ESTUDO MORFOFISIOMÉTRICO DE OVÁRIOS E MATURAÇÃO OVOCITÁRIA IN VITRO EM BUBALINOS E BOVINOS NAS DIFERENTES FASES DA ATIVIDADE REPRODUTIVA

Texto

(1)UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA. ESTUDO MORFOFISIOMÉTRICO DE OVÁRIOS E MATURAÇÃO OVOCITÁRIA IN VITRO EM BUBALINOS E BOVINOS NAS DIFERENTES FASES DA ATIVIDADE REPRODUTIVA. LUCIANA DA SILVA LEAL. BOTUCATU - SP MAIO, 2008.

(2) 1. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA. ESTUDO MORFOFISIOMÉTRICO DE OVÁRIOS E MATURAÇÃO OVOCITÁRIA IN VITRO EM BUBALINOS E BOVINOS NAS DIFERENTES FASES DA ATIVIDADE REPRODUTIVA. LUCIANA DA SILVA LEAL. Tese apresentada. ao Programa. de. Pós-graduação em Medicina Veterinária para obtenção do Título de Doutor. Área de concentração: Reprodução Animal Orientadora: Profa. Dra. Eunice Oba. BOTUCATU - SP MAIO, 2008.

(3) 2. COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA. Autora: Luciana da Silva Leal Título: Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade reprodutiva Data: 05/05/08. Nome. Assinatura. Profa. Dra. Eunice Oba. ________________________. Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga _______________________. Profa. Dra. Mayra Elena Ortiz D’Ávila Assumpção _______________________. Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda. ________________________. Prof. Dr. Otávio Mitio Ohashi. ________________________.

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(35) 4. DEDICATÓRIA. A DEUS, por estar sempre cuidando de mim.. Aos meus amados pais, Fernando e Maria de Lourdes, e irmãs, Fernanda e Debora, pelo apoio, dedicação, incentivo, confiança, respeito, torcida, alegrias... A vocês dedico todo o esforço, tentativas e amor incondicional!!!. Às minhas avós, Josefina e Ermelinda (in memorian), aos meus avôs, Albertino e Manuel (in memorian) e ao meu irmão, Fernando (in memorian), por iniciarem a trajetória..

(36) 5. AGRADECIMENTOS. À minha família, por estar sempre presente nas vitórias e nas dificuldades e por todo o amor dedicado.. À Profa. Titular Eunice Oba, pela orientação, oportunidade, incentivo e colaboração constante na realização deste trabalho.. À Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga, pelo auxílio fundamental nas análises ultra-estruturais, por permitir a utilização do laboratório e tempo dedicado.. Ao Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes, pelo apoio diário, respeito e amizade sincera.. À Banca Examinadora (Professores Eunice, Fernanda, Mayra, Marcelo e Ohashi), pelas ótimas sugestões e idéias para a melhoria da tese.. À Profa. Dra. Lídia Raquel de Carvalho, pela realização das análises estatísticas.. À Carla F. Moya, Cláudia Barbosa Fernandes e Lílian Rigatto Martins, pela amizade, generosidade e colaboração incomensurável para a execução deste trabalho.. À Camila Dias Porto, pela amizade e processamento das amostras para as análises histológicas.. À Maria Inês Lenz Souza, pela amizade, respeito e colaboração nas dosagens hormonais..

(37) 6 Aos docentes e funcionários do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelo convívio e dedicação diários.. Aos residentes, colegas de pós-graduação e de orientação, especialmente à Tatiana, Liani e Daniela, pela ajuda nas rotinas.. À estagiária Camila Chavier, pela colaboração na execução do projeto.. Aos funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências, pelo processamento das amostras para avaliação ultra-estrutural.. À Profa. Dra. Kunie I. Rabello Coelho e ao funcionário Carlão, por permitirem a utilização do microscópio eletrônico de transmissão no Departamento de Patologia Humana da Faculdade de Medicina.. Aos funcionários da pós-graduação, pela presteza e cordialidade.. Aos funcionários do Setor de Transportes, pela disponibilidade e boas horas de viagem.. Aos funcionários do Hospital Veterinário, pela presteza e convívio diário.. Aos funcionários dos frigoríficos Frigol, Better Beef e Frivale, pela colheita do material.. Às queridas amigas Fernanda, Marcella, Márcia, Soraya e Tatiana da turma XXXIII, pelo companheirismo.. Ao colega Ian Martin, pela idéia de classificar o corpo lúteo.. À bibliotecária Selma Maria de Jesus, pela elaboração da ficha catalográfica.. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, pela formação pessoal e profissional..

(38) 7 Ao Curso de Pós-graduação, pelo aprimoramento científico.. À CAPES, pela bolsa concedida e possibilidade de realização do doutorado.. À FAPESP e FUNDUNESP, pelos auxílios financeiros concedidos para a execução desta pesquisa..

(39) 8. LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Freqüência de búfalas e vacas gestantes e não gestantes segundo a forma do ovário..................................................................................................64. Tabela 2. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas...........................................66. Tabela 3. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo o período de gestação das búfalas.....................................................67. Tabela 4. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo o período de gestação das vacas.......................................................68. Tabela 5. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais segundo a espécie animal.................................................................................71. Tabela 6. Freqüência da presença de folículos em búfalas e vacas não gestantes e nos períodos inicial, médio e final da gestação..............................73 Tabela 7. Mediana [10 e 30 quartis] dos números de corpos lúteos (N0 de CL) e folículos 7/ 6 mm (N0 de Fol 7/ 6 mm) segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas..................................................................................................74 Tabela 8. Mediana [10 e 30 quartis] dos números de corpos lúteos (N0 de CL) e folículos 7/ 6 mm (N0 de Fol 7/ 6 mm) segundo o período de gestação das búfalas e vacas..................................................................................................75.

(40) 9 Tabela 9. Mediana [10 e 30 quartis] referentes às presenças de corpo lúteo (CL) e folículos 7/ 6 mm segundo a espécie animal...............................................76 Tabela 10. Freqüência da presença de corpo lúteo (CL) e a época do ano em búfalas...............................................................................................................76. Tabela 11. Distribuição da freqüência de corpos lúteos (CL) segundo a classificação em búfalas e vacas.......................................................................77 Tabela 12. Mediana [10 e 30 quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo (μm) segundo a classificação do folículo ovariano para as búfalas...................84 Tabela 13. Mediana [10 e 30 quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo segundo a classificação do folículo ovariano para as vacas.............................85. Tabela 14. Média e desvio-padrão do número de células foliculares ao redor do ovócito segundo a classificação do folículo ovariano em búfalas e vacas........88. Tabela 15. Freqüência de folículos ovarianos de búfalas (n= 103) e vacas (n= 161) segundo a presença de vacúolos no ovócito.............................................89 Tabela 16. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e TOT RECUP segundo a espécie animal.........................................................116 Tabela 17. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e TOT RECUP segundo a época do ano em vacas...........................................117 Tabela 18. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e TOT RECUP segundo o período de gestação das búfalas.............................119 Tabela 19. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e TOT RECUP segundo a presença do CL em búfalas.....................................120.

