FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ENEIDA DIAS VIANNA BRAGA
ESTUDO DE COLONIZAÇÃO NASAL POR Staphylococcus aureus EM
CRIANÇAS QUE FREQUENTAM CRECHES COMUNITÁRIAS DO
MUNICÍPIO DE NITERÓI, RIO DE JANEIRO
NITERÓI, RJ
2013
1
ESTUDO DE COLONIZAÇÃO NASAL POR Staphylococcus aureus EM
CRIANÇAS QUE FREQUENTAM EM CRECHES COMUNITÁRIAS DO
MUNICÍPIO DE NITERÓI, RIO DE JANEIRO
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Médicas da Universidade
Federal Fluminense como requisito
parcial à obtenção do título de
Mestre. Área de concentração:
Ciências Médicas
Orientadora: Profa. Dra. Claudete Aparecida Araújo Cardoso
Coorientador: Prof. Dr. Sérgio Setúbal
NITERÓI, RJ
2013
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ENEIDA DIAS VIANNA BRAGA
ESTUDO DE COLONIZAÇÃO NASAL POR Staphylococcus aureus EM
CRIANÇAS QUE FREQUENTAM CRECHES COMUNITÁRIAS DO
MUNICÍPIO DE NITERÓI, RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre. Área de Concentração: Ciências
Médicas
Aprovado Em: ____/_____/____
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________ Profa. Dra. Ianick Souto Martins - UFF
__________________________________________________ Prof. Dra. Rosana Rocha Barros - UFF
__________________________________________________ Prof. Dr. Ivano Raffaele Victorio de Filippis Capasso - FIOCRUZ
Niterói 2013
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Aos meus pais por terem me ensinado a perseverança, o pensamento crítico, e a
busca da verdade. Aos meus amigos pela confiança na minha capacidade e todo o
incentivo. Com amor e gratidão.
4
Agradecimentos
Agradeço a meus orientadores, em especial a professora Claudete, pela oportunidade, incentivo, amizade e ensinamentos, que foram muito além dos técnicos;
Ao professor Fábio Aguiar Alves pela condução da realização dos exames laboratoriais que possibilitou a realização do projeto e por toda a orientação;
Ao professor Sérgio Setúbal pelas apropriadas correções e todo o incentivo;
À Verônica e Cláudia, Ivete, Teresa e Isabel, parceiras nessa jornada, em especial Verônica e Cláudia pela inestimável ajuda na elaboração do projeto e na coleta dos dados;
Às alunas de Iniciação Científica Monique, Thami e Ana Paula pela presteza e excelente desempenho na coleta do material, aplicação dos questionários e digitação do banco de dados, que foram imprescindíveis na realização do projeto;
À equipe do Laboratório de Epidemiologia Molecular e Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense, com especial gratidão à Fátima e Giorgio pelo empenho e seriedade no processamento das amostras;
Ao Robert Snyder, Mariel Marlow e Lee W. Riley pela preciosa ajuda na elaboração do artigo; À professora Dejanira, então responsável pelo Programa Criança na Creche da Prefeitura de Niterói pelo apoio e colaboração no acesso as creches;
A todas as diretoras, as professoras e as funcionárias das 23 creches visitadas pelo acolhimento e ajuda na coleta dos dados;
Aos pais, avós e responsáveis que confiaram a nós suas preciosas crianças, colaborando também com o preenchimento dos questionários e pelo exercício de cidadania ao concordarem em
participar de um projeto para o bem coletivo e o progresso científico;
5 Aos amigos e familiares que suportaram meus momentos de afastamento e reclusão, me incentivaram e foram bons ouvintes nos meus momentos difíceis.
6
“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me
em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras,
enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”.
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RESUMO
O surgimento de cepas de Staphylococcus aureus (S. aureus) resistentes a meticilina em ambiente comunitário (CA-MRSA) tem sido um desafio, dadas a sua rápida propagação mundial na última década, com significativas taxas de morbimortalidade na população pediátrica. As evidências demonstram que a colonização nasal pode funcionar como reservatório da bactéria na comunidade, e indivíduos colonizados tem maior chance de desenvolver infecção. O objetivo desse estudo foi descrever a prevalência de colonização nasal por S. aureus e MRSA em crianças que frequentam creches comunitárias do município de Niterói, RJ, utilizando métodos genotípicos para caracterizar as amostras resistentes a meticilina, e identificar possíveis fatores associados à colonização nasal destas crianças. Trata-se de estudo de corte transversal, realizado em 23 creches comunitárias de Niterói entre agosto de 2011 e outubro de 2012, com 500 crianças de 3 meses a 6 anos, selecionadas por amostra de conveniência. A média das idades foi de 4 anos (desvio padrão ±1,3) e 256 (51,2%) eram do sexo masculino. Um questionário contendo dados clínicos e epidemiológicos foi aplicado aos pais e responsáveis. A coleta foi realizada por rotação de suabe estéril nas narinas anteriores. As amostras isoladas de S. aureus foram submetidas ao teste de sensibilidade a oxacilina e cefoxitina por disco-difusão. Nas amostras de MRSA foi realizada, por reação em cadeia da polimerase (PCR), a pesquisa dos genes de resistência (mecA) e de patogenicidade lukS-PV e lukF-PV. A tipagem do cassete cromossômico estafilocócico (SCCmec, Staphylococcus chromosomal cassette mec) foi feita por reação de PCR multiplex. As taxas de colonização nasal por S. aureus e MRSA foram de 48% e 6,2%, respectivamente. Na análise bivariada, os fatores associados à colonização por S. aureus foram a frequência à creche por período maior que 12 meses [p=0,002, OR=1,85 (IC 95%=1,26-2,63)], idade maior que 36 meses [p=0,011, OR=1,66 (IC 95%=1,12-2,50)] e frequentar creche localizada em favela [p<0,001 OR=2,44 (IC95%=1,50-3,95)]. Após análise multivariada, os fatores associados a colonização por S. aureus foram a frequência à creche por mais de 12 meses e a localização das creches em favelas. Os fatores associados à colonização por MRSA foram uso de antibióticos ß-lactâmicos nos últimos 30 dias [p=0,003, OR=3,24 (IC95%=1,42-7,38)] e frequência a creches localizadas em favelas [p=0,001, OR=3,27 (IC95%=1,52-7,00)]. A regressão logística não foi conduzida para os MRSA em decorrência do pequeno tamanho da amostra. Não houve, entre os grupos frequentando creches dentro ou fora de favelas, diferença significativa quanto ao número de coabitantes, grau de instrução da mãe ou à renda familiar. Das 31 amostras de MRSA, 23 carreavam SCCmecIV (74,2%), duas amostras o SCCmecIII (6,5%) e quatro amostras, presumivelmente, o SCCmecII (12,9%). Duas amostras não foram tipadas. Em cinco amostras de MRSA, o gene da PVL estava presente (16,1%). Os clones identificados por spa typing predominantes foram t002 (11/22) e t318 (4/22), correspondendo a 50% e 18,2% respectivamente. São necessárias mais investigações visando à caracterização molecular das amostras de MRSA em distintos ambientes comunitários, para que se possam obter dados que permitam avaliar a disseminação local e global de infecções por CA-MRSA.
PALAVRAS CHAVE: Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus resistente a meticilina. Creches.
