INFECÇÃO DE Deroceras sp. COM Davainea proglottina (DAVAINE, 1860) DE Gallus gallus NO BRASIL E ALGUNS ASPECTOS
MORFOLÓGICOS DO CISTICERCÓIDE
FLORENCE GONÇALVES MARTINS
U N I V E R S I D A D E FEDERAL RURAL DO RIO DE J A N E I R O INSTITUTO DE B I O L O G I A
CURSO DE P Ó S - G R A D U A Ç Ã O EM M E D I C I N A V E T E R I N Á R I A P A R A S I T O L O G I A V E T E R I N Á R I A
INFECÇÃO DE Derocera s sp. COM Davainea proglottina (DAVAINE, 1860) DE Gallus gallus NO BRASIL E A L G U N S A S P E C T O S
M O R F O L Ó G I C O S DO C I S T I C E R C Ó I D E
FLORENCE GONÇALVES MARTINS
SOB A ORIENTAÇÃO DO PROFESSOR: DR. JOSÉ LUIZ DE BARROS A R A Ú J O
Tese submetida como requisito par-cial para a obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária -Parasitologia Veterinária
ITAGUAÍ, RIO DE JANEIRO AGOSTO, 1990
T Í T U L O DA TESE
I N F E C Ç Ã O DE Deroceras sp. COM Davainea proglottina (DAVAINE, 1860) DE Gallus gallus NO B R A S I L E A L G U N S A S P E C T O S
M O R F O L Ó G I C O S DO C I S T I C E R C Ó I D E
A U T O R
FLORENCE GONÇALVES MARTINS
TESE A P R O V A D A EM: 15/ 08/ 1990
JOSÉ LUIZ DE B A R R O S A R A Ú J O
D E L I R C. G. M. DA S E R R A F R E I R E
A o s m e u s p a i s e i r m ã o s pelo constante incenti- vo e a p o i o .
A G R A D E C I M E N T O S
P e l o s o b s t á c u l o s que nos e n s i n a m r e s i s t ê n c i a , P e l a s p r o v a ç õ e s que nos i n d u z e m à p a c i ê n c i a , P e l a s l á g r i m a s que nos lavam os olhos,
p a r a que v e j a m o s c o m m a i s c l a r e z a ,
P e l o s d e s e n g a n o s que nos a c o r d a m p a r a a r e a l i d a d e , P e l o s a m i g o s que, p o r amor, em meio a tudo, c o m p a r - t i l h a m c o n o s c o t r i s t e z a s e a l e g r i a s ,
Por t o d a s as f o r ç a s que nos a r r a n c a m da i n é r c i a p a r a a c o n s t r u ç ã o de um m u n d o m e l h o r ,
P o r seu a m o r
B I O G R A F I A
Florence Gonçalves Martins, filha de Antonio Francisco Martins e Wanda Gonçalves Martins, nasceu a 19 de janeiro de 1963, na Cidade do Rio de Janeiro, RJ.
No primeiro semestre de 1981 ingressou no curso de Me- dicina Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio de Ja- n e i r o , g r a d u a n d o - s e em a g o s t o de 1985.
Em março de 1987 ingressou no curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Parasitologia Veterinária, a nível de M e s t r a d o , n a U n i v e r s i d a d e F e d e r a l Rural do Rio de Janeiro.
ÍNDICE 1. I N T R O D U Ç Ã O 2. R E V I S Ã O D E L I T E R A T U R A 2.1. C e s t ó i d e 2 . 1 . 1 . T a x i o n o m i a e b i o l o g i a 2 . 1 . 2 . D i s t r i b u i ç ã o g e o g r á f i c a 2 . 1 . 3 . P a t o g e n i c i d a d e 2.2. M o l u s c o s 2.3. I n f e c ç õ e s 3. M A T E R I A L E M É T O D O S 3.1. C o l h e i t a e m a n u t e n ç ã o d o s h o s p e d e i r o s 3 . 1 . 1 . M o l u s c o s a. E s p é c i e s b. L o c a i s de c o l h e i t a c. T r a n s p o r t e d. M a n u t e n ç ã o e m l a b o r a t ó r i o 3 . 1 . 2 . A v e s 3.2. I n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l n o h o s p e d e i r o i n t e r m e - P á g i n a 1 3 3 3 4 4 6 8 11 11 11 11 11 12 12 13
d i á r i o 3.3. H i s t o l o g i a e h i s t o q u í m i c a do c i s t i c e r c ó i d e 4. R E S U L T A D O S E D I S C U S S Ã O 4.1. P e s q u i s a de a v e s p o r t a d o r a s dos c e s t ó i d e s a- d u l t o s 4.2. R e c e p t i v i d a d e dos m o l u s c o s ao m a t e r i a l i n f e c - t a n t e 4.3. I n f e c ç õ e s p o s i t i v a s 4 . 3 . 1 . A s p e c t o s h i s t o l ó g i c o s e h i s t o q u í m i c o s do c i s t i c e r c ó i d e 4.4. I n f e c ç õ e s n e g a t i v a s 5. C O N C L U S Õ E S 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS v i i i P á g i n a 14 16 17 17 17 18 19 20 26 27
ÍNDICE DE FIGURAS P á g i n a 22 23 24 25 F I G U R A 1. F I G U R A 2. F I G U R A 3. F I G U R A 4. F o t o m i c r o g r a f i a de c i s t i c e r c ó i d e de
Davainea
proglottina.
Rostelo ao centro e ventosas. H.E., 1000 xF o t o m i c r o g r a f i a de c i s t i c e r c ó i d e de
Davainea
proglottina.
Camada externa e camada fina. P.A.S., 1000 x F o t o m i c r o g r a f i a de c i s t i c e r c ó i d e deDavainea
proglottina.
C a m a d a m a i s e x t e r n a , c a m a d a fi- b r o s a i n t e r n a e c o r p ú s c u l o s c a l c á r i o s . T r i - c r ô m i c o de G o m o r i , 1000 x F o t o m i c r o g r a f i a de c i s t i c e r c ó i d e deDavainea
proglottina.
