Produção de Ácido Cítrico utilizando Glicerol em condições
limitantes da relação carbono/nitrogênio por Yarrowia lipolytica
Roberta dos Reis Ribeiro
1Luana Vieira da Silva
2Priscilla Filomena Fonseca Amaral
3Maria Alice Zarur Coelho4
1
Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFRJ, discente do curso de Engenharia Química 2 Aluna de mestrado da pós graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos/Escola de Química/UFRJ
3 Aluna de pós doutorado Departamento de Engenharia Bioquímica/Escola de Química/UFRJ 4 Professora do Departamento de Engenharia Bioquímica/Escola de Química/UFRJ
RESUMO
O glicerol é um subproduto do processo de produção de biodiesel que é uma fonte energética renovável promissora que está sendo desenvolvido para substituir o petróleo. Algumas companhias produtoras de biodiesel estão enfrentando sérios problemas por causa do impacto ambiental que o excesso de glicerol gerado pode causar. Uma das promessas de aplicação do glicerol proveniente da produção do biodiesel é na produção de compostos de alto valor através da fermentação microbiológica. Vários metabólitos podem ser produzidos a partir do glicerol proveniente da produção do biodiesel como, por exemplo, o ácido cítrico, cujo nome oficial é ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxílico. Cerca de 70% da produção do ácido cítrico é utilizado pela indústria de alimentos e bebidas, 12% pela indústria farmacêutica e 18% por outras indústrias. Portanto, o objetivo deste presente trabalho foi otimizar o meio de cultura para produzir ácido cítrico através de uma cepa de Yarrowia lipolytica isolada da Baia de Guanabara, no Rio de janeiro, Y. lipolytica IMUFRJ 50682, utilizando glicerol e variando a relação carbono/nitrogênio. Inicialmente, foram utilizados 4 tipos de meio de cultura. O meio YPG 1 e YPG 2 foram preparados utilizando somente água destilada com glicerol, extrato de lêvedo e peptona em concentrações diferentes e o meio YPG 3 e YPG 4 foram preparados com meio mineral utilizando água destilada e continham glicerol, extrato de lêvedo e sulfato de amônia também em concentrações diferentes. O meio mineral era composto de KH2PO4, Na2HPO4 . 7 H2O, MgSO4 . 7H2O, CaCl2 . 2 H2O, FeCl3 . 6 H2O, ZnSO4 . 7 H2O e MnSO4 . H2O. Após análise dos 4 experimentos em HPLC, estes meios foram novamente preparados, porém substituindo a água destilada por água Milliq. Estes apresentaram picos um pouco maiores em comparação com os meios preparados com água destilada. A partir destes dados um planejamento experimental 2k-1, sendo k = 4, foi elaborado. Os parâmetros foram glicerol na concentração de 40 e 200 g/l, extrato de lêvedo na concentração de 0,5 e 10 g/l, sulfato de amônia na concentração de 0 e 10 g/l e agitação a 160 rpm e 250 rpm. Foi encontrado através de um método enzimático um rendimento de 0,55 g/l de ácido cítrico para o ensaio cuja composição foi de 200 g/l de glicerol, 0,5 g/l de extrato de lêvedo, 0 g/l de sulfato de amônia e na agitação de 250 rpm. Um novo planejamento foi elaborado a partir da composição deste meio, cujo modelo foi 2k, sendo k = 2. Os parâmetros foram glicerol na concentração de 150 g/l e 250 g/l e extrato de lêvedo na concentração de 0,1 e 0,9 g/l. 2 experimentos apresentaram os maiores rendimentos cuja concentração foi de 0,6223 g/l e 0,6227 g/l no tempo 75,83 h, porém o ensaio que foi elaborado por uma composição menor obteve um rendimento de 0,62 g/l em 45 h de processo, beneficiando a relação custo-benefício. Observou-se um aumento na produção de ácido cítrico quando a fonte de nitrogênio foi limitante.
