EFEITO DO JEJUM, DA AUSÊNCIA DE ÓLEO NA DIETA E DA
SUPLEMENTAÇÃO DIETÉTICA COM AMINOÁCIDOS ESSENCIAIS SOBRE O METABOLISMO INTERMEDIÁRIO DE Brycon amazonicus
RodrigoYamakami Camilo*, Claucia Aparecida Honorato e Gilberto Moraes
*Departamento de Genética e Evolução, Laboratório de Bioquímica Adaptativa - Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). E-mail: rycamilo@gmail.com
Resumo
Neste trabalho, investigou-se o efeito do jejum, da ausência de óleo dietático e da suplementação com aminoácidos essenciais livres (AAEL) na ausência de óleo, sobre o metabolismo intermediário de Brycon amazonicus. Para isso, os peixes foram divididos em quatro grupos denominados: Controle, SO (sem óleo), SO+AAEL (SO+aminoácidos) e Jejum. Os peixes foram alimentados por 15 dias, com exceção do grupo jejum. Após o período experimental, nove peixes de cada tratamento foram amostrados para a coleta de sangue, fígado e músculo branco, onde foram avaliados: triglicerídeos, ácidos graxos livres, glicose, piruvato, lactato, glicogênio, proteína, aminoácidos livres e amônia. No grupo Jejum, observou-se um consumo significativo das reservas lipídicas, protéicas e glicídicas para a manutenção do metabolismo. No grupo SO, observou-se um aumento significativo da concentração de glicogênio hepático e também uma diminuição significativa da concentração de aminoácidos livres associada a um aumento da glicose e da amônia plasmática. No grupo SO+AAEL, observou-se uma diminuição dos triglicérideos plasmáticos e da glicose hepática e um aumento da proteína hepática e dos aminoácidos hepáticos e musculares. Com base nos resultados observados, pôde-se concluir que uma mudança na condição alimentar de B. amazonicus provocou uma adaptação metabólica para a manutenção da homeostase.
Introdução
As moléculas que circulam no organismo resultantes da digestão são utilizadas por uma variedade de tecidos e órgãos, nos quais estão sujeitas a diferentes reações do metabolismo intermediário. Essas reações podem ter como destino degradação da molécula para a liberação de energia ou a produção de constituintes teciduais. Sendo assim, a determinação do perfil metabólico pode servir como excelente índice do estado fisiológico e nutricional do organismo, apesar de ser pouco utilizado. Alguns autores sugerem que a avaliação das variações dos intermediários metabólicos seja uma importante ferramenta para se conhecer as relações metabólicas entre os tecidos e sua correspondência com os nutrientes da dieta (Melo, 2004).
Os aminoácidos desempenham numerosas funções nos peixes. Quando em excesso, eles podem ser oxidados para suprir a demanda energética. As mudanças na concentração dos aminoácidos são seqüenciais e refletem as rotas metabólicas nos tecidos de acordo com a digestão, absorção, metabolismo e conseqüentemente o crescimento. Portanto, a habilidade para regular o grande influxo de aminoácidos, para a manutenção da homeostase tecidual, bem como para melhorar a utilização da energia e de proteína da dieta, é o ponto central para o sucesso da utilização destes nutrientes (Carter & Houlihan, 2001).
Na produção de organismos aquáticos, o matrinxã destaca-se pelo seu grande potencial econômico, pois, além de aceitar facilmente ração artificial e subprodutos agroindustriais, possui carne saborosa (Gomiero et al., 2003). Devido à importância comercial crescente que
essa espécie apresenta, o conhecimento das suas respostas metabólicas em diferentes condições alimentares pode possibilitar o ajuste do uso de nutrientes para melhora do crescimento e para o preparo de dietas mais econômicas. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo estudar as alterações do metabolismo intermediário frente ao jejum, à ingestão de uma dieta sem óleo e de uma dieta sem óleo e suplementada com AAEL.
Material e Métodos
Foram utilizados 108 peixes com peso médio inicial de 100g, distribuídos em 12 aquários. Foram formuladas três dietas purificadas isoproteicas (36% PB) e isoenergéticas (4670 kcal.kg-1) modificadas como segue. Os tratamentos experimentais foram denominados: Jejum - os peixes permaneceram sem receber alimento durante o período experimental; Controle - Dieta com todos os nutrientes; Sem óleo (SO) - Dieta sem adição de óleo na composição; Sem óleo com suplementação de aminoácidos (SO+AAEL) - Dieta sem adição de óleo na composição suplementada com 0,1% de fenilalanina, 0,1% de triptofano, 0,1% de valina, 0,1% de histidina, 0,1% de arginina e 0,1% de leucina.
