topo e (c) espectro de massa no modo positivo da
cianidina-3-O-rutinosídeo da polpa de açaí após extração em SAB – fase topo
4. CONCLUSÃO
A extração e identificação de antocianina da polpa comercial de açaí foram realizadas nesse estudo. A maior diferença entre coeficiente de partição de antocianinas e de açúcares foi alcançada no CLA de 45,24% m/m e razão de volume das fases de 1,29. Nessas condições, o rendimento de antocianinas na fase topo (fase rica em etanol) foi de 74,76% m/m e o rendimento de açúcares na fase fundo (fase rica em sulfato de amônio) foi de 56,97% m/m. A análise no LC-MS identificou a antocianina cianidina-3-O-rutinosídeo da polpa de açaí antes e após partição em sistema aquoso bifásico formado por etanol e sulfato de amônio.
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