INTRODUÇÃO
O glicerol vem sendo produzido a partir da produção do biodiesel, uma fonte energética
renovável promissora desenvolvida para
substituir o petróleo, um combustível fóssil (Papanikolaou et al., 2002; Rymowicz et. al., 2006; Silva et. al., 2009). Algumas companhias produtoras de biodiesel estão enfrentando sérios problemas por causa do impacto ambiental que o excesso de glicerol gerado pode causar. A substância 1,2,3-propanotriol, mais conhecida como glicerol ou glicerina, pertence a função química álcool e está presente em muitas aplicações industriais,
como cosmética, pintura, automotiva,
alimentos, tabaco, farmacêutica, de papel, couro e têxteis (Silva et al., 2009). Uma das
promessas de aplicação do glicerol
proveniente da produção do biodiesel é na produção de compostos de alto valor através da fermentação microbiológica (Silva et al., 2009; Papanikolaou et al.,2008). Vários metabólitos podem ser produzidos a partir do glicerol proveniente da produção do biodiesel como os ácidos orgânicos (Rymowicz et. al., 2006; Papanikolaou et al.,2008; Rymowicz et al., 2008; Silva et al., 2009) propiônico, succínico (Rymowicz et al., 2008; Silva et al., 2009) e cítrico (Papanikolaou et al., 2002; Rymowicz et al., 2006; Papanikolaou et al., 2008; Rymowicz et. al., 2008).
O ácido cítrico, cujo nome oficial é ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxílico, é um ácido orgânico fraco, que pode ser encontrado nos citrinos e é sintetizado em escala industrial pelo fungo filamentoso Aspergillus niger através do processo de fermentação submersa tendo a sacarose como fonte de carbono (Papanikolaou et al., 2002; Rymowicz et al., 2006; Levinson et al., 2007; Rymowicz et al., 2008; Silva et al., 2009). Cerca de 70% da produção do ácido cítrico é utilizado pela indústria de alimentos e bebidas; 12% pela indústria farmacêutica e 18% por outras indústrias. O ácido cítrico é um intermediário do ciclo de Krebs e mantém uma posição chave no metabolismo de cada célula
microbiológica (Rymowicz et al., 2008;
Levinson et al., 2007. Sua produção global alcançou 1,4 milhões de tonelada por ano e existe um crescimento anual de 3,5 – 4 % do consumo de ácido cítrico (Rymowicz et al., 2008).
Vários estudos apontam a produção elevada de ácido cítrico por uma levedura conhecida como Yarrowia lipolytica utilizando glicerol da produção do biodiesel como fonte de carbono. Papanikolaou et al., (2002) e Papanikolaou et al., (2008) conseguiram uma produção alta de
ácido cítrico após limitar o nitrogênio no meio. Levinson et al., (2007) apontam que a composição do meio de crescimento e a relação carbono/nitrogênio afetam a proporção dos ácidos cítrico e isocítrico produzidos e que é necessário estabelecer uma relação entre estes dois compostos para otimizar a produção de ácido cítrico. Portanto, o objetivo deste presente trabalho foi otimizar o meio de cultura para produzir ácido cítrico através de uma cepa de Yarrowia lipolytica isolada da Baia de Guanabara, no Rio de janeiro, Y. lipolytica IMUFRJ 50682 utilizando glicerol P.A.
MATERIAL E MÉTODOS Microrganismo e Composição do meio O microrganismo utilizado foi uma cepa selvagem de Yarrowia lipolytica (IMUFRJ 50682) selecionada de um estuário no Rio de Janeiro, Brasil (Haegler & Mendonça-Haegler, 1981). A cepa foi acondicionada em meio YPD com 2% de glicose, 2% de peptona, 1% de extrato de lêvedo e 2% de Agar-Agar a temperatura de 4º C. Inicialmente, foram utilizados 4 tipos de meio de cultura. O meio YPG 1 e YPG 2 foram preparados utilizando água destilada e os mesmos substratos. A diferença entre eles foi a concentração de cada um. O meio YPG 1 foi preparado com 20 g/l de glicerol, 10 g/l de extrato de lêvedo e 6,4 g/l de peptona já o meio YPG 2 foi preparado com 20 g/l de glicerol, 4 g/l de extrato de lêvedo e 2,60g/l de peptona e o meio YPG 3 e YPG 4 foram preparados com meio mineral utilizando água destilada e também com os mesmos substratos. O meio YPG 3 foi preparado com 20 g/l de glicerol e 10 g/l de sulfato de amônia e o meio YPG 4 continha 20 g/l de glicerol e 4 g/l de sulfato de amônia. O meio mineral era composto de: KH2PO4: 12
g/L; Na2HPO4 . 7 H2O: 12 g/L; MgSO4 . 7H2O:
1,5 g/L; CaCl2 . 2 H2O: 0,15 g/L; FeCl3 . 6 H2O:
0,15 g/L; ZnSO4 . 7 H2O: 0,02 g/L; MnSO4 .
