Avaliação das propriedades mecânicas do tendão do calcâneo de ratos diabéticos submetidos ao treinamento físico aeróbico moderado

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FISIOTERAPIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA. RODRIGO RIBEIRO DE OLIVEIRA. AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES MECÂNICAS DO TENDÃO DO CALCÂNEO DE RATOS DIABÉTICOS SUBMETIDOS AO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO MODERADO.. RECIFE 2011.

(2) RODRIGO RIBEIRO DE OLIVEIRA. AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES MECÂNICAS DO TENDÃO DO CALCÂNEO DE RATOS DIABÉTICOS SUBMETIDOS AO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO MODERADO.. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Fisioterapia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do Grau de Mestre em Fisioterapia. Linha de Pesquisa: Fisioterapia: Desempenho físico-funcional e qualidade de vida. Orientadora: Profª Drª Sílvia Regina Arruda de Moraes.. RECIFE 2011.

(3) Oliveira, Rodrigo Ribeiro de Avaliação das propriedades mecânicas do tendão do calcâneo de ratos diabéticos submetidos ao treinamento físico aeróbico moderado / Rodrigo Ribeiro de Oliveira . – Recife: O Autor, 2011. 156 folhas: il., fig,. ; 30 cm . Orientador: Silvia Regina Arruda de Moraes. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Fisioterapia, 2011. Inclui bibliografia, anexos e apêndices. 1. Diabetes mellitus. 2. Tendão calcâneo. 3. Propriedades mecânicas. I. Moraes, Silvia Regina Arruda de. II.Título.. 616.462. CDD (22.ed.). UFPE CCS2011-033.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva PRÓ-REITOR DA PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DIRETOR Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA COODENADORA Profa. Dra. Armèle Dornelas de Andrade VICE-COODENADORA Profa. Dra. Glória Elizabeth Carneiro Laurentino CORPO DOCENTE Profa. Dra. Armèle Dornelas de Andrade Profa. Dra. Caroline Wanderley Souto Ferreira Anselno Profa. Dra. Glória Elizabeth Carneiro Laurentino Profa. Dra. Karla Mônica Ferraz Teixeira de Barros Prof. Dr. Marco Aurélio Benedetti Rodrigues Profa. Dra. Maria Cristina Falção Raposo Profa. Dra. Maria do Amparo Andrade Profa. Dra. Maria do Socorro Brasileiro Santos Prof. Dr. Murilo Carlos Amorim de Brito Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho Profa. Dra. Sílvia Regina Arruda de Moraes.

(6) ORIENTADORA Sílvia Regina Arruda de Moraes Professora Associado do Departamento de Anatomia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco Doutora em Ciências Morfofuncionais pela Universidade de São Paulo.

(7) DEDICATÓRIA. Com carinho, dedico este trabalho: Aos Meus Pais RONALDO J. DE OLIVEIRA e LENICE R. DE OLIVEIRA que me deram o alicerce da vida e me ensinaram as lições que não estão nos livros; À Minha Linda Esposa MARCELA N. MEDEIROS DE OLIVEIRA; Aos meus irmãos ALEXANDRE S. DE OLIVEIRA, ALPHEU B. DE OLIVEIRA, RENATA CARLA SANTOS e o caçula RONALDO JARDIM DE OLIVEIRA JÚNIOR Aos meus Avôs AGOSTINHO DIAS DE OLIVEIRA “In Memoriam”, ZILDA J. DE OLIVEIRA, LAURINDO DE OLIVEIRA E JÚLIA R. DE OLIVEIRA. À Bisa ENEDINA M. JARDIM (vó Zéia) “In Memoriam”..

(8) AGRADECIMENTOS ESPECIAIS. À Deus, que tem me guiado pelas estradas da vida sem que eu perca a força e a esperança.. Aos Meus Pais Ronaldo Jardim de Oliveira e Lenice Ribeiro de Oliveira e ao Meu Irmão Ronaldo J. Oliveira Júnior, por não me abandonarem em seus pensamentos e me ensinarem algo bom todos os dias.. À Minha Esposa Marcela N. Medeiros, pelo amor que despeja sobre nosso relacionamento, pelo apoio as minhas decisões, pela paciência nos dias ruins, por suportar a distância e meu cheiro de biotério.. À Profª. Drª. Sílvia Regina Arruda de Moraes, que aceitou a orientação deste trabalho e sempre se conduziu de maneira dedicada e competente durante toda sua elaboração. Muito obrigado por sua dedicação, paciência, incentivo e apoio em todos os momentos, sempre disponível quando precisava..

(9) AGRADECIMENTOS. . Ao Departamento de Fisioterapia da UFPE, especialmente aos servidores e docentes do programa de pós-graduação em Fisioterapia, pela acolhida e pelo apoio desde o início das atividades do mestrado;. . Ao. Laboratório. de. Materiais. Poliméricos. e. Caracterização. do. Departamento de Engenharia Química da UFPE, especialmente ao Engenheiro Magno Felipe Teixeira, pelas consultorias nas realizações dos ensaios mecânicos e pelas horas de conversa sobre matemática e futuro profissional. . Aos meus parceiros de estudo e de moradia, Thales Henrique de Araújo Sales e Pedro Olavo de Paula Lima, pelo companheirismo e por toda paciência com minha pessoa durante o período do mestrado;. . A todos os meus colegas de mestrado, Alana; Thaysa; Emanuela; Leila; Antônio; João; Jacqueline; Silvana; Dinalva; Roberta e Adriana, pelos estudos e debates que tanto promoveram o conhecimento da primeira turma do curso (2009), assim como pelos encontros sociais realizados;. . Aos Alunos de Iniciação Científica e de Mestrado/Doutorado do laboratório de Plasticidade Neuromuscular que foram fundamentais na operacionalização do projeto, em Especial a Kamilla Dinah, a Patrícia Cerqueira, o Marcos Galdino, a Fernanda Dias, o Olavo Campos, o Márcio Almeida e a Juliana Netto pela disponibilidade do tempo de.

(10) vocês em prol deste trabalho, pelo carinho e companheirismo, principalmente nos dias difíceis; . Agradeço a toda minha família e aos meus amigos pela torcida, constantes incentivos e orações. Obrigado por acreditarem no meu esforço..