C a m a d a e x t e r n a e c a m a d a fina. A l c i a n Blue, 1000 xRESUMO
Observações foram feitas acerca do ciclo de
Davainea
proglottina
(Davaine, 1860) com o principal objetivo de se deter- minar um possível hospedeiro intermediário para este parasito no Brasil. Para isso foram testadas cinco espécies de moluscos:Bradybaena similaris
Fèrussac, 1821,Bulimulus tenuissimus
Orbig- ny, 1835,Leptinaria unilamellata
Orbigny, 1835,Subulina octona
Brugière, 1789 e
Deroceras sp.
Rafinesque, 1820. Nestas infec- ções foram utilizadas proglótides grávidas deste cestóide, obti- das de galinhas naturalmente infectadas.Cisticercóides foram encontrados somente em
Deroceras
sp.,
13 dias após a infecção, sendo evidenciados em cortes his- tológicos, na parede do tubo digestivo e na cavidade geral des- tes moluscos.Alguns testes histoquímicos foram utilizados como auxí- lio na evidenciação e caracterização destes cisticercóides.
S U M M A R Y
Experimental research was conduct to clarify the possi- ble role played by species of molluscs from Southeastern Brazil in the life cycle of Davainea proglottina (Davaine, 1860). Five species Bradybaena similaris Fèrussac, 1821, Bulimulus tenuis- simus Orbigny, 1835, Subulina octona Brugière, 1789 and Deroce- ras sp. Rafinesque, 1820 were used. Gravid proglotids obtained from naturally infected chickens were given to molluscs. Cysti- cercoids were found in tissue section only in Deroceras sp. 13 days post infection in the walls of digestive tube and in the body cavity of the slugs.
Some h i s t o c h e m i c a l tests were used to help in eviden- tiation and identification of these cysticercoids.
1. INTRODUÇÃO
Entre os cestóides que parasitam as aves domésticas, Davainea proglottina (Davaine, 1860) é um dos principais, pela frequência com que é encontrado e, principalmente, pelas lesões que provoca, resultantes da patogenicidade para o hospedeiro.
Não existem informações relativas à transmissão do pa- rasito às aves no Brasil, permanecendo-se dependentes da lite- ratura mundial. Esta literatura refere várias espécies de molus- cos como h o s p e d e i r o s intermediário e a infecção das aves se dá de forma passiva, com a ingestão do molusco portando o cisti- cercóide.
Das espécies referidas como hospedeiros intermediári- os, aquelas pertencentes à família Limacidae prevalecem, mas algumas outras das famílias Zonitidae, Subulinidae, Helicidae e Arionidae são destacadas. Destas, apenas a última citada, não tem r e p r e s e n t a n t e s no Brasil.
Na maioria das vezes, as espécies de moluscos são co- nhecidas somente pelos caracteres conquiliológicos ou de morfo- logia externa, o que também representa uma dificuldade no estu- do de todos os aspectos que a elas se relacionem. As espécies
da família Limacidae são conhecidas pelos caracteres de anatomia visceral; contudo, embora várias delas sejam citadas no Brasil, há carência de estudos comparativos para a segura definição de suas identidades.
Se avaliarmos a distribuição geográfica destas espécies de moluscos passíveis de atuarem como hospedeiros intermediários de D. proglottina, bem como a da própria espécie do cestóide, constatamos que existe, em quase todas as regiões, pelo menos uma espécie capaz de atuar como tal, mas nem sempre com a mesma eficiência. Existem peculiaridades que determinam a preferência do parasito e que precisam ser detectadas em cada caso. Por ou- tro lado, em algumas áreas é frequente o parasitismo sem que ain- da tenha sido d e t e c t a d o um p o s s í v e l h o s p e d e i r o i n t e r m e d i á r i o .
O estudo morfológico da ontogenia do parasito no hospe- deiro intermediário permite interpretar o seu desenvolvimento até completa maturação, quando está capaz de infectar o hospe- deiro final a p r o p r i a d o .
Estes são alguns dos tópicos cuja abordagem é essencial para o início dos estudos e que se objetivou conhecer como aspec- tos básicos para a adoção de medidas de controle do parasitismo em etapas futuras.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Cestóide
2.1.1. Taxionomia e biologia
Este parasito foi originalmente observado em galinhas na França por DAVAINE (1860), conforme DAVAINE (1877), que o descre- veu como Taenia proglottina.
BLANCHARD (1891) propôs o gênero Davainea recombinando T. proglottina que foi considerada como espécie tipo do novo gê- nero.
KALYANKAR e cols. (1984), revisando este gênero, propuse- ram três subgêneros: Davainella, Blanchardea e Davainea; neste úl- timo foi i n c l u í d a a e s p é c i e Davainea proglottina.
Este parasito se localiza no duodeno de galinhas e, ape- sar de seu tamanho diminuto (0,5 a 4,0, mm de comprimento), pos- sui ventosas e rostelo armados de ganchos e se fixam profundamen- te entre as vilosidades intestinais. As proglótides grávidas são eliminadas nas fezes. São ativas e se arrastam pelo solo liberan- do os ovos. Uma vez ingerido pelo molusco hospedeiro intermedi-
ário, o ovo liberta o embrião hexacanto que penetra a parede do tubo digestivo do hospedeiro se encistando nos tecidos deste. Es-se processo de formação do cisticercóide leva de 13 a 26 dias (ABDOU, 1958), dependendo da temperatura ambiente. As aves se in- fectam ingerindo os moluscos contendo o cisticercóide maduro e começam a eliminar proglótides grávidas nas fezes em 15 dias (BAYON, 1933) e 20 dias (CHANDLER, 1923).
2.1.2. D i s t r i b u i ç ã o g e o g r á f i c a
Esta espécie é considerada cosmopolita. No Brasil, DUAR- TE (1981), em uma lista de parasitos no Estado do Rio de Janei- ro, não cita a ocorrência de D. proglottina. Mais tarde, COSTA e cols. (1986) assinalam esta espécie nas seguintes unidades da Fe- deração: Pará, Maranhão, Pernambuco, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Rio G r a n d e do Sul e D i s t r i t o Federal.
2.1.3. Patogenicidade
A patogenicidade deste cestóide para o hospedeiro defi- nitivo ainda não é bem definida, apesar dele ser apontado como o m a i s p a t o g ê n i c o para as aves.
BAYON (1933) se refere a posturas insatisfatórias em a- ves com infecções graves por este parasito durante observações a campo. Comenta ainda uma possível relação entre a paralisia avi- ária ou neurolinfomatose e a forma grave deste parasitismo. Nes- tes casos o autor considerou a infecção como maciça (acima de 2000 espécimes) e o parasito foi encontrado em quase todo o in- testino.
