ANÁLISES CLÍNICAS E GESTÃO DE LABORATÓRIO
Daniel Peixoto Pinto
ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE DOS TESTES DE LABORATÓRIO UTILIZADOS NO DIAGNÓSTICO DO VÍRUS LINFOTRÓFICO DE CÉLULAS
T HUMANAS
Governador Valadares 2011
Daniel Peixoto Pinto
ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE DOS TESTES DE LABORATÓRIO UTILIZADOS NO DIAGNÓSTICO DO VÍRUS LINFOTRÓFICO DE CÉLULAS
T HUMANAS
Trabalho de Conclusão de Curso do curso de Análises Clínicas e Gestão de Laboratório da Universidade Vale do Rio Doce – UNIVALE.
Orientador: Maria José Ferreira Morato
Governador Valadares 2011
SUMÁRIO RESUMO__________________________________________ IV ABSTRACT________________________________________ V 1. INTRODUÇÃO ___________________________________ 01 2. JUSTIFICATIVA __________________________________ 06 3. OBJETIVO GERAL _______________________________ 08 4. METODOLOGIA __________________________________ 09 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO_______________________10 6. CONCLUSÕES___________________________________ 19 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS___________________ 20 ANEXOS___________________________________________24
RESUMO
Em vista das dificuldades encontradas no diagnóstico de infecção por vírus linfotrópicos de células T humanas dos tipos 1 e 2 (HTLV-1 e HTLV-2), e a gravidade e possíveis conseqüências que as doenças supostamente causadas pelo vírus HTLV podem acarretar; tanto as doenças hematológicas quanto as neurológicas, foi proposto o presente estudo que objetivou avaliar os níveis de sensibilidade e especificidade dos testes laboratoriais de diagnóstico disponíveis para o HTLV-1 e 2, comparando e mostrando a necessidade e importância de cada um deles. Do total de 2.312 amostras de sangue, provenientes da rotina diagnóstica do Instituto Adolfo Lutz, dos anos de 1998 a 2006, foi empregado um algoritmo usando ensaios imuno – enzimáticos de primeira, segunda e terceira geração, fazendo uma relação com teste confirmatório de Western Blot. Nenhum kit de reagentes EIA, isoladamente, foi capaz de detectar todos os soros verdadeiramente positivos quanto à presença de anticorpos anti-HTLV-1 e 2. Os resultados obtidos confirmam a necessidade da utilização de dois kits de reagentes EIAs na triagem sorológica de infecção por HTLV-1 e 2 em laboratórios de diagnóstico. O estudo também cogitou a possibilidade de se utilizar a reação em cadeia da polimerase no diagnóstico diferencial de infecção por HTLV-1 de HTLV-2, que se apresentou como um teste rápido, seguro, de baixo custo e de fácil execução, podendo ser utilizado como teste confirmatório de infecção por HTLV-1 e HTLV-2.
Palavras-chave: HTLV-1; HTLV-2; HTLV e diagnósticos laboratoriais; ensaios imunoenzimáticos; Western blot; reação em cadeia da polimerase; sensibilidade e especificidade.
ABSTRACT
In view of the difficulties encountered in the diagnosis of infection with human T-lymphotropic type 1 and type 2 (HTLV-1 and HTLV-2), and the severity and possible consequences that the disease allegedly caused by HTLV viruses can cause, both the diseases hematological and neurological, it was proposed that the present study aimed to evaluate the levels of sensitivity and specificity of diagnostic laboratory testing available for HTLV-1 and 2, comparing and showing the need and importance of each. Of the total 2.312 blood samples from the routine diagnosis of the Institute Adolfo Lutz, the years 1998 to 2006, he was employed an algorithm using immunoassay - enzyme first, second and third generation, making a relationship with the Western blot confirmatory test . No EIA reagent kit alone was able to detect all true positive sera for the presence of anti-HTLV-1 and 2. The results confirm the necessity of using two EIA kits of reagents in serological screening of HTLV-1 and 2 in diagnostic laboratories. The study also raised the possibility of using the polymerase chain reaction in the differential diagnosis of HTLV-1 HTLV-2, which is presented as a quick test, safe, inexpensive and easy to perform and can be used as a confirmatory test for HTLV-1 and HTLV-2.
Keywords: HTLV-1, HTLV-2, HTLV and laboratory diagnosis, enzyme immunoassays, Western blot, polymerase chain reaction, sensitivity and specificity.
1 INTRODUÇÃO
O vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-1) foi inicialmente descrito em 1980 (POIESZ B. J. et al). Trata-se de um retrovírus associado tanto a doença hematológica, como também à manifestação clínica de doença neurológica, descrita como paraparesia espástica tropical (GESSAIN A et al, 1994).
O HTLV pertence à família Retroviridae e tem um genoma de RNA de fita simples com uma estrutura genética similar à dos demais retrovírus (HALL, W.W. et al, 1994). Como os demais retrovírus, seu ciclo de vida é dependente da enzima transcriptase reversa. Inicialmente a partícula viral necessita se ligar à superfície celular. Essa inserção ocorre entre as glicoproteínas do envelope viral e receptores específicos da superfície celular, ainda desconhecidos. Após essa interação, o vírus torna-se capaz de penetrar na célula, liberando todo o seu conteúdo no citoplasma. Neste, a fita simples de RNA viral é transcrita à DNA de fita dupla pela transcriptase reversa. A dupla fita de DNA linear migra para o núcleo e integra-se no genoma do hospedeiro pela ação de uma integrase viral (SEIKI M et al. 1984). Uma vez integrado, o provírus utiliza a maquinaria celular para a transcrição primária do RNA genômico. Parte do RNA viral sintetizado é processada para gerar o RNAm que será traduzido nas proteínas virais apropriadas no citoplasma. Como último passo, o core viral é montado e o vírus é liberado da superfície celular por um processo mais ou menos simultâneo (CANN A J e CHEN, I S Y, 1979).