H2O: 0,06 g/l. Após análise das amostras
coletadas destes 4 experimentos em HPLC, estes meios foram novamente preparados, porém substituindo a água destilada por água
Milliq. Suas amostras também foram
analisadas em HPLC. Um planejamento
experimental foi elaborado utilizando a
composição do meio sugerido pela literatura, onde foi confirmada a produção de ácido cítrico utilizando glicerol do biodiesel pela Yarrowia lipolytica. Foi encontrado um melhor resultado em termos de ácido cítrico para o ensaio 2 deste planejamento e um novo planejamento foi elaborado a partir da
composição do meio 2. O pré-inóculo definido como meio YPD foi preparado com a composição em glicose a 2%, peptona a 2% e extrato de lêvedo a 1% e incubado em um agitador rotatório a 28ºC, em 160 rpm de agitação por 72 h.
Condições do cultivo e quantificação do crescimento celular
Os experimentos foram conduzidos em frascos Erlenmeyer de 1 litro contendo 400 ml de meio de cultura e inoculados com meio YPD descrito acima em uma concentração de 1g/l e incubados a 28º C em um agitador rotatório (Tecnal Digimec BTC9090). Os 4 meios iniciais forma submetidos a uma agitação de 250 rpm por 5 dias. A concentração celular foi determinada por medidas de densidade óptica a 570nm e esses valores foram convertidos para mg p.s./mL usando-se um fator previamente determinado. O equipamento utilizado para leitura foi o Espectrofotômetro Hach DR/4000 UV.
Determinação de glicerol, ácidos orgânicos e Ph
Foram coletadas 5 ml do meio de crescimento que foram centrifugadas em Centrífuga Sigma 2K 15 para posterior análise de ácidos orgânicos, glicerol e pH. Os ácidos orgânicos do meio YPG1, YPG 2, YPG3 e YPG 4 produzidos com água destilada ou água Milliq foram somente determinados por cromatografia de fase líquida HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), Waters 1525. Para quantificar a produção de ácido
cítrico dos meios relacionados ao 1º
planejamento experimental utilizou-se o
método de MARIER & BOULET (1958). Para tanto utilizou-se 1 mL do extrato, 1,3 mL de piridina e 5,7 mL de anidrido acético em banho maria por 30 minutos à 32oC e leitura no espectrofotômetro a 420 nm. A produção de ácido cítrico dos meios relacionados ao 2º planejamento foi determinada pelo método enzimático e por HPLC. O ensaio 1 do 2º planejamento rendeu um melhor resultado em termos de ácido cítrico e todas as amostras coletadas do ensaio 1 foram analisadas em HPLC. Novos experimentos foram realizados repetindo o ensaio 1, que obteve o melhor resultado em ácido cítrico, do 2º planejamento. O 1º experimento substituiu a água deionizada por água Milliq. O 2º experimento foi formulado com água deionizada e em meio não tamponante, ou seja, a concentração de KH2PO4 e Na2HPO4*7H2O utilizadas foi de 7 g/l e 2,5 g/l respectivamente. No 3º
experimento foram adicionados 80 ml de PFC ao meio, pois esta substância seqüestra oxigênio e insere-o no meio com o objetivo de promover maior concentração de oxigênio. O
glicerol foi determinado pelo método
enzimático de quantificação de
triacilglicerídeos da empresa LABORLAB e o pH foi identificado no aparelho pHmetro DM-22 Digimed.
RESULTADOS E DISCUSSÕES O crescimento celular dos meios YPG 1, YPG 2 e YPG 4 elaborados com água destilada foi instável. Ao longo do cultivo a concentração celular oscilava ora aumentando ora diminuindo. Apenas no cultivo YPG 3 nota-se um crescimento celular nota-seguindo o perfil da curva de crescimento ideal, apresentando as fases de latência, exponencial, desaceleração, estacionária e de morte. Os meios 3 e 4 atingiram uma concentração celular maior que os experimentos 1 e 2, que foram formulados com maios quantidade de fonte de nitrogênio. A máxima concentração celular em meio YPG 1 e em meio YPG 2 foi de 13,94 mg/ml em 75,67 h e 9,75 mg/ml em 45,83 h de
experimento respectivamente. Já os
experimentos 3 e 4 atingiram uma
concentração celular de 16,28 mg/ml em 53,67 h e 16,36 mg/ml em 69,75 h de experimento respectivamente. Nos 4 casos, houve queda de pH seguida de um aumento no final do experimento.