(41) 10 Tabela 20. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e TOT COR segundo a espécie animal..............................................................124. Tabela 21. Matriz de correlações de Spearman referentes às variáveis analisadas (GI, GII, GIII, DESN, EXP, TOT RECUP, VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e TOT COR) nas vacas...................................................................................125 Tabela 22. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e TOT COR segundo o estado reprodutivo das búfalas.....................................127 Tabela 23. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/NI e TOT COR segundo o período de gestação das búfalas..................................127 Tabela 24. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de progesterona (P4 p) (ng/mL) segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas................................................................................................................131 Tabela 25. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de progesterona. (P4 p). (ng/mL). segundo. o. período. de. gestação. das. búfalas.............................................................................................................132 Tabela 26. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de progesterona (P4p) (ng/mL) segundo a presença de corpo lúteo (CL) em búfalas e vacas................................................................................................132 Tabela 27. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de progesterona (P4 p) (ng/mL) segundo a época do ano em búfalas e vacas................................................................................................................135 Tabela 28. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração plasmática de insulina (μUI/mL) segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas..........................135.

(42) 11 Tabela 29. Mediana [10 e 30 quartis] concentração plasmática de insulina (μUI/mL) segundo o período de gestação das búfalas e vacas.......................136 Tabela 30. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração intrafolicular de progesterona (P4) (ng/mL) em folículos < e 7/ 6 mm em búfalas e vacas................................................................................................................138 Tabela 31. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração intrafolicular de estradiol (E2) (ng/mL) em folículos < e 7 mm em búfalas............................................139 Tabela 32. Mediana [10 e 30 quartis] da concentração intrafolicular de IGF-I (ng/mL) em folículos < e 7 mm em búfalas...................................................140 Tabela 33. Mediana [10 e 30 quartis] das variáveis P4p, INSp, IGF-I Fol < 7/ 6 mm, IGF-I Fol 7/ 6 mm, P4 Fol < 7/ 6 mm e P4 Fol 7 /6 mm, segundo a espécie animal.................................................................................................141.

(43) 12. LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Colheita do sangue no momento do abate.........................................53. Figura 2. Dissecção de um ovário com o auxílio de tesoura e pinça anatômica para extrair os tecidos ao seu redor, permitindo melhor acurácia nas avaliações realizadas...........................................................................................................54. Figura 3. Mensuração de um ovário com o auxílio de um paquímetro (a) e no detalhe o paquímetro digital (b).........................................................................54. Figura 4. Corpos lúteos seccionados ao meio para classificação e determinação. do. diâmetro. médio. utilizando-se. paquímetro. digital..................................................................................................................55. Figura 5. Aspiração dos folículos antrais com auxílio de agulha 30 x 8 e seringa de 10 mL............................................................................................................56. Figura 6. Gotas de meio de maturação identificadas com o número da fêmea, contendo os CCOs em placa de Petri................................................................57. Figura 7. Microscópio invertido Leica equipado com epifluorescência utilizado para a visualização dos ovócitos corados com Hoechst 33342........................58. Figura. 8.. Ovários. seccionados e fixados. em. solução de formalina. 10%....................................................................................................................60. Figura 9. Fragmentos de ovário em solução de glutaraldeído 2,5%.................61. Figura 10. Aparelho Gamma Count Cobra II para leitura de amostras por procedimento de radioimuniensaio....................................................................62.

(44) 13. Figura 11. Ovários bubalinos com formato redondo (a); alongado (b; esquerda) e oval (b; direita)................................................................................................79. Figura 12. Ovário bubalino com corpo lúteo cavitário (a); ovário bovino com corpo lúteo cavitário (b).....................................................................................79. Figura 13. Classificações dos corpos lúteos bubalino. CL I (a); CLII (b, c); CLIII (d, e) e CL IV (f, g).............................................................................................80. Figura 14. Classificações dos corpos lúteos bovino. CL I (a); CLII (b, c, d); CLIII (e, f)....................................................................................................................81. Figura 15. Micrografias de folículos ovarianos bubalinos: primordial (a; 400x); primário (b; 400x); secundário em fase inicial (c; 400x); secundário em fase tardia (d; 400x); antral com antro menos desenvolvido (e; 100x) e pré-ovulatório (f; 50x). A: antro.................................................................................................91. Figura 16 Micrografias de folículos ovarianos bovinos: primordial (a; 400x); em transição (b; 400x, setas indicam células pavimentosas); primário (c; 400x); secundário (d; 400x); terciário (e; 400x); pré-ovulatório (f; 200x); complexo cumulus oophorus (g; 400x); parede folicular de folículo pré-ovulatório (h; 200x). A: antro; CG: células da granulosa; CT: células tecais; N: núcleo; O: ovócito; ZP: zona pelúcida.................................................................................92. Figura 17. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: espaço entre a membrana plasmática do ovócito e da célula da granulosa, iniciando-se a deposição de material da zona pelúcida, indicada pela seta (77.500x). CG: célula da granulosa; O: ovócito..........................................................................98. Figura 18. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: presença de microvilosidades entre o ovócito e a célula da granulosa (42.000x). As setas indicam vesículas cobertas (coated vesicles). CG: célula da granulosa; O: ovócito................................................................................................................99.

(45) 14 Figura 19. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: organelas distribuídas no citoplasma do ovócito (5.750x). CG: célula da granulosa; L: lisossomo (vesícula digestória); N: núcleo; V: vesícula...................................100. Figura 20. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: prevalência de mitocôndrias circulares no citoplasma do ovócito (23.000x). A seta indica uma mitocôndria alongada. RE: retículo endoplasmático........................................101. Figura 21. Células da granulosa de folículo secundário bubalino (9.750x). A mais escura apresenta abundância em RE. A mais clara apresenta menos RE e mais mitocôndrias. C: centríolo; CGo: complexo de Golgi; M: mitocôndria; N: núcleo; RE: retículo endoplasmático...............................................................102. Figura 22. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário. A seta indica secreção de fluido (5.750x). MB: membrana basal.........................................103. Figura 23. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário: espaço entre as células da granulosa (42.000x). As setas indicam gap junctions entre as células da granulosa........................................................................................104. Figura 24. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: distribuição das organelas no citoplasma (3.250x). CG: célula da granulosa; M: mitocôndria; N: núcleo; Nu: nucléolo....................................................................................109. Figura 25. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: mitocôndrias predominantemente de formato circular no citoplasma do ovócito (42.000x). A seta indica coated vesicle (vesícula coberta). CG: célula da granulosa; GM: grânulo. mitocondrial;. Mi:. microvilosidades;. O:. ovócito;. RE:. retículo. endoplasmático................................................................................................110. Figura 26. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: núcleo do ovócito (9.750x). As setas apontam os poros nucleares. CFE: centro fibrilar externo; Nu: nucléolo.......................................................................................111.