8
ABSTRACT
The emergence of community associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) infections has been a challenge, particularly in the last decade, due to their fast global spreading and their significant morbidity and mortality rates, with impact on the pediatric population. Evidence has shown that nasal carriers can function as a reservoir of the bacteria in the community and that S. aureus carriers have higher chances of developing infection. The aim of this study was to describe the prevalence of S. aureus and MRSA nasal colonization in children attending day-care centers (DCC) in the city of Niterói, Rio de Janeiro, using molecular methods to characterize methicillin-resistant isolates and identify possible factors associated with nasal colonization of these children. The study was cross-sectional and conducted in 23 community DCCs in Niterói, from August 2011 to October 2012, with 500 children aged 3 months to 6 years, selected by convenience sampling. The mean age at admission to the study was 4 years (SD 1·3). The overall study population was 51·2% male. A questionnaire containing clinical and epidemiological data was applied to parents and caretakers. Cultures were obtained by rotating a sterile swab in each of the anterior nares. Isolates of S. aureus were tested for susceptibility to oxacillin and cefoxitin performed by disk-diffusion method. For all oxacillin or cefoxitin resistant isolates the presence of the mecA gene was determined by polymerase chain reaction (PCR). All MRSA samples were assessed by PCR for detection of genes mecA, lukS-PV and lukF-PV and typing of staphylococcal cassette chromosome (SCCmec Staphylococcus
chromosomal cassette mec) by multiplex PCR. S. aureus and MRSA nasal colonization rates
were 48% and 6.2% respectively. Factors associated with colonization with S. aureus were DCC attendance over 12 months [p <0.01, OR: 1.85 (95% CI: 1.26-2.63)], age greater than 36 months, [p = 0.011, OR: 1.66 (95% CI: 1.12-2.50)] and attending DCC in slum areas [p <0.01 OR: 2.44 (95% CI 1.50 to 3.95)]. In multivariate analysis only DCC attendance over 12 months and the DCC location in slum areas remained significant. Factors associated with MRSA colonization were using beta-lactam antibiotics in the previous 30 days [p <0.01, OR: 3.24 (95% CI: 1.42 to 7.38)] and attending DCC in slum areas [p <0.01, OR: 3.27 (95% CI: 1.52 to 7.00)]. Logistic analysis was not conducted for MRSA carriage due to small sample size. Among the groups attending DCCs in slum and non-slum areas, there was no significant difference in the number of cohabitants, mother educational level or household income. Of the 31 MRSA samples, 23 harbored SCCmecIV (74.2%), four samples presumably harbored SCCmecII (12.9%) and two samples harbored, SCCmecIII (6.5%). Two samples were not typed. PVL gene was present in five MRSA isolates (16.1%). The predominant spa typing clones found were t002 (11/22) and 318 (4/22), corresponding to 50% and 18.2% respectively. Further investigation is needed to molecularly characterize clinical isolates of MRSA in different community settings in order to provide informative data to assess local and global spreading of CA-MRSA infections.
KEYWORDS: Staphylococcus aureus. Methicillin resistant Staphylococcus aureus. Day-care centers.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BHI: Brain Heart InfusionCA-MRSA: Community-associated Staphylococcus aureus (associado à comunidade)
ccr: Cassete Chromosome Recombinases
HA-MRSA: Healthcare-associated Staphylococcus aureus (associado à assistência à saúde) CCIH: Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CDC: Centers for Disease Control and Prevention CLSI: Clinical and Laboratory Standard Institute CV: Core Variable Genes
EUA: Estados Unidos da América IC: Intervalo de confiança
IWG-SCC: International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette
Chromosome Elements
Kb: Quilobases
LA-MRSA: Livestock-associated MRSA (associado a pecuária) MGE: Mobile genetic elements ou Elementos Genéticos Móveis MMWR: Morbidity and Mortality Weekly Report
MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus resistente a meticilina)
MS: Ministério da Saúde
MSSA: Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus sensível a meticilina)
OR: Odds ratio
10
pb: pares de base
PBP: Penicillin Binding Protein PCR: Polymerase chain Reaction
PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis PVL: Panton-Valentine Leukocidin
SCCmec: Staphylococcal Chromosome Cassete mec SCIH: Serviço de Controle de Infecção Hospitalar SENTRY: SENTRY Antimicrobial Surveillance Program S. aureus: Staphylococcus aureus
VRSA: Staphylococcus aureus resistente a Vancomicina UFF: Universidade Federal Fluminense
11 LISTA DE TABELAS
pg. TABELA 1 Descrição das principais características epidemiológicas e clínicas das
crianças das creches comunitárias de Niterói incluídas na pesquisa de colonização nasal por S. aureus, período de agosto de 2011 a outubro de 2012
53
TABELA 2 Análise bivariada do status de colonização nasal por região geográfica de
crianças das creches comunitárias de Niterói incluídas na pesquisa de colonização nasal por S. aureus, período de agosto de 2011 a outubro de 2012
55
TABELA 3 Creches comunitárias de Niterói incluídas no estudo de colonização nasal
por S. aureus com respectivas regiões geográficas, amostras coletadas, percentuais de S. aureus e MRSA, período de agosto de 2011 a outubro de 2012
55
TABELA 4A Análise bivariada das variáveis epidemiológicas e clínicas em relação ao estado de colonização nasal por S. aureus de crianças atendidas nas creches comunitárias de Niterói no período de agosto de 2011 a outubro de 2012
56
TABELA 4B Análise bivariada das variáveis epidemiológicas em relação ao estado de
colonização nasal por S. aureus de crianças atendidas nas creches comunitárias de Niterói no período de agosto de 2011 a outubro de 2012
57
TABELA 5A Análise bivariada das variáveis epidemiológicas e clínicas em relação ao estado de colonização nasal por MRSA de crianças atendidas nas creches comunitárias de Niterói no período de agosto de 2011 a outubro de 2012
58
TABELA 5B Análise bivariada das variáveis epidemiológicas em relação ao estado de
colonização nasal por MRSA de crianças atendidas nas creches
comunitárias de Niterói no período de agosto de 2011 a outubro de 2012 59
TABELA 6 Fatores associados de crianças frequentando creches comunitárias de
Niterói por área geográfica, período de agosto de 2011 a outubro de 2012 60
TABELA 7 Regressão logística avaliando fatores associados a colonização nasal por S. aureus em crianças frequentando creches comunitárias de Niterói, período de agosto de 2011 a outubro de 2012
62
TABELA 8 Tipagem do SCCmec, spa e presença de PVL nas amostras de MRSA 64 em creches comunitárias de Niterói, período de agosto de 2011 a
12
LISTA DE QUADROS
pg. QUADRO 1 Atuais tipos de SCCmec encontrados em amostras de S. aureus 28 QUADRO 2 Atuais tipos de genes ccr identificados em S. aureus 29
QUADRO 3 Os cinco “Cs” da transmissão de CA-MRSA 31
QUADRO 4 Características do Staphylococcus aureus relacionado à assistência à saúde (HA-MRSA) e associado à comunidade (CA-MRSA) 33 QUADRO 5A Estudos sobre a colonização por S. aureus e MRSA em crianças
pré-escolares saudáveis em ambientes comunitários. Descrição da população/ Resultados
37
QUADRO 5B Estudos sobre a colonização por Staphylococcus
aureus e MRSA em crianças em crianças pré-escolares saudáveis
em ambientes comunitários. Resultados
38
QUADRO 6 Descrição das sequências dos primers utilizados para a detecção do gene mecA, sua posição de ligação no genoma de S. aureus e o tamanho do fragmento gerado
46
QUADRO 7 Descrição das sequências dos primers utilizados para a detecção dos genes lukS-PV e lukF-PV e o tamanho do fragmento gerado
47
QUADRO 8 Primers utilizados na abordagem multiplex-PCR para classificação
do SCCmec com a respectiva especificidade e tamanho do respectivo fragmento amplificado
13 LISTA DE FIGURAS
pg. FIGURA 1 Gráfico mostrando diferentes percentuais de colonização nasal por S.
aureus em diferentes regiões geográficas com perfis de resistência de
crianças atendidas em creches comunitárias de Niterói no período de agosto de 2011 a outubro de 2012
54
FIGURA 2 Mapa de Niterói com localização das creches comunitárias
pesquisadas 61
FIGURA 3 Eletroforese em gel de agarose para a tipagem do SCCmec por PCR multiplex de parte das amostras
65
FIGURA 4 Eletroforese em gel de agarose para a tipagem do SCCmec por PCR multiplex de parte das amostras
65
FIGURA 5 Cromatograma de algumas das amostras MRSA para análise do sequenciamento do SPA.
