O pbr322 foi o primeiro plasmídeo a ser largamente usado pela comunidade científica, tendo permitido identificar recombinantes por selecção negativa

O pBR322 foi o primeiro plasmídeo a ser largamente usado pela comunidade científica, tendo permitido identificar recombinantes por selecção negativa

Validação de colónias seleccionadas - “Miniprep” (Extracção e isolamento de plasmídeo a partir de uma cultura em meio líquido), “Colony PCR” (reacção de PCR com pequena amostra da colónia) ou “Electroforese directa”

Miniprep

PCR

Análise de

Restrição

PCR

Electroforese directa

1. Isolation of Plasmids from E. coli by Alkaline Lysis

Purification of plasmid DNA from Escherichia coli using alkaline lysis (1,2) is

based on the differential denaturation of chromosomal and plasmid DNA in order to separate the two. Bacteria are lysed with a solution containing sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium hydroxide. During this step, chromosomal as well as plasmid DNA are denatured. Subsequent neutralization with potassium acetate allows only the

covalently closed plasmid DNA to reanneal and to stay solubilized. Most of the chromosomal DNA and proteins precipitate in a complex formed with potassium and SDS,

which is removed by centrifugation. The plasmid DNA is concentrated from the supernatant by ethanol precipitation. Using this procedure, 2–5 μg of DNA can be obtained from a 1.5-mL culture of E. coli containing a pBR322-derived plasmid, and three- to five-fold higher yields can be expected from pUC-derived plasmids (3).

2. Isolation of Plasmids from E. coli by Boiling Lysis

The boiling lysis procedure (1) is quick to perform and, therefore, especially suitable for screening large numbers of small-volume Escherichia coli cultures. It is

described with different adaptations in a variety of protocol books (2,3). The quality of the isolated plasmid DNA is lower than that from an alkaline lysis miniprep, but it is sufficient for restriction analysis.

The bacteria are lysed by treatment with lysozyme, Triton, and heat. The chromosomal DNA remains attached to the bacterial membrane and is removed by centrifugation. The plasmid DNA remains in the supernatant from which it is then precipitated

3. Isolation of Plasmids from E. coli by alkaline lysis followed by anion-exchange resin

Plasmid purification protocols are based on a modified alkaline lysis procedure,

followed by binding of plasmid DNA to a anion-exchange resin under appropriate low-salt and pH conditions. RNA, proteins, dyes, and low-molecular–weight impurities are removed by a medium-salt wash. Plasmid DNA is eluted in a high-salt buffer and then concentrated

MiniPrep (baseado em lisozima)

Extracção de DNA plasmídico (MINIPREP)

• Perto da chama transferir cerca de 1,5 mL de cultura bacteriana para um tubo de 1,5

mL estéril

• Centrifugar à velocidade máxima durante 1 minuto para recolher as bactérias no

fundo do tubo

• Ressuspender o sedimento em 200 μL de STET e adicionar 4 μL de lisozima (50

mg/mL)

• Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos

• Ferver durante 45 segundos

• Centrifugar durante 5 minutos à velocidade máxima

• Remover o sedimento com um palito ou ponta estéril

• Adicionar 200 μL de isopropanol e agitar o tubo

• Centrifugar à velocidade máxima durante 10 minutos

• Eliminar o sobrenadante e deixar secar até desaparecer o odor do isopropanol,

evitando que o sedimento seque em demasia

• Ressuspender em 30 – 40 μL de água destilada estéril agitando a base do tubo com

os dedos

As colónias seleccionadas têm sempre que ser sujeitas a validação

Validação por

Análise de restrição

PstI 700 EcoRI ₈₀₀ EcoRI 1 5000 4000 2000 1000 500 300 200 100 400 Plasm colónia branca1 + PstI Plasm colónia branca2 +PstI Plasm colónia branca3 +PstI

As colónias escolhidas têm sempre que ser sujeitas a validação(“miniprep” ou “colony PCR”)

Validação por

PCR e/ou

Sequenciação

POSICIONADAS EM PLASMÍDEOS PARA AMPLIFICAR REGIÃO DO INSERT (FLANQUEIAM O MCS).

Validação por

PCR e/ou

Sequenciação:

•SP6

•T7

•T3

•M13

Validação por

PCR e/ou

Operações associadas a clonagem de genes - Resumo

1. Digestão de restrição

2. (Introdução de um local de restrição - > PCR)

Operações associadas a clonagem de genes - Resumo

4. Desfosforilação do vector 5. Fosforilação do insert

Os plasmídeos podem ser caracterizados pela densidade de super-enrolamentos (σ), fenómeno que origina diferentes topoisómeros. Valores crescentes de σ indicam

A ramificação é outra característica estrutural de plasmídeos e aumenta linearmente com o tamanho

a) Fill in the blanks with the identities of

the uncut DNA bands labeled A, B, and C:

A___________________

B___________________

C___________________

b) How many times does XhoI cut the DK15 DNA? Justify your answer in

one sentence.

c) How many times does SspI cut the DK15 DNA? How do you know?

You are a bit puzzled by the SmaI result, and show your gel to Kate to get

her input. Kate concludes that the DK15 DNA contains two SmaI sites—

even though you observed three bands on your gel.

d) Assuming that Kate is correct, propose a simple explanation for your

observation of three bands. Explain your answer by stating the probable

identity of each band you observed, and how you deduced this.

A sequência de reconhecimento da HindIII é

A’AGCTT, a qual ocorre 1 vez no pUC19 e 7 vezes no fago λ. λ/BstEII λ/HindIII λ/BstEII λ pUC19 pUC19/ HindIII