(46) 15 Figura 27. Eletromicrografia de folículo primário bovino: microvilos (12.000X) projeções do citoplasma do ovócito emitidas no citoplasma da célula da granulosa. CG: célula da granulosa; L: lisossomo; M: mitocôndria; N: núcleo; O: ovócito..............................................................................................................112. Figura 28. Eletromicrografia de folículo primário bovino: complexo juncional (30.000x).. A. seta. indica. gap. junctions.. ZA:. zona. de. aderência.........................................................................................................113. Figura 29. Eletromicrografia de folículo primário bovino: mitocôndrias circulares com grânulos (7.000x). A seta aponta uma mitocôndria em processo de divisão. CG:. célula. da. granulosa;. L:. lisossomo;. O:. ovócito;. RE:. retículo. endoplasmático................................................................................................114. Figura 30. Fotografia de complexos cumulus oophorus expandidos de búfalas após 22 a 24 horas de incubação observados em estereomicroscópio (aumento 40x)..................................................................................................................129. Figura 31. Fotografia de ovócito de búfala (aumento 400x), no estágio de Metáfase II, corado com Hoechst 33342 visualizado em microscópio invertido equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e emissão, respectivamente)..............................................................................129. Figura 32. Fotografia de zigoto bubalino partenoto (aumento 100x), visualizado em microscópio invertido equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e emissão, respectivamente)...................................130. Figura 33. Fotografia de complexos cumulus oophorus expandidos de vacas após 22 a 24 horas de incubação observados em estereomicroscópio (aumento 40x)..................................................................................................................130.

(47) 16 Figura 34. Fotografia de ovócito de vaca (aumento 400x), no estágio de Metáfase II, corado com Hoechst 33342 visualizado em microscópio invertido equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e emissão, respectivamente)..............................................................................131.

(48) 17. LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS AI: anáfase I BEN: balanço energético negativo CCOs: complexos cumulus oophorus CG: célula da granulosa CGo: complexo de Golgi CIV: cultivo in vitro CL: corpo lúteo DEG/ NI: degenerado/ não identificado DESN: desnudo DNA: ácido desoxirribonucléico E2: estradiol eCG: gonadotrofina coriônica eqüina EGF: fator de crescimento epidermal EXP: expandido FF: fluido folicular FIV: fertilização in vitro FSH: hormônio folículo estimulante GC: grânulos corticais GH: hormônio de crescimento GI: grau I GII: grau II GIII: grau III GnRH: hormônio liberador de gonadotrofina hCG: gonadotrofina coriônica humana IA: inseminação artificial IGF-I: fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I Insp: insulina plasmática LH: hormônio luteinizante MAPK: proteína quinase ativada por mitógeno MI: metáfase I MII: metáfase II.

(49) 18 MIV: maturação in vitro MOET: embryo transfer and multiple ovulation μUI/mL: microunidades internacionais por mililitro NaCl: cloreto de sódio OD: ovário direito OE: ovário esquerdo P4: progesterona P4p: progesterona plasmática PBS: phosphate buffer saline PIV: produção in vitro PMSG: gonadotrofina sérica da égua prenhe QVG: quebra da vesícula germinativa REL: retículo endoplasmático liso RER: retículo endoplasmático rugoso RNA: ácido ribonucléico RNAm: ácido ribonucléico mensageiro SFB: soro fetal bovino TCM-199: Tissue Culture Medium-199 TE: transferência de embriões TI: telófase I TOT COR: número total de ovócitos corados TOT RECUP: número total de ovócitos recuperados UI: unidade internacional VG: vesícula germinativa.

(50) 19. SUMÁRIO RESUMO...........................................................................................................21 ABSTRACT........................................................................................................23 1. INTRODUÇÃO...............................................................................................25 2. REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................27 2.1. O Ovário...............................................................................................27 2.2. Ovogênese e Foliculogênese...............................................................29 2.3. Reinício da Meiose...............................................................................30 2.4. Folículos Ovarianos.............................................................................32 2.5. O Corpo Lúteo (CL)..............................................................................36 2.6. Características Reprodutivas da Fêmea Bubalina...............................37 2.7. Características Reprodutivas da Fêmea Bovina..................................39 2.8. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)......................................................41 2.9. Hormônios e IGF-I no Líquido Folicular...............................................48 2.10. Insulina Plasmática............................................................................49 3. HIPÓTESE.....................................................................................................50 4. OBJETIVOS...................................................................................................51 5. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................52 5.1. Colheita do Sangue..............................................................................52 5.2. Colheita e Avaliação Morfométrica dos Ovários..................................53 5.3. Recuperação e Seleção dos Ovócitos.................................................56 5.4. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)......................................................57 5.4.1. Avaliação da Maturação Nuclear..................................................57 5.5. Processamento Histológico dos Ovários para Microscopia de Luz.....................................................................................................................59.

(51) 20 5.6. Processamento dos Ovários. para Microscopia Eletrônica. de. Transmissão......................................................................................................60 5.7. Dosagens Hormonais...........................................................................61 5.7.1. Plasma..........................................................................................61 5.7.2. Fluido Folicular..............................................................................61 5.8. Metodologia Estatística...............................................................................62 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................64 6.1. Morfometria do Ovário.........................................................................64 6.2. Morfometria dos Folículos Ovarianos..................................................82 6.3. Características Ultra-estruturais dos Folículos Ovarianos...................93 6.3.1. Búfalas..........................................................................................93 6.3.2. Vacas..........................................................................................104 6.4. Recuperação e Qualidade do Ovócito...............................................114 6.5. Maturação Nuclear Ovocitária in vitro................................................122 6.6. Concentração Plasmática de Progesterona e Insulina......................131 6.6.1 Concentração Plasmática de Progesterona.................................131 6.6.2. Concentração Plasmática de Insulina.........................................135 6.7. Concentração Intrafolicular de Progesterona, Estradiol e IGF-I........138 7. CONCLUSÕES............................................................................................142 8. BIBLIOGRAFIA............................................................................................145 ANEXO I..........................................................................................................179.

(52) 21. RESUMO LEAL, L.S. Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade reprodutiva. [Morphophysiometric study of ovaries and in vitro maturation of oocytes during different phases of reproductive activity in bubaline and bovine]. 2008. 179f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de concentração: Reprodução Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2008. Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária in vitro em várias espécies, com o intuito de aprimorar tecnologias de produção e manipulação de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar: a morfometria ovariana; os aspectos morfométricos e ultra-estruturais dos folículos ovarianos; os fatores que influenciam a recuperação, qualidade ovocitária e taxas de maturação nuclear in vitro; as concentrações de progesterona e insulina plasmáticas e os níveis de hormônios esteróides (estradiol e progesterona) e IGF-I no líquido folicular, em búfalas e vacas. Amostras de sangue e os ovários de 86 búfalas (33 gestantes e 53 não gestantes) e de 95 vacas (36 gestantes e 59 não gestantes) foram colhidos em abatedouros. Os ovários foram transportados ao laboratório em solução salina acrescida de penicilina e estreptomicina a 36ºC. As dimensões ovarianas foram mensuradas com o auxílio de paquímetro e balança digitais. Para a maturação ovocitária in vitro, os complexos cumulus oophorus (CCOs) foram recuperados por aspiração folicular, selecionados e cultivados em meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio, FSH, LH, estradiol, cisteamina e gentamicina, por 22 a 24 horas, a uma temperatura de 38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar. Para as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão foram processados 10 e 5 ovários de cada espécie, respectivamente. As concentrações de progesterona, insulina, estradiol e IGF-I nas amostras de sangue e fluido folicular foram determinadas por procedimento de radioimunoensaio, utilizandose kits comerciais. Na análise histológica, verificou-se que os diâmetros dos folículos e dos ovócitos aumentaram conforme o desenvolvimento folicular. A caracterização ultra-estrutural dos folículos ovarianos de búfalas e vacas.