(11) SUMÁRIO. 1 - Introdução ................................................................................................. 16 1.1 Hipóteses ............................................................................................... 20 1.2 Objetivos ................................................................................................ 21 1.2.1 Geral ............................................................................................ 21 1.2.2 Específicos .................................................................................. 21 2 – Material e Métodos .................................................................................. 22 2.1 – Animais ............................................................................................ 23 2.2 - Grupos Experimentais ...................................................................... 23 2.3 – Indução ao Diabetes Experimental ................................................. 24 2.4 – Avaliações Clínicas e Metabólicas ................................................... 24 2.5 – Treinamento Físico Aeróbico Moderado .......................................... 25 2.6 – Eutanásia e Coleta das Amostras do Tendão do Calcâneo ............ 29 2.7 – Análise Biomecânica – Ensaio Mecânico Convencional .................. 30 2.8 – Análise Estatística ........................................................................... 31 3 – Referência Bibliográfica ......................................................................... 33 4 – Resultados ............................................................................................... 38 4.1 – Artigo Original 1 ............................................................................... 39 4.2 – Artigo Original 2 ............................................................................... 62 4.3 – Artigo Original 3 ............................................................................... 84 5 – Considerações Finais ........................................................................... 108 6 – Limitações do Estudo ........................................................................... 110 7 - Anexos .................................................................................................... 112 ANEXO A - Review Article: Alterations of tendons in patients with Diabetes Mellitus: a systematic review ................................................................................ 113 ANEXO B - Aceite do Artigo Original 1 - Mechanical properties of Achilles tendon in rats induced to experimental diabetes ................................................ 147 ANEXO C – Submissão do Artigo Original 2 - Treino moderado de Corrida causa alterações nas propriedades biomecânicas do tendão do calcâneo?......148 ANEXO D - Comissão de Ética em Experimentação Animal - CEEA ................. 149. 8- Apêndices ................................................................................................. 150.

(12) APRESENTAÇÃO Para o desenvolvimento do presente estudo, inicialmente, foi realizada uma revisão da literatura com o intuito de se fazer um levantamento sobre a incidência de alterações nos tendões em indivíduos portadores de Diabetes Mellitus. Dessa revisão resultou o primeiro artigo desse trabalho de dissertação no formato de uma revisão sistemática intitulada – Alterations of tendons in patients with Diabetes Mellitus – a systematic review (ANEXO A). O artigo foi aceito para publicação no periódico Diabetic Medicine (conceito A1 na área 21 da CAPES e com Fator de Impacto 2.871) e encontra-se disponível. no. site:. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1464-. 5491.2010.03197.x/abstract. A partir dos dados obtidos nessa revisão, foi desenvolvido um protocolo experimental, utilizando ratos Wistar, com o intuído de avaliar os efeitos do estado diabético induzido quimicamente sobre as propriedades mecânicas do tendão do Calcâneo destes animais e, posteriormente, o efeito de um programa de treinamento físico aeróbico moderado sobre esse mesmo parâmetro bem como os parâmetros clínicos e metabólicos. Segundo. as. normas. do. Programa. de. Pós-Graduação. em. Fisioterapia da UFPE, o trabalho de dissertação, aqui apresentado, foi estruturado da seguinte forma: 1. Capítulo de Introdução: 1.1. Hipóteses. 1.2. Objetivos. 2. Capítulo de Material e Métodos..

(13) 3. Capítulo de Referências: contemplando as referências relativas aos capítulos de Introdução e Material e Métodos. 4. Capitulo de Resultados: apresentado sob a forma de três artigos originais: 4.1. O primeiro (Artigo Original 1) intitulado – Mechanical properties of Achilles tendon in rats induced to experimental diabetes teve como objetivo avaliar o efeito do Diabetes Mellitus (induzido quimicamente) sobre as propriedades mecânicas dos tendões do calcâneo de ratos correlacionando com os achados metabólicos e clínicos. Foi submetido ao periódico Annals of Biomedical Engineering (conceito A2 na área 21 da CAPES, Fator de Impacto 2.409) no dia 20 de setembro de 2010 e aprovado no dia 04 de janeiro de 2011(ANEXO B). 4.2. O segundo (Artigo Original 2), intitulado – Treino moderado de Corrida causa alterações nas propriedades biomecânicas do tendão do calcâneo? – teve como objetivo avaliar o efeito do treinamento físico aeróbico moderado sobre as propriedades mecânicas dos tendões do calcâneo de ratos. Foi submetido à Revista Brasileira de Medicina do Esporte (conceito B1 na área 21 da CAPES, Fator de Impacto 0.0769) no dia 11 de janeiro de 2011 e encontra-se em processo de revisão (ANEXO C). 4.3. O terceiro (Artigo Original 3), intitulado – Treinamento físico aeróbico restabelece as propriedades biomecânicas do tendão do Calcâneo de ratos induzidos ao Diabetes Mellitus – objetivou avaliar o efeito do treinamento físico aeróbico moderado sobre as propriedades mecânicas dos tendões do calcâneo de ratos quimicamente induzidos ao Diabetes.

(14) Mellitus. Será submetido à Diabetic Medicine (conceito A1 na área 21 da CAPES e com Fator de Impacto 2.871). 5. Considerações Finais 6. Limitações do Estudo 7. Anexos 8. Apêndices.

