ARTIGO ORIGINAL
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É possível ler o antibiograma de bactérias obtidas de infecção
urinária em 6 horas utilizando os novos pontos de corte
propostos pelo EUCAST?
Is it possible to read the antibiogram of bacteria obtained from urinary
tract infection in 6 hours using the new cutoff points proposed by EUCAST?
¿Es posible leer el antibiograma de bacterias obtenidas de la infección del
tracto urinario en 6 horas usando los nuevos puntos de corte propuestos por
EUCAST?
Nathalia Feltes,
1Afonso Luís Barth.
1,21LABRESIS – Laboratório de Pesquisa em Resistência Bacteriana, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil.
2Curso de Especialização em Análises Clínicas, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
Recebido em:30/01/2020
Aceito em: 09/02/2020 Disponível online: 09/02/2020 Autor correspondente:
Afonso Luís Barth albarth@hcpa.edu.br
RESUMO
Justificaiva e objetivos: A Escherichia coli,
perten-cente à família Enterobacteriaceae ordem Enterobacterales, é o principal patógeno da infecção do trato urinário (ITU) correspondendo a cerca de 80% de todas as ITU. A crescente resistência antimicrobiana e a rápida liberação do antibiogra-ma são desafios para microbiologistas e profissionais da saúde. Este estudo teve como objetivo avaliar a liberação do perfil de sensibilidade de E. coli do trato urinário em até 24-30 horas do recebimento da amostra. Métodos: Foi realizada uma análise comparativa do diâmetro dos halos de inibição de antibiogra-mas por disco-difusão em leituras de 6 e 18 horas de incubação utilizando os novos pontos de corte propostos pelo EUCAST para hemoculturas (RAST) e os pontos de corte padrão em leituras de 6 e 18 horas (padrão). Resultados: Embora tenha havido uma tendência de aumento do tamanho do halo para a maioria dos antibióticos com o maior tempo de incubação, esse aumento normalmente não foi significativo sendo que as leituras em 6h e 18h (padrão) apresentaram ótimos percentuais de concordância para os antimicrobianos testados. Discussão: Os pontos de corte padrão utilizados em leituras em 6h seriam
mais indicados que os pontos de corte de leitura rápida “RAST” porque incluem mais opções de antibióticos para tratamento de infecção urinária. Os pontos de corte “RAST” padronizados pelo EUCAST devem ter maior valor para leitura de hemocul-tura, como o próprio documento indica.
Palavras-chave: Escherichia coli, Infecções urinárias,
RAST, EUCAST
ABSTRACT
Background and Objectives: Escherichia coli, belonging
to the family Enterobacteriaceae order Enterobacterales, is the main pathogen for urinary tract infection (UTI) accounting for about 80% of all UTIs. The increasing antimicrobial resis-tance and the rapid release of the antibiogram are challenges for microbiologists and health professionals. The pourpose of this study was analyze the release of sensitivity profile of E. coli of the urinary tract within 24-30 hours of receiving the sample. Methods: A comparative analysis of the diameter of the disc-diffusion antibiogram inhibition halos in the 6 and 18 hour incubation readings using the new cut-off points proposed
by the EUCAST for blood cultures (RAST) and the standard cut-off points in the readings of 6 and 18 hours (standard).
Results: Although there was a tendency of increasing halo
size for most antibiotics with the longest incubation time, this increase was not usually significant and the 6h and 18h (stan-dard) readings showed a good percentage of agreement for the tested antimicrobials. Discussion: The standard cut-off points used for 6-h readings would be more indicated than "RAST" fast cut-offs because they include more antibiotic options for treating urinary tract infection. The "RAST" cut-off points standardized by EUCAST should have a higher value for blood culture reading, as the document itself indicates.
Key words: Escherichia coli, ITU, RAST, EUCAST.