Usa-se o termo “retro” porque o RNA genômico é transcrito em DNA pela transcriptase reversa. Há dois grupos clinicamente importantes: o grupo do oncovírus, ao qual pertencem os vírus do sarcoma e das leucemias, por exemplo, vírus da leucemia de células T humanas (HTLV) e o grupo dos lentivírus, o qual inclui o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e certos patógenos animais. (LEVINSON W e JAWETZ E, 2005).
Os HTLVs são vírus de forma esférica a pleomórfica (vírions) com 80-100 nanômetros de diâmetro, constituídos por um envelope glicoprotéico, um nucleocapsídeo e um nucleóide, morfologicamente semelhantes aos demais retrovírus. O envelope é formado por uma glicoproteína de superfície
extracelular e uma glicoproteína transmembrânica. Junto à membrana do envelope está a matriz composta pela proteína Gag. O capsídeo possui simetria icosaédrica e contém proteínas codificadas pelo gene gag constituindo o cerne viral. O nucleóide é composto por duas cópias de ácido ribonucleico (RNA) de fita simples e pela enzima denominada transcriptase reversa, responsável pela transcrição do genoma viral de RNA para cDNA (provírus) (FRANCHINI, 1995).
A replicação viral do HTLV inicia quando ocorre a interação das glicoproteínas virais ao receptor presente na superfície da célula alvo. A penetração do nucleocapsídeo pode ocorrer por meio de dois mecanismos: fusão do envelope viral à membrana da célula hospedeira ou por endocitose mediada por receptores. A entrada do vírus na célula alvo é mediada pelas glicoproteínas do envelope gp46 que se liga ao receptor celular e pela gp21 que funde o envelope viral com a membrana da célula alvo. Após a adsorção ocorre a penetração do core viral no citoplasma da célula, com posterior liberação do RNA viral (LEVINSON W e JAWETZ E, 2005).
O HTLV apresenta uma forma pouco usual de replicação quando, após a penetração na célula, libera o RNA viral, que é transcrito em DNA complementar de dupla fita pela ação da enzima transcriptase reversa; este DNA penetra no núcleo onde se integra ao DNA celular, formando o DNA proviral (LEVINSON W e JAWETZ E, 2005).
A transcriptase reversa (TR) inicia sua função a partir da molécula de tRNA na extremidade 5’, que corresponderá aos fragmentos R e U5. Depois a TR juntamente com os fragmentos transcritos R e U5, passam para a extremidade 3’ para continuar a formação da fita simples de DNA. A seqüência R é responsável pela transferência do DNA nascente de uma extremidade a outra. O RNA viral que serviu de molde é degradado pela RNAse H. Após a remoção ocorre o início da síntese da fita complementar de DNA na região U3, dando origem ao DNA de fita dupla. Na síntese do DNA, em cada extremidade do genoma são originadas seqüências duplicadas conhecidas como LTR compostas das regiões U3, R e U5. Após a migração do DNA viral para o núcleo por ação da Rex, ocorre a integração do mesmo com o genoma celular pela ação da enzima integrase. Uma vez integrado no DNA celular, o provírus
se torna estável e inicia a transcrição em RNA utilizando o sistema celular. A RNA polimerase II é responsável pela transcrição do genoma viral e de todos os mRNA necessários para a síntese de proteínas. No entanto, para que ocorra o início da transcrição é necessário que a seqüência LTR seja ativada e forneça sinais ao sistema de transcrição celular para que o provírus seja expresso de forma eficiente (LEVINSON W e JAWETZ E, 2005).
Na transcrição do DNA proviral em RNA, três espécies de mRNA são formados: um mRNA genômico sem evento de processamento do tipo splicing (unspliced), que codifica as proteínas precursora de gag e de pol, um mRNA subgenômico (4,3Kb) com um evento de processamento do tipo splicing, que codifica a proteína precursora que dará origem às proteínas do envelope, e um mRNA (2,1 Kb) com duplo evento de processamento do tipo splicing, que codifica as proteínas regulatórias Tax e Rex.Após a síntese de proteínas virais no citoplasma ocorre a última fase do ciclo replicativo, que são a montagem e o brotamento das novas partículas virais. Esse último evento é resultante da interação entre a proteína da matriz com a membrana celular, processo pelo qual o vírus adquire o envelope (LEVINSON W e JAWETZ E, 2005).
O HTLV-1 e o HTLV-2 diferenciam-se principalmente no gene pX, sendo, no entanto, semelhantes em cerca de 60% do genoma. Com propriedades biológicas semelhantes, agem infectando os linfócitos dos humanos, sendo que o tipo 1 tem tropismo preferencial por linfócitos T CD4+, enquanto o tipo 2 por linfócitos T CD8+. Ambos têm a capacidade de se integrar ao genoma da célula hospedeira e nesta forma recebem a denominação de provírus (FRANCHINI, 1995).
Alguns estudos mostram que indivíduos co-infectados por HIV/HTLV-2 parecem “protegidos” ou se tornam progressores lentos da Síndrome da Imunodefência Adquirida (AIDS), talvez pela produção de quimiocinas que se ligam aos co-receptores do HIV, impedindo sua penetração na célula hospedeira. Diferentemente do que ocorre na co-infecção HIV/HTLV-2, o HTLV-1 promove aumento no número de células CD4+ e na replicação do HIV, com progressão mais rápida para AIDS (SCHECHTER et al., 1994).