Analisando os cromatogramas,
observou-se que não houve produção de ácido cítrico pelos meios YPG 1, YPG 2, YPG 3 e YPG 4 elaborados com água destilada. Pelos resultados obtidos nos experimentos utilizando água Milliq foi possível observar que o crescimento celular foi menor comparando-os com os experimentos que utilizavam água destilada, mostrando que a ausência de certos íons prejudica o crescimento celular. A máxima concentração celular no meio YPG 1, YPG 2, YPG 3 e YPG 4 foi de 7,07 mg/ml em 53,47 h, 8,26 mg/ml em 100,63 h, 6,92 mg/ml em 94,13 h e 7,33 mg/ml em 68,82 h
respectivamente. Porém o perfil de
crescimento celular do meio YPG 1 com água Milliq se mostrou mais estável que do meio YPG 1 em água destilada uma vez que seguiu a curva de crescimento ideal. O meio YPG 2 formulado com água Milliq também mostrou um perfil de crescimento celular mais estável que o meio YPG 2 em água destilada. No final do cultivo, percebeu-se uma diminuição da concentração celular seguida de um aumento. O pH nesta faixa de experimento diminuiu e
depois aumentou. Provavelmente houve consumo de algum metabólito proporcionando aumento de pH e da concentração celular. O meio YPG 3 em água Milliq se mostrou menos estável que o meio YPG 3 em água destilada, pois este seguiu a curva de crescimento. Os dois meios YPG 4 apresentaram um perfil de crescimento celular instável. Além disso, em todos os casos, há uma queda de pH e depois um aumento. Analisando os cromatogramas, foi possível notar a presença de um pico no
tempo de retenção de 13 minutos
aproximadamente nos meios YPG 1, YPG 2, YPG 3 e YPG 4 elaborados com água Milliq. Este tempo foi próximo ao tempo de retenção do padrão ácido succínico, 13,242 minutos. Para os 4 casos, a área deste pico de 13 minutos aumentou até o 4º dia de experimento e no 5º dia diminuiu ou até mesmo não esteve presente. Não apareceu pico próximo ao tempo de retenção do ácido cítrico nos
cromatogramas de nenhum destes 4
experimentos. Certamente há formação de
ácidos orgânicos, mas sem identificação exata de quais seriam. Observando-se que não
houve produção do ácido de interesse através dos meios elaborados tanto com água destilada quanto com água Milliq partiu-se
para novos experimentos utilizando a
composição de meio sugerido pela literatura, onde foi confirmada a produção de ácido cítrico utilizando glicerol do biodiesel pela Yarrowia lipolytica.
Foi feito um planejamento experimental, aumentando a razão C/N, pois com a limitação da fonte de nitrogênio o crescimento celular fica também limitado e o fluxo de carbono é direcionado para produção de metabólitos. Foi estudada também a influência da agitação que está relacionada com o crescimento celular. A
Tabela 2 apresenta o planejamento
experimental adotado. Os meios de cultura foram preparados com os componentes do meio mineral descrito na seção material e métodos. Foi utilizada água deionizada na confecção dos meios para retirar o elemento químico ferro, que possivelmente esteja presente na água destilada, uma vez que este composto inibe a produção do metabólito de interesse.