(15) RESUMO O presente estudo tem como objetivos de avaliar experimentalmente o efeito do Diabetes Mellitus sobre as propriedades mecânicas do tendão do calcâneo e, posteriormente, o de averiguar se a aplicação de um protocolo de treinamento físico aeróbico moderado restabelece os parâmetros mecânicos bem como os aspectos clínicos e metabólicos de ratos diabéticos e se altera o padrão de normalidade dos animais sadios. Material e Métodos: quarenta e quatro ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos da seguinte forma: Grupo Controle Sedentário – GCS, Grupo Diabético Sedentário – GDS, Grupo Controle Treinado - GCT e o Grupo Diabético Treinado – GDT, os grupos treinados foram submetidos a um protocolo de treinamento físico moderado contínuo em esteira motorizada. Para o ensaio mecânico os tendões foram fixados em uma máquina de ensaio mecânico convencional e tracionados até o ponto de fracasso do espécime, com célula de carga de 500N. Resultados: A avaliação das propriedades biomecânicas do tendão de calcâneo do GD apresentou-se com diminuição do módulo elástico (MPa) (p<0,01) e na Área de secção transversa (mm2) (p<0,01) e aumento da Deformação. Específica. Força. Máxima. (mm). (p<0,01),. Energia/Área. (N.mm/mm2) (p<0,01). O treinamento físico aeróbico moderado não modificou as propriedades biomecânicas do tendão do calcâneo dos animais do GCT, no entanto, restabeleceu as diferenças nos valores para o Módulo Elástico (MPa), Deformação Específica Força Máxima (mm) e Energia/Área (N.mm/mm2) do GDT, desta forma aproximando aos valores dos grupos controle. Conclusão: As. propriedades. mecânicas. do. tendão. de. calcâneo. de. ratos. quimicamente induzido ao Diabetes Mellitus têm alterações significativas quando comparado ao controle e essas alterações podem predispor a ruptura precoce, contudo, o treinamento físico aeróbico moderado foi eficaz no restabelecimento desses parâmetros mecânicos e não causando nenhuma alteração nociva ao tendão do GCT. Este estudo pode ser útil para compreender melhor. as complicações do sistema músculo-esquelético que. acometem aos portadores do Diabetes Mellitus. Palavras Chave: Diabetes Mellitus; Tendão do Calcâneo; Propriedades Mecânicas..

(16) ABSTRACT. The aim of this study is evaluate the effect of Diabetes Mellitus on the mechanical properties of the Achilles tendon and, subsequently, to determine whether the application of a protocol of moderate intensity aerobic exercise training restores the mechanical parameters as well as clinical and metabolism of diabetic rats and alters the normal pattern of healthy animals. Methods: Forty-four rats were divided randomly into four groups as follows: Sedentary Control Group - SCG, Sedentary Diabetic Group - SDG, Control Trained Trained CTG and Diabetic Group - DG, the trained groups were submitted to a protocol moderate physical training in continuous treadmill. For mechanical testing the tendons were fixed in a conventional mechanical testing machine and pulled to the point of failure of the specimen, the load cell of 500N. Results: Evaluation of biomechanical properties of the Achilles tendon GD presented with decreased elastic modulus (MPa) (p <0.01) and the Cross-sectional area (mm2) (p <0.01) and increased Specific Strength Deformation Maximum (mm) (p <0.01), Power / Area (N.mm/mm2) (p <0.01). Moderate aerobic exercise training did not modify the biomechanical properties of the Achilles tendon of the animals of GCT, however, reinstated the differences in the values for elastic modulus (MPa), Strain Specific Maximum Force (mm) and Power / Area (N.mm / mm2) approaching the values of the control groups. Conclusion: The mechanical properties of tendon calcaneus chemically induced diabetes mellitus have changed significantly compared to control and these changes may predispose to premature rupture, however, moderate aerobic exercise training was effective in restoring these mechanical parameters and causing no adverse change in the tendon of the GCT. This study may be useful to better understand the intricacies of the musculoskeletal system affecting those living with Diabetes Mellitus. Keywords: Diabetes Mellitus, Achilles tendon, Mechanical Properties.. Key words: Diabetes Mellitus, Achilles tendon; Mechanical Properties, Animal Model.

(17) 1 - INTRODUÇÃO.

(18) 17. A tendinopatia é uma disfunção do tendão caracterizada por degeneração intratendínea e desorganização das fibras de colágeno. Macroscopicamente, se apresenta como uma degeneração mucóide, com o tecido friável, desorganizado e de cor acastanhada. Microscopicamente, confirma-se que esta estrutura apresenta desorganização e micro ruptura das fibras de colágeno, hipercelularidade com arredondamento dos núcleos (MAFFULLI & KADER, 2002; NAKAMA et al., 2005; GLAZEBROOK et al., 2008), aumento significativo de colágeno tipo III em relação à quantidade de colágeno tipo I (JONES. et al., 2006), aumento da quantidade de. glicosaminoglicanos (FU; CHAN & ROLF, 2007), neovascularização (SZOMOR; APPLEYARD & MURRELL, 2006) e apoptose (LIAN et al., 2007). O Diabetes Mellitus (DM), por sua vez, vem sendo considerado um crescente problema de saúde pública, em decorrência de sua alta prevalência na população mundial, atingindo níveis epidêmicos em vários países. O DM inclui um grupo de doenças metabólicas que se caracteriza por apresentar uma hiperglicemia, resultante da deficiência na produção de insulina e/ou em sua ação. Diversos processos patogênicos específicos estão envolvidos no desenvolvimento do DM, dentre eles, a ação auto-imune sobre as células β do pâncreas, que resulta na deficiência da produção da insulina e anormalidades que desencadeiam resistência a ação da insulina (American Diabetes Association,2009). O estado de hiperglicemia provoca, a médio e longo prazo, alterações microvasculares que levam à diminuição do aporte sanguíneo dos tecidos, diminuindo assim a perfusão de oxigênio e ocasionando complicações crônicas como nefropatias, retinopatias, neuropatias, artropatia de Charcot e.

(19) 18. manifestações de disfunções autonômicas dentre outras (GROSS & NEHME, 1999). Dentre as complicações provenientes do DM estão às alterações do sistema músculo-esquelético, que têm sido pouco discutidas na literatura bem como na atuação clínica. No entanto, acredita-se que desenvolvimento dessas complicações no sistema músculo-esquelético, em especial nos tendões, poderão proporcionar o agravo do estado geral de saúde desses pacientes (AKTURK et al., 2002; OLIVEIRA; MAYWORN & OLIVEIRA, 2003; BOLTON et al., 2005). Os estudos sobre disfunções dos tendões musculares em indivíduos portadores de Diabetes Mellitus são escassos e enfocam, de maneira geral, avaliações com bases em exames de imagem (AKTURK et al., 2002; UNLU et al., 2003; BOLTON et al., 2005; AKTURK et al., 2007; BATISTA et al., 2008; PAPANAS. et al., 2009) e com desfechos centrados na desorganização. macroscópica (UNLU et al., 2003; BATISTA et al., 2008) e na espessura dessa estrutura (AKTURK et al., 2002; BOLTON et al., 2005; GIACOMOZZI et al., 2005; AKTURK et al., 2007; PAPANAS et al., 2009). Sobre esse tema, uma revisão sistemática realizada durante a execução desse trabalho comprovou haver uma relação entre o Diabetes Mellitus e alteração no tendão embora ainda não seja conclusivo em função dos desenhos dos estudos serem bastante variáveis (DE OLIVEIRA et al., 2010). Sabe-se do importante efeito que o exercício físico apresenta regulando e melhorando as condições do diabetes, facilitando a captação periférica da glicose e o metabolismo de glicogênio e proteínas (OLIVEIRA;.