Os peixes foram arraçoados durante 15 dias, duas vezes ao dia até a saciedade. Decorrido o período de arraçoamento, três peixes de cada aquário (nove por tratamento) foram amostrados para coleta de tecidos e sangue. Depois foram sacrificados por secção medular e uma amostra de fígado e de músculo branco foi coletada. Os tecidos foram imediatamente congelados e permaneceram assim até as análises bioquímicas.
Alíquotas de plasma, de fígado e de músculo branco foram diluídas em ácido tricloroacético 20% na proporção de 1/10 para a quantificação de piruvato, lactato e amônia; e diluídas em água destilada na proporção de 1/10 para a quantificação de aminoácidos, glicose, triglicerídeos (TG) e ácidos graxos livres (AGL). Após a homogeneização, as soluções foram centrifugadas e os sobrenadantes, utilizados para as análises bioquímicas.
Nas determinações de TG utilizou-se o Kit Labtest Liquiform. As determinações de AGL foram realizadas segundo Norvák (1965). Nas quantificações de glicose utilizou-se o Kit Labtest de Glicose Oxidase. As determinações do lactato foram feitas segundo Harrower & Brown (1972) e piruvato segundo Lu (1939). A extração e determinação do glicogênio foram realizadas segundo Bidinotto et al. (1997) e o teor de proteínas totais segundo Bradford (1976). Os teores de aminoácidos livres e de amônia foram determinados segundo Copley (1941) e Gentzkow & Mazen (1942), respectivamente.
Os dados foram inicialmente submetidos a uma análise de variância (ANOVA) utilizando-se o software Graphpad Instat, seguida do pós-teste de Tukey para comparação das médias dos grupos. O nível de significância admitido foi de p<0,05.
Resultados e Discussão
A utilização das reservas energéticas nos peixes depende do tempo de privação alimentar (Van Den Thillart & Van Raaij, 1995) e do tipo de alimento. Uma das formas de se suprir essas necessidades é a utilização das reservas lipídicas. Estas são as fontes de energia mais importantes durante os períodos de jejum (Collins & Anderson, 1997). As diminuições significativas das concentrações de TG no plasma e no fígado associadas aos aumentos significativos das concentrações de AGL muscular e plasmático do grupo Jejum são evidências de que os TG foram mobilizados desses locais para serem utilizados como fonte de
energia pelo músculo branco (Figura 1). Krogdahl et al. (1999) também observaram imediata diminuição da concentração de TG plasmáticos devido ao jejum para suprir a demanda energética. Quando o organismo necessita de energia, os TG armazenados são mobilizados e transportados como AGL para o plasma, e daí para os tecidos, principalmente para os músculos (Van Den Thillart & Van Raaij, 1995), onde serão oxidados. Como não se observou uma variação significativa das concentrações de TG e AGL plasmáticos, musculares e hepáticos no grupo SO (Figura 1), a demanda energética do SO possivelmente foi suprida por outras fontes.
Figura 1. Perfil lipídico plasma, músculo branco e fígado de B. amazonicus em diferentes materiais analisados. (a) Trigliceríreos e (b) Ácidos graxos livres. Os valores das concentrações médias de TG e ácidos graxos livres do plasma são expressos em μmol/ ml de plasma e do músculo branco e do fígado estão expressos em μmol/ mg de tecido. Os peixes foram colocados em diferentes condições alimentares: Jejum, Controle, SO, SO+AAEL, SA e SA+AAEL. Letras diferentes no mesmo grupo de tecido representam medias estatisticamente diferentes para p< 0.05. Os valores estão representados como Média ± SEM para n = 9.
A redução significativa da concentração de glicose e glicogênio no fígado de matrinxã em jejum (Figura 2) sugere o seu fornecimento para manter os níveis plasmáticos de glicose (Figura 2a). O aumento da capacidade de glicogenólise do fígado pode ser devido às mudanças de hormônios reguladores da glicemia no plasma, insulina e glucagon (Pereira et al., 1995). A manutenção dos teores de glicose sanguíneos é importante, pois muitos tecidos, como o cérebro, utilizam preferencialmente glicose como fonte energética. O fígado é responsável por exportar glicose oriunda de glicogênio para os tecidos extra-hepáticos, pois os estoques musculares deste polissacarídeo não são utilizados para manutenção da glicemia de outros tecidos (Hemre et al., 2002). Este estoque é direcionado para queima local pela demanda do exercício (Van Den Thillart & Van Raaij, 1995). O glicogênio muscular é utilizado somente após o esgotamento do glicogênio hepático em período de jejum induzido (Jobling, 1994). Em matrinxã, o fígado provavelmente exerceu sua função de manutenção da glicemia, pois não houve uma diminuição significativa dos estoques de glicogênio muscular (Figura 2d).