Tabela 2 – Código e valores reais das variáveis do planejamento experimental 2k-1, sendo k = 4. Ensaio
Glicerol Extato de lêvedo Sulfato de amônia Agitação
Código Valor (g/L) Código Valor (g/L) Código Valor (g/L) Código Valor (rpm) 1 -1 40 -1 0,5 -1 0 -1 160 2 +1 200 -1 0,5 -1 0 +1 250 3 -1 40 +1 10 -1 0 +1 250 4 +1 200 +1 10 -1 0 -1 160 5 -1 40 -1 0,5 +1 10 +1 250 6 +1 200 -1 0,5 +1 10 -1 160 7 -1 40 +1 10 +1 10 -1 160 8 +1 200 +1 10 +1 10 +1 250 9 0 120 0 5,25 0 5 0 205 10 0 120 0 5,25 0 5 0 205 11 0 120 0 5,25 0 5 0 205
Foi possível perceber através dos resultados da cinética de crescimento celular e pH que poucas foram as condições que favoreceram o crescimento celular e a redução do pH. Houve maior crescimento no Ensaio 3, com menor relação C/N, que iniciou com uma concentração de 0,92mg/ml e terminou com 8,22 mg/ml e a maior redução de pH ocorreu nos ensaios 2 e 5. O ensaio 2 iniciou com pH igual a 7,22 e terminou com 4,19 e o ensaio 5 começou com 6,46 e terminou com 3,92. Os outro ensaios tiveram o seu pH próximo a 6 no início do experimento e próximo a 5 os ensaios 1, 3 e 4 e a 4 os ensaios 6, 7, 8, 9,1 0 e 11 no final do experimento. Os ensaios 9, 10 e 11, que são
pontos centrais, apresentaram resultados
similares da cinética de crescimento celular e pH como era previsto.
A Figura 3 apresenta os resultados de produção de ácido cítrico pelo método de
MARIER & BOULET (1958) dos os
experimentos do 1º planejamento
experimental. É possível perceber que houve produção significativa apenas nos Ensaios 1 e 2, que contém as maiores relações C/N, ou seja, quando a fonte de nitrogênio é limitante.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 0 20 40 60 80 100 120 Tempo (h) C o n c e n tr a ç ã o d e á c id o c ít ri c o ( p p m )
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4 Ensaio 5 Ensaio 6
Ensaio 7 Ensaio 8 Ensaio 9 Ensaio 10 Ensaio 11
Figura 3. Produção de Ácido Cítrico dos Ensaios do 1º planejamento experimental Na tabela 3 estão mencionados os resultados
máximos em ácido cítrico pelo método
enzimático. Observa-se que os ensaios 1 e 2 foram os que apresentaram melhor rendimento de ácido cítrico. No ensaio 1, houve produção de aproximadamente 0,60 g/l e no ensaio 2, foi
observada uma produção de 0,55 g/l
aproximadamente. Estes resultados estão mostrados também nas figuras 5 e 6.
Tabela 3 - Produção máxima de Ácido Cítrico de cada ensaio pelo método
enzimático
ENSAIO Ácido Cítrico (g/l)
1 0,5903 2 0,5526 3 0,0129 4 0,0147 5 0,0069 6 0,0028 7 0,0245 8 0,0202 9 0,0128 10 0,0166 11 0,0114 0,0000 0,1000 0,2000 0,3000 0,4000 0,5000 0,6000 0,7000 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 Tempo (h) C o n c e n tr a ç ã o d e Á c id o C ít ri c o (g /L )
Concentração de Ácido Cítrico X Tempo
Figura 5: Produção de Ácido Cítrico do ensaio 1pelo método enzimático
0,0000 0,1000 0,2000 0,3000 0,4000 0,5000 0,6000 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Tempo (h) C o n c e n tr a ç ã o d e Á c id o C ít ri c o ( g /L )
Figura 6: Produção de Ácido Cítrico do ensaio 2 pelo método enzimático Em termos de rendimento o ensaio 1
apresentou melhor resultado, porém em termos de produtividade o ensaio 2 foi melhor. Portanto o 2º planejamento foi elaborado a partir do ensaio 2. A tabela 4 mostra o 2º
planejamento experimental adotado. Os
ensaios 5 e 6 são os pontos centrais. Tabela 4– Código e valores reais das variáveis do planejamento experimental 2k,
sendo k = 2.
ENSAIO GLICEROL LÊVEDO (NH4)2SO4 AGITAÇÃO 1 150 0,1 0 250 2 250 0,1 0 250 3 150 0,9 0 250 4 250 0,9 0 250 5 200 0,5 0 250 6 200 0,5 0 250
A tabela 5 mostra os resultados máximos em concentração de ácido cítrico obtidos por cada ensaio analisado pelo método enzimático. A maior concentração em ácido cítrico foi obtida pelo ensaio 1, que foi de 2,51 g/l no tempo de processo igual a 75,83 h, ou seja, no 4º dia no final da tarde. O ensaio 1 foi formulado com a menor quantidade de substrato de glicerol e extrato de lêvedo, beneficiando a relação custo-benefício.