O HTLV pode ser transmitido por meio do contato sexual, transfusão de sangue, da amamentação, ou pelo uso compartilhado de agulhas entre
usuários de drogas intravenosas. A transmissão sexual é mais freqüente do homem para a mulher do que da mulher para o homem. Estima-se que a eficiência de transmissão do homem para mulher num período de 10 anos é de 61%, enquanto que, no mesmo período, da mulher para o homem seja de apenas 0,3%. O risco de transmissão do HTLV pela transfusão de sangue e de hemoderivados teoricamente não existe no Brasil, pois, desde 19 de novembro de 1993, o Ministério da Saúde tornou obrigatória a seleção sorológica para o HTLV-1 e 2 de todos os doadores nos bancos de sangue do país. A transmissão da mãe para filho (transmissão vertical) ocorre principalmente pela amamentação. Estudos mostram que a freqüência de transmissão do vírus pela amamentação varia de 15% a 77% e o risco de transmissão é diretamente relacionado ao tempo de amamentação (POMBO DE OLIVEIRA MS, HAMERSCHLACK N, HIATTONE CS, FERREIRA JR OCF).
O HTLV-1 é o agente etiológico da leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) e da doença neurológica degenerativa denominada paraparesia espástica tropical (TSP), mielopatia associada ao HTLV (HAM) (LEVINSON W e JAWETZ E, 2005).
No Brasil e no mundo, vários estudos associam o HTLV-1 a ATL e TSP/HAM e a outras síndromes neurológicas, artrites, uveítes, doenças dermatológicas e urinárias, manifestações oculares, pneumonias e a outras desordens pulmonares (BITTENCOURT et al., 2006; CARVALHO et al., 2006).
O diagnóstico da infecção pelo vírus HTLV-1 é feito em três etapas: triagem, métodos suplementares e métodos confirmatórios. Como triagem para a infecção são utilizados os testes sorológicos, que testam a presença de anticorpos contra o vírus (ELISA ou aglutinação). Métodos suplementares podem-se utilizar um teste sorológico, como Western blot ou imunofluorescência. Como confirmatório o radioimunoensaio ou a técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR), que detecta diretamente o material genético viral (LEVINSON W e JAWETZ E, 2005).
A leucemia/linfoma de células T do adulto é diagnosticada pelo achado de células T malignas nas lesões. O diagnóstico da mielopatia associada ao HTLV (HAM) é confirmado pela presença necessariamente de anticorpos HTLV no líquido cefalorraquidiano ou pelo achado de ácidos nucléicos de HTLV em
2 JUSTIFICATIVA
A importância de se adotar medidas para o melhor e mais precoce diagnóstico é devido à gravidade e possíveis conseqüências que as doenças supostamente causadas pelo vírus HTLV podem acarretar; tanto as doenças hematológicas quanto as neurológicas. Com o diagnóstico mais preciso e mais rápido, pode-se evitar complicações das mesmas ou até mesmo prevenir novas manifestações de outras origens (SATOU e MATSUOKA, 2010).
Os mecanismos de patogênese do HTLV-1 ainda não estão totalmente definidos, porém vários estudos apontam para maior influência de fatores genéticos do hospedeiro na evolução da infecção do que para fatores virais, uma vez que a variabilidade genética dos HTLV-1 é baixa (SATOU e MATSUOKA, 2010).
De acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS), a paraparesia espástica tropical /mielopatia associada ao vírus HTLV-1 (PET/MAH) é causada por este retro vírus, da subfamília Oncovirinae, denominado protovírus T-linfotrópico humano. É caracterizada clinicamente por paraparesia espástica com sinais piramidais, evolução lenta e progressiva, comprometimento da função esfincteriana e distúrbios sensitivos, além de sorologia positiva para o vírus HTLV-1 (CORAL L, QUEIROZ L, GRZESIUK A, 1998). A mielopatia leva a um processo inflamatório de desmielinização, crônico e progressivo, em níveis baixos da medula (torácia baixa, lombar e sacra), causado pela infiltração parenquimatosa de células CD4 (linfócito helper modificado). A inflamação envolve medula espinhal, provocando comprometimentos motores (fraqueza e espasticidade em membros inferiores); sensitivos (parestesias e dores neuropáticas), distúrbios esfincterianos vesicais e intestinais, além de disfunção erétil no homem (RIBAS J e MELO G, 2002).
A leucemia-linfoma de células T do adulto (LLcTA) é uma neoplasia de linfócitos T maduros, relacionada à infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas do tipo I (HTLV-1). As formas clínicas do LLcTA caracterizam-se em quatro subtipos: leucêmico agudo, linfoma, crônico e smoldering (forma oligo-sintomática). Além destes subtipos bem definidos por critérios clínicolaboratoriais, existe um estado limítrofe entre indivíduos assintomáticos e
LLcTA, que é denominado como fase pré- LLcTA. Nesta fase assintomática existe a presença de linfócitos atípicos circulantes que podem desaparecer espontaneamente e a doença é definida pela monoclonalidade da inserção proviral do HTLV-1 no linfócito T CD4+ (SHIMOYAMA M, 1991).