DICK & BURT (1970), discutindo a patogenicidade de ces- tóides, comentam que TAYLOR (1933), trabalhando com D. proglotti- na, infectou experimentalmente frangos de 10 semanas de idade e não encontrou correlação entre a severidade da infecção e o atra- so de ganho de peso, mesmo onde mais de 3000 vermes estavam pre- s e n t e s em u m a ú n i c a ave.
LEVINE (1938b) parece ter sido o primeiro a conduzir um experimento sob condições controladas para verificar os efeitos deste parasito em frangos de corte. Não foram notados nas aves sintomas que pudessem ser atribuídos diretamente ao parasitismo, mas a diferença no ganho de peso entre o grupo infectado e o gru- po controle foi significativa. Tal diferença não foi somente, es-tatística, mas também perceptível sob o ponto de vista prático, s e n d o e s t a de até 12%.
Segundo SOULSBY (1965) D. proglottina é o mais patogêni- co de todos os cestóides de galinha. Ele fica profundamente inse- rido entre as vilosidades do duodeno causando necrose da mucosa com inflamação hemorrágica. Ocorre edema e infiltração celular excessiva e o duodeno contém muco e fragmentos celulares. Em in- fecções maciças uma enterite hemorrágica pode levar à morte, mas em casos crônicos a enterite está associada com debilidade geral e emagrecimento. Distúrbios nervosos têm sido atribuídos à infec- ção por este parasito, mas nenhum trabalho foi publicado que sus- t e n t e e s t a h i p ó t e s e .
Outros autores como KALKUS (1928), BISSET (1928), NE- VEU -LEMAIRE (1936) e REID (1984) citam ainda apatia, penas eri- çadas, movimentos lentos, fraqueza nas pernas e dificuldade res- p i r a t ó r i a como s i n t o m a s n a s a v e s i n f e c t a d a s por D. proglottina.
2.2. Moluscos
Apesar de representarem o maior grupo de animais, de- pois dos insetos, os Mollusca ainda c o n t i n u a m pouco conhecidos, principalmente com relação a sua sistemática e a literatura espe- c í f i c a é escassa.
THIELE (1931) classificou os Mollusca caracterizando-os até o nível de subgênero.
SCOTT (1945) publicou uma lista de espécies de moluscos terrestres e aquáticos coletadas em Tilcara, Argentina, quando se refere à identificação de Agriolimax laevis baseada principal- mente em a s p e c t o s m o r f o l ó g i c o s da rádula.
PILSBRY (1948) apresentou uma classificação para a famí- lia Limacidae onde considerou Agriolimax como sinônimo de Deroce- ras e a l g u m a s espécies daquele gênero foram incluídas neste.
MORRETES (1949) relaciona as espécies de moluscos que ocorrem no Brasil. Para a família Limacidae cita o gênero Agrio- limax com as espécies A. agrestis e A. laevis, e Limax flavus e Milax gargates. Dentre os subulinidae cita Subulina octona e Leptinaria lamellata; e ainda Bradybaena similaris (Fruticicoli- ade) e B u l i m u l u s t e n u i s s i m u s (Bulimulidae).
GETZ (1959), a partir de observações no campo e no labo- ratório, comenta aspectos da reprodução, alimentação, preferênci- as de habitat, umidade e temperatura de Arion circumscriptus, De- r o c e r a s l a e v e e D e r o c e r a s r e t i c u l a t u m .
BURCH (1960), recorrendo à caracteres de morfologia ex- terna, classifica os moluscos, inclusive limacídeos, para os quais havia quarentena obrigatória nos Estados Unidos da Améri- ca. Esse autor (BURCH, 1982) atualiza a sistemática de Mollusca.
STEPHENSON & KNUTSON (1966) apresentam uma revisão sobre a associação de lesmas com outros invertebrados dos filos Insec- ta, Protozoa, Nemathelminthe e Platyhelminthe. Nesta, citam ABDOU (1958) a respeito da presença de cisticercóides de D. proglottina em e s p é c i e s das famílias L i m a c i d a e e A r i o n i d a e .
HYMAN (1967) comenta aspectos de morfologia, fisiologia, h i s t o l o g i a e c o m p o r t a m e n t o das seis c l a s s e s de M o l l u s c a .
WALKER (1970) estudou os tipos celulares encontrados em glândula digestiva de Agriolimax reticulatus e discutiu as possí- veis funções de cada uma delas. O mesmo autor (WALKER, 1972) tam- bém estudou fagocitose e absorção de nutrientes nessa espécie de molusco.
MALEK & CHENG (1974) detalharam hematologia e mecanismos de defesa interna de molusco; suas relações com parasitos, além de comentar aspectos histológicos e histoquímicos de moluscos. Es- tudos histológicos foram feitos no Brasil por BONFATI (1974) em manto de Megalobulimus sp. e BONFATI (1980) em tubo digestivo des- ta m e s m a espécie.
BOFFI (1976) cita para o Brasil as espécies Limax maxi- mus, L. flavus e D. reticulatum para a família Limacidae e B. si- milaris para a família Bradybaenidae. ARAÚJO (1982) cita a ocor- rência e distribuição no Brasil de S. octona, Leptinaria unilamel- lata, B. similaris, B. tenuissimus e Deroceras sp. entre outros, além de descrever anatomicamente as três primeiras espécies lis- tadas.
DUTRA (1988) descreve aspectos da biologia e reprodução de L. u n i l a m e l l a t a , o b s e r v a n d o u m a p o p u l a ç ã o em P e r n a m b u c o .
2 . 3 . I n f e c ç õ e s
GRASSI & ROVELLI (1889) foram os primeiros a sugerir que o hospedeiro intermediário de D. proglottina poderia ser uma lesma. Eles identificaram experimentalmente Limax flavus, L. ci- nereus e A. agrestis como hospedeiros intermediários deste para- sito.
MEGGITT (1916) em Birmingham, Inglaterra, fracassou em suas tentativas de infectar cinco Arion ater, seis Arion horten- sis, 18 A. circumscriptus e 45 A. agrestis utilizando proglótides grávidas sobre vegetais que serviriam de alimento às lesmas. Dis- secações e cortes histológicos não mostraram desenvolvimento de cisticercóides. O tempo entre a infecção e a dissecação variou entre 10 e 35 dias. Tentando explicar o insucesso das infecções, enumerou alguns fatores que julgou importantes como a incerteza do completo desenvolvimento dos ovos, a possibilidade da não in- g e s t ã o p o r todas as l e s m a s e a m o r t e das l e s m a s i n f e c t a d a s .