RESUMEN
Antecedentes y objetivos: Escherichia coli, perteneciente
a la familia Enterobacteriaceae, orden Enterobacterales, es el principal patógeno de la infección del tracto urinario (ITU) que corresponde a aproximadamente el 80% de todas las ITU. La creciente resistencia a los antimicrobianos y la rápida libera-ción del antibiograma son desafíos para los microbiólogos y los profesionales de la salud. Este estudio tuvo como objetivo eva-luar la liberación del perfil de sensibilidad de E. coli del tracto urinario dentro de las 24-30 horas posteriores a la recepción de la muestra. Métodos: Se realizó un análisis comparativo del diámetro de los halos de inhibición de antibióticos por difusión en disco en lecturas de 6 y 18 horas de incubación utilizando los nuevos puntos de corte propuestos por EUCAST para hemocultivos (RAST) y los puntos de corte estándar en las lecturas 6 y 18 horas (estándar). Resultados: Aunque hubo una tendencia a aumentar el tamaño del halo para la mayoría de los antibióticos con el mayor tiempo de incubación, este au-mento generalmente no fue significativo y las lecturas en 6 y 18 horas (estándar) mostraron excelentes porcentajes de acuerdo para los antimicrobianos probados. Discusión: Los puntos de corte estándar utilizados en las lecturas de 6 horas serían más adecuados que los puntos de corte de lectura rápida "RAST" porque incluyen más opciones de antibióticos para tratar infecciones del tracto urinario. Los puntos de corte "RAST" estandarizados por EUCAST deben tener un valor más alto para la lectura de hemocultivos, como muestra el documento.
Palabras clave: Escherichia coli, infecciones urinarias,
RAST, EUCAST.
INTRODUÇÃO
A infecção do trato urinário (ITU) é uma doença infe-ciosa frequentemente diagnosticada em clínicas e hospitais do mundo inteiro, sendo mais comum em mulheres do que em homens.1-2 A Escherichia coli, pertencente à família Entero-bacteriaceae ordem Enterobacterales, é o principal patógeno, correspondendo a cerca de 80% de todas ITU.3-4
A maioria das ITUs é tratada de forma empírica, visto que, para liberação do resultado do exame bacteriológico e do perfil de sensibilidade com as técnicas padrões, o laboratatório necessita de, pelo menos, 48 horas.5-7 A demora na liberação
do antibiograma, juntamente com o aumento da resistência bacteriana, leva a uma resposta imprevisível ao tratamento e crescente uso de antimicrobianos de amplo espectro.7-8 Desta
forma, a rápida disponibilidade do resultado do antibiograma é muito importante para diminuir as eventuais falhas terapêu-ticas no tratamento empírico com antimicrobianos.6
Recentemente, o Comitê Europeu de Teste de Suscetibi-lidade (EUCAST 2019) publicou recomendações de pontos de corte para leitura após incubação curta (4, 6 e 8h) do antibio-grama realizado diretamente de frascos de hemocultura po-sitivos (RAST, rapid antimicrobial susceptibility testing). Esta padronização está indicada para a técnica de disco-difusão, para alguns antimicrobianos e para algumas bactérias especí-ficas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae), utilizando inóculos de 100-150uL sem centrifu-gação ou diluição. Após curta incubação, as zonas de inibição devem ser lidas com uso de luz refletida. Os pontos de corte do diâmetro dos halos de inibição para interpretação dos resulta-dos em “Sensível”, “Área de incerteza técnica” e “Resistente” são específicos para cada tempo de incubação e espécie.9 A
identificação bacteriana rápida, a qual pode ser realizada pela tec-nologia de espectrometria de massas (técnica de MALDI-TOF), é pré-requisito para correta utilização destes pontos de corte.10
O objetivo desse estudo foi fazer uma análise compara-tiva do diâmetro dos halos de inibição de antibiogramas por disco-difusão em leituras em 6 e 18 horas de incubação, a fim de avaliar a liberação do antibiograma de uroculturas em, no máxi-mo, 24 a 30 horas após o recebimento da amostra no laboratório.
MÉTODOS
Isolados de Escherichia coli provenientes de amostras de urina de um laboratório da região do Vale dos Sinos, Rio Grande do Sul, Brasil, que presta atendimento hospitalar e à comunidade foram utilizados nesse estudo. As urinas foram semeadas em ágar cromogênico (Laborclin ou Biomerieux) usando alças bacteriológicas de 1µl para quantificação. As placas foram incubadas a 35 ± 1ºC por 16-24 horas. Inicial-mente foram selecionados 213 isolados (Grupo A) de E.coli com contagem ≥105 UFC/mL para realização do teste de
sensibili-dade de acordo com a metodologia de disco-difusão conforme o EUCAST.11-12 Os discos de antimicrobianos (Bio-Rad) testados
foram os que apresentam pontos de corte para leitura rápida e que estavam disponíveis no laboratório, na mesma concentra-ção: gentamicina 10 µg, amicacina 30 µg, meropenem 10 µg e ciprofloxacino 5 µg. Posteriormente, foram avaliados 150 iso-lados de E.coli (≥105 UFC/mL) para um segundo grupo (Grupo
B) com antimicrobianos utilizados contra a infecção urinária que não apresentam pontos de corte para RAST: ampicilina 10 µg, amoxicilina-ácido clavulânico 20-10 µg, norfloxacino 10 µg, sulfametoxazol-trimetoprima 23,75-1,25 µg e, novamente, ciprofloxacino 5 µg.