(20) 19. ROGATTO & LUCIANO, 2002), sendo de grande importância no controle do diabetes tipo 2 (LINDSTRÖM et al., 2010). No entanto, a resposta do tecido conjuntivo ao treinamento físico ainda não está completamente elucidada. Alguns estudos utilizando a avaliação das propriedades mecânicas dos tendões demonstraram sua plasticidade em responder ao treinamento aeróbico, entretanto, os resultados ainda são conflitantes (VIIDIK, 1967; KIISKINEN,. 1977;. OXLUND;. MANTHORPE. &. VIIDIK,. 1981;. VIIDIK;. DANIELSON & OXLUND, 1982; BIEWENER & ROBERTS, 2000; BUCHANAN & MARSH, 2001; SEE et al., 2004; SEYNNES et al., 2009a). Com relação especificamente ao DM, não foram encontrados, na literatura estudos que tenham investigado a influência da atividade física aeróbica e/ou anaeróbica sobre os parâmetros biomecânicos dos tendões. Desta forma, tendo em vista a escassez de dados relativos ao efeito do Diabetes Mellitus sobre o comportamento mecânico do tendão do calcâneo bem como do efeito de um protocolo de treinamento físico aeróbio moderado sobre esse parâmetro. Esse estudo experimental torna-se relevante no sentido que pode contribuir para fornecer conhecimentos acerca desse tema que possam vir a ser aproveitados e extrapolados para a prática clinica..

(21) 20. 1.1. HIPÓTESES. . Os tendões do calcâneo de ratos com Diabetes Mellitus experimental do tipo. I. sofrem. alterações. nas. propriedades. mecânicas,. assim,. predispondo ao fracasso (ruptura) precoce;. . O treinamento físico aeróbico moderado em esteira é eficaz para potencializar as propriedades mecânicas dos tendões do calcâneo de ratos diabéticos, minimizando os efeitos da síndrome hiperglicêmica sobre a estrutura do tendão destes animais, desta forma, retardando a ruptura;.

(22) 21. 1.2. OBJETIVOS. 1.2.1. GERAL. Avaliar experimentalmente o efeito do Diabetes Mellitus sobre o comportamento mecânico do tendão do calcâneo e o efeito da aplicação de um treinamento físico aeróbico moderado sobre este parâmetro bem como nos parâmetros clínicos e metabólicos.. 1.2.2. ESPECÍFICOS. . Avaliar se o Diabetes Mellitus promove alteração na área da secção transversa do tendão do calcâneo e nas propriedades mecânicas do mesmo (Módulo Elástico (MPa), a Tensão força máxima (MPa), a Deformação (%), Deformação específica Força Máxima (mm), a Energia/Área (Nmm/mm2).. . Avaliar o efeito de um protocolo de corrida de intensidade moderada em esteira sobre as propriedades mecânicas (Área de Secção Tranversal mm2, Módulo Elástico (MPa), a Tensão força máxima (MPa), a Deformação (%), Deformação específica Força Máxima (mm), a Energia/Área (Nmm/mm2) dos tendões do calcâneo de ratos.. . Avaliar se a aplicação de um treinamento físico aeróbico moderado restabelece os parâmetros mecânicos (Área de Secção Tranversal mm2, Módulo Elástico (MPa), a Tensão força máxima (MPa), a Deformação.

(23) 22. (%), Deformação específica Força Máxima (mm), a Energia/Área (Nmm/mm2) bem como os aspectos clínicos e metabólicos (peso corpóreo, ingestão de líquido (ml), ingestão de sólidos (g), diurese (ml), glicemia (ml/dL)..

(24) 2 – MATERIAL E MÉTODOS.

(25) 24. 2.1 Animais. Foram. utilizados ratos albinos da. linhagem. Wistar (Rattus. Norvegicus), machos, com peso inicial entre 300 a 350 g, oriundos do Laboratório de criação do Departamento de Nutrição.. Os animais foram. mantidos no Biotério de experimentação do Departamento de Anatomia, em gaiolas plásticas coletivas (máximo de seis animais/gaiola) em um ambiente com temperatura de 23  1C, ciclo de luz/escuridão (12 h) invertido e com livre acesso a dieta de manutenção (Labina - Purina PetCare Company) e água ad libitum. Os procedimentos aplicados para manejo e cuidado dos animais estão de acordo com as normas internacionais estabelecidas pelo National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animal e foram aprovados pela comissão de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências Biológicas – UFPE (ANEXO D).. 2.2 Grupos Experimentais. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais: Grupo Controle Sedentário – GCS (n=11) constituído por ratos sadios; Grupo Controle Treinado – GCT (n=11) constituído por ratos sadios submetidos à treinamento físico aeróbico; Grupo Diabético Sedentário – GDS (n=11) constituído com ratos induzidos ao Diabetes Mellitus sem qualquer tipo de intervenção física e Grupo Diabético Treinado (n=11) constituído por ratos induzidos ao Diabetes Mellitus e submetidos a um treinamento físico aeróbico.

(26) 25. moderado. O grupo de animais treinados foi submetido a protocolo de treinamento aeróbico moderado e os demais se limitaram a atividades dentro da gaiola. 2.3 Indução ao Diabetes Experimental O diabetes experimental, equivalente ao do tipo I, foi induzido pela administração intraperitoneal de solução de estreptozotocina (Sigma Chemical Co., USA) após jejum alimentar de 14 horas. A estreptozotocina (STZ) foi diluída em tampão citrato de sódio a 10mM e pH 4,5, na dose única de 60 mg/kg de peso do animal, medido cuidadosamente em balança digital de precisão (BS3000A). Os animais controles receberam da mesma forma, doses equivalentes de solução tampão citrato de sódio, e decorridos 30 minutos do tratamento os animais foram alimentados normalmente (DALL'AGO. et al.,. 2002).. 2.4 Avaliação Clínica e Metabólica. Cinco animais de cada grupo experimental foram escolhidos aleatoriamente para serem colocados em gaiolas metabólicas (Tecniplast 3701M081) (Figura 1), durante um período de 72 horas (24 horas de adaptação ao novo ambiente e 48 horas para a realização dos registros), sendo avaliados o peso corporal (g), a ingestão hídrica (ml/24 h), a ingestão alimentar (g/24 h), a diurese (ml/24 h) e colhido o sangue e urina, respectivamente, para as dosagens da glicemia (mg/dL) e creatinina (mg/dL)..