CHANDLER (1923), nos EUA, encontrou 150 cisticercóides em um dos 25 A. agrestis naturalmente infectados, coletados de quintal de galinhas. Os cisticercóides foram dados às duas ga- linhas e após 20 dias estas estavam eliminando nas fezes progló- tides de D. proglottina. Estas foram dadas a dois A. agrestis e quatro L. flavus. Nos dois primeiros foram encontrados cisticer- cóides maduros 22 dias depois. Nos quatro últimos, somente um c i s t i c e r c ó i d e foi e n c o n t r a d o .
Novamente resultados negativos foram obtidos por BISSET (1928) testando a preferência de A. agrestis em ingerir proglóti- des grávidas frente a outros alimentos. Colocou estas lesmas du- rante 14 dias em uma placa de Petri contendo um número definido
de segmentos grávidos e pedaços de repolho. Ambos eram trocados diariamente. Por vezes, o autor retirava o repolho e ainda assim as lesmas não i n g e r i r a m as p r o g l ó t i d e s .
JONES (1929) infectou experimentalmente com proglótides grávidas de D. proglottina os seguintes moluscos: Zonitoides arborea, Vallonia indentata, Gasterodonta ligera e Polygyra thy- roides. Infectando frangos com cisticercóides provenientes des- tes moluscos, obteve o parasito adulto no intestino destas aves.
TAYLOR (1933), in ABDOU (1956), capturou moluscos natu- ralmente infectados, que foram administrados à frangos em doses variando de 25 a 304. Os moluscos capturados foram: Thrichia se- ricia, Helicella virgata, Helicella caprata e A. agrestis. Como resultado ele obteve adultos de D. proglottina nas aves infecta- das.
BAYON (1933) capturou A. agrestis de uma área onde ga- linhas não tinham acesso e alimentou-os com proglótides grávidos de D. proglottina. Apesar da grande mortalidade das lesmas, algu- mas sobreviveram o tempo suficiente para desenvolver cisticercói- des maduros. Estes foram dados à duas frangas que após três sema- nas apresentaram poucos cestóides adultos no duodeno (três e 33).
LEVINE (1938a) infectou A. agrestis com proglótides grá- vidas de D. proglottina e após três a quatro semanas as lesmas foram dadas a galinhas das quais foram recuperadas nas fezes pro- glótides grávidas do parasito. O mesmo autor (LEVINE, 1938b) in- fectou 17 galinhas com 75 A. agrestis infectados experimentalmen- te, recuperando até mais de 5.000 cisticercóides maduros de três das aves i n f e c t a d a s .
ABDOU (1956) demonstrou em trabalhos experimentais que as seguintes espécies foram capazes de atuar como hospedeiros in-
10 termediários de D. proglottina: Agriolimax carvanae, A. reticula- tus, L. cinereus. L. flavus, Milax gracilis, M. sowerby, Arion hortensis, A. circumscriptus e A. intermedius. Este mesmo autor (ABDOU, 1958) estudando o cisticercóide em vários estágios de de-senvolvimento identificou ainda mais três espécies de moluscos como hospedeiros intermediários deste parasito: Agriolimax carua- nne, A. agrestis e Arion empericorum. Demonstrou também a termo- dependência deste parasito durante o estágio larvar. À temperatu- ra de cerca de 15°C, os cisticercóides necessitam de 26 dias pa- ra se tornarem infectantes para a ave, enquanto que à 25°C isto foi conseguido em 13 dias.
3. M A T E R I A L E MÉTODOS
3.1. C o l h e i t a e m a n u t e n ç ã o dos h o s p e d e i r o s
3.1.1. Moluscos
a. E s p é c i e s
Durante 1988-89 foram realizadas colheitas de espécimes de B. similaris, S. octona, L. unilamellata e B. tenuissimus. De setembro a novembro de 1989 foram colhidos espécimes de Deroce- ras sp.
b. Locais de c o l h e i t a
Os caramujos foram capturados no campus da UFRRJ e em outras áreas do município de Itaguaí; no bairro de Vila da Pe- nha, município do Rio de Janeiro; em São José do Vale do Rio Pre- to, município de Petrópolis, todos no Estado do Rio de Janeiro. Também no município de Viçosa, Estado de Minas Gerais. As lesmas foram encontradas somente nas duas últimas, das localidades ci-
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tadas e no m u n i c í p i o de Piquete, E s t a d o de São Paulo.
Os caramujos foram retirados de seus habitats, lugares úmidos, sombreados, sob pedras, pedaços de madeira e telhas e fo- lhas. As lesmas foram encontradas em lugares com características semelhantes porém com mais umidade; algumas vezes também foram c o l h i d a s sob f e z e s secas de b o v i n o s e na p a s t a g e m .
Para se estabelecer as criações em laboratório, visando a realização das infecções experimentais, foram colhidos molus- cos preferentemente em áreas onde não tinham acesso galinhas. En- tretanto, para detecção de infecção natural no hospedeiro inter- mediário, foram realizadas colheitas em áreas com ocorrência do p a r a s i t i s m o .
c. T r a n s p o r t e
Os moluscos colhidos foram acondicionados em caixas plásticas com 10 cm de diâmetro por oito cm de profundidade, con- tendo terra retirada dos locais onde os moluscos foram encontra- dos. Sobre a terra foram colocados pedaços de madeira e folhas secas de vegetais para que a umidade se mantivesse por mais tem- po. As caixas com os moluscos foram fechadas com tecido de nylon com m e n o s de 2 m m de malha.
N e s s a s c o n d i ç õ e s foram t r a n s p o r t a d o s os m o l u s c o s c o l h i - dos nas á r e a s de c a p t u r a fora de Itaguaí.
d. M a n u t e n ç ã o em l a b o r a t ó r i o
Os moluscos colhidos foram transferidos para a Estação para Pesquisas Parasitológicas W. O. Neitz, do Curso de Pós-Gra- duação em Medicina Veterinária - Parasitologia Veterinária, da
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U n i v e r s i d a d e F e d e r a l Rural do Rio de J a n e i r o ( E P P - W O N / C P G P V ) . No laboratório os moluscos foram mantidos em caixas de cimento de amianto de 40 x 40 x 20 cm com terra autoclavada (120 °C/30 min.) a uma altura de até 10 cm. Sobre a terra, pedaços de madeira e pedras. As caixas foram fechadas com tela de nylon com m a l h a de 2,0 mm.