Nas formas clínicas mais agressivas do LLcTA (agudo e linfoma), o paciente apresenta-se com performance status (PS) comprometido, apresenta a síndrome tumoral caracterizada por linfoadenomegalias, lesões viscerais múltiplas (hepatoesplenomegalia e infiltração pulmonar), lesões de pele e lesões ósseas. Hipercalcemia causada pelo aumento da reabsorção óssea pelos osteoclastos pode ocorrer em 50% dos casos. Os pacientes com LLcTA são geralmente imunodeficientes, têm predisposição constante às infecções oportunísticas, sejam elas bacterianas, fúngicas, parasitárias ou virais (MANNS A, HISADA M, DA GRENADE L, 1999).
Ao contrário do HTLV-1, o HTLV-2 não está associado a um tipo particular de doença, embora existam relatos de manifestações neurológicas semelhantes à TSP/HAM (ORLAND et al., 2003; POSADA-VERGARA et al., 2006), de predisposição a infecções bacterianas e manifestações dermatológicas em portadores assintomáticos usuários de drogas injetáveis (UDI) (MURPHY, 1996) e de associação com o aumento de mortalidade por câncer (BISWAS et al., 2010).
Quanto à infecção por HTLV-2, poucos estudos apontam para potencial patogênico deste vírus, no entanto, alguns relatos de manifestações neurológicas foram atribuídos à infecção por HTLV-2 (ORLAND et al., 2003; POSADA-VERGARA et al., 2006).
Ainda, vários casos de doenças linfoproliferativas e desordens neurológicas em co-infectados por HIV/HTLV-2 foram relatados, principalmente em UDI (POSADA-VERGARA et al., 2006).
Recentemente, dois novos tipos de HTLV, denominados HTLV-3 e HTLV-4 foram identificados em populações do sul de Camarões, na África Central, mas sem associação com doenças em humanos (CALATTINI et al., 2005; MAHIEUX E GESSAIN, 2009).
3 OBJETIVO GERAL
Descrever os níveis de sensibilidade e especificidade dos testes laboratoriais de diagnóstico disponíveis para o HTLV 1 e 2, fazendo uma comparação e mostrando a necessidade e importância de cada um deles.
4 METODOLOGIA
Foi realizada uma revisão bibliográfica, baseada na contextualização do tema: Especificidade e sensibilidade dos testes de laboratório utilizados no diagnóstico do vírus linfotrófico de células T humanas.
Banco de dados: SciELO; LILACS; SeCS; LIS; BIREME; Cochrane BVS; Livros de microbiologia e imunologia;
Palavras-chave: HTLV-1; HTLV-2; HTLV e diagnósticos laboratoriais; ensaios imunoenzimáticos; Western blot; reação em cadeia da polimerase; sensibilidade e especificidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O primeiro teste laboratorial descrito para detecção de anticorpos anti – HTLV-1 foi o ensaio imuno – enzimático (EIA), cujo kit foi licenciado pelo Food and Drug Administration (FDA), em 1988 (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
Por causa da baixa sensibilidade e especificidade para detectar infecção por HTLV, os EIAs passaram por várias modificações em sua composição antigênica e formato (CATERINO-DE-ARAUJO, 2009).
A metodologia utilizada para detecção de anti-HTLV pode ser agrupada em três categorais: a) para triagem, o enzimaimunoensaio (EIA) ou (ELISA), que utiliza como antígeno o lisado viral, frações recombinantes ou peptídeos sintéticos: b) métodos suplementares tipo Western Blot (WB), e c) métodos confirmatórios como a Reação em Cadeia Polimerase (PCR) (INOUYE, REICHE, MORIMOTO, MORIMOTO, BORTOLIERO e CARVALHO, 2000).
O ELISA tem sido o método mais utilizado para detecção de anticorpos anti-HTLV-1, cujas principais características são a alta sensibilidade associada à baixa especificidade e reatividade cruzada entre os tipos 1 e 2 do HTLV (60 a 80%). Essas características contribuem para um grande número de falso-positivos, tornando-se difícil o diagnóstico e aconselhamento do paciente e, em casos de triagem sorológica de doadores levando as perdas desnecessárias de bolsas de sangue. Poucos bancos de sangue realizam testes sorológicos específicos para HTLV 1 e 2 isoladamente, fazendo-se necessário o desenvolvimento de testes simples e rápidos utilizando fragmentos recombinantes ou peptídeos sintéticos para diferenciar as duas viroses, permitindo posteriores estudos da história natural da infecção pelos vírus HTLV 1 e 2 em indivíduos soro positivos (INOUYE, REICHE, MORIMOTO, MORIMOTO, BORTOLIERO e CARVALHO, 2000).
Os EIAs detectam anticorpos no soro, produzidos em resposta aos antígenos virais codificados por genes estruturais e reguladores dos HTLVs (COSTA, 2010).
Os primeiros testes imuno - enzimáticos usados para pesquisa do HTLV foram os de primeira geração, que empregavam como antígeno lisado viral total do HTLV-1, e foram utilizados na triagem sorológica em soro ou plasma nos Estados Unidos e na Europa. A semelhança entre os genomas do HTLV-1 e do HTLV-2 (60% de similaridade) permitiu a utilização de EIA com lisado viral do HTLV-1 na triagem sorológica de HTLV-2. No entanto, a sensibilidade não era boa e o diagnóstico diferencial tornou-se importante, visto que o HTLV-2 é reconhecidamente menos patogênico do que o HTLV-1. Pelas características expostas, os testes de primeira geração foram denominados EIA para HTLV-1 e 2 e, posteriormente, acrescidos de lisado viral total de HTLV-2 (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
Fato relevante que deve ser lembrado diz respeito à sensibilidade e especificidade dos ensaios disponíveis no comércio, que dependem da composição antigênica e da configuração do teste.