66
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE 1 Termo de consentimento livre e esclarecido 78 APÊNDICE 2 Questionário de coleta de dados clínicos e epidemiológicos 79 APÊNDICE 3 Listagem das creches participantes do estudo com número de 80 alunos por creche
LISTA DE ANEXOS
14 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 15
2 REVISÃO DA LITERATURA 18
2.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 18
2.1.1 Estrutura genômica do S. aureus 19
2.1.2 Colonização nasal por S. aureus 20
2.2 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA 21
2.2.1 Resistência a penicilina 22
2.2.2 Resistência a meticilina 22
2.2.2.1 História e Epidemiologia 22
2.2.2.2 Aspectos genotípicos dos MRSA 24
2.2.2.3 Métodos moleculares usados na classificação dos S. aureus e MRSA 25
2.2.2.4 Componentes e Classificação dos SCCmec 26
2.2.3 Resistência a vancomicina 29
2.2.4 CA-MRSA 30
2.2.4.1 Tipos de SCCmec encontrados no CA-MRSA 34
2.2.4.2 Fatores de virulência associados ao CA-MRSA 34
2.3 2.3.1 2.3.2 CRECHES Creches comunitárias Creches e MRSA 35 35 36 3 OBJETIVOS 40 3.1 OBJETIVO GERAL 40 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 40 4 METODOLOGIA 41 4.1 TIPO DE ESTUDO 41
4.2 LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO 41
4.2.1 Ambiente e períododo estudo 41
4.2.2 População do estudo e recrutamento dos indivíduos 41
4.2.3 Análises laboratoriais 41
4.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO NO ESTUDO 42
4.4 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO NO ESTUDO 42
4.5 COLETA DE DADOS 42
4.6 CÁLCULO DO TAMANHO DA AMOSTRA E ANÁLISE ESTATÍSTICA 43
4.7 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA 44
4.8 EXTRAÇÃO DO DNA BACTERIANO 45
4.9 TESTE MOLECULAR CONFIRMATÓRIO DE RESISTÊNCIA À METICILINA E
DETECÇÃO DOS GENES DA LEUCOCIDINA PANTON-VALENTINE
46
4.10 DETERMINAÇÃO DO TIPO ESTRUTURAL DO CASSETE CROMOSSÔMICO
ESTAFILOCÓCICO MEC
47
4.11 SEQUENCIAMENTO DA PROTEÍNA A (“spa typing”) 49
5 CONSIDERAÇÕES SOBRE OS ASPECTOS ÉTICOS 51
6 RESULTADOS 52
7 DISCUSSÃO 67
8 CONCLUSÃO 76
9 APÊNDICES 78
9.1 APÊNDICE 1:TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 78
9.2 APÊNDICE 2: QUESTIONÁRIO DE DADOS CLÍNICOS E EPIDEMIOLÓGICOS 79
9.3 APÊNDICE 3:LISTAGEM DO NÚMERO DE ALUNOS POR CRECHES
PARTICIPANTES DO ESTUDO
15
10 ANEXOS 81
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
81
16
1- INTRODUÇÃO
Staphylococcus aureus (S. aureus) é um dos principais causadores de infecção em crianças, podendo apresentar alta morbimortalidade. Trata-se de um patógeno importante na etiologia de infecções de pele, de tecidos subcutâneos, do trato respiratório inferior e do sistema osteoarticular. Infecções por S. aureus são de difícil tratamento pela virulência deste micro-organismo e porque envolvem resistência antimicrobiana. A resistência à penicilina em ambiente comunitário e hospitalar em todo o mundo já está amplamente disseminada (DIEKEMA et al., 2001; CHAMBERS et al., 2009) e S. aureus resistente a meticilina (MRSA) é um dos principais agentes de infecções em ambientes hospitalares. Na última década, o surgimento de S. aureus resistente a meticilina associado à comunidade (CA-MRSA) tem se configurado como um novo desafio, já assumindo caráter endêmico em diversos países como os EUA, onde a epidemia de CA-MRSA já apresenta mais vítimas fatais que a epidemia de aids (DELEO & CHAMBERS, 2009). Tal agente atinge principalmente crianças e jovens previamente sadios que não apresentavam fatores de risco associados à assistência a saúde. O quadro clínico de infecções por CA-MRSA, em aproximadamente 90% dos casos, é de infecções de pele e de partes moles, mas este agente é também responsável por apresentações clínicas graves como fasciite necrosante e/ou potencialmente fatais como pneumonias necrosantes. Estes quadros podem ter caráter fulminante, levando ao óbito nas primeiras seis horas de evolução da doença (KLUYTMANS-VANDENBERGH & KLUYTMANS, 2006; MILLER & DIEP, 2008; DELEO & CHAMBERS, 2009). A infecção por MRSA tem tido grande impacto clínico e econômico, com alto custo para
17 os pacientes, para os hospitais e para a sociedade. Soma-se a isto a tendência do aumento das hospitalizações devidas a infecções por CA-MRSA. (SOLA et al., 2012; IWAMOTO et al., 2013) Investigações epidemiológicas, apoiadas por técnicas de biologia molecular, em indivíduos colonizados e infectados por S. aureus e MRSA em ambiente hospitalar e comunitário, tem sido realizadas em todo o mundo. Estas investigações buscam ampliar conhecimentos que auxiliem o combate a estas infecções, empregando para isto estratégias em âmbitos locais e globais (RODRIGUEZ-NORIEGA et al., 2010; STEFANI et al., 2012).
A colonização nasal por S. aureus é, por si só, um fator de risco para o desenvolvimento da infecção estafilocócica. A cepa infectante é geralmente indistinguível da cepa colonizadora (VON EIFF et al., 2001; SAFDAR & BRADLEY, 2008).
No Brasil, as medidas de controle, prevenção e vigilância das infecções por MRSA em ambiente hospitalar são rotineiramente realizadas através das Comissões de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) em todo o país conforme legislação do Ministério da Saúde através da Portaria N.° 2616/98. Tais programas devem incluir, no mínimo, a atuação em vigilância epidemiológica, as normas para o uso racional de antimicrobianos, germicidas e materiais médicos hospitalares, os processos para a prevenção de transmissão de micro-organismos, as normas e rotinas técnicas operacionais, a padronização das medidas de prevenção e controle de infecção hospitalar (IH) e o treinamento dos profissionais de saúde em relação à prevenção e ao controle da IH. A execução dessas medidas se dá através dos Serviços de Controle de Infecção Hospitalar (SCIH). Ou seja, a CCIH, pela sua constituição, tem caráter consultivo e normativo, enquanto o SCIH é o executor do Programa de Controle de Infecção Hospitalar, e tem importância fundamental na implantação das medidas de prevenção e controle da IH (MS, 1998).
Quanto às infecções estafilocócicas oriundas da comunidade, é fundamental conhecer a prevalência local de MRSA, bem como os fatores associados à infecção por esta bactéria, uma vez que os antibióticos ß-lactâmicos ainda são o tratamento de primeira linha no tratamento destas infecções. Tal conhecimento é fundamental para auxiliar a decisão terapêutica empírica, uma vez que escolher outro antimicrobiano é uma medida preconizada sempre que a prevalência de MRSA em uma comunidade exceder 10-15% (KAPLAN, 2005; GORWITZ, 2006).
Esse projeto foi motivado pela necessidade de se conhecer a prevalência de colonização por MRSA em ambiente comunitário no Brasil, e pelo papel que creches comunitárias podem ter como reservatório desse micro-organismo. Busca também fornecer uma melhor compreensão do
18 seu comportamento clínico-epidemiológico em nível local e nacional, com dados que auxiliem nas estratégias de prevenção e vigilância epidemiológica
19
2- REVISÃO DA LITERATURA
2.1- STAPHYLOCOCCUS AUREUS
A espécie S. aureus pertence ao gênero Staphylococcus, família Staphylococcaceae. São bactérias gram-positivas, anaeróbias facultativas, de forma esférica e cor amarelada devido à produção de carotenoides. Agrupam-se em forma de cachos de uvas quando cultivados em meio sólido. Fermentam o manitol e são positivas nos testes de catalase e coagulase. Trata-se da espécie mais virulenta em seu gênero e é a mais importante dentre os estafilococos. São ubíquos constituintes da microbiota, principalmente da cavidade nasal e da pele, podendo tornar-se patogênicos em condições tais como a quebra da barreira cutânea ou a diminuição da imunidade (KLUYTMANS& WERTHEIM, 2005). Sabe-se que cerca de 20 a 40% da população humana é portadora nasal de S. aureus (VAN BELKUN et al., 2009).
S. aureus é um dos agentes patogênicos mais comuns no ser humano, sendo responsável
por infecções superficiais da pele e do tecido subcutâneo e por infecções invasivas, tais como pneumonias, osteomielites, artrites sépticas, endocardites, e infecções cirúrgicas e da corrente sanguínea. Produzem também a síndrome do choque tóxico estafilocócico. Essas infecções podem ter origem comunitária ou hospitalar, e apresentam significativos índices de morbidade e mortalidade (LIU et al., 2011). A combinação de virulência, evasão do sistema imune e aquisição de resistência antimicrobiana fazem do S. aureus um micro-organismo altamente patogênico (CHUA et al., 2013).
20
2.1.1 - Estrutura genômica de S. aureus
O genoma estafilocócico consiste de um cromossomo circular de aproximadamente 2800 pares de bases contendo prófagos, plasmídeos e transpósons. Os genes responsáveis pela virulência e resistência aos antibióticos são encontrados nos cromossomos e nos elementos genéticos móveis extracromossomiais, que podem ser transferidos entre espécies e clones de
Staphylococcus, e também entre outras bactérias gram-positivas (LOWY, 1998).