As lesmas foram mantidas em potes de plástico com 15 cm de diâmetro por 10 cm de profundidade. Os recipientes continham terra autoclavada até uma altura de 3 cm; sobre esta terra foram colocados pedaços de madeira, pedras e folhas secas. Foram fecha-dos com t e c i d o de n y l o n com m e n o s de 2 mm de m a l h a .
Diariamente todas as caixas eram borrifadas com água pa- ra que a terra se mantivesse úmida. Para a alimentação de todos os molsucos a dieta básica era alface, algumas vezes complementa- da com cenoura, batata e repolho. Como fonte de cálcio, os molus- cos d i s p u n h a m "ad l i b i t u m " de pó de giz.
Das criações eram retirados periodicamente os ovos e/ou filhotes que foram submetidos ao mesmo manejo e condições ambien- tais, e em caixas separadas para serem utilizados nas infecções e x p e r i m e n t a i s .
3.1.2. A v e s
Entre 1987 e 1989 foram adquiridos 30 Gallus gallus de criações de fundo de quintal no campus da UFRRJ e adjacências. As galinhas foram mantidas na EPPWON/CPGPV em gaiolas de arame com 60 x 40 x 50 cm e alimentadas com ração comercial de cresci- mento ou postura e água "ad libitum". Essas aves destinaram-se à detecção de infecção natural, com D. proglotina, através de exa-
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mes coprológicos e necrópsias. Para os exames coprológicos, as fezes foram diluídas em solução fisiológica e examinadas em pla- cas de Petri sob microscópio estereoscópico. Uma vez observada a presença do parasito, iniciava-se o processo de colheita das p r o g l ó t i d e s p a r a a i n f e c ç ã o dos m o l u s c o s .
3.2. Infecção experimental no hospedeiro intermediário
Os caramujos foram infectados com proglótides grávidas de D. proglotina colhidos da luz intestinal das aves durante as necrópsias. As proglótides recolhidas foram colocadas em placas de Petri de 100 x 15 mm com solução fisiológica até reunir quan-tidade suficiente para a infecção. Esse processo não durava m a i s de 2 horas.
As lesmas foram infectadas com proglótides colhidas de fezes eliminadas pelas galinhas adquiridas para o experimento. P a r a o r e c o l h i m e n t o das p r o g l ó t i d e s as f e z e s t o t a i s e r a m c o l h i - das três vezes por dia e examinadas ao microscópio estereoscópi- co. Isto foi feito baseado no trabalho de LEVINE (1938a), onde ele observou que havia uma periodicidade na eliminação de pro-g l ó t i d e s pro-g r á v i d a s .
Antes de serem oferecidas aos moluscos todas as progló- tides eram examinadas para avaliar a viabilidade dos ovos basea- da no completo desenvolvimento das oncosferas e no movimento re- a l i z a d o p o r elas p a r a r o m p e r os ovos.
Para as infecções dos moluscos estabeleceu-se um perío- do m á x i m o de j e j u m p r é - i n f e c ç ã o de 24 h o r a s
No dia da infecção preparava-se uma placa de Petri de 150 x 50 mm com papel de filtro umedecido que recobria todo o fundo da placa. Sobre o papel de filtro eram depositados frag-
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mentos de folhas de alface, sobre os quais foram colocadas pro- g l ó t i d e s i n t e i r a s ou f r a g m e n t o s de D. proglotina.
Todas as infecções foram acompanhadas no microscópio es-tereoscópico para que se tivesse certeza da ingestão de proglóti- des e/ou ovos pelos moluscos. Esses permaneceram na placa de Pe- tri até o dia seguinte à infecção para que pudessem ingerir mai- or quantidade de material infectante. Após esse período, eram transferidos para caixas plásticas de 10 cm de diâmetro por 8 cm de profundidade, com terra autoclavada e fechadas com tecido de n y l o n com m a l h a de m e n o s de 2 mm.
Foram feitas 14 tentativas de infecção dos moluscos, e em cada uma destas, 10 exemplares de cada espécie foram libera- dos nas placas preparadas para esse fim, acompanhando-se a inges- tão de material infectante. Uma vez que nem todos ingeriram, a quantidade final de moluscos infectados variou em cada tentativa. O número de moluscos em cada grupo controle foi igual ao do gru- po i n f e c t a d o .
Além das tentativas de infecção que foram feitas com proglótides recém obtidas do intestino das aves necropsiadas ou das fezes frescas dos hospedeiros vertebrados, também foram ten- tadas infecções com proglótides obtidas de necrópsias e mantidas até 15 horas após a colheita; isso para verificar se o contato destas com a ambiente influenciava na capacidade infectiva dos ovos. Nessa abordagem as proglótides foram contadas, divididas em três grupos e mantidas em três placas de Petri de 50 x 50 mm. Em um dos grupos as proglótides foram estocadas sobre fezes de galinha; no outro permaneciam imersas em solução fisiológica e no terceiro foram depositadas no próprio vidro do fundo da placa de Petri. Depois disso as proglótides eram transferidas para a placa de infecção e o procedimento era o mesmo utilizado com to-
16 dos os m o l u s c o s .
Para avaliar a influencia da temperatura no desenvolvi- mento do cisticercóide, dois grupos de caramujos infectados fo- ram mantidos, durante 15 dias após terem ingerido ovos de D. proglotina em estufa para BOD com temperatura controlada a 27°C e u m i d a d e r e l a t i v a de 70 ± 10%.
Transcorridos 20 dias de infecção, isolava-se as par- tes moles dos caramujos, retirando-as das conchas pelo rompimen- to destas; procedia-se o exame com auxílio de microscópio este- reoscópico, e fixava-se o material em formol-cálcio de Baker. As lesmas foram fixadas inteiras após morte natural, oito, 12 e 13 dias após a infecção.