(53) 22 mostrou um aparato celular especializado para a metabolização de substratos, produção de energia e síntese de hormônios esteróides. Além disso, foram identificadas microvilosidades e junções específicas entre o ovócito e as células da granulosa. Nas búfalas, a gestação influenciou negativamente o número de folículos ovarianos superficiais, a recuperação ovocitária e a taxa de ovócitos que estavam em estágio de metáfase II. Em ambas espécies (bubalina e bovina), a concentração plasmática de progesterona foi maior (p< 0,001) nas fêmeas gestantes (4,7 ± 2,1 e 8,5 ± 2,8 ng/mL, respectivamente) do que nas não gestantes (2,4 ± 2,6 e 3,6 ± 3,5 ng/mL, respectivamente). A concentração de insulina foi superior nas fêmeas não gestantes do que nas gestantes (4,2 ± 5,5 e 2,1 ± 1,3 μUI/mL, búfalas; p= 0,016) e (5,9 ± 5,8 e 3,4 ± 2,8 μUI/mL, vacas; p= 0,028) Os fluidos dos folículos < 7 mm (búfalas) e < 6 mm (vacas) apresentaram maior concentração de progesterona (207,6 ± 194,5 e 239,8 ± 133,7 ng/mL, respectivamente) e menor nível de IGF-I (187,7 ± 153,6 e 80,7 ± 98,0 ng/mL, respectivamente) comparados aos folículos 7 mm (búfalas) (76,3 ± 171,1 ng/mL de P4 e 290,4 ± 177,7 ng/mL de IGF-I) e 6 mm (vacas) (104 ± 120,1 ng/mL de P4 e 165,6 ± 166,5 ng/mL de IGF-I). Comparando as espécies, o tamanho e o peso dos ovários foram menores (p< 0,001) para as búfalas (24,4 x 17,1 x 13,1 mm e 4,0 g/ comprimento, largura, altura e peso, respectivamente) do que para as vacas (30,9 x 21,7 x 15,4 mm e 7,7 g/ comprimento, largura, altura e peso, respectivamente). Nas búfalas, os índices de recuperação de todas as categorias de CCOs (grau 1: 25,9%; grau 2: 30,7%; grau 3: 10,2%; desnudos: 18,6 e expandidos: 14,6%) foram inferiores aos obtidos para as vacas (31,8; 30,6; 15,4; 4,5 e 17,7%, respectivamente). A porcentagem de ovócitos que atingiu o estágio de metáfase II também foi menor nas búfalas (63,4%; 242/396) do que nas vacas (67,8%, 696/1234). Foram observadas diferenças em todas as análises realizadas, indicando que cada espécie possui características fisiológicas próprias.. Palavras-chave: Búfalas, Hormônios, Maturação in vitro, Ovário, Ovócito, Vacas..

(54) 23. ABSTRACT LEAL, L.S. Morphophysiometric study of ovaries and in vitro maturation of oocytes during different phases of reproductive activity in bubaline and bovine. [Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade reprodutiva]. 2008. 179f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de concentração: Reprodução Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2008. Researchers around the world have investigated the function of biological factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of embryo production and manipulation. The aim of the present study was to evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations; progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro maturation process, cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered by follicular aspiration, selected and matured in TCM 199 supplemented with 10% fetal calf serum, sodium pyruvate, LH, FSH, estradiol, gentamicin and cysteamin. In vitro maturation was carried out at 38.5ºC under a controlled gas atmosphere of 5% CO2 in humidified air for 22-24 hours. For classical histology and transmission electron microscopy, 10 and 5 ovaries of each species respectively were processed. Progesterone, insulin, estradiol and IGF-I concentrations of blood and follicular fluid were determined by use of radioimmunoassay and commercial kits. In histological evaluation, the diameters of follicles and oocytes increased according to follicular development. Ultrastructural characterization of bubaline and bovine ovarian follicles showed a differentiated cell apparatus for substrate metabolization, energy production and hormone synthesis. Furthermore, microvillis and specific junctions were.

(55) 24 identified between granulosa cells and oocyte. In buffaloes, the pregnancy affected negativelly the number of ovarian follicles from surface, oocyte recovered and oocytes that were in metaphase II stage. In both species (bubaline vs. bovine), plasma progesterone concentration was higher (p< 0.001) for pregnant (4.7 ± 2.1, n= 33 and 8.5 ± 2.8 ng/mL, n= 36, respectively) than for non pregnant females (2.4 ± 2.6, n= 51 and 3.6 ± 3.5 ng/mL, n= 59, respectively). Insulin concentration was higher for non pregnant than pregnant animals (4.2 ± 5.5 e 2.1 ± 1.3 μUI/mL for buffaloes; p= 0.016) and (5.9 ± 5.8 and 3.4 ± 2.8 μUI/mL for cows; p= 0,028) The fluid from follicles < 7 mm (buffaloes) and < 6 mm (cows) had more progesterone concentration (207.6 ± 194.5 and 239.8 ± 133.7 ng/mL, respectively) and less IGF-I (187.7 ± 153.6 and 80.7 ± 98.0 ng/mL, respectively) when compared with follicles 7 mm (buffaloes) (76.3 ± 171.1 ng/mL - P4 and 290.4 ± 177.7 ng/mL - IGF-I) and 6 mm (cows) (104.0 ± 120,1 ng/mL - P4 and 165.6 ± 166.5 ng/mL - IGF-I). Among the species, dimensions and weigth of ovaries were lower (p< 0.001) for buffaloes (24.4 x 17.1 x 13.1 mm and 4.0 g to length, width, thickness and weight, respectively) than cows (30.9 x 21.7 x 15.4 mm and 7.7 g to length, width, thickness and weight, respectively). In the buffaloes, the recovery rates of each COCs categories (grade 1: 25.9%; grade 2: 30.7%; grade 3: 10.2%; denuded: 18.6% and expanded: 14.6%) were lower than cows (31.8; 30.6; 15.4; 4.5 and 17.7%, respectively). The percentage of bubaline oocytes that reached metaphase II (63.4%; 242/396) was lower than bovine oocytes (67.8%, 696/1234). Differences were observed in all analysis, indicating that each species has its own physiological characteristics.. Keywords: Buffaloes, Hormones, In vitro maturation, Ovary, Oocyte, Cows..