Os EIAs de segunda geração sofreram algumas modificações. Uma delas foi a adição de uma proteína recombinante do envelope viral, a gp21 (rgp21) ao lisado viral de HTLV-1 e/ou HTLV-2 (CATERINO-DE-ARAUJO, 2009).
Houve assim uma melhora significativa na detecção da infecção por HTLV-2, ficando acima dos 90% a sensibilidade do ensaio de segunda geração (CATERINO-DE-ARAUJO, 2009).
Estima-se que a sensibilidade dos kits de reagentes disponíveis no mercado para a pesquisa de anticorpos anti-HTLV-1 seja de 97,3% a 100,0%, e a especificidade, na ordem de 99,3% a 99,9% (índices calculados em amostra de 5 mil doadores de sangue dos Estados Unidos, provenientes de áreas não endêmicas para essa infecção viral (CATERINO-DE-ARAUJO, 2009)).
Recentemente, kits de terceira geração foram desenvolvidos, uma vez que a fase sólida e o conjugado são constituídos por proteínas recombinantes e/ou peptídeos sintéticos, sozinhos ou em combinação, usando o princípio do “sanduíche”. Estes são altamente sensíveis e específicos, quando comparados
aos que empregavam apenas lisado viral dos HTLVs. Acrescentando estes antígenos específicos ao teste, resultou em significativa melhora da sensibilidade para a detecção de anticorpos dirigidos, principalmente ao HTLV-2. Se por um lado, os testes de última geração apresentem uma alta especificidade, próxima de 100%, quando empregados em populações de baixa prevalência de infecção por HTLV, tal como doadores de sangue, mostram valores preditivo positivo muito baixos. Mesmo as amostras com resultados repetidamente reagentes ainda requerem confirmação, quanto à presença de anticorpos específicos (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
Após a triagem sorológica, as amostras reagentes nos EIAs podem ser confirmadas por diversos ensaios sorológicos como o Western blot (WB) e a Reação em Cadeia Polimerase (PCR) (AVELAR-SILVA-COSTA, 2010).
Há necessidade de se verificar qual o melhor teste confirmatório para ser usado no diagnóstico, embora nenhum desses testes seja reconhecido pelo FDA. Isto porque o diagnóstico discriminatório do HTLV-1 e HTLV-2 é de suma importância para o aconselhamento, e para direcionar a conduta clínica e terapêutica do paciente, em países onde o HTLV 1 e 2 são endêmicos, e onde os isolados virais podem divergir dos isolados empregados na composição dos kits, utilizados na detecção de anticorpos específicos (CATERINO-DE-ARAUJO, 2009).
Desde dezembro de 1998, o Instituto Adolfo Lutz (IAL) – órgão da Coordenadoria de Controle de Doença da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo (IAL/CCD/SES-SP) vem realizando a sorologia para HTLV-1 e 2 através da pesquisa de anticorpos específicos em amostras de soro, provenientes de pacientes da rede pública de saúde. Pela experiência adquirida e os problemas enfrentados, o IAL relata quais kits de reagentes se mostraram mais eficientes para serem usados em população de risco de São Paulo, e recomenda seu algoritmo de triagem sorológica para a rede de laboratórios de saúde pública do País (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
O IAL analisou 2312 amostras de soro quanto à presença de anticorpos dirigidos ao HTLV-1 e 2. Desse total, 1393 eram provenientes de Centros de Referência e Treinamento em AIDS de São Paulo e 919 soros de ambulatórios de especialidades do SUS. Isso no período de dezembro de 1998 a março de 2006, pela Seção de Imunologia do IAL Central. O algoritmo adotado pelo IAL para sorologia de HTLV-1 e 2 foi a realização de dois EIAs de diferentes formatos e composição antigênica na triagem, como mostra a Figura 1. Todos os soros com resultados reagentes em pelo menos um EIA foram, posteriormente, submetidos à pesquisa de anticorpos específicos pelo teste confirmatório de WB, cuja realização e interpretação seguiram os critérios estabelecidos pelo fabricante (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
Figura 1. Algoritmo empregado pelo IAL para a detecção de anticorpos anti-HTLV-1 e 2.
Daquelas 2.312 amostras de soro, 1.857 (80,32%) foram testadas por dois EIAs e 455 (19,58%), por um. Soros considerados reagentes, em pelo menos um EIA, foram submetidos ao WB. Quatrocentos e sessenta e uma amostras foram testadas pelo WB: 74 das 455 analisadas por um EIA, e 367 das 1.857 testadas por dois. Durante todo o período de pesquisa, foram
empregados sete diferentes kits de reagentes EIA (Anexo 1) e um teste confirmatório de WB, como mostra a Tabela 1 (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
Tabela 1. Sensibilidade, especificidade e eficiências relativas dos kits de ensaio imunoenzimático (EIA) para detecção de anticorpos específicos para HTLV 1 e 2 em relação ao WB 2.4, em população encaminhada ao Instituto Adolfo Lutz para análise.
EIAs Sensibilidade (%) Especificidade (%) Eficiência (%)
1ª geração (n=1071) V* (n=194) 71.4 100 78.9 HB (n=182) 80.9 33.3 70.4 P (n=695) 98.4 44.4 82.4 2ª geração (n=925) V** (n=660) 95.8 70 90.2 HE (n=265) 90.9 83.3 86.9 3ª geração (n=2173) O (n=454) 94.4 46.7 80.4 M (n=1719) 98.2 42.6 83.7
Legendas: n = total de amostras de soro analisadas por cada kit. Fonte: JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007.
