Estudo de parâmetros químicos e bioquímicos de clones da casta Tinta Roriz

Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro

Estudo de parâmetros químicos e bioquímicos de

clones da casta Tinta Roriz

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar

Ana Patrícia Nunes Azevedo

Orientadora: Professora Doutora Ana Isabel Barros

Co-Orientadora: Professora Doutora Fernanda Cosme

II

Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro

Estudo de parâmetros químicos e bioquímicos de

clones da casta Tinta Roriz

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar

Ana Patrícia Nunes Azevedo

Composição de júri:

Presidente: Professor Doutor António Inês

Vogais: Professora Doutora Ana Isabel Barros

Professora Doutora Berta Gonçalves

III Este trabalho foi expressamente elaborado como dissertação original para o efeito de obtenção de grau de Mestre em Biotecnologia e Qualidade Alimentar

IV “As doutrinas apresentadas no presente trabalho são da exclusiva responsabilidade do autor”

V

Agradecimentos

Em primeiro lugar quero agradecer aos meus pais e ao meu irmão pelo apoio incondicional, mas principalmente à minha mãe que sempre acreditou em mim e tentou sempre realizar os meus sonhos.

Às Professoras Doutoras Ana Barros e Fernanda Cosme, pelo tempo gasto, paciência, disponibilidade e boa disposição que foi essencial durante todo o trabalho.

À Doutora Irene Gouvinhas e ao Doutor Nélson Machado por me terem tirado todas as dúvidas que surgiram, pelo apoio no laboratório, pela experiência e ensinamento partilhado.

Às minhas amigas e colegas de laboratório, Carolina Gonçalves e Ana Santos, sem vocês, teria sido tudo muito mais complicado. Também aos meus amigos Maria Cunha, Sílvia Martins, Rui Costa, Carlos Marques e ao meu namorado Miguel Alves pela amizade e por todos os momentos vividos.

À Dona Paula, Dona Palmira e Sr Carlos por me terem ajudado durante a execução do trabalho na preparação de soluções e fornecimento de materiais.

À Professora Doutora Paula Lopes e à empresa Sogrape Vinhos S.A pelo fornecimento das amostras de uvas.

VI

Índice Geral

Agradecimentos V

Índice geral VI

Índice de tabelas VIII

Índice de figuras IX

Lista de abreviaturas X

Resumo XI

Abstract XII

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 - Enquadramento temático 2

1.2 - Produção de uvas e vinho 2

1.3 - Região Demarcada do Douro 7

1.3.1 - Caracterização histórica da Região Demarcada do Douro 7

1.3.2 - Localização, delimitação, sub-regiões e caraterização 8

1.3.2.1 - Solo 10

1.3.2.2 - Clima 11

1.4 - Casta Tinta Roriz 12

1.5 - Seleção clonal 15

1.5.1 - Seleção clonal da casta Tinta Roriz 16

1.6 - Compostos fenólicos 17

1.7 - Atividade antioxidante 18

1.8 - Compostos fenólicos e os seus benefícios para a saúde 19

1.9 - Objetivos 21

CAPÍTULO II - MATERIAL E MÉTODOS

2.1 - Amostragem 22

2.2 - Caraterização enológica dos clones e da casta Tinta Roriz 22

2.2.1 - Extração do mosto das uvas 22

2.2.2 - Acidez total 23

2.2.3 - pH 23

2.2.4 - Grau Brix 23

2.2.5 - Álcool provável 23

2.3 - Extração dos compostos fenólicos 23

2.4 - Intensidade e tonalidade corante 24

2.5 - Antocianinas totais 24

2.6 - Fenóis totais 24

2.7 - Orto-difenóis 25

2.8 - Flavonóides 25

2.9 - Atividade antioxidante 26

VII

CAPÍTULO III - RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 - Caraterização enológica do mosto das uvas dos clones e da casta Tinta Roriz 29

3.2 - Antocianinas totais, intensidade e tonalidade corante 31

3.3 - Compostos fenólicos e atividade antioxidante 33

3.4 - Análise em componentes principais 35

CAPÍTULO IV – CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS

4 - Conclusões e perspetivas futuras 39

CAPÍTULO V – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

5 - Referências Bibliográficas 42

CAPÍTULO VI - Anexos

VIII

Índice de Tabelas

Tabela 1 - Evolução da produção mundial de vinho entre 2010 e 2014 4

Tabela 2 - Evolução do consumo de vinho em Portugal, entre os anos

de 2010 e 2014 4

Tabela 3 - Produção de vinho por região vitivinícola, nos anos 2012/2013, 2013/2014 e 2014/2015

5

Tabela 4 - Definição das sub-regiões da RDD 9

Tabela 5 - Catalogação da amostragem dos clones da casta Tinta Roriz 22 Tabela 6 - Peso dos bagos, volume de mosto, pH, acidez total, grau Brix,

açúcares e álcool provável do mosto das uvas dos clones e da casta Tinta

Roriz (vindima 2012 e 2013) 30

Tabela 7 - Antocianinas totais, tonalidade e intensidade corante dos

clones e da casta Tinta Roriz 32

Tabela 8 - Atividade antioxidante, compostos fenólicos totais, flavonóides e orto-difenóis dos extratos das películas dos clones e da

IX

Índice de Figuras

Figura 1 - Área representativa da produção mundial de vinho entre

2000 e 2014 2

Figura 2 - Evolução da área mundial plantada com vinha 3

Figura 3 - Produção mundial de uvas entre 2000 e 2014 4

Figura 4 - Tendências da produção mundial de vinho 4

Figura 5 - Peso da produção por região no total de Portugal

2014/2015 7

Figura 6 - Topografia da região Demarcada do Douro 9

Figura 7 - Cacho e folha da casta Tinta Roriz 14

Figura 8 - Estruturas dos flavonóides 17

Figura 9 - Princípio do método de determinação da capacidade

antioxidante com ABTS 26

Figura 10 - Estrutura do ácido

(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2-cromonil) fórmico (“Trolox”) 26

Figura 11 - Projeção dos valores obtidos relativamente aos dois primeiros componentes principais para os clones e para a casta Tinta Roriz, obtidos da análise com recurso aos valores de orto-difenóis, fenóis totais, atividade antioxidante, tonalidade e intensidade corante

X

Lista de abreviaturas

ABTS: Ácido 2,2'-azino-bis (3 - etilbenzotiazolino-6-sulfónico) AG: Ácido Gálico

Anova: análise de variância

IVDP: Instituto dos Vinhos do Douro e Porto MhL: milhões de hectolitros

PCA: Principal Component Analysis

OIV: Organização Internacional da Vinha e do Vinho

TEAC: Trolox Equivalent Antioxidant Capacity

XI

Resumo

A casta Tinta Roriz é, provavelmente, a casta tinta com maior importância económica no contexto vitivinícola ibérico. Hoje em dia, é possível encontrar disponíveis no mercado viveirista vários clones desta casta, com origens geográficas distintas. A seleção clonal da casta Tinta Roriz teve início nos anos de 1980-1990, em que os clones eram destinados a aumentar a sua produtividade, tanto em Portugal como em Espanha, o que resultou em vários clones certificados, comercialmente disponíveis; assim, a interação entre o genótipo e o ambiente torna pertinente a realização de ensaios de comparação clonal.

Tendo este facto em consideração, o presente trabalho foi desenvolvido com o intuito de verificar se amostras de uma mesma casta (em dois anos de vindima) com características genéticas diferentes, também apresentavam propriedades funcionais diferentes, nomeadamente ao nível da composição fenólica. Simultaneamente, pretendeu-se verificar em que pretendeu-se diferenciavam estes clones da casta propriamente dita.

Com os resultados obtidos, foi possível constatar que os valores relativos aos parâmetros enológicos (pH, acidez total, grau Brix, açúcares e álcool provável) se apresentam muito semelhantes entre si quer para os diferentes clones, quer para a casta Tinta Roriz nos dois anos de vindima em estudo (2012, 2013).

Quando comparados os dois anos de vindima, verificou-se que os resultados relativos à composição fenólica e atividade antioxidante foram superiores no ano de 2013 relativamente ao do ano de vindima de 2012, o que certamente estará relacionado com as condições climáticas em cada um dos anos.