Seu primeiro sequenciamento genético completo foi realizado em 2001. Muitos elementos ainda têm função desconhecida (KURODA et al., 2001). Sequenciamentos parciais ou completos têm sido depositados por pesquisadores de todo o mundo no banco unificado que contém vários tipos clonais, o GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), o que permite a unificação e o acesso universal aos dados.
A estrutura genômica de S. aureus é composta de três elementos principais. O primeiro é composto de genes centrais encontrados em todas as linhagens e altamente (97%) conservados. O segundo é composto de genes variáveis (denominados CV, do inglês, core variable). Nele estão contidos os genes conhecidos como housekeeping, responsáveis pelo crescimento e pela sobrevivência da bactéria, além de vários genes de virulência. São utilizados para definição das linhagens. O terceiro elemento da estrutura genômica corresponde aos elementos genéticos móveis (MGE), ou frações de DNA que codificam as funções de mobilidade, mais frequentemente de transferência, e menos comumente de recombinação (STEFANI, 2012).
A rápida evolução de clones de S. aureus se dá pela aquisição de diversos MGE, resultando em resistência aos antimicrobianos e na aquisição de fatores de virulência em linhagens sucessivas. Estão incluídos nessas linhagens os HA-MRSA (associados à assistência à saúde), os CA-MRSA (associados ao ambiente comunitário), os VRSA (S. aureus resistentes à vancomicina) e os LA-MRSA (livestock-associated MRSA, associados à pecuária). Cada linhagem tem uma diferente combinação de MGE codificando genes de resistência e fatores de virulência. A transferência horizontal de MGE entre as linhagens, facilitada por sua mobilidade, é o principal mecanismo para a sua rápida evolução (LINDSAY, 2010). O genoma acessório inclui também plasmídeos, transpósons e ilhas de patogenicidade que podem codificar proteínas que
21 contribuem para a virulência e para a capacidade de sobreviver em determinados ambientes (CHAMBERS & DELEO, 2009; STEFANI et al., 2012).
2.1.2 - Colonização nasal por S. aureus
Os mecanismos envolvidos na determinação do estado de portador nasal de S. aureus são multifatoriais e envolvem características do hospedeiro e fatores bacterianos e ambientais (NOUWEN, 2004; SIVARAMAN et al., 2008). Em estudos longitudinais, três perfis foram categorizados em relação à colonização nasal:
- Carreadores persistentes: usualmente carreiam um mesmo clone e possuem uma carga bacteriana maior, o que pode acarretar maior disseminação e mais chances de desenvolvimento de infecção. Correspondem a 10 a 25% dos casos.
- Carreadores intermitentes: podem carrear diferentes clones em momentos distintos e correspondem a 20 a 75% dos indivíduos.
- Não carreadores: nunca ou muito raramente albergam S. aureus. Seu percentual varia entre 5 e 50% (KLUYTMANS et al., 2005).
Diversos fatores parecem determinar o estado de portador de S. aureus em crianças saudáveis. A idade exerce grande influência neste processo, com maiores prevalências de colonização nos menores de seis meses (LEBON et al., 2008) e nas crianças acima de dois anos de idade (LAMARO-CARDOSO, 2009). O maior número de irmãos mais velhos, as famílias maiores, o desmame, a frequência a creches, as mães fumantes e um menor grau de instrução materna são também fatores associados ao estado de portador nasal de S. aureus (PEACOCK, 2003). Crianças cuidadas por grupos não familiares apresentam, quando comparadas com crianças cuidadas por um núcleo familiar, índices elevados de colonização nasal por patógenos respiratórios e uma predisposição a doenças respiratórias virais e bacterianas (BRADY, 2005; LEBON, 2008). Traços comportamentais que favorecem um contato físico mais íntimo, aliados ao uso frequente de antibióticos, têm transformado as creches em ambientes de seleção e de amplificação de patógenos resistentes (ADCOCK et al., 1998; LU et al., 2005).
A colonização nasal é um evento dinâmico, que pode ocorrer logo após o nascimento e durante toda a vida, favorecendo os episódios de infecção. Vários estudos têm estabelecido uma relação causal entre portadores nasais de S. aureus e o subsequente desenvolvimento de infecções estafilocócicas, demonstrando, na maioria das vezes, que a cepa invasiva é indistinguível da cepa
22 colonizadora (VON EIFF et al., 2001; NOUWEN et al., 2005; CREECH et al., 2006; HUANG et al., 2007; SAFDAR& BRADLEY, 2008). Quase todos S. aureus de origem humana podem ser atribuídos a um número limitado de complexos clonais, os quais são igualmente eficazes em colonizar o nariz humano. Em contraste, fatores genéticos humanos parecem predominar entre os determinantes da colonização persistente. A colonização por S. aureus é um processo multifatorial que envolve uma série de fatores bacterianos, diferentes tipos de células epiteliais da cavidade nasal e, talvez, da garganta, além de vários mecanismos de defesa do hospedeiro. Compreender toda a complexidade da colonização por S. aureus poderá permitir o desenvolvimento de melhores estratégias para a erradicação e medidas preventivas contra a recolonização (WEIDENMAIER et al., 2012).
A adesão de S. aureus às superfícies celulares e, em particular, aos componentes da matriz extracelular, é mediada por uma classe de proteínas da parede bacteriana denominada, em inglês, MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). S. aureus tem a capacidade de se aderir ao epitélio escamoso queratinizado das narinas anteriores através do clumping factor B (ClfB) que, ancorado à parede celular da bactéria, funciona como um engate que a fixa à citoqueratina. Vencida essa primeira etapa, S. aureus necessita manter uma proliferação elevada a fim de vencer a renovação constante do epitélio nasal e do muco. Assim, a taxa de proliferação das bactérias precisa ser alta o suficiente para compensar esta eliminação mecânica e, presumivelmente, outros mecanismos de defesa antibacterianos. Também exercem influência a interação com outros comensais (como os pneumococos) e as adesinas estafilocócicas. No entanto, o estado fisiológico necessário para que o S. aureus se mantenha na cavidade nasal ainda requer maiores investigações (WEIDENMAIER et al., 2012).
2.2 - RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA
S. aureus é um patógeno versátil, com grande poder de adaptação e capacidade de albergar
23 passaram a ser utilizados, há cerca de 70 anos. Na última década, estudos moleculares têm levado a um grande avanço na compreensão desses fenômenos (CHAMBERS & DELEO, 2009).
Do ponto de vista epidemiológico, o surgimento de mecanismos de resistência aos antimicrobianos seguiram trajetórias semelhantes, inicialmente ocorrendo em hospitais e instituições de saúde onde são maiores as pressões seletivas para o desenvolvimento de resistência. Tais cepas permaneceram por algum tempo contidas nesses ambientes, até que eventualmente surgiram também na comunidade, como patógenos virulentos e adaptados (CHAMBERS & DELEO, 2009).
2.2.1 - Resistência a penicilina
Antes da era antimicrobiana, a mortalidade por S. aureus excedia 80% e as infecções metastáticas ocorriam em frequência acima de 70% (SKINNER & KIFFER, 1941). Com a introdução da penicilina, esse prognóstico desfavorável pareceu ter sido superado. Entretanto, as primeiras cepas resistentes à penicilina foram isoladas três anos após a sua primeira utilização (RAMMELKAMP, 1942). No final dos anos 60, 80% dos S. aureus presentes na comunidade já possuíam essa resistência. Ela é mediada pela produção de uma ß-lactamase (ou penicilinase) que inativa os antimicrobianos β-lactâmicos por hidrólise de seu anel ß-lactâmico. Atualmente, mais de 90% dos estafilococos isolados produzem ß-lactamase, inclusive em ambiente comunitário (JEVONS & PARKER, 1964; OLIVEIRA et al, 2002; SALGADO, 2003; CHAMBERS & DELEO, 2009).
2.2.2 - Resistência a meticilina 2.2.2.1 - História e Epidemiologia
Tal como ocorreu com a penicilina, registraram-se em 1961, ou seja, no ano seguinte ao início do uso da meticilina (a primeira penicilina semissintética resistente à ß-lactamase estafilocócica, então chamada Celbenin®), os primeiros casos de S. aureus resistentes a esse fármaco. Estas cepas foram denominadas methicillin-resistant Staphylococcus aureus ou MRSA (JEVONS, 1961; BARBER, 1961). A meticilina logo deixou de ser utilizada pela sua nefrotoxicidade (CHEN et al., 2013), sendo substituída pela oxacilina, mas a denominação MRSA permaneceu universal.