3.3. H i s t o l o g i a e h i s t o q u í m i c a do c i s t i c e r c ó i d e
Após a fixação, iniciou-se o processamento histológico quando as partes moles dos moluscos foram desidratadas na série crescente de álcoois e diafanizadas no xilol. O tempo de perma- nência do material em cada etapa desse processo foi reduzido de- vido à fragilidade do tecido. Após a desidratação e diafanização o material foi incluído em blocos de parafina. Os cortes em sé- rie f o r a m r e a l i z a d o s com e s p e s s u r a de 5 µm.
P a r a os e s t u d o s m o r f o l ó g i c o s , os cortes f o r a m c o r a d o s com hematoxilina e eosina. Para estudos histoquímicos, a respei- to dos envoltórios do cisticercóide foram utilizados as seguin- tes técnicas: Tricrômico de Gomori (seg. GOMORI, 1950) para evi- denciação de fibras conjuntivas colágenas; PAS (seg. PEREIRA, 1970) (ácido periódico de Schiff) para evidenciação de mucopolis- sacarídeos neutros e Alcian Blue pH O,5 e 2,5 (seg. PEREIRA, 1970) p a r a c a r a c t e r i z a ç ã o de m u c o p o l i s s a c a r í d e o s ácidos.
4 . RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. P e s q u i s a de aves portadoras dos cestóides adultos
Para a obtenção de proglótides grávidas para as infec- ções dos moluscos, foram examinadas trinta galinhas de fundo de quintal, obtendo-se um índice de 80% de aves infectadas, assina- lando-se desta forma a presença deste cestóide também no Estado do Rio de Janeiro.
4.2. Receptividade dos moluscos ao material infectante
A receptividade das lesmas às proglótides foi superior quando comparada a dos caramujos. Mesmo quando estas não estavam em jejum de 24 horas a ingestão das proglótides era quase imedia- ta e se estas eram colocadas longe dos fragmentos de alface, e- ram preferidas a estes. BISSET (1928) observou um comportamento contrário com A. agrestis utilizando repolho e proglótides grá- vidas de D. proglottina. As lesmas sempre ingeriram o vegetal e não as p r o g l ó t i d e s .
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ram maior receptividade às proglótides do que B. similaris e B. tenuissimus. Além disso, quando fezes de galinha foram colocadas na placa de Petri com os moluscos, para observação do comporta- mento destes, as Deroceras sp. foram as únicas que não somente ficaram em contato com as fezes, como também as ingeriram. Esta diferença no comportamento de caramujos e lesmas também foi ob- servada por ABDOU (1956) quando ele relata que as lesmas foram a-traídas pelas fezes de aves, nas quais pareceram se alimentar. Também foi notado quão facilmente estas lesmas, especialmente A. reticulatus, devoraram as proglótides, enquanto por outro lado, os caramujos não mostraram qualquer destes hábitos. BAYON (1933) também comenta que as lesmas devoram as proglótides quase pronta- mente.
Estes fatores podem favorecer a infecção de Deroceras sp. em r e l a ç ã o aos outros moluscos.
4 . 3 . I n f e c ç õ e s p o s i t i v a s
Foram consideradas desta forma as infecções dos molus- cos, nas quais após decorridos os 13 dias, foram detectados os cisticercóides. Tal fato só aconteceu nas infecções utilizando- se Deroceras sp. Os cisticercóides foram observados nos cortes histológicos, localizados na parede do tubo digestivo do molus- co e l i v r e s em v á r i o s pontos da cavidade geral.
Para obtenção dos cisticercóides foram feitas duas in- fecções, utilizando-se 22 lesmas. Apenas oito ingeriram o mate- rial infectante e destas apenas seis sobreviveram o tempo mínimo para o completo desenvolvimento do cisticercóide, com ventosas e r o s t e l o a r m a d o s de ganchos observados ao m i c r o s c ó p i o ótico (Fig. 1). A quantidade de cisticercóides encontrados em cada lesma va-
riou de 1 a 5.
18
4 . 3 . 1 . A s p e c t o s h i s t o l ó g i c o s e h i s t o q u í m i c o s do c i s t i c e r c ó i d e
No estudo histológico verificou-se que os cisticercói- des localizavam-se na parede do tubo digestivo, no córion, entre o epitélio e a camada fibro-conjuntiva e também na cavidade ge- ral.
Com relação à localização, CHANDLER (1923) relata que alguns dos cisticercóides foram encontrados livres na cavidade do corpo da lesma, mas muitos deles estavam embebidos nos teci- dos, p a r t i c u l a r m e n t e nas p a r e d e s do canal a l i m e n t a r .
ABDOU (1958) observou que as oncosferas tinham penetra- do a parede intestinal 24 horas depois de ingeridas e algumas de- las foram encontradas na cavidade do corpo entre o estômago e a glândula salivar e algumas entre o intestino e a glândula diges- tiva.
Como resultado dos testes histoquímicos, verificou-se que os tecidos que envolvem o escólex dispõe-se em camadas, que também haviam sido observadas por ABDOU (1958), e que são descri-tas a seguir:
- uma camada mais externa, fibrosa, resultante da reação do hos- pedeiro, evidenciada pela coloração com o Tricrômico de Gomori o que c a r a c t e r i z a a p r e s e n ç a de f i b r a s c o n j u n t i v a s (Fig. 3);
- uma camada externa, delgada, fina, própria do cisticercóide com reação ao P.A.S. e ao Alcian Blue fortemente positiva indi- cando a p r e s e n ç a de m u c o p o l i s s a c a r í d e o s á c i d o s (Fig. 2 e 4);
- a b a i x o d e s t a um r e v e s t i m e n t o g r a n u l a r com p r e s e n ç a de c é l u l a s , caracterizada pela coloração com Hematoxilina-eosina, e com rea-
20 ção ao P.A.S. e ao Alcian Blue positivas, porém menos intensa que na c a m a d a anterior;
- uma membrana basal fina, com reação ao P.A.S. e ao Alcian Blue positivas;
- uma camada fibrosa mais interna, espessa, evidenciada pelo Tri- crômico de Gomori, indicando a presença de fibras conjuntivas (Fig. 3);
- internamente, envolvendo o escólex, e abaixo dessa camada fi- brosa, estão n u m e r o s o s c o r p ú s c u l o s c a l c á r e o s (Fig. 3).
Estes resultados conferem com aqueles obtidos por ABDOU (1958), que também identificou seis camadas no cisticercóide de D a v a i n e a p r o g l o t t i n a em A g r i o l i m a x reticulatus.