Chegou-se à conclusão que clones de uma mesma casta com características genéticas diferentes podem por vezes apresentar diferenças funcionais significativas relativamente à casta propriamente dita.

Palavras-Chave: Tinta Roriz, casta, clone, composição fenólica, atividade antioxidante, seleção clonal

XII

Abstract

Tinta Roriz is one of the red grape varieties with the highest economic importance in the iberian wine industry context. Nowadays, clones of this variety can be easily found in nurseries market, from distinct geographical origins. Tinta Roriz clonal selection began in the years 1980-1990, in which the clones were designed to increase their productivity, both in Portugal and Spain, which resulted in multiple certificate clones commercially available. Thus, the interaction between the genotype and the environment require the realization of clonal comparison tests.

Taking this into account, this study was conducted in order to verify if samples of the same grape variety (during two harvest years) with different genetic characteristics present different functional properties, particularly in terms of phenolic composition. Simultaneously, it was also intended to verify how they differ from the Tinta Roriz wine grape variety.

The results demonstrated that the values regarding the enological parameters (pH, total acidity, Brix degree, sugars and potential alcohol degree) are very similar to those obtained for Tinta Roriz grape variety during the two harvest years of study (2012, 2013). Regarding the two harvest years, the results concerning the phenolic content and antioxidant activities were higher in 2013 than in 2012, which is certainly related to the climatic conditions in each year.

It was concluded that clones of the same grape variety with different genetic characteristics may sometimes have significant functional differences from the corresponding grape variety.

Keywords: Tinta Roriz, wine grape, clones, phenolic composition, antioxidant activity, clonal selection

Capítulo I

2

1.1. Enquadramento temático

As uvas, são consideradas do ponto de vista económico e cultural, os frutos mais importantes a nível mundial (Conde et al., 2007).

Existem diversos fatores responsáveis pela alteração da composição química das uvas e pela qualidade do vinho, nomeadamente o clima, o solo, as condições geográficas, as práticas culturais, a casta e o porta-enxerto (Jackson e Lombard, 1993).

A casta Tinta Roriz é, provavelmente, a casta tinta com maior importância económica no contexto vitivinícola ibérico. Encontram-se hoje disponíveis no mercado vários clones desta casta, com origens geográficas distintas. A interação genótipo/ambiente torna pertinente a realização de ensaios de análise, avaliação e comparação clonal.

Em Portugal, os trabalhos de seleção das castas de videira, iniciaram-se em finais da década de setenta do século passado (Martins et al., 1994). A deficiente qualidade do material vegetal, no que diz respeito à sua aptidão genética e estado sanitário, tem sido apontada como uma das causas para o fraco desempenho da viticultura nacional (Pereira, 1997).

A seleção clonal surge como o único meio para recuperar as castas tradicionais e assegurar a permanência das suas características ou, por outro lado, modificá-las, no sentido de um melhor desempenho cultural e enológico (Ladeira, 1994).

No seio de uma casta, se um indivíduo se destacar dos demais, por pequenas diferenças no seu património genético ou do seu estado sanitário, o conjunto da sua descendência obtida por propagação vegetativa, pode constituir um clone mantendo desse modo as características comportamentais (produtividade, tamanho do cacho, teor em açúcares e outros compostos químicos da uva ou do mosto) e sanitárias do progenitor inicial, também chamado “cabeça de clone” (Anónimo a, 2009).

1.2. Produção de uvas e vinho

A vitivinicultura expande-se, a nível mundial, com uma distribuição de área de produção por países de acordo com o apresentado na figura 1.

3

Figura 1 – Área representativa da produção mundial de vinho entre 2000 e 2014 (OIV, 2014).

Em 2014 segundo a Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV), a área mundial plantada de vinha foi de 7573 milhares de hectares, mas este valor tem vindo a diminuir desde 2000 (figura 2) principalmente devido à redução da área de vinha Europeia. Esta diminuição foi compensada pelo aumento da área de superfície plantada no resto do mundo. Na China e na América do Sul, a área total de vinha continua a aumentar: estas áreas são os principais centros de crescimento de área de vinha do mundo.

Figura 2 – Evolução da área mundial plantada com vinha (OIV,2015).

A produção mundial de uvas tem aumentado desde 2000, tendo atingido o seu máximo em 2013. Já em 2014 a produção foi de 737 milhões de quintais (Mqx (100kg)) (figura 3), das quais 41% são produzidas na Europa, 29% na Ásia e 21% na América.

França Itália Espanha Estados Unidos Argentina Austrália China África do Sul Chile Alemanha Portugal Roménia Grécia Brasil Outros

4

Figura 3- Produção mundial de uvas entre 2000 e 2014 (OIV,2015).

Com uma redução de 7% em comparação com o ano anterior (2013), a produção mundial de vinho em 2014 foi de 270 milhões de hectolitros (MhL) (figura 4). O ano foi marcado por riscos climáticos (aumento da temperatura, precipitação extrema) significativos, que estão na origem deste facto, especialmente na Europa.

Figura 4 – Tendência da produção mundial de vinho (OIV, 2015).

A Europa, apesar de uma tendência decrescente na produção de vinho, acompanhando a tendência no Novo Mundo, continua a ser o primeiro produtor de vinho. A França é o maior produtor (46,7 MhL) europeu, à frente da Itália, que viu uma má colheita (44,7 MhL) no ano de 2014, tendo a Espanha voltado a um nível médio de produção (38,2 MhL), após um ano recorde em 2013 (tabela 1).

Por outro lado, a produção de vinho no hemisfério sul e nos Estados Unidos continua a aumentar: Estados Unidos com um alto nível de produção (22,3 MhL); Argentina 15,2 MhL; África do Sul 11,3 MhL e a Nova Zelândia um novo recorde com 3,2 MhL.

5

Tabela 1 – Evolução da produção mundial de vinho entre 2010 e 2014 (OIV, 2015).

Ano 2010 2011 2012 2013 Diferença entre o ano de 2013 e 2012 2014 MhL França 44,4 50,8 41,5 42 0,5 46,7 Itália 48,5 42,8 45,6 54 8,4 44,7 Espanha 35,4 33,4 31,1 45,3 10,2 38,2 Estados Unidos 20,9 19,1 21,7 23,6 1,9 22,3 Argentina 16,3 15,5 11,8 15 3,2 15,2 Austrália 11,4 11,2 12,3 12,3 0 12 África do Sul 9,3 9,7 10,6 11 0,4 11,3 China 13 13,2 13,5 11,8 -1.7 11,2 Chile 8,8 10,5 12,6 12,8 0,2 10,5 Alemanha 6,9 9,1 9,0 8,4 -0,6 9,2 Portugal 7,1 5,6 6,3 6,3 0 6,2 Romania 3,3 4,1 3,3 5,1 1,8 3,7 Nova Zelândia 1,9 2,4 1,9 2,5 0,6 3,2 Grécia 3,0 2,8 3,1 3,3 0,2 2,9 Brasil 2,5 3,5 3,9 2,7 -1,2 2,7 Hungria 1,8 2,8 1,8 2,7 0,9 2,6 Áustria 1,7 2,8 2,1 2,4 0,3 2 Total 265 268 258 291 33 270

Em termos de área, a União Europeia é líder no mercado mundial do vinho (cerca de 45% do total), de produção (60%), de consumo (60%) e também de comércio internacional, importação e exportação.

A nível de consumo, houve um decréscimo de 1,2% face ao ano anterior (2013) (tabela 2), em que o consumo mundial de vinho apresentou um valor de 240 MhL. Portugal ocupa o décimo segundo lugar num total dos treze principais países consumidores.

Tabela 2 – Evolução do consumo de vinho em Portugal, entre os anos de 2010 e 2014 (OIV, 2015).

Ano 2010 2011 2012 2013 2014

MhL 5 5 5 4 4

A cultura da vinha desempenhou sempre um papel muito importante na agricultura portuguesa, tendo o vinho um papel relevante na economia nacional.

6

O mercado do vinho é um setor cada vez mais internacionalizado pois a produção de vinho que é comercializado quase duplicou: em 2000, 25% do vinho consumido no mundo foi importado; em 2013 essa participação chegou a mais de 40%.