24 casos hospitalares esporádicos (CHAMBERS & DELEO., 2009). Na década de 80, o início da epidemia de HA-MRSA deu-se com o surgimento de clones mais adaptados, que apresentavam maior mobilidade e maior potencial de transferência horizontal de genes, tornando-se assim os maiores causadores de infecções relacionadas à assistência à saúde. Tais patógenos acometem principalmente pacientes idosos, debilitados e acometidos de doenças crônicas, como diabéticos com úlceras de pele, portadores de catéteres vasculares, doentes renais em hemodiálise, imunossuprimidos, internados em unidades de terapia intensiva, submetidos à internação prolongada ou em uso de antibióticos de amplo espectro. Entre 1997 e 1999, o Programa de Vigilância Antimicrobiana SENTRY investigou a prevalência mundial de colonização por MRSA em hospitais, já então constatando taxas de 23% na Austrália, 67% no Japão, 35% na América Latina, 40% na América do Sul, 32% nos Estados Unidos e 26% na Europa (DIEKEMA et al., 2001; BELL et al., 2002).
O S. aureus é a causa mais frequente de infecções relacionadas à assistência à saúde. Uma elevada proporção destas é causada por MRSA (DELEO & CHAMBERS, 2009). Os MRSA são altamente prevalentes em hospitais de todo o mundo. Embora os dados epidemiológicos de estudos diversos muitas vezes não sejam comparáveis devido às diferenças no desenho do estudo e nas amostras das populações, as taxas mais elevadas (acima de 50%) são relatadas na América do Sul e do Norte, na Ásia e em Malta. Taxas intermediárias (25-50%) são relatadas na China, Austrália, África e em alguns países europeus como Portugal, Grécia, Itália e Romênia. Outros países europeus têm geralmente baixas taxas de prevalência, como, por exemplo, Holanda e Escandinávia (STEFANI et al., 2012). Os complexos clonais CC5 e CC8, são os mais prevalentes em todo o mundo e estão distribuídos de maneira diferente, em muitos países e/ou regiões do mundo, sendo o CC8 o mais comum nos EUA. O CC22 é difundido globalmente, o CC30 também é comum nos EUA e no Reino Unido, e o CC45 é comum nos EUA e na Europa. Os clones de MRSA CC5 (ST5), CC8 (ST239) e CC30 predominam na América Latina (STEFANI et al., 2012).
No Brasil, vem sendo cada vez mais documentada a ocorrência de clones MRSA carreando o SCCmec tipo IV (tipicamente associado ao CA-MRSA) em ambientes hospitalares, nos quais, porém, ainda predomina o Clone Epidêmico Brasileiro (TRINDADE et al., 2005; ROSSI, 2011; MARRA et al., 2011; TEIXEIRA et al, 2012; CABOCLO et al., 2013),
25 caracterizado por ST239-SCCmec Tipo IIIA, primeiramente descrito em 1984 como um clone autóctone originário do Brasil (SADER et al., 1994), e que posteriormente se disseminou para diversos países da América Latina, incluindo a Argentina, Chile, Colômbia, Equador, Paraguai, Peru e Uruguai e também para a Europa, Ásia, Austrália e África do Sul. A patogenicidade do clone brasileiro é decorrente de várias propriedades presentes em diferentes graus e em diferentes variantes: multirresistência, incluindo a resistência aos β-lactâmicos, cloranfenicol, quinolonas, lincosamidas, eritromicina, sulfametoxazol-trimetoprima (TMP-SMX) e mupirocina; produção de biofilme protetor; capacidade de aderir e invadir as células epiteliais das vias aéreas; e produção de toxinas, como enterotoxinas e leucocidina Panton-Valentine (PVL) (RODRIGUEZ-NORIEGA et al., 2010).
As medidas de controle, como a vigilância ativa, o isolamento dos pacientes colonizados e infectados por MRSA, e a descolonização nasal, têm reduzido o percentual de infecções relacionadas à assistência à saúde em todo o mundo, mas sem erradicá-las. Apesar das controvérsias, as abordagens inespecíficas (não direcionadas ao patógeno) para a prevenção da infecção parecem ser, em comparação com as intervenções específicas, mais eficazes e menos dispendiosas. Essas intervenções inespecíficas incluem: assegurar a higiene das mãos, melhorar a limpeza do ambiente hospitalar e aderir às práticas e protocolos que reduzem as infecções relacionadas a dispositivos e as infecções de sítio cirúrgico (CHEN et al., 2013).
2.2.2.2 - Aspectos genotípicos dos MRSA
A resistência à meticilina e outros ß-lactâmicos deu-se pela aquisição do gene mecA, que codifica uma nova proteína de ligação à penicilina denominada de PBP2a ou PBP2’ ao invés da PBP original (MATSUHASHI et al., 1986). A presença de ß-lactâmicos ativa a produção da PBP2a, o que, dada a sua baixa afinidade por estes antibióticos, lhes dificulta a ação. O gene
mecA está contido em uma estrutura móvel denominada cassete cromossômico estafilocócico
(SCCmec) (ITO et al., 1999; KATAYAMA et al, 2000). Essas estruturas são adquiridas através de transferência horizontal de genes, a partir de uma outra bactéria, incluindo outros
Staphylococcus e até mesmo outros Gram positivos (CHAMBERS & DELEO, 2009; COOKE &
26
2.2.2.3 - Métodos moleculares usados na classificação de S. aureus e MRSA
Os clones de MRSA podem ser caracterizados por métodos de tipagem molecular, incluindo a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), a tipagem por sequenciamento multilocus (MLST), tipagem do gene da proteína de superfície estafilocócica A (spa typing) e a a tipagem do SCCmec (CHAMBERS & DELEO, 2009).
A técnica de PFGE analisa o polimorfismo do DNA cromossômico. Possui alto poder discriminatório do perfil genético e é a mais utilizada no Brasil, embora tenha como desvantagens a demora e a dificuldade técnica de sua execução, além de não dispor de uma nomenclatura universalmente padronizada. É útil principalmente na investigação de surtos (STEFANI et al., 2012).
A técnica Multilocus Sequence Typing (MLST) baseia-se na análise de sequências de fragmentos de sete genes constitutivos (housekeeping) do S. aureus. Um alelo distinto é atribuído a cada uma das diferentes sequências de cada gene, resultando em um perfil alélico designado
sequence typing (ST). Amostras com mais de cinco alelos idênticos são agrupadas em um mesmo
complexo clonal (CC). O método possui nomenclatura padronizada e fácil portabilidade, mas ainda tem custo elevado e baixo poder discriminatório (CHAMBERS & DELEO, 2009; STEFANI et al., 2012).
O método de tipagem conhecido internacionalmente como spa typing é feito em um único
locus gênico, através da determinação do polimorfismo de sequência na região variável X do
gene spa. Este gene codifica a proteína de superfície estafilocócica A (spa). O tipo de spa é deduzido da ordem de repetições específicas ao qual é atribuído um código numérico, os quais podem ser inseridos na base de dados digitais (http://www.spaserver.ridom.de), permitindo o registro e as comparações entre sequências de S. aureus descritas em diferentes partes do mundo. Este sistema de tipagem tornou-se o mais popular para os MRSA. Esta popularidade é atribuída às suas muitas vantagens práticas, incluindo o alto rendimento e a completa portabilidade dos dados, graças à sua reprodutibilidade absoluta, que permite designar o tipo com base em uma ferramenta oferecida na Internet e a sua comparação com um banco de dados provenientes de
27 todo o mundo. No entanto, esta técnica também tem limitações, que incluem, em algumas circunstâncias, a necessidade de se utilizar testes adicionais para assegurar confiança da tipagem de certas linhagens como ST1, ST8 e ST80 (SHOPSIN et al., 1999; HARMSEN et al., 2003; STRUELENS et al., 2009; STEFANI et al., 2012).
2.2.2.4 - Componentes e classificação dos SCCmec
O SCCmec é composto pelo complexo do gene mec (mecA e seus reguladores mecI e
mecRI), pelo complexo do gene ccr (cassette chromosome recombinase) e pelas regiões J, cujo
nome deriva do termo em inglês junkyard, recentemente substituído por joining region, designando todo o restante do material genético do SCCmec.