4.4. Infecções negativas
Ao exame das localizações prováveis do cisticercóide em cortes histológicos ou nos exames ao microscópio estereoscópio, que seriam principalmente no aparelho digestivo em sua porção mé- dia, não foram encontradas formas que se assemelhassem a ele. Es- te fato ocorreu com S. octona, L. unilamellata, B. similaris e B. tenuissimus, tanto nas infecções experimentais, como com os espé- cimes colhidos nas áreas de alta incidência do parasitismo entre as aves. BAYON (1933) encontrou apenas 3 a 5% de A. agrestis in- fectados em áreas de grande parasitismo. Comparando-se ambos re- sultados, os negativos podem ter sido devidos a fatores que impe- diram a detecção de tão baixos índices, ou provavelmente estas es- pécies de moluscos não sejam os hospedeiros intermediários de e- leição na região. Levando-se em conta também que Deroceras sp., positiva para a infecção experimental, não ocorria na região onde
21 a parasitose alcançava altos índices nas aves, sugere que uma ou- tra espécie de molusco não estudada possa estar atuando no ciclo. Pensou-se também na possibilidade de alguma influência da tempe- ratura sobre os moluscos e a infecção. Para eliminação desta pos- sibilidade os moluscos infectados foram colocados em estufa B.O. D. à 27°C e umidade relativa de 70 ± 10%. Também para se elimi- nar a possibilidade da necessidade da proglótide ficar em conta- to com o ambiente, foram utilizadas proglótides com 15 horas de eliminação. Mesmo diante destas variações os resultados mantive- ram-se n e g a t i v o s .
Estes resultados permitem apontar Deroceras sp. como uma espécie susceptível de atuar como hospedeiro intermediário de D. proglottina no Brasil. Contudo, muitos fatores podem fazer com que este fato possa se alterar, pois as características am- bientais variadas das diferentes regiões, podem também provocar variações no comportamento dos parasitos, determinando-lhes si- tuações que favoreçam o seu desenvolvimento, até mesmo a prefe- rência por outra espécie como seu hospedeiro intermediário. As- sim se pode explicar como fator provável a existência de muitas espécies apontadas na literatura como hospedeiro intermediário, sem contudo atuarem como tal em áreas endêmicas da parasitose.
Outros fatores precisam ser estudados como o comporta- mento de cada espécie de molusco nas várias condições ambientais durante seu ciclo de vida, determinando-se assim as oportunida- des que são oferecidas aos parasitos para as infecções, explican- do-se então a atuação de espécies diferentes com maior eficiên- cia em d i f e r e n t e s regiões.
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F I G U R A 1. F o t o m i c r o g r a f i a de c i s t i c e r c ó i d e de Davainea proglo- ttina. N o t a r o r o s t e l o ao c e n t r o (R) e as v e n t o s a s
23
FIGURA 2. Fotomicrografia de cisticercóide de Davainea proglo- ttina. Notar a camada mais externa, própria do cis- ticercóide (CEC) e camada externa (CE). P.A.S., 1000
24
F I G U R A 3. F o t o m i c r o g r a f i a de c i s t i c e r c ó i d e de Davainea proglo-
ttina. Notar a camada mais externa, resultante da
re-ação do h o s p e d e i r o (CEH), a c a m a d a f i b r o s a i n t e r n a (CF) e os corpúsculos calcários (CC). Tricrômio de Gomori, 400 x.
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F I G U R A 4. F o t o m i c r o g r a f i a de c i s t i c e r c ó i d e de Davainea proglo- ttina. N o t a r a c a m a d a m a i s externa, p r ó p r i a do cis- ticercóide (CEC) e a camada externa (CE). Alcian Blue, 1000 x.
5. CONCLUSÕES
Diante destes resultados obtidos, concluimos que:
1. Davainea proglottina é um cestóide assinalado em Gallus gallus também no Estado do Rio de Janeiro.
2. Deroceras sp. é um hospedeiro intermediário, no Bra- sil, de Davainea proglottina.
3. Através de estudos histológicos e histoquímicos, ve- rificou-se que o cisticercóide é composto de seis camadas, assim dispostas de fora para dentro: camada fibroconjuntiva própria do hospedeiro; camada fina, própria do cisticercóide; camada celu- lar; membrana basal; camada conjuntiva e corpúsculos calcários.
4. Subulina octona, Leptinaria unilamellata, Bradybaena similaris e Bulimulus tenuissimus, frequentes nas áreas endêmi- cas da parasitose, foram negativos nas infecções esperimentais.
5. Pela ausência de Deroceras sp. e a negatividade das espécies citadas acima, sugere-se a hipótese de outros moluscos atuarem como hospedeiros intermediários de D. proglottina em á- reas onde o p a r a s i t i s m o é frequente.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDOU, A. H. 1956. O b s e r v a t i o n s on the life c y c l e of Davainea proglottina in Britain. J. Helmint., 3 0 ( 4 ) : 1 8 9 - 2 0 2 .
ABDOU, A. H. 1958. Studies on the d e v e l o p m e n t of Davainea pro- glottina in the i n t e r m e d i a t e host. J. Parasit., 44: 4 8 4 - 4 8 8 .
A R A Ú J O , J. L. B. 1982. A l g u n s m o l u s c o s t e r r e s t r e s como h o s p e d e i - ros i n t e r m e d i á r i o s de p a r a s i t o s de a n i m a i s d o m é s t i c o s no B r a s i l : E s t u d o s sobre a n a t o m i a , s i s t e m á t i c a de p a r t i c i p a ç ã o em h e l m i n t o s e s . Tese de D o u t o r a d o - UFRRJ, 104 p. BAYON, H. P. 1933. "Recent a d v a n c e s in o u r k n o w l e d g e of d i s e a s e s . Three l e c t u r e s at the I m p e r i a l C o l l e g e of L e c t u r e I". Vet. Rec., 13: 6 5 5 - 6 6 9 .
p o u l t r y Science.
B I S S E T , N. 1928. O b s e r v a t i o n s on Davainea proglottina in the do- m e s t i c fowl, w i t h a note on Amoebotaenia sphenoids V. Linstow.
Vet. Jour., 84: 19-32.
B L A N C H A R D , R. 1891. "Notices h e l m i n t h o l o g i q u e s (2 me. ser.) Sur les t è n i a d é s a v e n t o u s e s a r m é e s g e n r e s Echynocotyle, Davainea,
28
Ophriocotyle. Mém. Soc. Zool. France, 4: 420-489.