Em 2014, o comércio de vinho aumentou 2,5% em termos de volume, no entanto, em termos de valor permaneceu similar ao do ano anterior (26 biliões de Euros). O comércio de vinho é dominado pela Espanha, Itália e França (OIV, 2015).

Segundo o Instituto da Vinha e do Vinho, em 2015 a produção em Portugal foi de 6,7 milhões de hectolitros, o que constitui um aumento face ao ano anterior.

A produção de vinhos com aptidão para Denominação de Origem Protegida (DOP) e Indicação Geográfica Protegida (IGP) tem ganho terreno e representa, neste ano, 77% da produção nacional (em 2004/2005 esta opção representava 65% do total). A tabela 3 representa a produção de vinho em hL por região vitivinícola.

Tabela 3 – Produção de vinho por região vitivinícola (IVV, 2015).

Região Vitivinícola Volume (hL)

2012/2013 2013/2014 Variação 13/14 – 12/13 2014/2015* Minho 655,253 793,417 138,164 691,973 Trás-os-Montes 108,615 96,615 -12 107,876 Douro e Porto 1 346,152 1 516,925 170,773 1 407,016 Beira Atlântico 283,897 255,333 -28,564 224,920 Terras do Dão 356,454 304,824 -51,630 240,281 Terras da Beira 217,693 215,783 -1,910 216,528 Terras de Cister 64,655 64,731 0,076 53,064 Tejo 641,789 500,807 -140,982 577,573 Lisboa 1 097,712 885,742 -211,970 893,891 Península de Setúbal 517,797 407,853 -109,944 502,531 Alentejo 970,124 1 127,910 157,786 1 121,772 Algarve 12,338 11,676 -0,662 10,679 Madeira 49,637 43,136 -6,501 40,882 Açores 4,991 6,595 1,604 12,926 Total Portugal 6 327,107 6 231,347 -95,760 6 201,909 *dados em abril de 2015

Como se verifica na figura 5, o Douro possui o maior peso da produção nacional de vinho seguido do Alentejo.

7

Figura 5- Peso da produção de vinho por região no total de Portugal 2014/2015 (IVV, 2015).

1.3. Região Demarcada do Douro

1.3.1. Caracterização histórica da Região Demarcada do Douro

Na área duriense, são visíveis os abundantes vestígios de ocupação dos períodos do Paleolítico, do Neolítico, da Idade do Cobre e da Idade do Ferro, apresentados pela grande concentração de monumentos megalíticos, esculturas antropomórficas e de figuras rupestres ao ar livre, destacando-se fortemente na zona do Vale do Côa sendo caraterizado como “um pólo cultural de um valor universal único” (Pereira, 2006).

Na Época Medieval, o vale do Douro foi controlado por suevos, alanos, visigodos e muçulmanos, que implementaram na região novas crenças e novas formas culturais. A cultura do vinho não foi extinta, pois é-nos concedida nas diversas cartas de foral, em meados do século XI, onde se verificavam várias referências ao vinho.

Logo após a formação de Portugal, a produção vitícola intensificava-se cada vez mais; ao mesmo tempo, cresciam diversas comunidades religiosas, que se destacavam pelo seu papel económico (Carrera,1999).

Quando aumentou na Europa o consumo de vinho, surgiram também as primeiras medidas legislativas dos Estados, e assim desta forma, foi possível organizar e controlar a produção e o comércio de alguns dos vinhos mais prestigiados, para garantir a sua qualidade e reputação face às imitações e garantir vantagens para as respetivas regiões de origem, surgindo as primeiras regiões demarcadas (Pereira, 1996).

Em 10 de Setembro de 1756, por alvará régio, o Marquês de Pombal criou a Companhia Geral da Agricultura das Vinhas do Alto Douro. Esta Companhia tinha como primordial objetivo sustentar a produção do Vinho, ou seja, apoiar o cultivo da vinha e a

8

própria produção para que recompensasse a lavoura diária de cada produtor (Pereira, 2006). Assim, procedeu-se à primeira delimitação administrativa da região, sendo esta a primeira região demarcada no mundo em termos de «denominação de origem controlada». A região demarcada (zona de Feitoria) correspondia mais ou menos a uma mancha de xisto que rodeia o vale do Douro desde pouco antes da Régua até às margens do rio Tua. Com o passar do tempo, a Região Demarcada do Douro (RDD) tem sofrido muitas modificações de ordem geográfica, regulamentar e técnica, que se têm revelado fundamentais para a melhoria da qualidade do vinho e para o crescimento da sua comercialização (Pereira, 1991 e 1998).

Na segunda metade do século XIX, várias mudanças ocorreram na região Duriense: surgiram novos meios de transporte, uma nova legislação e períodos de grandes crises devido ao aparecimento de doenças e pragas sobre a vinha.

Em 1852, esta nova legislação liberalizadora de Fontes Pereira de Melo, veio reduzir os direitos de exportação do Vinho do Porto, substituindo também a Companhia por uma Comissão Reguladora da Agricultura e Comércio dos Vinhos do Alto Douro. Nesta mesma data, as doenças na vinha como a filoxera começavam a surgir. Esta doença foi a que mais afetou a vinha nesta altura pois provocava nodosidades (tumores) nas raízes que em poucos anos enfraquecem e destoem as cepas (Pereira, 2009).

Atualmente, no quadro institucional, existe a Comissão Interprofissional da Região Demarcada do Douro (CIRDD), criada em 1995 (DL nº 74/95 de 19 de Abril) e na qual estão representados o comércio e a lavoura e que têm como linhas orientadoras, os interesses na disciplina e controlo da produção e da comercialização dos vinhos e produtos vínicos da região com direito a denominação de origem, garantindo desta forma a genuinidade e defesa da qualidade (Melo e Faria, 1998).

1.3.2. Localização, delimitação, sub-regiões e caraterização

A Região Demarcada do Douro (RDD), na sua delimitação atual, abrange uma vasta área geográfica, com relevo bastante acidentado e agreste. É a superfície mais importante entre as regiões vitícolas de montanha do mundo, sendo desta forma uma zona com caraterísticas morfológicas, geológicas e climatéricas muito peculiares. Tudo isto, tem permitido produzir uvas e vinhos de excecional qualidade (Cervim, 2009).

No que diz respeito à geologia, o solo da RDD é predominantemente em xisto, que é uma característica muito importante para a cultura da vinha, pois confere uma melhor qualidade aos vinhos (Anónimo b, 2009).

9

A área atual da Região Demarcada do Douro (RDD) compreende 250.000 ha, que incluem cerca de 45.000 ha de vinha instalada, dos quais 84% com direito a benefício.

Localiza-se no nordeste de Portugal Continental, na bacia hidrográfica do rio Douro e seus afluentes (Corgo, Pinhão, Tua e Sabor na margem direita, Tedo, Távora, Tordo, Côa na margem esquerda), entre as latitudes 40 º 06’N e 40º 15’N e as longitudes 7º 52’W. Estende-se desde Barqueiros, na confluência das Serras do Marão e de Montemuro, até Barca D’Alva, na fronteira espanhola. A Norte e a Sul é definida segundo contornos irregulares, pelas cotas entre os 400 e os 700 m. Devido às grandes diferenças mesoclimáticas, influenciadas quer por diferentes altitudes, quer pelo maior ou menor afastamento do mar, a região do Douro é subdividida segundo três sub- regiões (figura 6): o Baixo-Corgo (18%), o Cima-Corgo (38%) e o Douro Superior (44%) (Magalhães, 2008). Na tabela 4 estão descriminados todos os concelhos que, na sua totalidade ou em parte, são abrangidos pela RDD.

Figura 6 - Topografia da região demarcada do douro (IVDP, 2011).

Estas três sub-regiões com potencialidades distintas, definiram-se naturalmente quer pela diversidade da fertilidade dos solos, através das diferentes disponilibiladades hídricas do solo para a videira, quer pelas caraterísticas climáticas.

10

Tabela 4 - Definição das sub-regiões da RDD (IVDP, 2006).

