Para a extração dos compostos fenólicos da película dos bagos dos clones e da casta Tinta Roriz, seguiu-se o método descrito por Downey et al. (2007). Assim, utilizaram-se cinco bagos, aos quais se retirou a película após prévia lavagem, sem descongelação. Pesaram-se as películas e procedeu-se à maceração das mesmas com dez mililitros de metanol acidificado (0,1 % HCl). Este procedimento foi repetido por três vezes, até à sua descoloração completa. Centrifugou-se a 3000 r.p.m durante dez minutos. Retirou-se o sobrenadante e colocou-se em balões volumétricos de 50 mL e perfez-se o volume com metanol. Cada extrato foi preparado em duplicado. A amostra foi colocada num porta- amostras. Por fim, e para que se pudessem efetuar as determinações pretendidas, o extrato foi em cada caso diluído cinquenta vezes.
2.4. Intensidade e tonalidade corante
A intensidade da cor dos extratos fenólicos das películas foi determinada de acordo com OIV (2013) e consistiu na soma das absorvâncias a 420, 520 e 620 nm. Para a
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tonalidade corante, utilizou-se o mesmo método e efetuou-se o quociente entre a absorvância a 420 e 520 nm.
Intensidade da cor = (Abs. 420 +Abs. 520 +Abs. 620)
Tonalidade da cor = Abs. 420 / Abs. 520
2.5. Antocianinas totais
O teor de antocianinas totais de cada um dos extratos fenólicos foi determinado colorimetricamente, pela diferença de cor obtida em dois tubos de ensaio, um a pH 3,5 e outro a pH 0,6.
Um dos tubos continha 1 mL da amostra concentrada, 1 mL da solução etanólica a 0,1% HCl, 10 mL da solução tampão a pH 3,5 e o outro tubo continha 1mL da amostra concentrada, 1 mL da solução etanólica 0,1%HCl e 10 mL de uma solução com pH 0,6. Seguidamente efetuou-se a leitura das amostras a um comprimento de onda de 520 nm.
A quantidade de antocianinas presentes nos extratos das amostras foi calculada através da seguinte fórmula:
Teor de Antocianinas totais= 400 (Abs 520pH0,6 – Abs 520pH3,5) mg/L
Utilizou-se o método descrito por Lee et al. (2005).
2.6. Fenóis totais
O princípio do método baseia-se na redução da mistura de ácido fosfotúngstico e de fosfomolíbdico em óxido de tungsténio e de molibdénio de cor azul, em meio básico, por parte dos compostos fenólicos presentes na amostra. A monitorização da reação foi realizada por colorimetria uma vez que o complexo reduzido apresenta uma coloração azul intensa e absorvância máxima ao comprimento de onda de 750nm. Desta forma, quanto maior for a quantidade de compostos fenólicos presentes no extrato das amostras, maior será a absorvância a este comprimento de onda (Huang et al., 2005; Prior et al., 2005; Apak et al., 2007). Foi utilizado o método proposto por Barros et al. (2012).
Para a realização do método foi necessário primeiramente, preparar uma solução padrão de ácido gálico, para a construção da reta de calibração com diferentes concentrações: 250, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 25, 10 e 5 mg/L. A reta de calibração utilizada para a quantificação dos fenóis totais das amostras encontra-se nos anexos, figura 1.
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Para a preparação de cada padrão foi colocado em cada um dos tubos de ensaio sequencialmente 1 mL de cada padrão de ácido gálico, 0,5 mL de Folin-Ciocalteu, 2,0 mL de Na2CO3 (7,5 %) e 6,5 mL de água destilada. Após homogeneização, colocaram-se os
tubos num banho de água a 70ºC, durante 30 minutos; de seguida arrefeceram-se os tubos em água corrente e leu-se a absorvância a 750 nm numas cuvetes de 1cm de percurso ótico.
O mesmo procedimento foi utilizado para a análise das amostras. Todas as análises foram realizadas em triplicado.
A quantificação dos fenóis totais de cada amostra foi calculada por interpolação da reta. Os resultados foram expressos em mg GAE/g de película.
2.7. Orto-difenóis
Os orto-difenóis foram determinados pelo método descrito por Mateos et al. (2001). Para a realização deste método procedeu-se primeiramente à preparação de uma solução padrão de ácido gálico, para a construção da reta de calibração com diferentes concentrações: 250, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 25, 10 e 5 mg/L.
A cada um dos tubos de ensaio foram adicionados sequencialmente 4 mL de cada padrão e 1 mL de molibdato de sódio (5%). Após homogeneização, deixou-se em repouso 15 minutos e leu-se a absorvância a 370 nm. Nos anexos, encontra-se a reta de calibração relativa a esta determinação (Figura 2).