O ágar Mueller-Hinton cátions ajustado (Laborclin) foi incubado a 35 ± 1ºC em ar ambiente por 6 horas para a leitura rápida e após re-incubado até 18 horas para leitura padrão. A leitura dos halos de inibição foi realizada com régua contra um fundo escuro. Para interpretação de categoria, utilizou-se os novos pontos de corte para hemocultura propostos pelo EUCAST em 2019, aplicados para a leitura de antibiograma de isolados de Escherichia coli do trato urinário (denominados rAST-U), em comparação com a leitura padrão em 18 horas (AST-18h) e a avaliação dos pontos de corte padrão em leitura de 6 (AST-6h), comparados a de 18 horas (AST-18h).
Para o Grupo A, foi realizada a leitura com os pontos de corte RAST (rAST-U), padrão (AST-18h) e leitura padrão mais rápida (AST-6h). Para o grupo B, foi realizada a leitura padrão em 6 e 18 horas (AST-6h e AST-18h). A leitura tradicional, 18 horas, foi utilizada como controle/padrão (Tabela 1).
pida (6h) foi obtido com apenas 200 (93,9%) de 213 isolados. Para amicacina (AN), 96,5% dos halos não modificaram mais que dois milímetros (mm) na comparação entre a leitura de 6 (rRAST-U) e de 18 horas (AST-18h). Resultado semelhante foi visto com gentamicina (GN) (94% de con-cordância). Já para meropenem (MEM) e ciprofloxacino (CIP) houve uma menor concordância, ou seja, 82% e 80,5%, respectivamente (Tabela 2). Para todos os discos de antimicrobianos houve tendência de aumento de halo com aumento de tempo de incubação (6h versus 18h), embora, na maioria das vezes, este aumento tenha sido considerado erro inerente da técnica (≤ 2 mm).
Para o grupo B, o crescimento foi suficiente para a lei-tura rápida (6h) em 147 de 150 (98%) isolados. Na comparação AST-6h e AST-18h, amoxicilina-ácido clavulânico (AMC), apresentou 96,7% de concordância de halo, seguido de am-picilina (AMP) com 95,2% e sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) com 90,5%. Já as fluoroquinolonas norfloxacino (NOR) e ciprofloxacino (CIP), apresentaram concordância menor que 70%. Os antimicrobianos AMP e SXT apre-sentaram maior percentual de resistência com ausência de halo. Para este grupo também houve tendência de aumento de halo com o aumento do tempo de incubação (6h versus 18h), mesmo que este aumento tenha sido considerado erro inerente da técnica (≤ 2 mm). (Tabela 3)
No primeiro comparativo do Grupo A, rAST-U versus AST-18h, houve 100% de concordância para meropenem e gentamicina, 98,5% para amicacina e 98% para ciprofloxa-cino. No total, foram encontrados três mE para amicacina e quatro AIT, em leitura de 18 horas, para ciprofloxacino. No segundo comparativo do Grupo A, AST-6h versus AST-18h, a concordância de categoria foi de 100% para meropenem e gen-tamicina, 99,5% para amicacina e 97,5% para ciprofloxacino, totalizando um mE para amicacina, três ME e dois AIT para ciprofloxacino (Tabela 4).
No comparativo do Grupo B (Tabela 5), AST-6h versus AST-18h, obteve-se 99,3% de concordância de categoria para AMP e AMC, seguido de 97,9% para SXT e NOR, e 95,8% para CIP. No total, foram encontrados 3 mE (dois para NOR e um para SXT), quatro ME (um AMP, um AMC, um NOR e um CIP) e dois VME (dois SXT).
Para cada isolado bacteriano e antibiótico foi realizado um comparativo de diâmetro e interpretação de categoria en-tre a leitura rápida (6h) e a padrão (18h): Sensível (S), Sensível, aumentando a exposição (I), Área de Incerteza Técnica (AIT) e Resistente (R). Isolados classificados como “AIT” na leitura de 6 horas foram excluídos do estudo.