BOFFI, A. V. 1979. Moluscos Brasileiros de Interesse Médico e Econômico. 182 pp. 191 figs. Hucitec ed.
BONFATI, I. D. 1975. Histologia do manto de Megalobulimulus (Gas-tropoda, Pulmonata, Stylommatophora, Megalobulimidae). Bole-tim do Instituto de Ciências Biológica e Geociências da UFJF, 17: 1-36.
BONFATI, I. D. 1980. Histologia do tubo digestivo de Megalobuli-mus (Gastropoda, Pulmonata, Stylommatophora, Magalobulimidae). Boletim do Instituto de Ciências Biológicas e Geociêneias da UFJF, 28: 1-59.
BURCH, J. B. 1960. Some snails and slugs of quarantine signifi-cance to the United States. Sterkiana, 2: 13-53.
BURCH, J. B. 1982. Taxonomic and nomenclatural changes since 1960 in snails and slugs of quarantine significance to the United States. Malacol. Rev., 15(1-2): 141-142.
CHANDLER, A. C. 1923. Observations on the life cycle of Davainea proglottina in the United States. Trans. Amer. Micros. Soc., 42: 144-147.
COSTA, H. M. A.; GUIMARÃES, M. P.; LEITE, A. C. R. & LIMA, W. S. 1986. Distribuição de helmintos Parasitos de Animais Domésti-cos no Brasil. Arq. Bras. Med. Vet. Zoot., 38(4): 465-579.
DAVAINE, C. 1877. Traité des Entozoaires et des maladies vermi-neuses da l'homme et des animaux domestiques. J. B. 1003 p.
29
ilust. 2º ed. Paris, Libraire.
DUARTE, M. J. F. 1981. Helmintos Parasitas dos Animais Domésticos no Estado do Rio de Janeiro. Arq. Esc. Vet. UFMG, Belo
Horizon-te, 33(1): 67-98.
DUTRA, A. V. C. 1988. Aspectos da biologia e da reprodução de Leptinaria unilamellata (Orbigny, 1835). Rev. Bras. Zool., 5
(4): 581-585.
DICK, T. A. & BURT, M. D. B. 1970. The life cycle and seasonal variation of Davainea tetraoensis. Fuhrmann, 1919, a cestode parasite of ruffed grouse Bonasa umbellus (L.). Can. J. Zoo., 49: 109-119.
GETZ, L. L. 1959. Notes on the Ecology of Slugs: Arion circums-criptus, Deroceras reticulatum and D. laeve. Am. Mid. Nat., 61
( 2 ) : 4 8 5 - 4 9 8 .
GOMORI, G. 1950. A rapid one-step Trichrome stain. Amer. J. Clin. Pathol., 20(7): 661-664.
GRASSI, G. B. & ROVELLI, G. 1889. "Embryologische Forschungen an Cestodes". Zbl. Bakt., 5: 370-377; 401-410.
HYMAN, L. H. 1967. The Invertebrates. Vol. VI. Mollusca. Mc. Graw-Hill Book Co. New York. 792 pp.
JONES, M. F. 1929. Report of cysticercoids of Davainea proglotti-na from four species of sproglotti-nails. J. Parsit., 15: 223-224.
30 Davainea proglottina in Washington. J. Am. Vet. Med. Ass., 73: 612-616.
KALYANKAR, S. D.; DESHMUKH, A. L. & VYAS, G. H. 1984. Revision of the genus Davainea Blanchard, 1891 (Cestoda: Davaineidae). Ri-vista di Parasitologia, 1(45): 407-409.
LEVINE, P. P. 1938a. Observations on the biology of the poultry cestode Davainea proglottina in the intestine of the host. J. Parasit., 24: 423-431.
LEVINE, P. P. 1938b. The effect of infection with Davainea proglo-ttina on the weights of growing chickens. J. Parasit., 24:550 -551.
MALEK, E. A. & CHENG, T. C. 1974. Medical and Economic Malacolo-gy. Academic Press. London. 398 pp.
MEGGITT, F. 1916. "A contribution to the knowledge of the tape-worms of fowls and sparrows". Parasit., 8: 390-410.
MORRETES, F. L. 1949. Ensaio de Catálogo dos Moluscos do Brasil. Arq. Mus. Paranaense, Curitiba, 7: 5-216.
NEVEU-LEMAIRE, M. 1936. Traité D'helminthologie Médicale et Vete-rinaire. Vigot Frères ed., Paris. x-xxiii + 1-1514 p. 787 fig.
PEREIRA, G. C. 1970. Contribuição ao estudo dos mucopolissacarí-deos do epitélio da vesícula biliar do cobaio (Cavia porce-llus) Tese de Mestrado. 53 pp. Rio de Janeiro.
Me-31
xico). Mon. Acad. Nat. Sci. Philad., 3(2): xlvii + 1113 PP. 585 figs.
REID, W. M. 1984. Cestodes. In: Diseases of Poltry (HOFSTAD, M. S., ed.). Iowa State University Press, Ames, Iowa. pp. 649-67.
SCOTT, M. I. H. 1945. Faunula malacologica de Tilcara. Rev. do Museo de La Plata, 4: 195-211.
SOULSBY, E. J. L. 1965. Textbook of Veterinary Clinical Parasito-logy. Blackwell Scientific Publications, Oxford. 1119 p.
STEPHENSON & KNUTSON, 1966. A Resumé of Recent studies of Inver-tebrate Associated with Slugs. J. Econ. Entomol., 59(2): 356-360.
WAITE, T. A. 1988. Huddling and postural adjustments in response to desiccating conditions in Deroceras reticulatum (Muller). J. Moll. Stud., 5 4 ( 2 ) 249-250.
THIELE, J. 1931. Handbuch der Systematischen Weichtierkinde. 1: vi + 1-778, 783 figs. Jena.
WALKER, G. 1970. The cytology, histochemistry, and ultrastruc-ture of the cell types found in the digestive gland of the slug Agriolimax reticulatus (Muller). Protoplasma, 71: 91-109.
WALKER, G. 1972. The digestive system of the slug Agriolimax reticulatus (Muller): Experiments on phagocytosis and nutri-ents absorption. Proc. Malacol. Soc. London, 40: 33-43.