Sub-Região Concelhos abrangidos Área Geográfica Área de Vinha

Hectares % da área Hectares % da área

Baixo Corgo

Vila Real, Sta Marta de Penaguião, Peso da Régua, Resende, Lamego e Tarouca

97 622 17,7 13 776 33,8

Cima Corgo

Sabrosa, Alijó, Murça, Carrazeda de Ansiães, São João da Pesqueira e Tabuaço

132 320 24,0 18 277 44,9

Douro Superior

Mirandela, Vila Flor, Alfândega da Fé, Torre de Moncorvo, Freixo de Espada à Cinta, Vila Nova de Foz Côa e Meda

321 636 58,3 8 657 21,3

Total 551 578 100 40 710 100

A cada uma delas estão associados fatores sócio-económicos e climatéricos que as tornam únicas nas características dos vinhos que produzem (Aguiar,1999).

O Baixo Corgo é a mais ocidental das sub-regiões e, sendo a mais pequena das três sub-regiões, é aquela em que a vitivinicultura assume maior importância (tem 97 622 ha de área geográfica, dos quais 13 776 ha são ocupados por vinha); o Cima Corgo é a parte central da região Duriense e é considerada o coração da região pelas suas boas condições para a produção de uvas de melhor qualidade (tem 132 320 ha de área geográfica, dos quais 18 227 ha são ocupados por vinha); o Douro Superior é a maior e mais oriental das sub-regiões, tendo uma área de vinha de apenas 21,3% em relação à área total (tem 321 636 ha de área geográfica, dos quais 8 657 ha são ocupados por vinha), mas em crescimento pelo seu elevado potencial não só atribuído à qualidade das uvas aí produzidas mas também porque se presta a uma maior eficácia da mecanização (Brito, 1997).

1.3.2.1. Solo

Os solos da RDD, pertencem à formação geológica denominada complexo xisto-grauváquico pré-ordovícico, com várias inclusões de uma formação geológica de natureza granítica envolvente (Magalhães, 1998). A ação antrópica é bem conhecida nestes solos,

11

como fator mais responsável pelo aprofundamento, pela fragmentação da rocha e pela construção do terreno em socalcos.

Os solos no Douro podem ser diferenciados em solos cuja formação existiu a intervenção da mão humana aquando da fixação da vinha e que abrangem a maior parte da RDD, sendo considerados solos de perfil composto por um único horizonte (A) antrópico de espessura muito variável, estando assim dependente da profundidade da escavação da terra, variando entre 1,10 e 1,30 m, e da localização do socalco. Este horizonte, encontra-se normalmente dividido em dois estratos. O tipo de solo diferente do anterior, apreencontra-senta uma baixa representatividade na região, sendo aquele onde não houve intervenção antrópica, considerando-se apenas uma pequena intervenção no primeiro estrato, ficando assim o restante perfil no seu estado natural (IVDP, 2013).

Relativamente às caraterísticas físico-químicas dos solos, dominam as texturas franco-arenosa fina e franco-limosa, com grande quantidade de elementos grosseiros nos antrossolos, tanto à superfície como no perfil, o que lhe garante proteção contra a erosão hídrica, boa permeabilidade às raízes e à água assim como elevada absorção de energia radiante, garantindo assim uma boa maturação e a diminuição da amplitude térmica diurna (Fonseca, 1987).

1.3.2.2. Clima

A natureza montanhosa das vertentes do Douro e dos seus afluentes, assim como o corredor ventoso dos vales garantem grandes variações microclimáticas, sendo uma das características mais marcantes a grande amplitude térmica anual.

O elemento determinante é o relevo que influencia o clima desta região através das serras do Marão e de Montemuro que são barreiras à penetração dos ventos húmidos do oeste e dos ventos frios do Norte. Esta região encontra-se em vales profundo, protegidos por montanhas com altitudes de aproximademente 1000 metros (Magalhães, 2008).

O clima é um fator indissociável do sucesso de todos os sistemas agrícolas, ao influenciar a adaptação de uma casta a uma determinada região e controlar a respetiva produção e qualidade, potenciando assim a sustentabilidade económica (ADVID, 2013).

O clima da RDD é mediterrânico, sendo caraterizado por uma forte consistência interanual de insolação total, temperatura e evapotranspiração potencial, e uma significativa variação interanual da precipitação (ADVID, 2007). Nesta região, como na maioria das regiões de clima mediterrânico, a alta variabilidade na precipitação, aliada a uma elevada evapotranspiração durante o período de verão, é um dos fatores limitadores

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do desenvolvimento da videira, bem como da produção e qualidade da vindima (Sotés, 2001).

A precipitação distribui-se assimetricamente ao longo do ano, sendo os valores mais elevados em dezembro e janeiro e os mais baixos em julho e agosto, variando as temperaturas médias anuais entre 11,8 ºC e 16,5 ºC, aumentando as amplitudes térmicas com o aumento da distância do mar (IVDP, 2013).

1.4. Casta Tinta Roriz

A casta Tinta Roriz tem uma forte expressão no encepamento ibérico, e é uma casta que está muito frequentemente associada à produção de vinhos de qualidade nas denominações de origem com maior prestígio (Magalhães, 2000; Banza et al., 2001).

Esta casta é originária da região de Valdepeñas tendo sido posteriormente difundida para a Rioja e para as outras regiões de cultura espanholas e portuguesas (Martins et al., 2004). Segundo Loureiro (2002), terá sido nesse trajeto que a casta foi adquirindo uma vasta lista de sinónimos, certamente devido ao reconhecimento do seu potencial vitícola pelos viticultores, que teriam como objetivo reclamá-la como sua.

Em Espanha é conhecida principalmente como Tempranillo, sendo oficialmente reconhecidos os sinónimos Cencíbel, Tinto Fino, Tinto de Toro, Tinto del País e Ull de Llebre (Chomé et al., 2003). Em Portugal também é conhecida como Aragonês (Portaria n.º 428/2000, de 17 de julho).

A entrada da casta no nosso país não tem data certa (Böhm et al., 2007). É avançada a hipótese de ter sido introduzida a partir de finais do século XVI, durante a dinastia Filipina. Porém, as primeiras referências escritas relativas à casta apenas aparecem em obras publicadas na primeira metade do século XIX, sendo referidos então três tipos: Aragonês, Aragonês da Terra e Aragonês de Elvas e só a partir de 1880, há referência à Tinta Roriz, nome pelo qual é conhecida no Douro e no Dão (INRB, 2010).

Nesta altura, a casta já era dominante nos encepamentos de Portalegre, Borba e Viana do Alentejo (Loureiro, 2002). Estes factos parecem indiciar não só uma presença mais antiga da casta entre nós, mas também que a sua introdução tenha sido feita a partir do Sul do país.

Segundo Böhm et al. (2007), a casta Tinta Roriz já ocupa uma área de cultura superior a 20 000 ha, o que a poderá tornar numa principal casta nacional.

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A sua presença é tradicional no Douro, no Alentejo e no Dão, sendo a sua expressão ainda diminuta, mas essencial para o loteamento dos tintos produzidos nestas regiões (Salvador, 2005). A sua introdução na região da Estremadura é mais recente e tem originado vinhos monovarietais o que provoca uma boa recetividade por parte do consumidor (Ghira e Constâncio, 2004; Carvalho, 2005).

Espanha também regista um interesse renovado pela casta. A sua área de cultura ultrapassa os 200 000 ha, o que a torna na casta tinta com maior expressão (OEMV, 2009). A seleção da casta Tinta Roriz teve início em 1985, com a prospeção de plantas-mãe nas principais regiões de cultura da casta no Douro, Dão e Alentejo. As principais caraterísticas na sua seleção foram, para além do aspeto sanitário, em que o vírus do enrolamento foliar da videira se revelou com alguma importância e representatividade, a regularidade da produção inter-anual, a produtividade média e a boa capacidade de maturação, particularmente acumulação de açúcares e de compostos fenólicos (Banza et al., 2001).

A importância económica desta casta, tem aumentado esporadicamente a necessidade de material de multiplicação e o interesse por clones selecionados. Atualmente, encontram-se em multiplicação no território nacional mais de duas dezenas de clones da casta Tinta Roriz, com diversas origens geográficas (Luís et al., 2004).

É uma casta vigorosa de porte ereto. Possui boa fertilidade nos gomos da base das varas (incluindo os da coroa) pelo que é aconselhável podá-la em poda curta e conduzi-la em cordão Royat (unilateral ou bilateral) (Luís et al., 2004).

É muito sensível ao vento, chegando as folhas a romperem-se e rasgarem-se, dando posteriormente origem a infeções causadas por fungos da podridão.