As divergências de categoria foram classificadas como very major error (VME), major error (ME) e minor error (mE) conforme segue: VME, se “S” no método teste (rAST-U ou AST-6h) e “R” no método padrão (AST-18h); ME, se “R” no método teste (rAST-U ou AST-6h) e “S” no método padrão (AST-18h); e mE, se “I” no método teste (rAST-U ou AST-6h) e “S” ou “R” no método padrão (AST-18h), ou vice-versa. Isola-dos categorizaIsola-dos como “AIT” na leitura de 18 horas não foram classificados como erro nem como concordância de categoria (tabela 4 e 5). Diferenças de até dois mm nas medidas dos halos de inibição foram interpretadas como erro inerente da técnica e desconsiderados.
RESULTADOS
Para o grupo A, crescimento visível para a leitura rá-Tabela 1. Pontos de corte para leitura rápida (RAST) e padrão.
GN, Gentamicina; AN, Amicacina; MEM, Meropenem; CIP, Ciprofloxacino; AMP, Ampi-cilina; AMC, Amoxicillina-ácido clavulânico; NOR, Nofloxacino; SXT, Sulfametoxazol--trimetoprima. GN AN MEM CIP AMP AMC NOR SXT S (≥) 14 15 17 20 -S (≥) 17 18 22 25 14 19 22 14 AIT 12-13 13-14 15-16 17-19 -I 14-16 15-17 16-21 22-24 -19-21 11-13 R (<) 12 13 15 17 -R (<) 14 15 16 22 14 19 19 11 AIT -22-24 19-20
-Pontos de corte RAST Pontos de corte Padrão
Tabela 2. Análise de variação de halo entre as leituras de 6 e 18 horas para o Grupo A.
GN, Gentamicina; AN, Amicacina; MEM, Meropenem; CIP, Ciprofloxacino.
Antimicrobiano
GN AN MEM CIP
Halo igual ou sem diferença significativa
188 (94%) 193 (96,5%) 164 (82%) 161 (80,5%) Aumento do halo ≥3mm 12 (6%) 7 (3,5%) 35 (17,5%) 26 (19,5%) Diminuição do halo ≤3mm 0 0 1 (0,5%) 0
Tabela 3. Análise de variação de halo entre as leituras de 6 e 18 horas para o Grupo B.
AMP, Ampicilina; AMC, Amoxicillina-ácido clavulânico; NOR, Nofloxacino; CIP, Ciprofloxacino; SXT, Sulfametoxazol-trimetoprima.
Antimicrobiano AMP AMC NOR CIP SXT
Halo igual ou sem diferença significativa
140 (95,2%) 142 (96,7%) 104 (70,7%) 93 (63,3%) 133 (90,5%) Aumento do halo ≥3mm 7 (4,8%) 4 (2,7%) 43 (29,3%) 54 (36,7%) 9 (6,1%) Diminuição do halo ≤3mm 0 1 (0,6%) 0 0 5 (3,4%)
bom percentual de concordância e, consequentemente, baixos índices de erro. Porém, entre os erros encontrados, além de minor error e do major error, SXT apresentou 1,4% de VME, ficando muito próximo ao limite de erro, isso pode estar re-lacionado ao fato supracitado, que talvez prejudique a leitura rápida e gere resultados mais variados entre a leitura rápida e a padrão. Será necessário testar mais amostras para melhor ava-liação deste antimicrobiano. Neste segundo grupo, para o qual também testamos ciprofloxacino, encontramos um percentual de concordância muito semelhante ao anterior, com 3,5% de amostras na zona de AIT na leitura de 18 horas. Estes isolados não foram contabilizados como erro, já que, de acordo com o documento padrão, isolados encontrados nesta zona não são confiáveis e requerem melhor análise.
Tendo em vista os bons percentuais de concordância encontrados, cabe mencionar que os isolados utilizados constituíram-se de bactérias muito sensíveis. Talvez em uma população mais resistente, com zonas mais “intermediárias” possam se encontrar resultados diferentes.