Para os cálculos de sensibilidade, especificidade e eficiência relativas dos kits de reagentes EIA foram utilizados os resultados de WB positivo e negativo como padrão-ouro. A Tabela 1 mostra o número de amostras analisadas por cada kit diagnóstico, e os resultados de sensibilidade, especificidade e eficiência dos mesmos em relação ao WB 2.4. Os testes de segunda geração tiveram o melhor desempenho entre os kits, que continham como antígeno
lisado viral total de HTLV-1 e HTLV-2, associado à proteína recombinante rgp21. Já, a Tabela 2 mostra que 19 (11,45%) das 166 amostras de soro que resultaram discordantes nos EIAs eram verdadeiramente positivas para a presença de anticorpos anti-HTLV-1 e 2, de acordo com a reatividade observada no WB. Os resultados obtidos definem os kits de reagentes EIAs que utilizam proteínas recombinantes/peptídeos sintéticos (terceira geração) como mais sensíveis do que os demais (coluna 1). Por outro lado, os kits que empregam lisado viral total de HTLV-1 e HTLV-2, somado ao antígeno recombinante (segunda geração), mostraram-se mais específicos (coluna 3) (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
Tabela 2. Número e porcentagem de soros que resultaram reagentes na triagem sorológica para pesquisa de anticorpos anti-HTLV-1 e 2 usando dois kits de reagentes EIA de primeira, segunda ou terceira geração, de acordo com os resultados obtidos no WB 2.4. Análise comparativa entre os kits EIA, cujos resultados se mostraram discordantes.
EIA (resultados) WB 2.4
(n=367) Positivo Indeterminado Negativo Total
nº % nº % nº % nº % Discordantes 19 11.45 93 56.02 54 32.53 166 100.0 1ª (-) vs 3ª (+) 9 18.00 24 48.00 17 34.00 50 100.0 1ª (+) vs 3ª (-) 3 5.45 35 63.65 17 30.91 55 100.0 2ª (-) vs 3ª (+) 5 15.15 13 39.39 15 45.45 33 100.0 2ª (+) vs 3ª (-) 2 7.14 21 75.00 5 17.86 28 100.0 Concordantes (+) 153 76.12 44 21.89 4 1.99 201 100.0 Legendas: Western Blot: WB HTLV 2.4, Genelabs Diagnostics.
Atualmente, o país com maior número absoluto de indivíduos infectados pelos vírus HTLV-1 e 2 é o Brasil, apresentando cerca de 2,5 milhões de portadores. A considerável prevalência de infecção pelo HTLV-1 e 2, aliada às dificuldades encontradas em seu diagnóstico, torna necessária a adoção de medidas que venham a melhorar esse. A análise deste trabalho do IAL mostrou que 19 soros com resultados discordantes nos kits de reagentes EIA resultaram positivos no teste confirmatório de WB. Os resultados obtidos permitem verificar diferenças no desempenho dos kits EIAs, empregados na triagem sorológica para HTLV-1 e 2, tal como apontar os kits de terceira geração como mais sensíveis em relação aos demais, devido ao menor número de resultados falso negativos (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
Já, os kits de reagentes de segunda geração que continham em sua composição lisado viral purificado de HTLV-1 e HTLV-2 e proteína recombinante rgp21, mostraram menor porcentagem de casos falso-positivos, ou seja, maior especificidade relativa. Independentemente dos resultados de desempenho encontrados nos kits EIA que fizeram parte deste estudo, uma maior importância deve ser destinada ao fato de que nenhum kit de reagentes mostrou 100% de sensibilidade e/ou especificidade relativas (JACOB, SANTOS-FORTUNA e CATERINO-DE-ARAUJO, 2007).
O algoritmo adotado pelo Instituto Adolfo Lutz difere do recomendado pelo Ministério da Saúde, pois usa dois testes EIA de composição antigênica e formatos diferentes na triagem sorológica, ao invés de um único EIA. Isto porque nenhum EIA disponível no comércio (1ª, 2ª ou 3ª geração) foi capaz de detectar todos os casos verdadeiramente soropositivos (WB) para a infecção por HTLVs, em casuística encaminhada a esta Instituição.
Apesar da melhora na composição dos kits EIA que tem aumentado sua sensibilidade e especificidade, um grande número de soros com padrão indeterminado no teste confirmatório de WB continua sendo observado. No IAL, cerca de 35% dos soros de população de risco de São Paulo apresenta perfil indeterminado à análise pelo WB. Em conseqüência, uma avaliação mais
detalhada dos resultados obtidos com os kits EIAs de 1ª, 2ª e 3ª gerações deve ser realizada (CATERINO-DE-ARAUJO, 2009).
Vem-se cogitando a possibilidade de se utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) em células mononucleares do sangue periférico no diagnóstico diferencial de infecção por HTLV-1 de HTLV-2.
Em vista do alto custo do teste de WB e do elevado número de soros com padrão inconclusivo, nos últimos anos foram propostas e utilizadas as PCRs como teste confirmatório e discriminatório de infecção por HTLV-1 e HTLV-2. Porém, essas PCRs carecem de padronização quanto ao trecho do segmento proviral pesquisado, par de primers e sondas empregadas, além de não existirem estudos multicêntricos. Estas variáveis dificultam a comparação dos resultados obtidos (AVELAR-SILVA-COSTA, 2010).
No Brasil, a PCR foi implantada e vem sendo usada para o diagnóstico e monitoramento da carga proviral de HTLV-1 e HTLV-2 em portadores assintomáticos. O limite de detecção destas PCRs tomou como base a maior diluição de DNA que resultou em PCR positiva, não o número de cópias provirais por célula (AVELAR-SILVA-COSTA, 2010).