(27) 26. Figura 1 – (A) Gaiola Metabólica própria para ratos (Tecniplast 3701M081), a. mamadeira para água; b. Câmara de alimentação; c. Funil coletor de fezes e urina. (B) a. sistema de drenagem para evitar a contaminação da urina; b. Câmara de alimentação bi-partida localizada fora da gaiola. A parte frontal capta os restos da alimentação impedindo a contaminação das fezes. (C) c. Funil coletor de fezes e urina com o sistema de separação para os tubos coletores.. A verificação da glicose sanguínea ocorreu nas seguintes etapas do experimento: 1- posterior ao jejum de 14 horas que antecederam a indução ao diabetes; 2 - três e sete dias após a indução, objetivando respeitar o critério de inclusão no Grupo Diabético, visto que foram somente incluídos os animais que apresentaram glicose sanguínea acima de 200 mg/dL (Glicosímetro Kit AccuChek Activ); 3 - No primeiro dia de cada momento da gaiola metabólica e 4 -no final de cada semana de treinamento físico, incluindo os animais dos grupos controle, até o final do experimento. Foram utilizadas tiras reagentes (AccuChek Activ) para dosagem da glicose sanguínea de gota de sangue da ponta da cauda do animal. A periodicidade da execução dos procedimentos da gaiola metabólica está apresentada na figura 2..

(28) 27. Realizada na semana que antecedeu a indução ao Diabetes Mellitus – Animais com 66±2 dias.. Gaiola Metabólica 1. Realizada na semana que antecedeu o inicio do treinamento físico aeróbico. Animais com 100 ± 2 dias.. Gaiola Metabólica 2. Gaiola Metabólica 3. Realizada após sete dias da indução ao Diabetes Mellitus – Animais com 73±2 dias.. Gaiola Metabólica 4. Realizada após as oito semanas de treinamento físico aeróbico – Animais com 160±2 dias.. Figura 2 – Períodos de utilização da gaiola metabólica durante o experimento considerando as fases do procedimento e a idade dos animais.. 2.5 Treinamento Físico Aeróbico Moderado Após a indução do diabetes experimental, os animais dos grupos treinados (GCT e GDT), escolhidos aleatoriamente, foram submetidos ao treinamento físico moderado contínuo em tapete ergométrico próprio para ratos (Esteira motorizada EP131 Insight), com seis baias (Figura 3). Os animais dos grupos não treinados permaneceram em suas respectivas gaiolas, sujeitos apenas à manipulação. O protocolo de treino consistiu na adaptação do protocolo de Leandro, Levada et al. (2007), treinamento uma vez ao dia (com as sessões de treino iniciadas 2 horas após o começo do ciclo escuro), 5 dias por semana, 8 semanas com uma intensidade aproximada de 70% do VO2max. O protocolo foi aplicado da seguinte forma: Na primeira semana (semana de adaptação) a velocidade era de no máximo 5 m/mim com duração da sessão de exercício de 10 min/dia. Nas sete semanas seguintes foi acrescentado.

(29) 28. tempo e intensidade até atingir a velocidade máxima de 13 m/min e tempo máximo de 60 min. Cada sessão de treinamento, a partir da segunda semana, foi dividida em quatro estágios progressivos: (a) período de aquecimento (3 a 5 minutos); (b) zona intermediária (14 a 20 minutos), (c) zona de treinamento (10 a 30 minutos), e (d) de esfriamento período (3 a 5 minutos) (Tabela 1). Um baixo estimulo elétrico (1.6 mA) emitidos ao toque da pata posterior dos animais em uma grade inoxidável na parede posterior da baia foi utilizado para encorajar a corrida.. Figura 3 - Esteira motorizada EP131 Insight com seis baias individuais com altura de 170 mm, largura interna 97 mm, comprimento de 385 mm onde foi realizado o treinamento dos animais..

(30) 29. Tabela 1 - Descrição do protocolo de treinamento físico demonstrando a velocidade e a duração das sessões com a divisão das fases de treinamento.. Semanas. Inicial (adaptação). Segunda semana. Terceira semana. Quarta semana. Quinta semana. Sexta semana. Sétima semana. Oitava semana. Velocidade km/h. m/min. 0.1 0.2 0.3 0.1 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.4 0.4 0.5 0.6 0.7 0.4 0.4 0.5 0.6 0.7 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.5 0.5 0.6 0.7 0.8 0.5. 2 3 5 2 3 5 7 3 5 7 8 10 5 7 8 10 12 7 7 8 10 12 7 7 8 10 12 7 8 10 12 13 8 8 10 12 13 8. Duração (min) 2 2 4 2 3 4 10 3 3 4 5 15 3 3 4 5 15 3 3 7 7 20 3 5 7 8 25 5 5 7 8 25 5 5 8 12 30 5. 10. 20. 30. 30. 40. 50. 50. 60.

(31) 30. 2.6 Eutanásia e Coleta das amostras do Tendão do Calcâneo No período imediatamente após o término do treinamento, os animais de todos os grupos foram anestesiados com solução de Xilazina (Rompum® - Bayer) (10mg/Kg) e Cloridrato de Ketamina (Ketalar®) (25mg/kg), 0,10 ml para cada 100g de peso. Após a anestesia foi realizada uma incisão na região posterior da pata posterior esquerda (figura 4) para coleta do tendão do calcâneo em suas origens e inserções, sendo nessa extremidade mantido ainda inserido ao osso calcâneo (figura 4B). Após a coleta o tendão foi transportado em recipiente térmico, recoberto com gaze levemente umedecida em solução salina 9% e encaminhado para a realização da análise do ensaio mecânico convencional.. Figura 4 - Coleta do Material biológico. (A) incisão da região posterior da pata posterior esquerda e (B) tendão do calcâneo isolado..