(56) 25. 1. INTRODUÇÃO A criação de búfalos tem despertado interesse crescente dos pecuaristas por sua comprovada rusticidade, produtividade de carne e leite e poder de tração. O rebanho mundial bubalino é de aproximadamente 174 milhões de animais e apresentou, nos últimos dez anos, um crescimento de 9,1% e um incremento de 70,6% na produção leiteira (FAO, 2005). O maior rebanho bubalino da América Latina encontra-se no Brasil, fato que pode fazer do país um grande exportador de material genético (OHASHI et al., 2003). O búfalo possui fácil adaptabilidade às condições brasileiras e é caracterizado por apresentar boa eficiência reprodutiva e crescimento ponderal (BARUSELLI & CARVALHO, 2002). A aplicação de biotécnicas da reprodução é importante em fêmeas bubalinas porque estes animais apresentam características reprodutivas particulares, tais como: expressão discreta do comportamento de estro e períodos longos de anestro pós-parto e intervalo entre partos, principalmente quando submetidos a uma dieta inadequada (MISHRA et al., 2008). O fato desta espécie apresentar índices reprodutivos inferiores aos bovinos está relacionado com manejo deficiente e/ou seleção inadequada, além do conhecimento não absoluto acerca da sua fisiologia (VALE & RIBEIRO, 2005). Em bubalinos, uma fertilidade reduzida é observada com a aplicação de algumas biotecnologias sendo provavelmente decorrente de um menor número de folículos primordiais no ovário, pouca responsividade à estimulação hormonal, baixa recuperação de embriões e menor taxa de prenhez quando comparados aos bovinos (NEGLIA et al., 2003). No entanto, Baruselli et al. (1999) verificaram por exames ultrasonográficos, que as búfalas apresentam resposta positiva ao tratamento superovulatório. Porém, a taxa de recuperação embrionária não é compatível à resposta ovariana. Devido à baixa eficiência de programas de ovulação múltipla e transferência de embriões (MOET) nesta espécie, há um grande interesse na produção in vitro de embriões para a rápida propagação do germoplasma superior, conservação de animais ameaçados de extinção e manipulação de.

(57) 26 constituintes genéticos (DATTA & GOSWAMI, 1998; GASPARRINI, 2002; OHASHI et al., 2002). O Brasil desempenha um papel importante na bovinocultura mundial porque é o maior criador comercial. Segundo os últimos dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o rebanho nacional bovino era de aproximadamente 207 milhões de animais em 2005. Embora a transferência de embriões (TE) em bovinos seja rotineiramente empregada, a técnica apresenta variabilidade na resposta ovariana das doadoras ao estímulo hormonal e no número de estruturas viáveis recuperadas, além do mais, caracteriza-se pela estagnação nos resultados alcançados. Os procedimentos de punção folicular e produção in vitro de embriões representam método alternativo ou complementar à TE, proporcionando a multiplicação de genótipos desejáveis, além de serem aplicados em fêmeas portadoras de transtornos reprodutivos adquiridos. No Brasil, essa associação tem sido empregada comercialmente com sucesso nos últimos anos, fazendo com que o país contribua com quase 50% do número total de embriões produzidos em laboratório no mundo (VIANA, 2003). No entanto, a referida técnica apresenta custo elevado e entraves que precisam ser solucionados, tais como: resultados ainda não satisfatórios de produção. de. estruturas. viáveis. para. transferência,. dificuldade. na. criopreservação dos embriões, aumento na incidência de abortamentos, gestação. nitidamente. prolongada,. anormalidades. congênitas. e. maior. mortalidade perinatal (GARCIA et al., 2003). O conhecimento de como diferentes componentes do sistema in vitro influenciam o desenvolvimento embrionário, fetal e placentário poderá resultar em método de cultivo mais confiável no sentido de produzir bezerros normais (PRESTES, 2005). Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos no processo de maturação nuclear e citoplasmática de ovócitos de diferentes espécies animais, pois o sucesso de tecnologias que visam a produção, manipulação e criopreservação de embriões depende da quantidade e, principalmente, qualidade de ovócitos no início do procedimento..

(58) 27 Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal estudar a fisiologia, morfologia e biometria dos ovários e folículos ovarianos, assim como a maturação ovocitária in vitro nas espécies bubalina e bovina, em diferentes fases da atividade reprodutiva.. 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. O Ovário Os ovários de ruminantes são órgãos pares localizados no terço médio das superfícies laterais da entrada da pelve, suspensos pelo mesovário, na porção cranial do ligamento largo, conectados ao útero pelo ligamento ovárico e ao peritôneo parietal pelo ligamento suspensor do ovário (NUNEZ, 1993). O ovário de búfala é ovóide e consideravelmente menor do que o da vaca (DYCE et al., 1996). Em búfalas adultas, Fadle et al. (1974) e Vale et al. (1982) descreveram medidas para o ovário direito (OD) de 24,0 e 25,4 mm (comprimento), 16,5 e 14,5 mm (largura) e 12,5 e 15,7 mm (espessura) e para o ovário esquerdo (OE) de 22,0 e 24,7 mm (comprimento), 15,5 e 14,1 mm (largura) e 14,0 e 14,8 mm (espessura), respectivamente. Em novilhas, Danell (1987) registrou para o OD 22,8 mm (comprimento), 18,2 mm (largura) e 14,2 mm (espessura) e OE 22,7 mm (comprimento), 16,6 mm (largura) e 13,8 mm (espessura). Parkale & Hukeri (1989), com base em 128 pares de ovários, encontraram as seguintes médias: 24,8 mm de comprimento, 16,7 mm de largura e 14,6 mm de espessura (OE); e 24,4 mm de comprimento, 17,4 mm de largura e 14,6 mm de espessura (OD). Para Vale & Ribeiro (2005), os ovários apresentaram em média, comprimento de 25 a 30 mm e largura de 14 mm. Alvarez & Oba (1995) avaliaram a biometria ovariana de 18 búfalas superovuladas com FSH-p e PMSG (gonadotrofina sérica da égua prenhe). O comprimento e largura dos ovários foram respectivamente 30 e 33 mm (FSH; OE); 29 e 42 mm (PMSG; OE); 33 e 23 mm (FSH; OD) e 42 e 29 mm (PMSG; OD). De acordo com relatos na literatura, o peso mínimo e máximo do ovário de búfalas é de 2,9 e 6,1 g, respectivamente (EL-WISHY et al., 1971), e médio de.