A folha adulta (figura 7) apresenta tamanho médio a grande, com lóbulo central alongado, perfil irregular, com empolamento e ondulação do limbo entre as nervuras no ponto peciolar. O seio peciolar apresenta lóbulos sobrepostos e base em V; os seios laterais superiores são profundos, ligeiramente sobrepostos e base em U (Magalhães, 2008).

A casta Tinta Roriz é muito generosa na produção, os cachos e os bagos (figura 7) são de tamanho médio ou grande e os rendimentos são com alguma frequência exagerados. A produção média deverá ser da ordem das 8-15 ton/ha.

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Figura 7 – Cacho e folha da casta Tinta Roriz (http://fitapreta.com/wordpress/viticultura-e-enologia/castas/).

De uma forma geral, é bastante suscetível às doenças criptogâmicas, sendo sensível ao míldio, nomeadamente tardio (bago de ervilha) que lhe pode causar prejuízos destruindo até 50% da produção; também é suscetível ao oídio e é sensível à podridão cinzenta, em particular antes da floração – altura em que, nos anos de chuvas persistentes, pode sofrer estragos consideráveis a nível de todos os órgãos verdes (Luís et al., 2004).

No domínio das pragas, é muito apetecida pelas cicadelas (cigarrinha verde), as quais chegam a provocar intensas desfolhas antes da maturação completa das uvas (INRB, 2013).

Do ponto de vista morfológico, o cacho apresenta-se médio, cilindro-cónico, medianamente compacto e pedúnculo de comprimento médio. O bago apresenta-se arredondado, médio e negro-azul, película de espessura média e polpa de consistência média. O sarmento é castanho – amarelado (Böhm et al., 2007).

Os vinhos podem ser caraterizados como bem providos de matéria corante, aromaticamente intensos e complexos. Desenvolvem inicialmente aromas de ameixas e frutos silvestres, que se tornam mais complexos com a evolução. Apresentam elevado potencial de envelhecimento, especialmente em madeira (Böhm, 2007).

O seu potencial é muito diversificado, em função dos locais e destino da produção, desde vinhos correntes a vinhos de reserva e vinhos do Porto. Em regiões quentes revela acidez particularmente baixa (Magalhães, 2008).

1.5. Seleção clonal

A deficiente qualidade do material vegetal, no que diz respeito à sua aptidão genética e estado sanitário, tem sido apontada como uma das causas para o fraco desempenho da viticultura nacional (Pereira, 1997).

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Durante os trabalhos de seleção da videira, iniciados a partir do final dos anos 70 do século passado, verificou-se uma elevada frequência do vírus do enrolamento tipo 3 em algumas castas tradicionais portuguesas; no caso da Tinta Roriz o nível de infeção variou entre os 15 e os 22,7% consoante a origem dos pés-mãe prospetados (Sequeira et al., 1991; Martins et al., 1995).

A seleção clonal da videira surge como o único meio para recuperar as castas tradicionais e assegurar a permanência das suas características ou, por outro lado, modificá-las, no sentido de um melhor desempenho cultural e enológico (Ladeira, 1994).

Portugal apenas iniciou os trabalhos de seleção das castas de videira a partir de finais da década de setenta do século passado (Martins et al., 1994).

O programa Português de seleção clonal, criado em 1978, tem como principal objetivo, conhecer e selecionar as melhores castas, visando aumentar a qualidade dos vinhos produzidos em Portugal. Estão atualmente abrangidos neste programa diversos clones certificados que são cultivados por viticultores nacionais.

A homologação recente de mais de uma centena de clones das castas portuguesas com maior importância económica, constituiu um passo fundamental para ultrapassar a situação de penúria em materiais de propagação vegetativa com garantia varietal e sanitária (Despacho 6147/2006, de 15 de Março; Despachos 6225 e 6226/2006, de 16 de Março) tornando expectável que se verifique, nos próximos anos, uma assinalável melhoria quantitativa e qualitativa do potencial vitícola, reforçando a competitividade da viticultura nacional na resposta às solicitações de um mercado cada vez mais exigente.

Contudo, e apesar do comportamento produtivo e qualitativo de um clone ser avaliado com base em numerosos parâmetros agronómicos e enológicos, a influência ambiental (nomeadamente solo, clima e práticas culturais), assume frequentemente um peso elevado e faz com que o potencial de cada clone esteja estreitamente ligado ao local onde se realizou a sua avaliação (Magalhães, 2008). Desta forma, a seleção clonal apenas constituirá um fator de evolução da fileira vitivinícola, na medida em que a escolha dos clones, pelo viticultor, seja feita sobre uma base criteriosa e desde que as técnicas culturais aplicadas respeitem a natureza dos materiais selecionados.

A seleção clonal levada a cabo na maioria dos países vitivinícolas contribuiu decisivamente para a melhoria do sector vitivinícola, proporcionando ao viticultor material vegetal de elevada qualidade e isento de viroses.

Contudo, quando se seleciona escolhe-se. Essa escolha tem como consequência a redução da variabilidade genética no interior das castas. Esta perda de genes poderá

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inviabilizar futuras seleções com base noutros critérios, muitas vezes motivados pela modificação do gosto do consumidor (Carneiro et al., 2003).

1.5.1. Seleção clonal da casta Tinta Roriz

A seleção clonal é feita, numa base regional como é o caso da seleção da casta Tinta Roriz ou Tempranillo em Espanha (Rubio et al., 2005) o que pode originar que os clones apresentados tenham características culturais ou tecnológicas muito distintas, devendo por esta razão o viticultor preocupar-se também com os clones a cultivar, tendo em vista o tipo de vinho que pretende produzir (Pereira, 1997). Apesar disto, se a seleção tiver sido bem feita, a superioridade evidenciada por um clone em relação aos outros (teor em açúcares, acidez, rendimento, regularidade da produtividade) apresenta geralmente um certo paralelismo em ambientes distintos (Huglin e Scnheider, 1998) pois o seu potencial genético, que se reflete pela resposta vitivinícola, mantém-se, independentemente, das características do meio (Magalhães et al., 2000).

A seleção clonal da casta Tinta Roriz teve início nos anos de 1980-1990, em que os clones eram destinados a aumentar a sua produtividade, tanto em Portugal como em Espanha, o que resultou em vários clones certificados, comercialmente disponíveis, que têm sido recentemente associados a vinhos de média qualidade, ou seja, baixo comportamento nos parâmetros de cor, baixo teor em polifenóis, baixa qualidade sensorial e altos rendimentos (Graça et al., 2014).

1.6. Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos desempenham um papel importante na vida das plantas, encontrando-se em todos os seres vivos vegetais superiores (Landrault et al., 2002); são metabolitos secundários presentes maioritariamente em frutos e localizam-se nos tecidos mais externos das plantas, ou nas paredes celulares (Marcheix et al., 1990).

Segundo Espín et al. (2001), há uma enorme variabilidade na estrutura e ocorrência das substâncias fenólicas, que vai desde compostos muito simples, como por exemplo o fenol, até estruturas mais complexas, como os taninos condensados de elevado peso molecular.

Estes compostos apresentam uma grande diversidade e dividem-se em dois grandes grupos: flavonóides (flavonas, isoflavonas, flavonóis, flavanóis, antocianinas, flavanonas, calconas, auronas) e não flavonóides (ácidos fenólicos e estilbenos).

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Estruturalmente, os flavonóides são substâncias aromáticas com 15 átomos de carbono (C15) no seu esqueleto básico, sendo compostos fenólicos, que possuem nessa

estrutura anéis em C6-C3-C6. O esqueleto C15 dos flavonóides é biogeneticamente derivado

do fenilpropano (C6-C3) e três unidades de acetato (C6) (Middleton e Kandaswarni, 1993).

Os flavonóides são responsáveis pelas propriedades organoléticas dos vinhos nomeadamente pela cor e estrutura (Mateus, 2009).

Os flavonóides das uvas e dos vinhos têm os mesmos grupos substituintes nos grupos hidroxilo do anel A, nas posições 5 e 7. As diferentes classes dos flavonóides são definidas pelas diferenças no estado de oxidação e substituição no anel C (Halliwel, 1995) (Figura 8).