(32) 31. 2.7 Análise Biomecânica – Ensaio Mecânico Convencional. Para a realização do ensaio mecânico o tendão foi alojado a um conector de metal (2,5 x 3,5 cm) para cada extremidade e fixado em uma máquina de ensaio mecânico convencional (EMIC, modelo DL 500, Brasil) através de garras auto travantes por efeito de alavanca (Figura 5) do Laboratório de Materiais Poliméricos e Caracterização do Departamento de Engenharia Química da UFPE. Os tendões foram tracionados até o ponto de fracasso do espécime, em velocidade de 0,1 mm/s, com célula de carga de 500 N. Os parâmetro avaliados foram: o Módulo elástico (MPa), a Tensão força máxima (MPa), a Deformação Específica Força Máxima (mm), a Energia/Área (N.mm/mm2) e a Área de secção transversa (mm2).. Figura 5 – Maquina de Ensaio Mecânico com o tendão do calcâneo fixado nas garras auto-travantes. a – conector de metal que fixa a porção músculo tendinosa da para posterior esquerda. b – conector de metal que fixa o osso do calcâneo. C0 Comprimento inicial (EMIC, modelo DL 500, Brasil)..

(33) 32. A área de secção transversa (AST) para o ensaio mecânico convencional foi estimada de acordo com a fórmula da determinação da área da elipse. , sendo o D = é a largura do terço médio do tendão, T =. a espessura do terço médio do tendão. Sendo essa forma geométrica a mais aproximada da observada nos cortes transversais do tendão.. 2.8 Análise estatística A descrição das características da amostra foi realizada através de medidas descritivas, tais como: medida de tendência central (média) e dispersão (desvio padrão). Foram apresentados a média e o erro padrão da média nos casos que foram mais adequados. Para determinar se a distribuição de probabilidade subjacente difere da normalidade foi aplicado o teste de Kolmolgorov-Smirnov, e o mesmo acusou padrão de distribuição normal. Desta forma foram definidas as inferências para comparação das médias das variáveis numéricas entre os vários tratamentos empregados. Quando houve necessidade de testar hipóteses comparando as médias de dois grupos independentes, ambos com distribuição normal, utilizouse o Teste t Amostras Independentes (Independent-Samples T Test). No entanto, para determinar a comparação das médias das variáveis numéricas dos quatro grupos estudados foi utilizado o teste de inferência de análise de variância (ANOVA On WAY) e complementado pelo exame das diferenças entre as médias (Bonferroni)..

(34) 33. Para analisar as possíveis correlações entre as variáveis numéricas dos efeitos metabólicos do Diabetes Mellitus com as variáveis de propriedade mecânica do tendão do Calcâneo foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Pearson. Os dados foram analisados no software SPSS (Statistical Package for Social Sciences 15.0) e utilizada uma margem de segurança de 99% de confiabilidade de acordo com a amostra e objetivos propostos..

(35) 3 – REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA.

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(40) 4 - RESULTADOS.

(41) 40. 4.1 Artigo Original 1. MECHANICAL PROPERTIES OF ACHILLES TENDON IN RATS INDUCED TO EXPERIMENTAL DIABETES Rodrigo Ribeiro de Oliveira* Master Program in Physical Therapy – Universidade Federal de Pernambuco – Brazil Department of Pathology and Forensic Medicine – Universidade Federal do Ceará – Brazil;. Kamilla Dinah Santos de Lira Department of Physical Therapy - Universidade Federal de Pernambuco-UFPE – Brazil;. Patrícia Verçoza de Castro Silveira Department of Physical Therapy - Universidade Federal de Pernambuco-UFPE – Brazil;. Marcos Paulo Galdino Coutinho Department of Physical Therapy - Universidade Federal de Pernambuco-UFPE - Brazil. Marcela Nicácio Medeiros Master Program in rehabilitation science - Centro Universitário Augusto Motta – Unisuam – Brazil. Magno Felipe Holanda Barboza Inácio Teixeira Department of Chemical Engineering - Universidade Federal de Pernambuco-UFPE - Brazil. Silvia Regina Arruda de Moraes Master Program of Physical Therapy - Universidade Federal de Pernambuco-UFPE - Brazil Department of Anatomy - Universidade Federal de Pernambuco – UFPE- Brazil;. * Corresponding author: Rodrigo Ribeiro de Oliveira Universidade Federal do Ceará – UFC Department of Pathology and Forensic Medicine Rua Alexandre Baraúna 949 60430-160 - Fortaleza CE - BRAZIL Telephone +55 85 3366 8004 Facsimile +55 85 3366 8002 E-mail address: rodrigo@ufc.br (R. R. Oliveira)..

(42) 41. ABSTRACT The aim of this study was to quantify the effect of chemically induced diabetes mellitus on the mechanical properties of the Achilles tendon of rats and correlate it with metabolic and biomechanical findings. Adult rats were selected randomly and assigned to two groups, the diabetic group consisted of animals receiving a dose of streptozotocin to induce type I diabetes and the control group. The animals were placed in metabolic cages for analysis of metabolism. Ten weeks after diabetes induction, the Achilles tendon of both groups were collected and submitted to a traction test in a conventional testing machine. The measurements of mechanical properties indicated that the elastic modulus (MPa) was significantly higher in the control group (p<0.01). In Maximum tension (MPa), the groups did not have differences (p>0.01). Energy/tendon area (N.mm/mm2), specific strain (%) and maximum specific strain (mm) were higher in tendon tests of the diabetic group (p<0.01). We observed that the mechanical properties of tendons have correlations with metabolic properties of the diabetic animals. These results showed that induced diabetes mellitus in rats have an important negative effect on the mechanical properties of the Achilles tendon.. Key words: Diabetes mellitus; Achilles tendon; mechanical properties, animal model _______.