Embora a concordância das leituras rápidas (rAST-U e AST-6h) com a leitura padrão (AST-18h) tenham sido muito boas e parecem oferecer resultados confiáveis, na população estudada, a leitura rápida usando os pontos de corte padrão (AST-6h) apresentaram uma performance um pouco melhor que a leitura com pontos de corte rAST-U. Concluímos que talvez seja melhor utilizar os pontos de corte padrão para a leitura rápida (AST-6h), visto que os novos pontos de corte padronizados pelo EUCAST (rAST-U) devem ter maior valor para leitura de hemocultura, como o próprio documento indi-ca, e não para isolados de urocultura com antibiograma reali-zado através de escala de McFarland. Além disso, AST-6h seria mais indicado porque inclui mais opções de antibióticos para tratamento de infecção urinária. Cabe mencionar que a leitura
DISCUSSÃO
Este trabalho fez uma comparação de leitura de halos e de interpretação de categorias visando avaliar a liberação de antibiograma do trato urinário de forma mais rápida. A com-paração entre a leitura rápida (6h) e padrão (18h) mostrou ten-dência a aumento de halo para a maioria dos antibióticos, mas não mais que dois milímetros de diferença (o que foi conside-rado erro inerente da técnica). Sulfametoxazol-trimetoprima foi o único antibiótico que apresentou, além da tendência do aumento de halo, um percentual importante de diminuição de halo para alguns isolados o que se configurou em nos dois únicos isolados com VME, o que pode estar relacionado ao crescimento reduzido dentro do halo de inibição, devido à presença de antagonistas no meio, e que deve ser ignorado no momento da leitura.13
Considerando que os valores aceitáveis de erro são de até 10% de minor error, 3% de major error e 1,5% de very major error,14 os resultados encontrados nesse estudo estão dentro
das margens aceitáveis. No Grupo A, para o qual realizamos dois comparativos, pudemos perceber resultados semelhantes de concordância utilizando tanto os pontos de corte “RAST” (rAST-U) quanto os pontos de corte padrão para leitura em 6h (AST-P6h). Para ambas leituras rápidas (rAST-U e AST-6h) observou-se minor erros para amicacina (1,5% rAST-U e 0,5% AST-6h), além de isolados na zona de “AIT” para ciprofloxacino (2% rAST-U e 1% AST-6h), já para gentamicina e meropenem encontramos 100% de concordância.
Após verificar esta concordância para as leituras em ambos documentos, analisamos os discos utilizados para o trato urinário (Grupo B) e que não apresentam pontos de corte no documento RAST. Nesta análise realizamos apenas o com-parativo com os pontos de corte padrão em dois momentos
Tabela 4. Análise de discrepâncias, encontradas na comparação entre a leitura rápida e a leitura padrão para o Grupo A.
mE, minor error; ME, major error; VME, very major error.
*Isolados categorizados como “AIT” na leitura de 18 horas não foram classificados como erro. GN, Gentamicina; AN, Amicacina; MEM, Meropenem; CIP, Ciprofloxacino.
Antimicrobiano rAST-U versus AST-18h
GN NA MEM CIP
AST-6h versus AST-18h
GN NA MEM CIP mE n(%) 0 3 (1,5) 0 0 0 1 (0,5) 0 0 ME n(%) 0 0 0 0 0 0 0 3 (1,5) VME n(%) 0 0 0 0 0 0 0 0 AIT* n(%) 0 0 0 4 (2%) 0 0 0 2 (1%) Concordância n(%) 197 (100) 197 (98,5) 200 (100) 195 (98) 200 (100) 199 (99,5) 200 (100) 191 (97,5) Total(n) 197 200 200 199 200 200 200 196
Tabela 5. Análise de discrepânciasencontradas na comparação entre a leitura rápida e a leitura padrão para o Grupo B
(AST-6h versus AST-18h).
mE, minor error; ME, major error; VME, very major error;.
AMP, Ampicilina; AMC, Amoxicillina-ácido clavulânico; NOR, Nofloxacino; CIP, Ciprofloxacino SXT, Sulfametoxazol-trimetoprima.
Antimicrobiano AMP AMC NOR CIP SXT mE n(%) 0 0 2 (1,36) 0 1 (0,68) ME n(%) 1 (0,68%) 1 (0,69%) 1 (0,68%) 1 (0,69%) 0 VME n(%) 0 0 0 0 2 (1,36) AIT* n(%) -0 -5 (3,49) -Concordância n(%) 146 (99,32) 144 (99,31) 144 (97,96) 137 (95,82) 144 (97,96) Total(n) 147 145 147 143 147
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foi possível de ser feita por não haver crescimento suficiente. A leitura em 4 horas talvez seja possível se for adicionado algum suplemento ao meio que torne o crescimento bacteriano visível para a leitura neste tempo de incubação. Mais estudos são necessários para verificar a utilização de pontos de corte para leitura rápida em uroculturas.
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