Figura 8 - Estrutura dos flavonóides (adaptado de Moreno-Arribas e Polo, 2009).

a – Flavona R3 = H; Flavonol R3 = OH; b – Flavanona R3 = H; Flavanonol R3 = OH

Os polifenóis apresentam, para além da capacidade antioxidante, importantes atividades anti-virais, anti-alérgicas, anti-inflamatórias e anti-tumorais (Carvalho, 2008).

Os compostos fenólicos existem em todas as variedades de uvas estando presentes em maior quantidade nas uvas tintas (Hutkins, 2008).

As antocianinas são os pigmentos responsáveis pela coloração vermelha e azul das películas das uvas e também do vinho tinto. Esta coloração deve-se à sua forma característica, sendo que quando a estrutura é alterada, existe alteração da cor

(Moreno-18

Arribas e Polo, 2009). Nas uvas e nos vinhos, foram identificadas 15 antocianinas diferentes, correspondentes aos monoglucósidos de cinco antocianidinas principais: delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina e malvidina (Cadenas e Packer, 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009). As suas quantidades variam de casta para casta, sendo, em todas as castas, a malvidina a maioritária. As antocianinas ainda reagem com os taninos condensados para originar estruturas conhecidas como pigmentos poliméricos que participam na coloração do vinho (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009)

As antocianinas estão presentes principalmente na película; nas castas tintureiras, também estão presentes na polpa (Carrera, 2007).

Os principais constituintes fenólicos presentes nas uvas são, por ordem crescente em termos de concentração: os flavonóis, os ácidos fenólicos, as antocianinas, as catequinas e as proantocianidinas (Laureano, 1988; Roggero et al., 1986).

A cor dos vinhos é um aspeto muito importante, por ser o primeiro atributo que se observa na avaliação sensorial do vinho (Hernández-Agero et al., 1993).

1.7. Atividade antioxidante das uvas e do vinho

Um antioxidante é qualquer substância capaz de retardar ou impedir danos causados pela oxidação estando presente em pequenas concentrações, quando em comparação com o agente oxidante (Maisuthisakul et al., 2007).

Os principais antioxidantes nos vegetais são as vitaminas C e E, os carotenóides e os compostos fenólicos, particularmente os flavonóides. Estes antioxidantes são capazes de reagir com radicais livres e assim inibir a etapa de iniciação ou de propagação das reações oxidativas causadas pelos radicais (Podsedek, 2007).

Os antioxidantes são capazes de estabilizar ou desativar os radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas células (Sousa et al., 2006).

Dado que o organismo humano não consegue sintetizar antioxidantes para combater os radicais livres, o papel dos antioxidantes naturais presentes nos alimentos é muito importante, dado que estes, em especial os frutos e os vegetais, são a sua principal fonte (Wang et al., 1996).

Vários trabalhos têm evidenciado a existência de uma importante relação entre os vários compostos fenólicos e a atividade antioxidante revelada pelas uvas e vinhos (Yilmaz e Toledo, 2004).

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Os estudos publicados sobre a atividade antioxidante em várias castas de diversos países apresentam, em geral, uma grande variabilidade de valores, sendo normalmente a casta, um dos fatores mais determinantes para os valores referenciados (Bozan et al. 2008; Poudel et al. 2008).

No que diz respeito à casta Tinta Roriz, Costa et al. (2011) apresentou valores, em dois métodos distintos, para a atividade antioxidante de 11,63 μmoles/g bago para o método ABTS e 13,71 μmoles/g bago para o método DPPH.

De acordo com Arts et al. (2003), os valores da atividade antioxidante variam de acordo com o método utilizado, visto que cada método apresenta uma afinidade diferente em função dos compostos fenólicos presentes no meio. Ainda de acordo com este autor, existe uma maior afinidade por parte do método ABTS, na determinação da atividade antioxidante das uvas.

1.8. Compostos fenólicos e os seus benefícios para a saúde

Os compostos fenólicos são produzidos nas plantas e são atualmente muito investigados devido aos benefícios para a saúde que têm demostrado, diminuindo o risco de determinados tipos de cancro, doenças cardiovasculares, diabetes, entre outros (Alonso et al., 2002). É possível encontrar polifenóis em várias frutas, entre as quais, as uvas. Cada 100 g de frutas vermelhas frescas contêm 200-300 mg de polifenóis (Pandey e Rizvi, 2009). A mesma quantidade pode ser encontrada em dois a três copos de vinho tinto ou em duas a três chávenas de chá ou café.

Apesar de haver relatos do consumo de vinho há mais de 7.000 anos, os benefícios deste foram apenas destacados em 1992, quando foi publicado o Paradoxo Francês (Facco, 2007). Os hábitos alimentares adotados pelos franceses, que, apesar de apresentarem altos índices de sedentarismo, tabagismo, alto consumo de gorduras saturadas e maiores níveis de colesterol, quando comparados com os habitantes de outros países, nomeadamente Norte Americanos, têm uma menor incidência de doenças coronárias, facto atribuído ao alto consumo de vinho (Fuhrman et al., 2005). Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) demonstram que os índices de mortalidade por doenças cardiovasculares na França são menores quando comparados a outros países, motivo pelo qual surgiu a denominação do Paradoxo Francês (Souza et al., 2006).

Vários estudos têm demonstrado a relação entre a diminuição da taxa de mortalidade de consumidores de vinho e o teor de polifenóis existente no mesmo. Hutkins

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(2008) fala de um estudo nos Estados Unidos da América onde se registou a taxa de mortalidade de cerca de 130 mil adultos da Califórnia, observando-se que esta era menor nos que bebiam vinho em relação aos que bebiam cerveja.

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1.9. Objetivos

A Tinta Roriz é, provavelmente, a casta tinta com maior importância económica no contexto vitivinícola ibérico. Encontram-se hoje disponíveis no mercado viveirista vários clones desta casta, com origens geográficas distintas. A interação genótipo/ambiente torna pertinente a realização de ensaios de comparação clonal. Assim, o primordial objetivo deste trabalho consistiu em verificar se amostras de uma mesma casta com características genéticas diferentes, também apresentavam propriedades funcionais diferentes, nomeadamente ao nível dos parâmetros enológicos e da composição fenólica. Simultaneamente, pretendeu-se verificar em que se diferenciavam da casta propriamente dita. Assim os objetivos específicos deste trabalho foram:

 Determinar a intensidade de cor, tonalidade, antocianinas totais, grau Brix, pH e acidez total;

 Efetuar a caraterização fenólica e a determinação da atividade antioxidante da casta Tinta Roriz e de um conjunto de clones da mesma casta de dois anos de vindima;

 Estabelecer um termo comparativo entre os clones e a casta Tinta Roriz;  Correlacionar os parâmetros fenólicos estudados com a atividade

antioxidante;

 Comparar a composição fenólica e a atividade antioxidante dos clones e da casta Tinta Roriz de dois anos de colheita;

 Diferenciar o conjunto de amostras analisadas recorrendo à análise em componentes principais e tendo como base os parâmetros avaliados.

Capítulo II

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2.1. Amostragem

Neste estudo foram usados oito clones, (1 a 8) catalogados pelos produtores de 344, 217, 5107, 415, 209, 5203, 1172 e 5205 da casta Tinta Roriz de acordo com o apresentado na tabela 5 e uma amostra da casta Tinta Roriz. Todas as amostras foram provenientes das vindimas de 2012 e 2013, da Quinta do Seixo da Região Demarcada do Douro. Coordenadas do local de vindima (N 41º 10’ 09.169; W 7º33’26.126).

Tabela 5: Catalogação da amostragem dos clones da casta Tinta Roriz.

Clone Catalogado 1 344 2 217 3 5107 4 415 5 209 6 5203 7 1172 8 5205

2.2. Caraterização enológica dos clones e da casta Tinta Roriz

2.2.1. Extração do mosto das uvas

Primeiramente contaram-se e pesaram-se os bagos de cada um dos clones e da casta Tinta Roriz; procedeu-se ao seu esmagamento (prensagem e esgotamento), até libertação total do mosto. Posteriormente, efetuou-se a determinação do volume de mosto em mL. Desse mosto determinou-se o grau Brix, acidez total e pH.