Por definição, esses elementos se caracterizam por:
a) carrear o gene mecA no complexo do gene mec b) carrear o gene ccr no complexo do gene ccr
c) integrar-se a um sítio específico do cromossomo estafilocócico, denominado sequência de integração local para o SCC ou integration site sequence for SCC (ISS), que funciona como um alvo para a recombinação mediada pelo gene ccr.
d) pela presença de sequências de flanqueamento de repetição direta contendo ISS.
O SCCmec integra-se ao cromossomo bacteriano na porção final 3’, em uma sequência específica (bacterial chromosomal attachment site, attBSCC) localizada próxima à origem de replicação do S. aureus, na extremidade de uma região de leitura aberta (open reading frame - ORF) denominada orfX, recentemente descrita como uma 23S rRNA metiltransferase (SHORE, 2011).
As regiões J são compostas de elementos não essenciais do cassete, mas podem carrear determinantes de resistência adicionais. Os tipos de SCCmec têm sido definidos pela combinação particular dos complexos de genes mec e ccr. As regiões J são utilizadas na classificação dos subtipos (ITO et al., 2001; MA et al., 2002; IWG-SCC, 2009). Atualmente são descritos 11 tipos de SCCmec. Eles diferem entre si no tamanho e na composição genética, e são classificados
28 como tipo I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X e XI, conforme exposto no Quadro 1 (ITO et al., 2001; ITO et al., 2004; IWG-SCC, 2009; SHORE et al., 2011).
A proteína MecI, codificada pelo gene mecl, reprime a expressão do mecA ao se ligar ao operador e esta repressão é revertida pela presença de meticilina ou outro antimicrobiano ß-lactâmico no meio. O gene mecR1 codifica uma proteína transmembrana MecR1 que reconhece a presença de ß-lactâmicos e, na presença destes, induz à transcrição do gene mecA e à consequente síntese de PBP2a (ITO et al, 2001). Cinco classes do complexo do gene mec tem sido descritas (A a E). A classe A contém o complexo mec íntegro e é composta do mecA, genes reguladores, mecR1 e mecI, e sequência de inserção IS431 (sequence insertion). As classes B e C apresentam os genes regulatórios interrompidos pelas sequências de inserção IS1272 e IS431, respectivamente. A classe E foi descrita no SCCmec tipo XI no qual se descreveu um gene mecA divergente, designado mecA (LGA251), 70% homólogo ao mecA do S. aureus (SHORE et al., 2011; ITO et al., 2012).
O complexo do gene ccr é constituído pelo gene da ccr circundado por estruturas de leitura aberta ou open reading frames (ORFs), algumas das quais possuem funções desconhecidas. Codifica recombinases que são responsáveis pela excisão e integração, bem como por sua mobilidade, permitindo a transmissão horizontal da resistência entre a mesma espécie ou entre espécies diferentes. Através dessa propriedade os S. aureus sensíveis a meticilina (MSSA) podem se tornar MRSA e vice-versa. Há oito alótipos para o complexo do gene ccr (1 a 8). Os tipos de ccr 1, 2, 3, 4, 6, 7 e 8 carreiam variações dos genes ccrA e ccrB subclassificadas em alelos quando partilham de 50 a 85% de similaridade, enquanto o tipo 5 carreia o gene recombinase ccrC, que até a presente data não necessitou subclassificação, pois as amostras conhecidas apresentam mais de 87% de similaridade (Quadro 2) (KATAYAMA et al., 2000; ITO et al., 2001; ITO et al., 2004; MA et al., 2002; IWG-SCC, 2009).
As regiões J são três, a saber:
J1 é a região entre a junção do cromossomo à direita e o complexo do gene ccr. J2 compreende o trecho entre o complexo do gene ccr e o complexo do gene mec. J3 é a região entre o complexo do gene mec e a junção do cromossomo à esquerda. Variações nas regiões J entre tipos de SCCmec com os mesmos complexos mec-ccr são utilizadas para definição de subgrupos
29 (MILHEIRIÇO et al., 2007; IWG-SCC, 2009; Zhang et al., 2009).
QUADRO 1 - ATUAIS TIPOS DE SCCmec ENCONTRADOS EM AMOSTRAS DE S. aureus Tipos de SCCmec Complexos de
genes ccr
Complexos de genes mec Cepas
I 1 (A1B1) B NCTC104 42, COL II 2(A2B2) A N315, Mu50, Mu3, MRSA252 , JH1, JH9 III 3(A3B3) A 85/2082 IV 2(A2B2) B CA05, MW2, 8/6-3P, 81/108, 2314, cm11, JCSC4469 , M03-68, E-MRSA-15, JCSC6668 , JCSC6670 V 5 (C1) C2 WIS(WB G8318), TSGH17, PM1 VI 4 (A4B4) B HDE288 VII 5 (C1) C1 JCSC6082 VIII 4 (A4B4) A C10682, BK20781 IX 1 (A1B1) C2 JCSC6943 X 7 (A1B6) C1 JCSC6945 XI 8 (A1B3) E LGA251
30
QUADRO 2 - ATUAIS TIPOS DE GENES ccr IDENTIFICADOS EM AMOSTRAS DE S. aureus
FONTE: International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements.
Em 2009 foi criado um grupo de trabalho internacional denominado International
Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements
(IWG-SCC) visando organizar uma rede intelectual para contribuir nos estudos dos SCCmec, estabelecer um consenso de nomenclatura uniforme para os elementos SCC, definir requisitos mínimos para descrição de novos elementos SCC e estabelecer protocolos para identificação dos SCCmec para estudos epidemiológicos (IWG-SCC, 2009).
2.2.3 - Resistência a vancomicina
Outro aspecto preocupante da epidemia de MRSA são as evidências de um aumento progressivo na resistência a vancomicina. Os testes de sensibilidade a vancomicina vem apresentando um progressivo aumento da Concentração Inibitória Mínima (CIM), que é a menor concentração em que um antibiótico inibe o crescimento da bactéria. Estas amostras com aumento da CIM para vancomicina associam-se a maiores índices de falha terapêutica e a maior mortalidade. São considerados casos de resistência intermediária a vancomicina (VISA) as
Complexos de genes ccr
Genes ccr Tipos de SCCmec carreando genes ccr
Tipo 1 A1B1 I, IX
Tipo 2 A2B2 II, IV
Tipo 3 A3B3 III
Tipo 4 A4B4 VI, VIII
Tipo 5 C1 V, VII
Tipo 6 A5B3
Tipo 7 A1B6 X
31 amostras com CIM de 4 a 8 mg/L. Tais amostras têm membranas celulares muito mais espessas, que dificultam a penetração, a ligação e a eficácia da vancomicina. As amostras consideradas resistentes a vancomicina têm CIM de 16 mg/L ou maior. Houve poucos relatos deste tipo de amostra em todo o mundo (CHEN et al., 2013). Em 2001, foi descrita, no Brasil, a ocorrência das primeiras amostras com resistência intermediária à vancomicina (OLIVEIRA et al., 2001).
2.2.4 - CA-MRSA – Community-associated S. aureus ou S. aureus associado à comunidade Os primeiros relatos de CA-MRSA surgiram no final da década de 1980, em comunidades aborígenes da Austrália (UDO et al., 1993). Na década de 1990 foram descritos, em vários países como Estados Unidos, Inglaterra, Canadá, França, Finlândia e Austrália, surtos envolvendo grupos específicos, como militares, atletas praticantes de esportes coletivos, crianças frequentando creches, indivíduos vivendo em comunidades fechadas ou envolvidos em atividades sujeitas a lesões abrasivas de pele, sem exposição prévia a ambientes hospitalares (BOYCE, 1998; CDC, 2003; GORWITZ et al., 2008). Um fator comum a estes grupos era a grande intensidade de contato físico e as precárias condições de higiene, condições estas que podem ampliar a transmissão deste patógeno na comunidade (NGUYEN et al., 2005).
No período de 1997-99 foram registrados no estado de Minnesota, nos EUA, quatro casos fatais de infecção por CA-MRSA envolvendo crianças até então saudáveis. Estes casos não estavam relacionados a nenhum fator de risco previamente descrito para este tipo de infecção (ANONIMOUS, 1999). Em 2005, a epidemia de CA-MRSA já havia se transformado em um grave programa de saúde pública naquele país, fazendo mais vítimas que a epidemia de aids (KLEVENS, 2007; CDC, 2007).