(43) 42. INTRODUCTION In. studying. complications. of. chronic. diabetes,. retinopathy. and. nephropathy have naturally been the focus of much evaluation and publication due to the gravity of these complications. However, little attention has been paid to alterations in the muscular–skeletal system, which can contribute to a decline in the general state of health of diabetic people (AKTURK. et al., 2002;. BOLTON et al., 2005). Details about the relationship between diabetes and tendinopathy still remain unclear (GRANT et al., 1997; AKTURK et al., 2002; AKTURK et al., 2007; AYDENIZ; GURSOY & GUNEY, 2008), nevertheless, case reports and some epidemiological studies frequently emphasize the possible connection between diabetes mellitus (DM) and alterations to tendons in various parts of the body (RAMIREZ &. RASKIN, 1998; DIDOMENICO;. WILLIAMS & PETROLLA, 2008). There is now evidence that diabetes may alter Achilles tendon stiffness and thickening, predisposing the patient to foot ulceration (PAPANAS et al., 2009). Specifically, the effect of Diabetes Mellitus (DM) on collagen structure of tendons is still not well established (GRANT et al., 1997; AKTURK et al., 2002; AKTURK. et al., 2007; AYDENIZ; GURSOY & GUNEY, 2008). Among. preliminary work on this matter, a study realized by Monnier Kohn et al (1984) found collagen alterations in diabetic individuals, speculating that diabetes could promote an effect similar to aging on the musculoskeletal system (MONNIER; KOHN & CERAMI, 1984). To evaluate possible tendon alterations in diabetic patients, some researchers have investigated the increase of thickness, fiber organization and.

(44) 43. presence of calcification in tendons of patients with DM using diagnostic imaging methods, most commonly the musculoskeletal ultrasound (AKTURK et al., 2002; UNLU et al., 2003; GIACOMOZZI et al., 2005; AKTURK et al., 2007; BATISTA et al., 2008), followed by computed tomography (BOLTON et al., 2005) and magnetic resonance imaging (PAPANAS et al., 2009). Only one study (GRANT. et al., 1997) used electron microscopy to. evaluate samples of the Achilles tendon in diabetic patients. Several morphological alterations were observed, such as increased density, irregularity and smaller fibril diameter and collagen disorganization with an abnormal configuration. Besides the occurrence of changes in tendon structure in diabetic individuals, some studies have examined the alterations in the biomechanical operation of the connective tissue. However, these studies do not refer directly to the diabetes state, but to the effect of reducing sugars, glucose and ribose, reacting with collagen to produce non-enzymatic glycation on the tendon, which leads to biochemical and biomechanical impairment (REDDY; STEHNOBITTEL & ENWEMEKA, 2002). The mechanical properties of the Achilles tendon influence the function and performance of the musculoskeletal system during locomotion (BIEWENER &. ROBERTS, 2000; BOBBERT, 2001; ROBERTS &. MARSH, 2003;. BIEWENER et al., 2004). The elasticity of tendons increases the efficiency of muscle during activity cycles such as gait that involves. stretching and. contraction of the muscle-tendon complex. Given this, the mechanical properties of the Achilles tendon reduce the work required of the muscle. This.

(45) 44. makes it possible for the gesture of locomotion, which would be mechanically unfavorable for muscle alone, to be performed using less energy (BIEWENER & ROBERTS, 2000; HOF; VAN ZANDWIJK & BOBBERT, 2002; ROBERTS & MARSH, 2003). Several studies have evaluated the mechanical properties of tendons and documented their plasticity in response to different situations, such as immobilization and / or suspension (ALMEIDA-SILVEIRA et al., 2000; NATALI et al., 2008a), vibration strength training (LEGERLOTZ et al., 2007), tensile strength (VIIDIK, 1967), training strength (SIMONSEN; KLITGAARD & BOJSEN-MOLLER, 1995;. MAGNUSSON;. HANSEN & KJAER, 2003a;. SEYNNES et al., 2009a) and endurance training (VIIDIK, 1967; SIMONSEN; KLITGAARD & BOJSEN-MOLLER, 1995; BUCHANAN & LEGERLOTZ. MARSH, 2001;. et al., 2007). In the specific case of diabetes, there are few. studies on the mechanical properties of tendons. This study is based on the hypothesis that the Achilles tendon of diabetic rats with chronic hyperglycemia and metabolic dysfunction undergoes changes in mechanical properties that can be assessed using a tensile test machine of conventional mechanical design. Despite this, no studies have been found concerning the effect of chemically induced diabetes mellitus on the mechanical properties of the Achilles tendon in animals. Therefore, the aim of this study was to quantify the effect of chemically induced diabetes mellitus on mechanical properties of the Achilles tendon in rats and correlate it to clinical and metabolic findings. MATERIAL AND METHODS.

(46) 45. Animals For this study, we used 22 male albino rats from the Wistar lineage, maintained in the vivarium of the Anatomy Department of the Federal University of Pernambuco. These animals were kept in an environment of 23 ±1°C, in an inverted cycle of light/darkness (12h) and they were offered a maintenance diet (Labina® - Purina) and water ad libitum in the vivarium. When they reached the age of 70 days, these animals were randomly distributed into two groups: Control Group – CG (n=11), consisting of healthy rats (not diabetic) and Diabetic Group – DG (n=11). However, due to complications of diabetes mellitus, four animals were excluded from the study. Type I diabetes was induced when the rats reached an age of 70 days and mass of 323.11±19.38g through a single intraperitoneal injection of a streptozotocin solution (Sigma Chemical Co, USA), after fasting for 12 hours. The streptozotocin (STZ) was diluted in a sodium citrate buffering solution (10mM) at pH 4.5 and administered in a single dose of 60mg/Kg of the animal’s weight, carefully measured in a precision digital balance (Model BS3000A Bioprecisa, BR.).. The non-diabetic animals received the same equivalent. doses of a citrate sodium buffering solution, and 30 minutes after treatment the animals in both groups were fed, according to the protocol to induce diabetes described by Szkudelski, 2001 (SZKUDELSKI, 2001). The protocol was approved by the Ethics Committee of Animal Experimentation of Federal University of Pernambuco – UFPE. Laboratory evaluation.