(59) 28 4,6 g (VALE & RIBEIRO, 2005). Danell (1987) observou peso médio de 3,44 ± 1,29 g (OE) e 3,59 ± 1,54 g (OD) em 30 novilhas bubalinas cíclicas avaliadas. Nos bovinos, os ovários são geralmente ovais a aplanados lateralmente, medindo em média de 30 a 45 mm de comprimento; 15 a 20 mm de largura e 20 a 28 mm de “profundidade” (SISSON & GROSSMAN, 1981). De acordo com Sisson (1986), o peso dos ovários de vacas adultas varia de 15 a 20 g. Em experimento realizado por Nascimento et al. (2003), os tamanhos dos ovários para vacas apresentando atividade ovariana luteal cíclica e vacas gestantes foram de 30,8 ± 0,7 (OD) e 30,2 ± 0,9 mm (OE); 33,0 ± 0,7 (OD) e 31,9 ± 0,8 mm (OE), respectivamente. Chacur et al. (2006) descreveram valores médios de 27,5; 19,5 e 16,5 mm (OD) e 28,0; 18,3 e 15,6 mm (OE) para comprimento, largura e espessura, respectivamente, quando avaliaram ovários de vacas zebus não gestantes, recuperados em matadouro. Danell (1987) detectou a presença de CL em 51,2% dos ovários esquerdos e 48,8% dos ovários direitos, revelando que a distribuição da ovulação é similar entre as gônadas. Entretanto, para vacas, ampla literatura descreve que a localização do CL é mais freqüente no ovário direito (HASLER et al., 1987; JAINUDEEN & HAFEZ, 1995; DEMCZUK et al., 1998; VIANA et al., 1999; SPELL et al., 2001; LEAL, 2004). Sabe-se que as búfalas apresentam menor número de folículos primordiais e maior taxa de atresia folicular do que as vacas (DANELL, 1987; LE VAN TY et al., 1989). Danell (1987) encontrou 12.636 e 10.132 folículos primordiais em novilhas bubalinas cíclicas e não cíclicas; número muito inferior ao previamente reportado para vacas (150.000) (ERICKSON, 1966). Os resultados de Carvalho (2005) evidenciaram um número médio de 15.449 folículos pré-antrais morfologicamente normais/ ovário em búfalas impúberes, adultas gestantes e não gestantes. Em revisão realizada por Vale & Ribeiro (2005), os autores descreveram 60 a 100 mil folículos primordiais para vacas (Bos taurus taurus) e apenas 12 a 20 mil folículos primordiais para búfalas. Porém existem na literatura registros de 235 mil (BETTERIDGE et al., 1989) e 720 mil (ERICKSON, 1986) folículos primordiais para vacas. Settergren (1964) constatou taxa de atresia de 50% nos folículos de vacas, inferior à encontrada por Danell (1987) (70,6%)..

(60) 29 Além do mais, os ovários bubalinos também contém menor número de folículos antrais do que ovários bovinos (46,3 vs. 90 folículos 1mm por par de ovários) (SETTERGREN, 1964; DANELL, 1987; KUMAR et al., 1997; PALTA & CHAUHAN, 1998; GUPTA et al., 2001).. 2.2. Ovogênese e Foliculogênese Na fêmea, a gametogênese é o resultado da associação de dois fenômenos que ocorrem no interior do ovário: a ovogênese e a foliculogênese (revisado por CARVALHO, 2005). A ovogênese é definida como o processo de formação, crescimento e maturação do gameta feminino, que tem início na vida fetal e culmina anos depois, pouco antes da ovulação, no animal adulto (WASSARMAN & ALBERTINI, 1994). As células germinativas primordiais, originárias no saco vitelínico, migram para a crista genital e proliferam-se por mitose. Completada a proliferação mitótica,. após. citoplasmáticas,. o as. crescimento células. celular. e. germinativas. redistribuição primordiais. das. organelas. passam. a. ser. denominadas ovogônias (BAKER, 1971). Nos bovinos, as ovogônias também se dividem repetidas vezes por mitose (HILSCHER et al., 1974) e, em torno de 72 a 82 dias de gestação, algumas já iniciaram a primeira prófase meiótica e, então, passam a ser designadas ovócitos primários (ERICKSON, 1966; HILSHER et al., 1974). O processo de formação dos gametas resulta da divisão de uma célula germinativa diplóide (2n) em células haplóides (n), ou seja, células que recebem apenas um cromossomo de cada par de homólogos e que apresentam, então, só a metade do número de cromossomos encontrada nas células somáticas da espécie. Para que ocorra a redução do número cromossômico é necessário que aconteça duas divisões celulares sucessivas, as quais são chamadas de meiose I e II, após uma única duplicação do DNA, que ocorre no período S anterior à primeira divisão meiótica (JORDÃO & ANDRADE, 2000)..

(61) 30 A prófase meiótica é caracterizada pela sua longa duração sendo dividida em: leptóteno, zigóteno, paquíteno e diplóteno (RÜSSE, 1983; JORDÃO & ANDRADE, 2000). Neste último estágio, também chamado de núcleo dictiado, os ovócitos permanecem em repouso até pouco antes da ovulação, quando se reinicia a meiose em resposta à estimulação hormonal (BUCCIONE et al., 1990). Esses ovócitos não possuem a habilidade de reassumir a meiose ou de serem fertilizados, permanecendo os seus núcleos em um estágio de imaturidade conhecido como vesícula germinativa (VG). (LANDIM-. ALVARENGA, 2006). Ainda nesta fase, os ovócitos primários são circundados pelas. células. foliculares,. formando. assim,. os. folículos. primordiais,. caracterizando, desta forma, o início da foliculogênese (RÜSSE, 1983). A foliculogênese é definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e finalizando-se. com. o. estágio. de. folículo. maduro. ou. pré-ovulatório. (SAUMANDE, 1981; PICTON, 2001). Em ruminantes, a foliculogênese tem início ainda durante a vida fetal (RÜSSE, 1983). Antes da formação do folículo, ocorre a colonização do ovário fetal por células mesonéfricas, que são fontes precursoras de células foliculares (PICTON, 2001). As células somáticas que acompanham a trajetória das células germinativas até a crista genital, circundam o gameta formando uma membrana basal deixando-o isolado. Tais células estão destinadas a tornaremse células da granulosa, da teca e do estroma ovariano (ERICKSON, 1986). A interação entre as células da granulosa e o gameta é de fundamental importância para o desenvolvimento do ovócito, sendo que as trocas metabólicas entre esses dois tipos celulares ocorrem por meio de zonas de aderência e complexos intercomunicantes (EPPIG& SHROEDER, 1989).. 2.3. Reinício da Meiose Os ovócitos devem crescer e sofrer várias mudanças ultra-estruturais e bioquímicas, tornando-se competentes para reiniciar e completar a maturação meiótica (DEKEL, 1996)..

(62) 31 O bloqueio da meiose é regulado em dois pontos: no estágio de diplóteno da primeira divisão meiótica, no qual os ovócitos se detêm por longos períodos de tempo, até o reinício do crescimento ovocitário, e no estágio de metáfase II, no qual permanecem até a fecundação (JORDÃO & ANDRADE, 2000). Na maioria dos vertebrados, o reinício da meiose é mediado pela interação entre receptores de membrana das células do cumulus e o LH (hormônio luteinizante). Esse sinal hormonal ativa o MPF (fator promotor de maturação) que induz a condensação cromossômica, ruptura do envoltório nuclear e formação do primeiro fuso meiótico (MURRAY, 1989; VERLHAC et al., 1994; JORDÃO & ANDRADE, 2000). O MPF é um complexo protéico dimérico, composto por duas subunidadeschave: a p34cdc2 e a ciclina. A p34cdc2 é a subunidade enzimática com atividade de proteína quinase, e a ciclina é uma proteína regulatória que controla a capacidade da cdc2 em fosforilar proteínas-alvo adequadas (VERLHAC et al., 1994; JORDÃO & ANDRADE, 2000; NURSE, 2000). Em mamíferos há evidências de que outros agentes, como as enzimas da família MAP quinase (proteína quinase mitógeno ativada) e fatores de crescimento também estão envolvidos nos eventos que ocorrem durante a maturação do ovócito e expansão das células do cumulus (NURSE, 1990; VERLHAC, et al., 1994; FISSORE et al., 1996). A maturação nuclear completa ocorre com a ativação do ovócito em estágio de VG, incluindo o rompimento da VG até a segunda parada meiótica em metáfase II (MII). Os ovócitos passam pelos estágios de diaquinese, metáfase I (MI), anáfase I (AI), telófase I (TI) e então rapidamente passam para MII. Como resultados dessas mudanças, os cromossomos homólogos se separam com a formação do primeiro corpúsculo polar. Esse corpúsculo polar contém uma pequena parte de citoplasma e a metade dos cromossomos homólogos. Logo após, os cromossomos do ovócito ingressam na segunda divisão da meiose formando-se a placa metafásica II. Neste momento, o ovócito é conhecido por ovócito secundário e pára novamente a divisão celular, permanecendo neste estágio (MII) até ser fertilizado pelo espermatozóide ou sofrer atresia (WASSARMAN, 1988; WU et al., 1997; LANDIM-ALVARENGA, 2006). O tempo requerido para a maturação nuclear varia dependendo da espécie. No bovino, a QVG (quebra da vesícula germinativa) ocorre de 8 a 12.