Desde então, a prevalência de colonização e de infecção por este agente vem aumentando em todo o mundo, não mais se restringindo a determinados grupos, mas surgindo de maneira global, assumindo, em alguns países, um caráter endêmico, com a detecção de vários clones, o que sugere que ocorreram mutações independentes em diferentes locais, e não a disseminação do clone inicial (CHAMBERS & DELEO, 2009).
No Brasil, há, em todo o país, poucos dados sobre a prevalência de colonização e infecção por CA-MRSA com características relacionadas à origem comunitária (RIBEIRO et al., 2005; LAMARO-CARDOSO et al., 2007, 2009; ROZENBAUM et al., 2009).
32 Os primeiros casos de infecção por CA-MRSA relatados na América Latina ocorreram no Brasil, em adultos. Em Porto Alegre, em 2003, quatro amostras foram obtidas de infecções de pele e tecidos moles, e uma amostra obtida de artrite séptica de joelho (RIBEIRO et al., 2005). O primeiro caso grave descrito de infecção por CA-MRSA na faixa etária pediátrica no Brasil envolveu uma criança de 10 anos de idade, sem passado de imunodeficiência, moradora da cidade do Rio de Janeiro (ROZEMBAUM et al., 2009).
Os clones de CA-MRSA apresentam várias características distintas dos HA-MRSA. São tipicamente resistentes apenas aos ß-lactâmicos, a alguns macrolídeos e, em alguns casos, às quinolonas. Apresentam habitualmente sensibilidade à clindamicina e à associação sulfametoxazol-trimetoprima, ao passo que os clones de HA-MRSA são habitualmente multirresistentes.
Os Centers for Disease Control and Prevention (CDC) listaram os "Cinco Cs" da transmissão de CA-MRSA, expostos no Quadro 3, a seguir.
QUADRO 3 - Os “cinco Cs" da transmissão de CA-MRSA
Os especialistas preconizam mudar a escolha terapêutica para cobertura de CA-MRSA em uma comunidade sempre que a prevalência local deste patógeno exceder 10-15% (KAPLAN, 2005; GORWITZ, 2006). Para casos de menor gravidade que requeiram uso de antibioticoterapia em caráter ambulatorial podem ser utilizadas a clindamicina e a associação sulfametoxazol/trimetroprim. Para casos que requeiram hospitalização estão indicados o uso de clindamicina e em pacientes graves ou instáveis clinicamente, a vancomicina ou a linezolida.
O espectro de manifestações clínicas causadas por CA-MRSA não difere muito do encontrado nos pacientes acometidos por S. aureus sensível a meticilina (MSSA), dificultando a suspeita de infecção por CA-MRSA com base apenas em parâmetros clínicos, embora se saiba que estas infecções provocam, em 90% dos casos, lesões supurativas da pele e do tecido
1- Contato com pessoa colonizada ou infectada. 2- Comprometimento da integridade da pele.
3- Contaminação por objetos, superfícies e fômites em geral. 4- Pouca higiene ("Cleanliness")
33 subcutâneo como furúnculos, antrazes e abscessos. Os casos de celulite sem secreção purulenta são de avaliação mais difícil, pela dificuldade na obtenção das culturas (ADLER et al., 2010). Alguns casos apresentam lesão necrótica inicial semelhante a uma picada de aranha (MORAN, et al., 2006; MILLER & KAPLAN, 2009). Algumas linhagens de CA-MRSA parecem ser particularmente virulentas, causando infecções degenerativas do tecido, como fasciites, e pneumonia necrosantes que podem evoluir de forma fulminante, com sepse grave e morte já nas primeiras horas de evolução da doença. Este tipo de evolução clínica raramente era observado antes da emergência dos CA-MRSA (BOYLE-VAVRA & DAUM, 2007; CHAMBERS & DELEO, 2009). As infecções por CA-MRSA atingem preferencialmente crianças e adultos jovens, enquanto que as provocadas por HA-MRSA acometem mais os idosos, causando, principalmente, pneumonias e infecções do trato urinário (NAIMI et al,, 2003; RODRIGUEZ-NORIEGA et al., 2010). Na diferenciação entre MRSA e MSSA adquiridos na comunidade, os aspectos clínicos e epidemiológicos são pouco preditivos, uma vez que ambos provocam infecções que evoluem de forma semelhante. Entretanto, as infecções por CA-MRSA parecem ter, em relação ao MSSA, maior capacidade de disseminação para os contatos íntimos (COOKE & BROWN, 2010). Crianças também parecem ser mais atingidas, não se sabe se por maior exposição ou por maior susceptibilidade ao agente. O quadro 4 ilustra as diferenças clássicas entre HA-MRSA e CA-MRSA.
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QUADRO 4 - CARACTERÍSTICAS DE Staphylococcus aureus RELACIONADO À ASSISTÊNCIA À SAÚDE (HA-MRSA) E ASSOCIADO À COMUNIDADE (CA-MRSA).
Característica HA-MRSA CA-MRSA
Época de descobrimento
1961 Década de 1980
População em risco Pacientes com hospitalização prévia, infecções cirúrgicas, internação prolongada,
diálise, cateteres permanentes, unidades de terapia intensiva.
Crianças e adultos jovens, moradores de rua, atletas, recrutas, presidiários, índios nativos dos Estados Unidos, moradores das
ilhas do Pacífico, crianças que frequentam creches.
Principais síndromes clínicas
Bacteriemia, pneumonia adquirida em hospital, pneumonia associada à ventilação mecânica, infecções por cateter ou prótese.
Infecção de pele e partes moles, pneumonia necrosante, bacteriemia,
osteomielite. Perfil de resistência a
antimicrobianos
Multirresistente, incluindo ß-lactâmicos, macrolídeos, sulfametoxazol-trimetoprima,
lincosamidas, tetraciclinas, rifampicina, quinolonas. Resistência aos glicopeptídeos
em ascensão.
Resistente a ß-lactâmicos. Sensibilidade variável aos macrolídeos, sulfametoxazol-trimetoprima, tetraciclinas e lincosamidas. Tipo de SCCmec
associado aos clones que causam infecção.
Tipos I, II e III Tipos IV e V
Expressão de PVL Incomum Comum
FONTE: Adaptado de RODRÍGUEZ-NORIEGA et al, 2010.
Os CA-MRSA apresentam grande diversidade genética conforme a região geográfica. Nos Estados Unidos, o tipo predominante de CA-MRSA é o ST8; a Austrália tem duas grandes linhagens: ST93 (Queensland), e ST1 (Western Austrália). Na Europa circulam vários tipos diferentes de CA-MRSA: ST80, ST5 e ST8. No Brasil existem apenas estudos pontuais de colonização e infecção, que mostraram a presença dos clones ST1, ST30, ST8 e ST45 (RIBEIRO et al., 2007; GELATTI et al., 2013) em Porto Alegre e no Rio de Janeiro. Lamaro-Cardoso e colaboradores identificaram quatro amostras portadoras de SCCmec tipo IV em Goiânia em 1192 crianças que frequentavam creches, amostras estas caracterizadas como ST30 e ST121 (LAMARO-CARDOSO et al., 2009).
Nos últimos anos, os limites entre as linhagens hospitalares e comunitárias vêm se tornando cada vez mais imprecisos, com casos de típicas infecções por CA-MRSA adquiridas em ambiente hospitalar e clones de HA-MRSA circulando em ambientes comunitários, em indivíduos sem contato com instituições de assistência à saúde (HUANG et al., 2007; BOYCE,
35 2008; POPOVICH et al., 2008).
2.2.4.1- Tipos de SCCmec encontrados no CA-MRSA
Os clones de CA-MRSA apresentam, em sua maioria, o SCCmec tipo IV (MA et al., 2002) ou, eventualmente, o SCCmec tipo V (ITO et al., 2004), ao passo que as cepas hospitalares geralmente apresentam os SCCmec tipos II e III (ITO et al., 2001) Os SCCmec tipos IV e V possuem menor tamanho, transmitem-se mais facilmente e portam menor quantidade de genes de resistência.
2.2.4.2 - Fatores de virulência associados ao CA-MRSA
Leucocidina de Panton-Valentine (PVL)
Foi primeiramente descrita em 1894 por Van deVelde e denominada substância leucocidina, pela sua habilidade de causar lise em leucócitos. Posteriormente Panton e Valentine, estudando culturas originárias de furúnculos, detectaram e demonstraram uma associação entre a presença da toxina e o desenvolvimento de abscessos cutâneos graves (PANTON & VALENTINE, 1932). O interesse pela toxina aumentou com a disseminação de diversos clones de CA-MRSA capazes de produzi-la, principalmente os clones USA300 e USA400, que são altamente virulentos e assumiram proporções endêmicas nos EUA (DELEO & CHAMBERS, 2009).