Há um limite de detecção das PCRs para HTLV-1 semelhante, portanto, qualquer uma dessas PCRs pode ser usada na identificação de HTLV-1 com a mesma sensibilidade. Já, para o HTLV-2, as PCRs foram mais sensíveis. Com isto, passou-se a utilizar como controle positivo para HTLV-2 na PCR, DNA de amostra clínica bem caracterizada (AVELAR-SILVA-COSTA, 2010).
Depois da otimização das PCRs, foram utilizadas como teste confirmatório amostras clínicas encaminhadas ao IAL para análise. O ensaio de WB foi mais sensível em relação aos moleculares. No entanto, as PCRs foram mais específicas e capazes de elucidar casos cujos soros resultaram HTLV não tipado ou indeterminado pela análise de WB. Vários fatores podem interferir nos resultados obtidos, como tipo de casuística encaminhada ao IAL e quantidade e qualidade do material biológico (AVELAR-SILVA-COSTA, 2010).
Usando o WB como padrão ouro, as PCRs para HTLV-1 são mais sensíveis do que as PCRs para HTLV-2. Isto pode ser explicado pela menor carga proviral identificada nas infecções por HTLV-2, o que pode de certa
forma estar relacionado com menor potencial oncogênico deste vírus em relação ao HTLV-1. Em oposição à casuística atual, baixos percentuais de resultado falso negativo na PCR foram detectados em população de banco de sangue e em população sob aconselhamento clínico de infecção por HTLV. Em relação ao WB, os resultados indeterminados podem ter ocorrido devido a período de soroconversão em que se encontravam os pacientes e/ou a possíveis reações cruzadas em casos de co-infecção com outros vírus e/ou parasitas (AVELAR-SILVA-COSTA, 2010).
6 CONCLUSÕES
É necessário estar atento à sensibilidade e especificidade dos métodos utilizados para o diagnóstico do HTLV para poder obter uma interpretação correta dos resultados da triagem, sendo necessário e obrigatório a realização dos testes mais específicos como, por exemplo, o WB e PCR para confirmação diagnóstica
Há necessidade de utilização de algoritmo com dois kits EIA para a triagem de infecção por HTLV-1 e 2.
Qualquer que fosse o kit EIA escolhido na triagem, 1ª, 2ª ou 3ª geração, ele sozinho não será capaz de detectar todos os casos verdadeiramente positivos para a infecção por HTLV-1 e 2.
Os kits de 2ª geração de EIA se mostraram mais específicos e eficientes para o diagnóstico de infecção por HTLV-1 e 2 do que os de 3ª geração, embora estes tenham se mostrado mais sensíveis.
O ensaio confirmatório de WB necessita ser empregado como complementar à PCR.
A PCR se apresentou como um teste rápido, seguro, de baixo custo e de fácil execução, podendo ser utilizado como teste confirmatório de infecção por HTLV-1 e HTLV-2.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Avelar-Silva-Costa E. Introdução da reação em cadeia da polimerase em tempo real no algoritmo de testes laboratoriais para o diagnóstico de infecção por HTLV-1 e HTLV-2. São Paulo. 2010).
Biswas HH, Kaidarova ZMA, Garratty G, Gibble JW, Newman BH, Smith JW et al. Increased all-cause and cancer mortality in HTLV-2 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 2010; 54(3): 290-6.
Bittencourt AL, Primo J, Oliveira MFP. Manifestations of the human T-cell lymphotropic virus type I infection in childhood and adolescence. J Pediatr. 2006; 82(6): 411-20.
Cann, A. J.; Chen, I. S. Y. Human T-cell leukemia virus type 1 and 2. In: FIELDS, B. N. et al. (eds). Fields Virology. 3rd edition. Philadelphia: Raven Publishers, 1996, v. 2, p. 1879.
Carneiro-Proietti ABF, Ribas JGR, Catalan-Soares BC, Martins ML, Brito-Melo GEA, Martins-Filho OA, et al. Infecção e doença pelos vírus linfotrópicos humanos de células T (HTLV-1 e 2) no Brasil. Rev Soc Bras Med Trop. 2002;35(5):499-508.
Carvalho MMN, Novaes AE, Marcelino de Carvalho E, Araújo MI. Doenças reumáticas auto-imunes em indivíduos infectados pelo HTLV-1. Rev Bras Reumatol. 2006; 46(5): 334-9.
Caterino-de-Araujo A. Diagnóstico de infecção por vírus linfotrópicos de células T humanas dos tipos 1 (HTLV-1) e -2 (HTLV-2) em população de risco: passado, presente e futuro. Rev. Inst. Adolfo Lutz (Impr.) vol.68 no.2 São Paulo. 2009.
Centers for Disease Control and Prevention. Current trends human T lymphotropic virus type 1 screening in volunteer blood donors – United States, 1989. Morb Mortal Wkly Rep. 1990 [acessado em 20 jun. 2011]. Disponível em: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/00001864.htm.
Coral L, Queiroz L, Grzesiuk A. HTLV-1 associated myelopathy/ tropical spastic paraparesis: report of two cases diagnosed in Florianópolis, Santa Catarina - Brazil. Arq Neuropsiquiatr 1998; 56(1):120-122.
Costa, E.A.S. Introdução da reação em cadeia da polimerase em tempo real no algoritmo de testes laboratoriais para o diagnóstico de infecção por HTLV-1 e HTLV-2. São Paulo, 2010.
Franchini G. Molecular mechanisms of human T-cell leukemia/lymphotropic virus type I infection. Blood. 1995; 86: 3619-39.