(63) 32 horas, a MI de 12 a 15 horas, a AI e a TI de 15 a 18 horas e a MII de 18 a 22 horas (SIRARD et al., 1989; WU et al., 1997). As. diversas. mudanças. que. ocorrem. no. citoplasma. durante. o. desenvolvimento e maturação dos ovócitos são essenciais para a capacidade de desenvolvimento, aquisição da competência meiótica, fertilização e desenvolvimento embrionário. Os ovócitos com maturação nuclear normal, em tempo regular, mas que possuem uma assincronia entre maturação citoplasmática e nuclear, não serão fecundados ou não irão redundar em um desenvolvimento embrionário (BEVERS et al., 1997; BLONDIN et al., 1997; HYTTEL et al., 1997).. 2.4. Folículos Ovarianos O folículo ovariano é considerado a unidade funcional da gônada feminina (ARIYARATNA & GUNAWARDANA, 1997). Além disso, é uma estrutura altamente organizada, constituída essencialmente pelo ovócito circundado por células foliculares e demarcado por uma membrana basal que os separa do estroma ovariano (LANDIM-ALVARENGA, 2006).. 2.4.1. Função dos Folículos Ovarianos O folículo ovariano apresenta duas funções principais: proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do ovócito e produzir hormônios esteróides, como o estrógeno e o estradiol e peptídeos, como inibina A e B, ativina e folistatina (GORDON, 1994a; LANDIM-ALVARENGA, 2006).. 2.4.2. Classificação dos Folículos Ovarianos De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser divididos em: folículos pré-antrais ou não cavitários (não possuem antro; primordiais, primários e secundários) e folículos antrais ou cavitários (possuem a cavidade antral no seu interior, repleta de líquido folicular; terciários e pré-ovulatórios) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2005)..

(64) 33 •. Folículos primordiais: são os primeiros folículos formados no ovário e encontram-se em estágio de quiescência. Consistem em um ovócito primário centralizado, circundado por uma única camada de células da granulosa de forma pavimentosa e demarcado por uma membrana basal (ERICKSON, 1986; EPPIG, 1991; HIRSHFIELD, 1991; FORTUNE, 1994; EPPIG & O’BRIEN, 1996; LANDIM-ALVARENGA, 2006);. •. Folículos primários: representam o primeiro estágio de crescimento folicular. Caracterizam-se pela presença de um ovócito centralizado, circundado por uma camada de células da granulosa de forma cúbica (HULSHOF et al., 1994; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Nesse tipo de folículo, as células da granulosa aumentam em número e tornam-se mais volumosas (VAN DEN HURK et al., 1997);. •. Folículos secundários: caracterizam-se pela presença de um ovócito centralizado, circundado por duas ou mais camadas de células da granulosa de forma cúbica (HULSHOF et al., 1994; LANDIMALVARENGA, 2006). Nos folículos secundários, em estágios mais avançados, as fibras de tecido conjuntivo se organizam paralelamente à membrana basal para formar a camada de células tecais (VAN DEN HURK et al., 1997), podendo então ser identificadas células tecais diferenciadas, bem como uma membrana hialinizada, denominada zona pelúcida (FIGUEIREDO, 1995);. •. Folículos terciários: consistem em um ovócito circundado pela zona pelúcida, corona radiata e células do cumulus. Possuem ainda células foliculares, uma pequena cavidade contendo líquido folicular (antro), uma membrana basal e duas camadas de células tecais (FIGUEIREDO, 1995; LANDIM-ALVARENGA, 2006);. •. Folículos pré-ovulatórios (cuja nomenclatura antiga era De Graaf): representam o estágio final de desenvolvimento folicular e apresentam um ovócito secundário e todos os componentes dos folículos terciários (revisado por LANDIM-ALVARENGA, 2006)..

(65) 34 2.4.3. Morfologia e Ultra-estrutura dos Folículos Ovarianos Os folículos primordiais têm cerca de 40 μm (vacas) e 35 μm (búfalas) e apresentam um ovócito (20 μm, na maioria das espécies) rodeado por uma camada de 4 a 8 células achatadas da granulosa. O ovócito pode apresentar um formato que varia de esférico a ovóide (HULSHOF et al., 1992; VAN WEZEL & RODGERS, 1996; FAIR et al., 1997a; PRIEDKALNS & LEISER, 1998; PICTON, 2001; MONDADORI et al., 2007). No ooplasma, visualizam-se numerosas. vesículas. com. distribuição. homogênea,. que. apresentam. membrana, mitocôndrias, associadas ou não aos retículos endoplasmáticos liso (REL) e rugoso (RER). Em pequeno número observam-se complexos de Golgi (CGo) e gotas lipídicas (FAIR et al., 1997a; HYTTEL et al., 1997). Os folículos primários apresentam diâmetro de 60 a 100 μm (vacas) e 25 a 80 μm (búfalas) e o ovócito é rodeado por uma camada completa de 11 a 20 células da granulosa de forma cubóide. O ovócito é geralmente esférico e apresenta abundância de mitocôndrias de forma alongada e em divisão e aumento nos números de REL e RER, refletindo o crescimento dos requerimentos de energia e de síntese de lipídios e proteínas pelo ovócito. Complexos de Golgi e polirribossomos também estão presentes (FAIR et al., 1997a; HYTTEL et al., 1997; KUMAR et al., 1997). Nos folículos primordial e primário, as comunicações entre as células da granulosa e o ovócito são mediadas por endocitose (HYTTEL et al., 1997). As principais modificações observadas durante a fase de desenvolvimento do ovócito são: formação das junções intercomunicantes entre o ovócito e as células somáticas circundantes; desenvolvimento e deslocamento do CGo, REL e das gotas lipídicas para a periferia do ovócito; formação dos grânulos corticais (GC) e zona pelúcida; diferenciação da mitocôndria; quebra dos centríolos e deposição ou síntese dos RNAm maternos para a produção de proteína. do. ovócito,. das. células. somáticas. e. mais. tarde. para. o. desenvolvimento (FAIR et al., 1996; HYTTEL et al., 1997). A progressão para o estágio de folículo secundário é marcada pelo surgimento de uma segunda camada de células da granulosa e pela deposição inicial de material da zona pelúcida em torno do ovócito de 50 a 60 μm de diâmetro (vacas) (DRIANCOURT, 1991; HYTTEL et al., 1997). Ao mesmo tempo, os grânulos corticais são formados no ooplasma (FAIR et al., 1997a). É.