Sequencialmente num tubo de ensaio adicionou-se 4 mL da amostra diluída e 1 mL de molibdato de sódio. Após homogeneização, deixou-se em repouso 15 minutos e leu-se a absorvância a 370 nm. Todas as análises foram realizadas em triplicado.
A quantificação dos orto-difenóis dos extratos de cada amostra, foi calculado por interpolação, e os resultados expressos em mg GAE/g de película.
2.8. Flavonóides
Para a determinação dos flavonóides foi utilizado o método descrito por Zhishen et al. (1999). Assim, preparou-se uma solução padrão de catequina, para a construção da reta de calibração com diferentes concentrações: 250, 100, 50, 25, 10 e 5 mg/L. No anexos encontra-se a reta de calibração obtida nesta determinação (Figura 3).
A cada um dos tubos de ensaio foram adicionados sequencialmente 0,5 mL de cada padrão, 150 µL de nitrito de sódio (5%). Esperou-se 5 minutos e adicionou-se 150 µL de cloreto de alumínio (10%) esperou-se 6 minutos e adicionou-se 1 mL de hidróxido de sódio (1M). Após agitação, leu-se a absorvância dos extratos das amostras a 510 nm.
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O mesmo procedimento referido para os padrões e obtenção da reta de calibração, foi adotado com as amostras, sendo que o teor em flavonóides em cada extrato de amostra foi determinado pela interpolação dos valores obtidos na reta. Os resultados são expressos em mg de catequina/ g de película.
2.9. Atividade antioxidante
Para a determinação da atividade antioxidante foi utilizado o método descrito por Ozgen et al. (2006), método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), figura 9. Este método tem sido amplamente utilizado por muitos investigadores na determinação da capacidade antioxidante de alimentos.
Figura 9 – Princípio do método de determinação da capacidade antioxidante com ABTS.
No método do ABTS, o grau de inibição obtido relaciona-se com o produzido por referências de concentração conhecida de um análogo sintético da vitamina E, ácido (6- hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2-cromonil) fórmico (“Trolox”) (figura 10).
Figura 10- Estrutura do ácido (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2-cromonil) fórmico (“Trolox”).
Os resultados são expressos em capacidade antioxidante em equivalentes de trolox (TEAC) (μmoles de Trolox/g de amostra).
Inicialmente preparou-se o radical ABTS•+, em que foi adicionado a um tubo, 19 mg de ABTS• e 5 mL de água destilada e agitou-se. Num outro tubo colocou-se 38 mg de persulfato de potássio (K2S2O8) e 1 mL de água destilada e agitou-se novamente. Deste
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A solução preparada colocou-se no escuro e à temperatura ambiente durante 12-16 horas.
Para preparar a solução de trabalho, procedeu-se à diluição da solução preparada anteriormente, na razão de 1:88 com a solução tampão acetato de sódio, 20 mM, preparada inicialmente. A solução apresentou uma absorvância de 734 nm de 0,70 ± 0,02, numa cuvete de 1 cm de largura, com um percurso ótico de 1 cm relativamente à água.
Para a construção da reta de calibração foram adicionados a seis tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho ABTS• e de seguida aos tubos de ensaios de 2 a 6 adicionou-se 200, 150,100,50, 25 µL da solução de trabalho de Trolox 11mM, respetivamente. Por fim, ao tubo de ensaio 1, 3 a 6 adicionou-se 200, 50, 100, 150, 175µL de água, respetivamente. O tubo de ensaio 1 será o branco. Esperou-se 15 minutos e leu-se a absorvância a 734nm. No anexo I encontra-se a reta de calibração para os cálculos da quantificação da atividade antioxidante.
A percentagem de inibição de cada padrão foi calculada pela seguinte fórmula:
% de Inibição = ((Abs.734nm branco – Abs.734nm amostra) / Abs.734nm branco) × 100
Para a determinação da percentagem de inibição das amostras adicionou-se em três tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho de ABTS•, 200, 100, 50 µL de extrato de amostra e 100, 150 µL de água para completar o volume dos tubos de ensaio que não continham 2,2 mL. Este ensaio foi realizado em triplicado. Esperou-se 15 minutos e de seguida leu-se a absorvância a 734 nm. Por interpolação da reta de calibração, foi determinada a atividade antioxidante dos extratos das amostras. Os resultados foram expressos em µmol de Trolox/g de película.
2.10. Tratamento estatístico dos dados
Para analisar as diferenças estatísticas entre os resultados, efetuou-se uma análise de variância (ANOVA, uma variável) e a comparação dos valores médios pelo teste de Tukey (p<0,05). A diferenciação dos clones e da casta Tinta Roriz pelos diferentes parâmetros determinados foi efetuada com recurso à análise em componentes principais e análise de clusters (pela distância Euclidiana média). O programa usado para o tratamento estatístico foi o Statistica 2010 (Stat softInc., 2010).