2.2.2. Acidez total

A acidez total foi determinada, em g de ácido tartárico/L, pelo método proposto pelo OIV (2013), que consiste numa titulação com NaOH, sendo o azul de bromotimol

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usado como indicador do ponto final da reação. A acidez total de um mosto, é a soma de todos os ácidos tituláveis, à exceção do dióxido de carbono, com o acerto do pH a 7, por adição de uma solução alcalina tituladora.

2.2.3. pH

A concentração hidrogeniónica do meio (neste caso do mosto) é definida pela expressão: pH= -log[H3O+]. A determinação é realizada por potenciometria. O método

(OIV, 2013), baseia-se na determinação da diferença de potencial entre dois elétrodos imersos no meio em análise – um (elétrodo de referência) com um potencial constante e conhecido, outro (elétrodo de medida) com o potencial determinado pelo pH do meio.

2.2.4. Grau Brix

A determinação do grau Brix realizou-se recorrendo à refratometria, utilizando-se um refratómetro de mão (OIV, 2013).

2.2.5. Álcool provável

O álcool provável foi calculado com base na determinação do grau Brix recorrendo a tabelas apropriadas.

2.3 - Extração dos compostos fenólicos

Para a extração dos compostos fenólicos da película dos bagos dos clones e da casta Tinta Roriz, seguiu-se o método descrito por Downey et al. (2007). Assim, utilizaram-se cinco bagos, aos quais se retirou a película após prévia lavagem, sem descongelação. Pesaram-se as películas e procedeu-se à maceração das mesmas com dez mililitros de metanol acidificado (0,1 % HCl). Este procedimento foi repetido por três vezes, até à sua descoloração completa. Centrifugou-se a 3000 r.p.m durante dez minutos. Retirou-se o sobrenadante e colocou-se em balões volumétricos de 50 mL e perfez-se o volume com metanol. Cada extrato foi preparado em duplicado. A amostra foi colocada num porta-amostras. Por fim, e para que se pudessem efetuar as determinações pretendidas, o extrato foi em cada caso diluído cinquenta vezes.

2.4. Intensidade e tonalidade corante

A intensidade da cor dos extratos fenólicos das películas foi determinada de acordo com OIV (2013) e consistiu na soma das absorvâncias a 420, 520 e 620 nm. Para a

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tonalidade corante, utilizou-se o mesmo método e efetuou-se o quociente entre a absorvância a 420 e 520 nm.

Intensidade da cor = (Abs. 420 +Abs. 520 +Abs. 620)

Tonalidade da cor = Abs. 420 / Abs. 520

2.5. Antocianinas totais

O teor de antocianinas totais de cada um dos extratos fenólicos foi determinado colorimetricamente, pela diferença de cor obtida em dois tubos de ensaio, um a pH 3,5 e outro a pH 0,6.

Um dos tubos continha 1 mL da amostra concentrada, 1 mL da solução etanólica a 0,1% HCl, 10 mL da solução tampão a pH 3,5 e o outro tubo continha 1mL da amostra concentrada, 1 mL da solução etanólica 0,1%HCl e 10 mL de uma solução com pH 0,6. Seguidamente efetuou-se a leitura das amostras a um comprimento de onda de 520 nm.

A quantidade de antocianinas presentes nos extratos das amostras foi calculada através da seguinte fórmula:

Teor de Antocianinas totais= 400 (Abs 520pH0,6 – Abs 520pH3,5) mg/L

Utilizou-se o método descrito por Lee et al. (2005).

2.6. Fenóis totais

O princípio do método baseia-se na redução da mistura de ácido fosfotúngstico e de fosfomolíbdico em óxido de tungsténio e de molibdénio de cor azul, em meio básico, por parte dos compostos fenólicos presentes na amostra. A monitorização da reação foi realizada por colorimetria uma vez que o complexo reduzido apresenta uma coloração azul intensa e absorvância máxima ao comprimento de onda de 750nm. Desta forma, quanto maior for a quantidade de compostos fenólicos presentes no extrato das amostras, maior será a absorvância a este comprimento de onda (Huang et al., 2005; Prior et al., 2005; Apak et al., 2007). Foi utilizado o método proposto por Barros et al. (2012).

Para a realização do método foi necessário primeiramente, preparar uma solução padrão de ácido gálico, para a construção da reta de calibração com diferentes concentrações: 250, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 25, 10 e 5 mg/L. A reta de calibração utilizada para a quantificação dos fenóis totais das amostras encontra-se nos anexos, figura 1.

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Para a preparação de cada padrão foi colocado em cada um dos tubos de ensaio sequencialmente 1 mL de cada padrão de ácido gálico, 0,5 mL de Folin-Ciocalteu, 2,0 mL de Na2CO3 (7,5 %) e 6,5 mL de água destilada. Após homogeneização, colocaram-se os

tubos num banho de água a 70ºC, durante 30 minutos; de seguida arrefeceram-se os tubos em água corrente e leu-se a absorvância a 750 nm numas cuvetes de 1cm de percurso ótico.

O mesmo procedimento foi utilizado para a análise das amostras. Todas as análises foram realizadas em triplicado.

A quantificação dos fenóis totais de cada amostra foi calculada por interpolação da reta. Os resultados foram expressos em mg GAE/g de película.

2.7. Orto-difenóis

Os orto-difenóis foram determinados pelo método descrito por Mateos et al. (2001). Para a realização deste método procedeu-se primeiramente à preparação de uma solução padrão de ácido gálico, para a construção da reta de calibração com diferentes concentrações: 250, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 25, 10 e 5 mg/L.

A cada um dos tubos de ensaio foram adicionados sequencialmente 4 mL de cada padrão e 1 mL de molibdato de sódio (5%). Após homogeneização, deixou-se em repouso 15 minutos e leu-se a absorvância a 370 nm. Nos anexos, encontra-se a reta de calibração relativa a esta determinação (Figura 2).

Sequencialmente num tubo de ensaio adicionou-se 4 mL da amostra diluída e 1 mL de molibdato de sódio. Após homogeneização, deixou-se em repouso 15 minutos e leu-se a absorvância a 370 nm. Todas as análises foram realizadas em triplicado.

A quantificação dos orto-difenóis dos extratos de cada amostra, foi calculado por interpolação, e os resultados expressos em mg GAE/g de película.

2.8. Flavonóides

Para a determinação dos flavonóides foi utilizado o método descrito por Zhishen et al. (1999). Assim, preparou-se uma solução padrão de catequina, para a construção da reta de calibração com diferentes concentrações: 250, 100, 50, 25, 10 e 5 mg/L. No anexos encontra-se a reta de calibração obtida nesta determinação (Figura 3).

A cada um dos tubos de ensaio foram adicionados sequencialmente 0,5 mL de cada padrão, 150 µL de nitrito de sódio (5%). Esperou-se 5 minutos e adicionou-se 150 µL de cloreto de alumínio (10%) esperou-se 6 minutos e adicionou-se 1 mL de hidróxido de sódio (1M). Após agitação, leu-se a absorvância dos extratos das amostras a 510 nm.

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O mesmo procedimento referido para os padrões e obtenção da reta de calibração, foi adotado com as amostras, sendo que o teor em flavonóides em cada extrato de amostra foi determinado pela interpolação dos valores obtidos na reta. Os resultados são expressos em mg de catequina/ g de película.

2.9. Atividade antioxidante

Para a determinação da atividade antioxidante foi utilizado o método descrito por Ozgen et al. (2006), método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), figura 9. Este método tem sido amplamente utilizado por muitos investigadores na determinação da capacidade antioxidante de alimentos.

Figura 9 – Princípio do método de determinação da capacidade antioxidante com ABTS.

No método do ABTS, o grau de inibição obtido relaciona-se com o produzido por referências de concentração conhecida de um análogo sintético da vitamina E, ácido (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2-cromonil) fórmico (“Trolox”) (figura 10).

Figura 10- Estrutura do ácido (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2-cromonil) fórmico (“Trolox”).

Os resultados são expressos em capacidade antioxidante em equivalentes de trolox (TEAC) (μmoles de Trolox/g de amostra).

Inicialmente preparou-se o radical ABTS•+, em que foi adicionado a um tubo, 19 mg de ABTS• e 5 mL de água destilada e agitou-se. Num outro tubo colocou-se 38 mg de persulfato de potássio (K2S2O8) e 1 mL de água destilada e agitou-se novamente. Deste

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A solução preparada colocou-se no escuro e à temperatura ambiente durante 12-16 horas.