(66) 35 neste ponto do desenvolvimento que o folículo parece tornar-se responsivo ao FSH (hormônio folículo estimulante) (FAIR, 2003). Quando duas a três camadas de células da granulosa são formadas, é possível a identificação de células tecais em torno da membrana basal (SCARAMUZZI et al., 1993). O estágio de folículo secundário é também associado aos primeiros sinais detectáveis de síntese de RNA (ácido ribonucléico) no ovócito (FAIR et al., 1997b). Um aspecto importante durante o crescimento do ovócito é seu alto grau de atividade transcricional. O acúmulo de RNAm (ácido ribonucléico mensageiro), ribossomos e polipeptídeos no ovócito, durante a fase de crescimento, é crucial para o desenvolvimento posterior. Os ovócitos bovinos que não estão completamente desenvolvidos no momento da fertilização in vitro falham em alcançar o estágio de blastocisto (FAIR & HYTTEL, 1997). Em búfalas, Kumar et al. (1997) relataram diâmetros médios de 20 a 30 μm (ovócito); 50 a 100 μm (folículo); 30 a 60 μm (ovócito) e 100 a 300 μm (folículo) para folículos secundários e terciários, respectivamente. A transição para o estágio de folículo terciário é caracterizada pela continuada proliferação e diferenciação das células foliculares em células da teca interna e externa, lâmina basal, células do cumulus e a formação de fluido na cavidade antral (DRIANCOURT, 1991). Em bovinos, o aparecimento do antro ocorre em folículos com 120 a 160 μm de diâmetro (MONNIAUX et al., 1993). No momento da formação da teca interna é possível detectar a expressão de RNAm para receptor de LH nas células tecais (XU et al., 1995). À medida que o folículo cresce e o antro é formado, as células da granulosa se separam em dois subtipos: células do cumulus que são íntima e metabolicamente ligadas ao ovócito e células murais, que formam a parede do folículo (GILCHRIST et al., 2004). Em folículos terciários mais desenvolvidos, as células da granulosa imediatamente ao redor do ovócito, tornam-se colunares e radialmente dispostas, formando a corona radiata (PRIEDKALNS & LEISER, 1998). As células da granulosa têm características estruturais de células. secretoras. de. proteínas,. notavelmente. um. extensivo. RER. (PRIEDKALNS & LEISER, 1998). As células do cumulus são altamente especializadas e têm projeções celulares que atravessam a zona pelúcida e formam pequenas junções com o.

(67) 36 citoplasma do ovócito (gap junctions) (RODRIGUEZ & FARIN, 2004). A comunicação entre as células do cumulus e o ovócito é bidirecional e, além das junções gap, é mediada por sinais parácrinos (GANDOLFI et al., 2005). As gap junctions são compostas por proteínas conhecidas como conexinas e se localizam entre as células da granulosa e entre estas e as superfícies de membrana do ovócito e das células da granulosa que o circundam. Essas junções intercomunicantes permitem a transferência direta para o ovócito de moléculas de baixo peso molecular, tais como: íons, metabólitos da glicose, nucleotídeos e aminoácidos necessários para o seu crescimento, assim como pequenas moléculas reguladoras como o AMPc (EPPIG, 1991; GANDOLFI et al., 2005). As moléculas maiores também são transferidas por essas junções, mas de forma indireta, ou seja, após se ligarem a seus receptores celulares (DODE, 2006). Após o pico de LH há uma evidente diminuição do fluxo de substâncias e ocorrem mudanças morfológicas nas gap junctions. A maturação do ovócito parece estar correlacionada negativamente com o número de gap junctions por células (LARSEN et al., 1986). Durante a maturação, o nucléolo se compacta, sugerindo a diminuição da atividade transcricional. Do mesmo modo, ocorrem mudanças na organização do citoplasma tais como: um contínuo desenvolvimento dos estoques de lipídios, redução do aparelho de Golgi, redistribuição de ribossomos, rearranjo das mitocôndrias e alinhamento dos GC próximo à membrana plasmática (HYTTEL et al., 1997). Antes da ovulação, as células da granulosa assumem características secretoras de esteróides e são encontrados, especialmente, RER e mitocôndrias com crista tubular (PRIEDKALNS & LEISER, 1998).. 2.5. O Corpo Lúteo (CL) Segundo Fields & Fields (1996) o CL é formado a partir da hiperplasia e diferenciação das células da granulosa e da teca do folículo ovulatório. É uma estrutura primariamente reconhecida pela habilidade em sintetizar e secretar progesterona (P4), hormônio que está intimamente relacionado com a manutenção de um ambiente adequado ao desenvolvimento embrionário e.

(68) 37 manutenção do próprio CL durante o período compreendido entre a ovulação e a implantação, quando ocorre o reconhecimento materno da gestação. A avaliação do CL fornece informações importantes sobre o estado reprodutivo da fêmea e possibilita a adequação de procedimentos de manipulação ou sincronização do ciclo estral (VIANA et al., 1999). O CL das búfalas está comumente inserido no estroma ovariano sendo geralmente menor do que na vaca, podendo atingir um peso máximo de 2,3 g e um diâmetro máximo de 15 mm (ROY & MULLICK, 1964). Figueiredo et al. (1997) encontraram diâmetro luteal máximo de 17,7 mm em animais da raça Nelore. Na mesma raça, Neves et al. (2002) reportaram em animais gestantes e não gestantes diâmetro luteal de 18,4 e 18,7 mm; 15,3 e 16,4 mm para ovários esquerdo e direito, respectivamente. De acordo com Ireland et al. (1980) existem quatro mudanças prontamente identificáveis na aparência do CL bovino após a ovulação. Segundo esses autores, os diâmetros dos CL nos estágios I, II, III e IV variaram de 5 a 15; 16 a 20; 16 a 20 e <10 mm, respectivamente.. 2.6. Características Reprodutivas da Fêmea Bubalina Os búfalos de água domésticos são classificados em búfalo de pântano e búfalo de rio, de acordo com o habitat e uso. O búfalo de rio (2n= 50) prefere água fresca sendo criado para produção de leite e carne. Já o búfalo de pântano (2n= 48) prefere água turva e barrenta e foi primariamente utilizado para tração e secundariamente para carne (GANGULI et al., 1998; HUFANADURAN et al., 2004; PRESICCE, 2007). Os búfalos são considerados animais sazonais, sendo que a eficiência reprodutiva é, geralmente, afetada pelo comprimento de luz do dia. Em vários países do mundo, a época em que os animais apresentam maior atividade reprodutiva é o outono, sendo que a concentração de partos ocorre de julho a dezembro, no hemisfério norte, e de janeiro a março, no hemisfério sul. Durante os meses quentes do ano, existe um aumento na incidência de cios silenciosos e ciclos estrais irregulares na fêmea, diminuição da libido e qualidade seminal nos machos. Esse comportamento não é observado nas.