A manutenção da glicemia pode também acontecer a partir de precursores não glicídicos, como lactato, piruvato e aminoácidos. A diminuição significativa das concentrações de lactato nos tecidos analisados (Figura 2b) e a manutenção de lactato no plasma aliada ao aumento da concentração de glicose plasmática (Figura 2a) do grupo Jejum podem ter ocorrido devido à utilização destas moléculas na gliconeogênese. A manutenção das concentrações de piruvato no plasma, no músculo branco e no fígado dos grupos Controle, SO e SO+AAEL (Figura 2c) possivelmente está ligada à manutenção do metabolismo energético pela hidrólise de glicose obtida a partir do alimento. Porém a privação alimentar do grupo Jejum provavelmente estimulou a gliconeogênese hepática a
partir de piruvato hepático e de piruvato proveniente de outros tecidos. Isto é sugerido pela redução significativa da concentração de piruvato hepático e o aumento significativo da concentração dessa molécula no plasma.
Figura 2. Perfil glicídico de plasma, músculo branco e fígado de B. amazonicus em diferentes materiais analisados. a) glicose, b) lactato, c) piruvato e d) glicogênio.Os peixes foram colocados em diferentes condições alimentares: Jejum, Controle, SO, SO+AAEL, SA e SA+AAEL. Os valores das concentrações médias de glicose, de lactato e piruvato do plasma estão expressos em μmol/ml de plasma e do músculo branco e do fígado estão expressos em μmol/mg de tecido. Os valores das concentrações glicogênio do músculo branco e do fígado estão expressos em µmol glicosil-glicose/g de tecido. Letras diferentes no mesmo grupo de tecido representam medias estatisticamente diferentes para p<0.05. Os valores estão representados como Média±SEM para n=9.
O aumento significativo do glicogênio hepático no tratamento SO deve-se à glicogênese (Figura 2d). Porém, a invariabilidade da concentração de glicose hepática neste grupo pode ser devida à maior mobilização de aminoácidos do fígado para a produção de glicose por gliconeogênese (Figura 3b). Esse fato é corroborado pelo significativo aumento da concentração de amônia plasmática (Figura 3c). Possivelmente, estes aminoácidos são oriundos de proteínas hidrolisadas do alimento, já que não se observa nenhuma redução nas concentrações de proteínas nos tecidos analisados no grupo SO (Figura 3a). Além da glicose (oriunda de gliconeogênese a partir de aminoácidos) estar sendo incorporada ao glicogênio hepático, também está sendo liberada para o sangue o que provoca seu aumento plasmático neste grupo.
Caso semelhante deve estar ocorrendo com o grupo SO+AAEL, porém, como a taxa de gliconeogênese a partir de aminoácidos neste grupo é menor, já que há aumento significativo da concentração de aminoácidos e diminuição significativa da amônia no fígado (Figura 3), pode-se notar que há uma diminuição significativa da concentração de glicose hepática neste grupo (Figura 2a). Essa diminuição de glicose no fígado pode ter causado também a mobilização de TG deste órgão e do plasma para que o suprimento energético neste
órgão fosse mantido (Figura 1a). O aumento significativo da concentração de aminoácidos no músculo branco (Figura 3b) pode ser devido à sua maior absorção pelo trato digestório graças à sua maior disponibilidade na dieta deste grupo. Possivelmente o excesso de aminoácidos hepático foi utilizado para a síntese de proteínas plasmáticas, justificando seu aumento significativo no plasma (Figura 3a). A síntese protéica é alta no fígado e este órgão é extremamente sensível a qualquer variação na composição da dieta (Carter & Houlihan, 2001).
Figura 3. Perfil proteico de plasma, músculo branco e fígado de B. amazonicus em diferentes materiais analisados. a) Proteína, b) aminoácidos e c) amônia. Os peixes foram colocados em diferentes condições alimentares: Jejum, Controle, SO, SO+AAEL, SA e SA+AAEL. Os valores das concentrações de proteína do plasma estão expressos em mg/ml de plasma e do músculo branco e do fígado estão expressos em mg/mg de tecido. Os valores das concentrações médias de aminoácidos e amônia do plasma estão expressos em μmol/ml de plasma e do músculo branco e do fígado estão expressos em μmol/mg de tecido. Letras diferentes no mesmo grupo de tecido representam medias estatisticamente diferentes para p<0.05. Os valores estão representados como Média±SEM.