A PVL é composta de duas subunidades lukS-PV e lukF-PV que são codificadas pelo prófago horizontalmente adquirido ΦSA2 (CHAMBERS & DELEO, 2009) e que, associadas, levam à formação de poros nas membranas dos neutrófilos polimorfonucleares e fagócitos, provocando a destruição destas células e necrose tecidual. Em concentrações elevadas, a PVL provoca a lise celular, mas em concentrações mais baixas, parece ativar parcialmente os neutrófilos mediante um fenômeno conhecido como priming, em que estas células secretam potentes mediadores inflamatórios, como leucotrieno B4 e interleucina 8. A PVL também causa a desgranulação dos neutrófilos, através de exocitose. A PVL, portanto, poderia também contribuir para a patogênese, causando uma resposta inflamatória exagerada e danos ao hospedeiro. Sua presença está relacionada a infecções cutâneas graves, como fasciite necrosante e com pneumonias graves evoluindo com necrose hemorrágica, altamente letais (LINA et al., 1999;
36 GILLET et al., 2002; VANDENESCH et al., 2003; BOYLE-VAVRA et al., 2007; DIEP et al., 2010). Por outro lado, PVL é menos frequentemente encontrada em amostras de CA-MRSA associadas à colonização nasal assintomática (BOYLE-VAVRA et al., 2005).
α-hemolisina (Hla ou α-toxina).
A α-hemolisina provoca, mediante a formação de poros, a destruição de uma vasta gama de células hospedeiras, entre as quais as células epiteliais, hemácias, monócitos e fibroblastos. A α-hemolisina é ubíqua entre as amostras clínicas, não obstante o fato de que está, em algumas estirpes, inativa (CHAMBERS & DELEO, 2009).
Modulinas do Tipo α solúveis em fenol (PSMαs)
Constituem um grupo de peptídeos presentes em S. aureus e cuja produção é mais elevada nas cepas de CA-MRSA que nas de HA-MRSA, o que pode contribuir para a maior virulência dos primeiros. Os peptídeos PSMα atuam mediante o recrutamento, ativação e lise de neutrófilos humanos (LOWY, 2007).
Elemento móvel catabólico arginina (ACME)
É um locus genético descoberto durante o sequenciamento do genoma do USA300. Embora nem todas as amostras USA300 transportem o ACME completo, levantou-se a hipótese de que ele possa contribuir para o aumento da virulência do clone USA300 e facilitar a colonização humana, explicando assim o sucesso deste clone. A contribuição exata do ACME para a persistência e a transmissão de S. aureus ainda não está bem definida (CHUA et al., 2013).
2.3- CRECHES
2.3.1- Creches comunitárias
Creches comunitárias são instituições sem fins lucrativos criadas por membros da comunidade, muitas vezes com apoio das associações de moradores e/ou instituições religiosas. No município de Niterói, o programa Criança na Creche foi criado em 1994, pelo Decreto Legislativo 287/94, e tinha por objetivo dar apoio financeiro e pedagógico às Creches Comunitárias que existiam em diversas comunidades. Além do suporte financeiro, a Fundação Municipal de Educação de Niterói mantém uma equipe supervisora, formada por pedagogos, nutricionistas, psicólogos, dentistas, médico, advogado e contador, que faz o acompanhamento das atividades desenvolvidas nas creches comunitárias e fiscaliza a aplicação dos recursos.
37 A incidência de infecções por CA-MRSA em crianças previamente saudáveis vem aumentando consideravelmente em todo o mundo, especialmente na última década (TAVARES et al., 2010). Desde então se procura estabelecer quais seriam as fontes destas amostras na comunidade, existindo a suspeita de que as crianças poderiam funcionar como um reservatório assintomático de CA-MRSA (TAVARES et al., 2010). As creches parecem ser um ambiente propício à formação desses reservatórios, pois propiciam o contato íntimo e prolongado em ambientes fechados, em uma população ainda não ciente dos hábitos básicos de higiene. Esta aglomeração facilita a disseminação de agentes infecciosos, especialmente os causadores de infecções respiratórias e cutâneas. Essas circunstâncias, por sua vez, levam ao uso frequente de antibióticos, com o consequente seleção de cepas resistentes (HOLMES et al., 1996). Na última década, vários estudos foram realizados e publicados sobre a frequência de colonização nasal por
S. aureus e MRSA em creches e pré-escolas. Estes estudos, que estão resumidos a seguir nos
quadros 5A e 5B, buscam também estabelecer os possíveis fatores associados à maior frequência de colonização nesta população específica.
38 QUADRO 5A - ESTUDOS SOBRE A COLONIZAÇÃO POR S. aureus E MRSA EM CRIANÇAS PRÉ-ESCOLARES SAUDÁVEIS EM AMBIENTES COMUNITÁRIOS. DESCRIÇÃO DA POPULAÇÃO/ RESULTADOS
Autores País Ano Amostra Faixa etária Local da coleta % S. aureus % MRSA Hisata et al. Japão 2005 818 N.I. 5 creches e 2
Jardins de infância. 28,2 4,3 Chatterjee et al. Índia 2009 489 5 a 15 anos Áreas rural, urbana e favelas. 52,3 3,9 Velásquez- Guadarrama et al. México 2009 2345 6 meses a 6 anos Creches em 14 cidades 10,1 0,9 Lamaro-Cardoso et al. Brasil 2009 1192 2 meses a 5 anos 62 creches 31,1 1,2 Miller et al. EUA 2010 1163 0 a 6
anos
24 creches 18,1 1,3 Tavares et al. Portugal 2010 2100 4 meses a
6 anos
Creches 17,4 0,1 Chen CJ et al. Taiwan 2011 6057 2 a
60 meses
Consultas de rotina
23,2 7,8 Rebollo-Pérez et al. Colômbia 2011 104 2 a 6
anos
Sem informação
38,5 4,8 Lee J et al. Coréia do
Sul
2011 428 1 a 6,8 anos
Creches 38,3 9,3 Gardella et al. Argentina 2011 316 - Jardins de
infância
31 4,4 Ho et al. Hong Kong 2012 2211 2 a 5 a Creches e
Jardins de infância em
18 distritos
27,6 1,3
MRSA: Staphylococcus aureus resistente a meticilina. J.I.: Jardins de infância
39
QUADRO 5B - ESTUDOS SOBRE A COLONIZAÇÃO POR S. aureus E MRSA EM CRIANÇAS PRÉ-ESCOLARES SAUDÁVEIS EM AMBIENTES COMUNITÁRIOS. RESULTADOS
Autores /aa Tipo de PVL PVL Comentários
Comentários Correlação com outros fatores de Risco
Hisata et al. 68% SCCmec II 32%SCCmec IV
Negativos - -
Chatterjee et al.
- - Áreas demográficas rural, urbana e favelas
sem diferenças significativas
S. aureus e MRSA: morador de casas de barro Velásquez-Guadarrama et al. 41% SCCmec II 59% SCCmec IV - Cidades de fronteira com maior positividade. - Lamaro-Cardoso et al. 67% SCCmec IIIa 27% SCCmec IV e 6% SCCmec V Negativos A maior escolaridade da mãe foi um fator
protetor.
Idade maior que 23 meses/SA Antecedentes de doença crônica Miller et al. 87% SCCmec IV
13% SCCmec II
40% - Não encontrados
Tavares et al. SCCmec IV Negativos Pesquisa de colonização por pneumococos simultânea. - Chen et al. 88% SCCmec IV 27,8% Positivos Pesquisa de colonização por pneumococos simultânea
MRSA: idade 2 a 6 m, Residir na área Norte de Taiwan
Rebollo-Pérez et al. 40% SCCmec IV 40% SCCmec I 20%SCCmec II 100% dos MRSA positivos
- S. aureus: Uso de antibióticos nos últimos 3 meses
Lee et al. - Pesquisa de
colonização por pneumococos
simultânea
Menores de 6 meses e entre 5-7 anos
Gardella et al. SCCmec IV 28% - S. aureus: Antecedentes de doença crônica Moradores de área rural Ho et al. 46% SCCmec IV 54% SCCmec V 25% dos MRSA positivos Pesquisa de colonização por pneumococos simultânea
S. aureus: menor prevalência em menores de 2 anos
MRSA: Staphylococcus aureus resistente a meticilina. PVL: Leucocidina de Panton-Valentine.