Tabela 5 – Produção Máxima de Ácido Cítrico de cada ensaio pelo método
enzimático Ensaio Ácido Cítrico (g/l) Tempo de Processo (h) 1 2,51 75,83 2 1,62 45 3 0,90 75,83 4 0,74 75,83 5 1,37 75,83 6 1,13 75,83
Os pontos do ensaio 1 foram escolhidos para serem analisados em HPLC uma vez que obteve o melhor resultado em ácido cítrico. De acordo com os resultados obtidos nos cromatogramas, o padrão ácido cítrico 0,5% apresentou um pico no tempo de retenção igual a 11,224 minutos e uma unidade de área igual a 1. No início do experimento não foi detectado nenhum pico próximo a este tempo. A partir do 4º dia de experimento na parte da manhã começa aparecer um pico com unidade de área igual a 0,33 no tempo de retenção igual a 11, 188 minutos. Não apareceu nenhum outro pico próximo aos tempos de retenção dos outros padrões. Na parte da tarde também do 4º dia apareceu um pico com 0,33 de unidade de área no tempo de retenção de 11,185 minutos. No ponto do 5º dia de manhã, apareceu um pico com 0,35 unidade de área no tempo de retenção igual a 11,501 minutos. Os tempos de retenção destes três picos são muito similares ao tempo de retenção do padrão ácido cítrico. No ponto do 5º dia coletado a tarde nenhum pico aparece em tempo próximo a 11 minutos, porém apareceu um pico em 6,939 minutos com 0,35 unidade de área. Este tempo é próximo ao tempo de retenção do padrão ácido oxálico 0,13% de 6,984 minutos. A tabela 6 mostra o tempo de retenção de cada padrão injetado no HPLC, possíveis ácidos produzidos.
Tabela 6 – Tempo de retenção dos padrões injetados no HPLC
Padrão (Ácidos) Tempo de Retenção (minutos) Cítrico 11,224 α-Cetoglutárico 10,959 Pirúvico 8,834 Succínico 14,502 Oxálico 6,984
Novos experimentos foram realizados repetindo o ensaio 1, que obteve o melhor resultado em ácido cítrico, do 2º planejamento. O 1º experimento substituiu a água deionizada por água Milliq. O resultado obtido não foi
satisfatório porque a concentração máxima de ácido cítrico produzida foi de 0,57 g/l. O 2º
experimento foi formulado com água
deionizada e em meio não tamponante, ou
seja, a concentração de KH2PO4 e
Na2HPO4*7H2O utilizadas foi de 7 g/l e 2,5 g/l
respectivamente. O rendimento em ácido cítrico foi 0,66 g/l, inferior ao obtido pelo ensaio 1 com meio mineral tamponante e em água deionizada. No 3º experimento foram adicionados 80 ml de PFC ao meio, pois esta substância seqüestra oxigênio e insere-o no meio com o objetivo de promover maior concentração de oxigênio. A resposta não foi satisfatória, pois a concentração máxima de ácido cítrico foi de 0,051 g/l.
CONCLUSÕES
A cepa Yarrowia lipolytica mostrou um significativo crescimento celular nos 4 meios iniciais produzidos com água destilada. Não houve produção de ácidos orgânicos por estes meios. O crescimento celular foi limitado nos 4 meios confeccionados com água Milliq e de
acordo com os cromatogramas ácido
orgânicos foram produzidos, porém ainda não identificados. Neste caso a rota metabólica foi direcionada para a produção de metabólitos, por esta razão, o crescimento foi limitado e os
picos dos cromatogramas apresentaram
unidade de área maior. O ensaio 2 do 1º planejamento experimental que foi elaborado com a maior relação carbono/nitrogênio apresentou o melhor resultado em termos de produtividade. Seu rendimento foi de 0,5526 g/l. Portanto, foi o ensaio utilizado para o 2º
planejamento experimental. A maior
concentração em ácido cítrico foi obtida pelo ensaio 1 do 2º planejamento, que foi de 2,51 g/l no tempo de processo igual a 75,83 h. O ensaio 1 foi formulado com a menor quantidade de substrato de glicerol e extrato de lêvedo, beneficiando a relação custo-benefício. As repetições do ensaio 1com algumas modificações não resultaram em
respostas satisfatórias. Logo, a melhor
resposta foi alcançada pelo ensaio 1 do 2º experimento onde obteve o maior rendimento em relação aos outros meios utilizados neste trabalho.
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