Admite-se que as proteínas possam ser a fonte energética durante os jejuns prolongados nos peixes (Van Den Thillart & Van Raaij, 1995). Entretanto, como a estrutura morfo-funcional dos organismos é formada significativamente por proteínas, as mudanças em sua composição devem ser bem pequenas e sem significância estatística, sendo basicamente o resultado de outras mudanças no tecido, tais como o conteúdo de água, lipídios e glicogênio. Por isso, muitos estudos utilizam os aminoácidos e a produção de amônia para inferir sobre o metabolismo protéico (Moyes et al., 1992). A gliconeogênese a partir de aminoácidos é uma característica central da privação de alimentos nas enguias e nos salmonídeos para a manutenção da glicemia (Love, 1980). Como as concentrações de aminoácidos hepáticos, plasmáticos e musculares variaram significativamente (Figura 3b), e as concentrações de amônia foram maiores no plasma do grupo Jejum (Figura 3c), podemos inferir que esse grupo utilizou sua estrutura protéica para a manutenção de suas necessidades energéticas, apesar de
terem sido mantidas constantes as concentrações de proteína plasmática e muscular, e a proteína hepática ter aumentado significativamente (Figura 3a).
Agradecimentos
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio financeiro.
Referências
BIDINOTTO, P. M.; SOUZA, R. H. S. & MORAES, G. Hepatic glycogen in eight tropical freshwater teleost fish: A procedure for field determinations of micro samples. Bol. Tec. Cepta, v.1, p.53-60. 1997.
BRADFORD, M. M.; MCRORIE, R. A. & WILLIAM, W. L. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. A. Anal Biochem., v.72, p.248-254. 1976.
CARTER, C. G. & HOULIHAN, D. F. Protein Syntesis. In: P. WRIGHT & ANDERSON, P (Ed.). Nitrogen Excretion. Fish Physiology Series. Boca Raton - NY: Academic Press, v.20. 2001. p.31-75. COLLINS, A. L. & ANDERSON, T. A. The influence of changes in food availability on the activities of key degradative and metabolic enzymes in the liver and epaxial muscle of the golden perch. Journal of Fish Biology, v.50, n.6, p.1158-1165. 1997.
COPLEY, N. G. Alloxan and ninhydrin test. Analyst, v.66, p.492-493. 1941.
GENTZKOW, C. J. & MAZEN, J. M. An accurate method for the determination of blood urea nitrogen by direct nesslerization. J. Biol. Che., v.143, p.531-544. 1942.
GOMIERO, J. S. G.; RIBEIRO, P. A. P.; FERREIRA, M. W. & LOGATO, P. R. V. Rendimento de carcaça de peixe matrinxã (Brycon cephalus) nos diferentes cortes de cabeça. Ciênc. agrotec., v.27, n.1, p.211-216. 2003.
HARROWER, J. R. & BROWN, C. H. Blood latic acid. A micromethod adaptes to field collection of microliter samples. J. Appl. Physiol., v.32, p.224-228. 1972.
HEMRE, G. I.; MOMMSEN, T. P. & KROGDAHL, A. Carbohydrates in fish nutrition: effects on growth, glucose metabolism and hepatic enzymes. Aquaculture Nutrition, v.8, n.3, p.175-194. 2002. JOBLING, M. Fish bioenergetics. London: Chapman & Hall. 1994. 309 p.
KROGDAHL, A.; NORDRUM; SORENSEN; BRUDESETH & ROSJO. Effects of diet composition on apparent nutrient absorption along the intestinal tract and of subsequent fasting on mucosal disaccharidase activities and plasma nutrient concentration in Atlantic salmon Salmo salar L. Aquacult. Nutr., v.5, n.2, p.121-133. 1999.
LOVE, R. M. The Chemical Biology of Fishes. London: Academic Press, v.2. 1980. 943 p.
LU, G. D. The metabolism of pyruvic acid in normal and vitamin B-deficient state. I. A rapid specific and sensitive method for the estimation of blood pyruvate. Biochem. J., v.33, p.249-254. 1939.
MELO, J. F. B. Digestão e metabolismo de jundiá (Rhamdia quelen) submetido a diferentes regimes alimentares. 2004. 80 p. Tese. (Doutorado). Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2004.
MOYES, C. D.; MATHIEU-COSTELLO, O.; BRILL, R. W. & HOCHACHKA, P. W. Mitochondrial metabolism of cardiac and skeletal muscle from a fast (Katsuwonus pelanis) and a slow (Cyprinus
carpio) fish. Can. J. Zool., v.70, p.1246-1253. 1992.
NORVÁK, M. Colorimetric ultramicro method for the determination of here fatty acids. J. of Lipid Research., v.6, p.431-433. 1965.
PEREIRA, C.; VIJAYAN, M. M. & MOON, T. W. In vitro hepatocyte metabolism of alanine and glucose and the response to insulin in fed and fasted rainbow trout. Journal of Experimental Zoology, v.271, n.6, p.425-431. 1995.
VAN DEN THILLART, G. & VAN RAAIJ, M. Endogenous fuels, non invasive versus invasive approaches. In: P.W. HOCHACHKA & MOMMSEN, P. (Ed.). Biochemistry and Molecular Biology of Fishes Metabolic Biochemistry. Amsterdam: Elsevier Science, v.4. 1995. p.33-63.