Para preparar a solução de trabalho, procedeu-se à diluição da solução preparada anteriormente, na razão de 1:88 com a solução tampão acetato de sódio, 20 mM, preparada inicialmente. A solução apresentou uma absorvância de 734 nm de 0,70 ± 0,02, numa cuvete de 1 cm de largura, com um percurso ótico de 1 cm relativamente à água.

Para a construção da reta de calibração foram adicionados a seis tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho ABTS• e de seguida aos tubos de ensaios de 2 a 6 adicionou-se 200, 150,100,50, 25 µL da solução de trabalho de Trolox 11mM, respetivamente. Por fim, ao tubo de ensaio 1, 3 a 6 adicionou-se 200, 50, 100, 150, 175µL de água, respetivamente. O tubo de ensaio 1 será o branco. Esperou-se 15 minutos e leu-se a absorvância a 734nm. No anexo I encontra-se a reta de calibração para os cálculos da quantificação da atividade antioxidante.

A percentagem de inibição de cada padrão foi calculada pela seguinte fórmula:

% de Inibição = ((Abs.734nm branco – Abs.734nm amostra) / Abs.734nm branco) × 100

Para a determinação da percentagem de inibição das amostras adicionou-se em três tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho de ABTS•, 200, 100, 50 µL de extrato de amostra e 100, 150 µL de água para completar o volume dos tubos de ensaio que não continham 2,2 mL. Este ensaio foi realizado em triplicado. Esperou-se 15 minutos e de seguida leu-se a absorvância a 734 nm. Por interpolação da reta de calibração, foi determinada a atividade antioxidante dos extratos das amostras. Os resultados foram expressos em µmol de Trolox/g de película.

2.10. Tratamento estatístico dos dados

Para analisar as diferenças estatísticas entre os resultados, efetuou-se uma análise de variância (ANOVA, uma variável) e a comparação dos valores médios pelo teste de Tukey (p<0,05). A diferenciação dos clones e da casta Tinta Roriz pelos diferentes parâmetros determinados foi efetuada com recurso à análise em componentes principais e análise de clusters (pela distância Euclidiana média). O programa usado para o tratamento estatístico foi o Statistica 2010 (Stat softInc., 2010).

Capítulo III

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3.1. Caraterização enológica do mosto das uvas dos clones e da

casta Tinta Roriz

Para caraterizar o mosto das uvas dos clones e das uvas da casta Tinta Roriz foram determinados vários parâmetros como o peso dos bagos, volume de mosto, pH, acidez total e grau Brix. Foram ainda calculados os teores de açúcares e o álcool provável (tabela 6).

Tabela 6 – Peso dos bagos, volume de mosto, pH, acidez total, grau Brix, açúcares e álcool provável do

mosto das uvas dos clones e da casta Tinta Roriz (vindima 2012 e 2013).

Amostras Ano de colheita Peso (g de 200 bagos) Volume de mosto (mL) pH Acidez total g/L Grau brix Acúcares g/L Álcool provável % (v/v) 1 2012 2013 296,9 --- 185 --- 4,59 --- 2,9 --- 25,3 --- 232,3 --- 13,8 --- 2 2012 2013 376,2 --- 231 --- 4,61 --- 2,2 --- 24,7 --- 246,4 --- 14,6 --- 3 2012 2013 399,2 465,9 239 255 4,66 4,65 2,5 1,3 27,2 26,0 275,2 261,1 16,4 15,5 4 2012 2013 403,9 521,3 246 305 4,08 4,58 2,4 1,2 24,9 26,1 248,7 262,5 14,8 15,6 5 2012 2013 383,8 --- 246 --- 4,63 --- 2,3 ---- 23,1 ---- 227,6 --- 13,5 --- 6 2012 2013 328,5 428,1 208 290 4,29 4,33 2,7 1,7 22,8 24,5 224,1 239,3 13,3 14,2 7 2012 2013 390,8 415,6 239 240 4,62 4,71 2,6 1,4 24,9 25,3 248,7 253,0 14,8 15,0 8 2012 2013 341,5 457,7 215 355 5,52 4,62 2,0 1,7 26,1 26,2 262,5 263,8 15,6 15,7 Tinta Roriz 2012 2013 306,9 447,9 208 255 4,22 4,05 2,9 2,4 24,6 26,0 245,0 261,1 14,6 15,5 --- Não analisados

Pela análise dos resultados, é possível constatar que o peso dos bagos foi superior no ano de vindima de 2013 comparativamente ao ano de vindima de 2012, apresentando este valores que variaram de 415,6g a 521,3g e consequentemente o volume de mosto obtido também foi superior no ano de vindima de 2013, apresentando os clones 8 e 4 um volume de mosto superior quando comparado com os restantes clones.

Quanto aos valores de pH, estes variaram entre 4,08 e 5,52 no ano de vindima 2012 e entre 4,05 e 4,71 no ano de vindima de 2013, já o mosto proveniente da casta Tinta Roriz apresentou um valor de pH de 4,22 para o ano de vindima de 2012 e 4,05 para o ano de vindima de 2013. Egipto (2011) obteve um valor de pH 3,57 para o mosto desta casta, sendo este valor inferior ao obtido no nosso estudo. Além disso, também Costa et

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al. (2013) obteve um valor de pH de 3,20 e 3,80 para o mosto da casta Tinta Roriz analisada.

Segundo Rizzon e Miele (2002) de entre os fatores que interferem no equilíbrio ácido-base e que são capazes de modificar o pH do mosto/vinho destacam-se: a dissolução dos minerais e ácidos orgânicos presentes na película da uva, especialmente o potássio durante a maceração, o que poderá levar a um aumento do valor de pH nos mostos em estudo.

Relativamente à acidez total, os valores variaram entre 2,0 e 2,9 g de ácido tartárico/L para os clones 8 e 1 no ano de vindima de 2012, respetivamente, entre 1,2 a 2,4 g de ácido tartárico/L para o clone 4 e para a casta Tinta Roriz, no ano de vindima de 2013. Estes valores são relativamente inferiores ao descrito na literatura, uma vez que Egipto (2011), determinou um valor de acidez total no mosto da casta Tinta Roriz de 3,3 g de ácido tartárico/L e Silva (2009) de 5,1 g de ácido tartárico/L. Um outro estudo realizado por Costa et al., 2013 mostrou que os resultados de duas vindimas da casta Tinta Roriz, podem ser diferentes pois para a vindima de 2010 obteve uma acidez total de 3,8 g de ácido tartárico/L e para a vindima de 2011 uma acidez total de 5,9 g de ácido tartárico/L. De acordo com Ribéreau-Gayon et al. (2006), vários fatores podem afetar a acidez total de um mosto, entre os quais se destacam as condições geográficas, o solo, principalmente a humidade e a permeabilidade do mesmo, assim como o clima nomeadamente a precipitação e a temperaturas ao longo da maturação. No entanto, o mesmo autor refere que independentemente do clima, os viticultores e enólogos podem ter algum controlo sobre a acidez total através de operações na vinha durante o período de maturação das uvas e também através da decisão da data de vindima. O tempo de maceração também pode afetar a acidez total do mosto pela libertação de ácidos orgânicos da película para o mosto durante a maceração (Giachini, 1996).

O teor em açúcares do mosto oscilou entre 224,1 g/L e 275,2 g/L no ano de vindima de 2012, já no ano de vindima de 2013 os valores oscilaram entre 239,3 g/L e 263,8 g/L. O valor de açúcares obtido para o mosto da casta Tinta Roriz foi de 245,0 e 261,1 g/L, respetivamente para o ano de vindima de 2012 e de 2013. Na literatura, Egipto (2011) obteve teores de açúcares de 209,5 g/L, valores ligeiramente inferiores aos obtidos nos mostos do presente estudo.

Para a vindima de 2012, os valores de álcool provável oscilaram entre 13,3% (v/v) para o clone 6 e 16,4 % (v/v) para o clone 3. Na vindima de 2013, o valor mais baixo foi também obtido para o clone 6 (14,2 %, v/v) e o mais elevado (15,7 %,v/v) para o clone