Gessain, A. et al. Phylogenetic study of ten new HTLV-1 strains from the Americas. AIDS Res Hum Retroviruses, v. 10, n. 1, p. 103-6, 1994.
Hall WW, Kubo T, Lijichi S, Takahashi H, Zhu SW. Human T cell leukemia/lymphoma virus, type 2 (HTLV-2): emergence of an important newly recognized pathogen. Sem Virol. 1994; 5: 165-78.
Hall WW. Human T cell lymphotropic virus type I and cutaneous T cell leukemia/lymphoma. J Exp Med, v. 180, n. 5, p. 1581-5, 1994.
Inouye, M. M. Z.; Reiche, E. M. V; Morimoto, H. K.; Morimoto, A A; Bortollero, A L.; Carvalho, R. A Correlação entre os resultados da pesquisa de anticorpos anti-vírus linfotrópico de células T humanas tipo I (HTLV-I) obtidos pelos métodos de enzimaimunoensaio (ELISA) e Western Blot. Semina: Cio Biol. Saúde, Londrina, V. 20/21, n. 2, p. 11-16, jun. 2000.
Jacob F, Santos-Fortuna E, Caterino-de-Araujo A. Algoritmo de testes sorológicos de triagem para infecção por HTLV-1 e 2 usado no Instituto Adolfo Lutz. São Paulo. 2007).
Levinson W, Jawetz E, Microbiologia Médica e Imunologia – 7ª ed. p. 205, 2005.
Manns A, Hisada M, Da Grenade L. HumanT- lymphotropic virus type I infection. Lancet 1999;353:1951-8.
Mahieux R, Gessain A. The human HTLV-3 and HTLV-4 retroviruses: New members of the HTLV family. Path Biol. 2009; 57: 161-6.
Murphy EL. The clinical epidemiology of human T-lymphotropic virus type 2 (HTLV-2). J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 1996; 13(1): 215-9. Orland JR, Engstrom J, Fridey J, Sacher RA, Smith JW, Nass C et al. Prevalence and clinical features of HTLV neurologic disease in the HTLV outcomes study. Neurology. 2003; 61: 1588-94.
Poiesz, B. J. et al. Detection and isolation of type C retrovírus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA, v. 77, n. 12, p. 7415-9, 1980.
Pombo de Oliveira MS, Hamerschlack N; Chiattone CS, Ferreira Jr OCF. ATL no Brasil. Ministério da Saúde - Instituto Nacional do Cancer, 1ª ed. Rio de Janeiro, 1995.
Posada-Vergara MP, Montanheiro P, Fukumori LMI, Bonasser F, Duarte AJS, Penalva De Oliveira AC et al. Clinical and epidemiological aspects of HTLV-2 infection in São Paulo, Brazil: presence of tropical spastic paraparesis/HTLV-associated myelopathy (TSP/HAM) simile diagnosis in HIV-1-co-infected subjects. Rev Inst Med Trop S Paulo. 2006; 48: 207-10.
Proietti ABFC. HTLV-1 e 2. Cadernos do Hemominas, volume XI, 2000.
Ribas J, Melo G. Human T-cell lymphotropic virus type 1(HTLV-1)-associated myelopathy. Rev Soc Bras Med Trop 2002; 35(4):377-384.
Satou Y, Matsuoka M. HTLV-1 and the host immune system: how the virus disrupts immune regulation, leading to HTLV-1 associated diseases. J Clin Exp Hematop. 2010; 50(1): 1-8.
Schechter M, Harrison LH, Halsey NA, Trade G, Santino M, Moulton LH, Quinn TC. Coinfection with human T-cell lymphotropic virus type I and HIV in Brazil. JAMA. 1994; 271(5): 353-7.
Seiki, M. et al. Nonspecific integration of the HTLV provirus genome into adult T-cell leukemia cells. Nature, v. 309, n. 5969, p. 640-2, 1984.
Shimoyama M. Diagnostic criteria and classification of clinical subtypes of adult T-cell leukemia-lymphoma. A report from the Lymphoma Study Group. Br J Haematol 1991;79:428-7.
Kits empregados nos testes imuno - enzimáticos
1ª geração: kits de reagentes EIA que utilizam lisado viral purificado de HTLV-1 e 2 como antígeno (Hemobio HTLVI/II HBK 424, EMBRABIO; Platelia HTLV-I New, Bio-Rad; * Vironostika HTLV-I/II, Organon Teknika Corp).
2ª geração: kits de reagentes que empregam lisado viral purificado de HTLV-1 e 2 em associação com antígenos recombinantes (Hemagen HTLV-I + HTLV-II, Hemagen Diagnósticos Com. Ltda; ** Vironostika HTLV-I/II, BioMerieux).
3ª geração: kits de reagentes EIA que contêm proteínas recombinantes/peptídeos sintéticos de HTLV-1 e 2 como antígeno (Murex HTLV-I+II, Murex Biotech; Ortho HTLV-I/HTLV-II, Ortho Clinical Diagnostics Inc.). WB: WB HTLV 2.4, Genelabs Diagnostics.
CARTA DE AUTORIZAÇÃO PARA ENTREGA DA MONOGRAFIA
Autorizo a entrega da Monografia, intitulada ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE DOS TESTES DE LABORATÓRIO UTILIZADOS NO DIAGNÓSTICO DO VÍRUS LINFOTRÓFICO DE CÉLULAS T HUMANAS, de autoria do (a) aluno(a) Daniel Peixoto Pinto, na Assessoria de Extensão para avaliação.
Governador Valadares 08 de julho de 2011.
Orientador (a): Maria José Ferreira Morato