(47) 46. Five animals were randomly selected from each experimental group, and placed in individual metabolic cages (TECNIPLAST 3701m081) for a 72h period, registering with their weight (g), water intake (ml/24h), food intake (g/24h), diuresis (ml/24h) and collecting blood and urine, for dosages of blood glucose (mg/dl) and urinary volume (ml), respectively, every 24 hours. The methods for collection were similar to the study of Lerco, M. et al. (2003)(LERCO et al., 2003). The metabolic analyses were performed on three occasions: 1- when the animals were 63 days old (one week before the induction of DM); 2- seven days after the induction of DM; 3- ten weeks after DM induction. The analyses were applied at the same times to the control group. Tissue preparation In the tenth week, after the final analysis in the metabolic cage, the rats of both groups were anesthetized with a solution of Xylazine (Rompum® - Bayer) (10mg/Kg) and Ketamine Chloridrate (Ketalar®) (25mg/Kg), 0.10ml per 100g weight. An incision was made along the posterior surface of the right leg, followed by the detachment of the Achilles tendon. This complex was dissected from the soft tissue proximally above the muscle-tendon junction, and distally, the tendon attachment to the calcaneus bone was preserved. After the removal of the samples, the animals were sacrificed. The Achilles tendons were transported in a thermal container, covered with gauze slightly moistened with a saline solution 9% and sent for analysis of conventional mechanical testing immediately after its removal..

(48) 47. Mechanical Testing The tendon-bone complex was attached to metal connectors (2.5 X 3.5 cm) with the serrated surface to the outside. This was secured to a conventional mechanical testing machine (EMIC, DL 500 model, Brazil) through a self-locking system by leverage, Figure 1. To reinforce the interface between the metal connectors and the muscle-tendon junction (proximally) and the tendon-bone complex (distally) we used cyanoacrylate. During this procedure, we were very careful to not let the gel spread over the tendon. (FIGURE 1) The tendons were tensioned to the point of failure of the specimen, at a speed of 0.1 mm/s, and the strength was constantly measured by a load cell of 500N; the dislocation of the specimen was registered automatically by the software TESC (Test Script) for automatic testing, compatible to the microprocessor testing machines, an EMIC product. The parameters studied were the elastic modulus (MPa), maximum tension (MPa), maximum specific strain (mm), energy/tendon area - That corresponds to the area below the stress-strain curve (N.mm/mm2) and cross-sectional area (mm2). Data were recorded automatically by the software TESC - Test Script Automation testing, consistent with the testing machine microprocessor EMIC. The cross-sectional area (CSA) of the unloaded tendon for the conventional mechanical testing was estimated according to the formula for determining the area of an ellipse:. , where D = width of the middle. third of the tendon, T = thickness of the middle third of the tendon. This.

(49) 48. geometric shape is the closest to the observed transversal sections of the tendon. The measurements of thickness and width of the tendon were obtained using a caliper.. Statistical analysis To. describe. the. sample. characteristics. we. used. descriptive. measurements, such as measure of central tendency (mean) and dispersion (standard deviation). To compare the mean variables between the various treatments we used the Student T test for the independent sample analysis to compare the control group and the diabetic group and the Pearson Correlation Coefficient for the analysis between the metabolic variables and the mechanical property variables. Data were analyzed with the SPSS software (Statistical Package for Social Sciences). We accepted 1% as the significance level.. RESULTS On the day of biomechanical testing, the animal’s body weight was 416 ± 38.73 g in the control group and 272 ± 48.73 g in the diabetes group, the latter showing a reduction of 34% of the body weight (p< 0.01). To minimize the influence of body weight in each group on the results of water intake (ml/24h), food intake (g/24h) and diuresis (ml/24h), we present and discuss these results normalized to 100g of the animal’s weight. In the first metabolic evaluation, water intake (ml/100g), food intake (g/100g), diuresis (ml/100g), as well as blood glucose and body weight, did not.

(50) 49. show statistical differences between the study groups. However, in the second and third analyses these parameters were significantly increased (p<0.01) in diabetic group. (TABLE 1) Biomechanical tests showed statistical differences in biomechanical properties of the Achilles tendon between control and diabetic groups. The typical stress-strain curve of the rat Achilles tendon is represented in Figure 2, where it is shown as a classic non-linear shape and it is divided into two regions. The initial region is characterized by low stiffness of the tendon and with the collagen fibers stretching to approximately 4% to 15%. Then the second region starts. This is considered linear, because with the increment in traction, the tendon offers resistance and the slope stress-strain curve becomes almost constant. An additional increment in maximum strain results in tissue failure which is associated with a drastic tension decrease (ALMEIDASILVEIRA et al., 2000). (FIGURE 2) The measurements of mechanical properties showed that the elastic modulus (MPa) was significantly higher in the control group (p<0.01). However, when we analyzed maximum tension (MPa) the groups did not show statistical significance (p>0.01). Specific strain (%), maximum tension strain (mm) and energy/tendon area (N.mm/mm2) were higher in the tendon tests of diabetic group (p<0.01). The cross-sectional area (mm2) of the tendon was greater in the control group when compared to the diabetic group (p<0.01)..

(51) 50. (TABLE 2) Achilles tendon mechanical properties were correlated with the results of the metabolic and clinical results, before the euthanasia of the animals. We observed that maximum tension strain has a strong correlation with the water intake of the CG (r = 0.975; p = 0.005) and shows, as well, a substantial correlation with the diuresis of the diabetic group (r = 0.975; p = 0.037). The cross-sectional area showed a strong correlation with the diabetic animals’ weight (r = 0.90; p = 0.037) and with diuresis (r = 0.99; p = 0.001). Other mechanical properties did not show correlations with the metabolic and clinical variables.. DISCUSSION We chose the Achilles tendon due to its function and superficial location. Furthermore, some research with humans showed that DM can change the thickness and integrity of this tendon (GRANT et al., 1997; UNLU et al., 2003; AKTURK et al., 2007; BATISTA et al., 2008) and another study describes that morphological alterations in the structure of the Achilles tendon can predispose patients to develop ―diabetic foot‖ (GIACOMOZZI et al., 2005). The method of analysis of mechanical properties in Achilles tendon is similar to the studies of Almeida-Silveira, Lambertz et al (2000) and Reddy, Stehno-Bittel et al (2002) (ALMEIDA-SILVEIRA. et al., 2000; REDDY;. STEHNO-BITTEL & ENWEMEKA, 2002). Moreover, it is known that mechanical properties of biological tissues can change according to age and the mammalian species evaluated, and therefore this study aims to compare the.

(52) 51. results of mechanical tests between the groups we studied rather than the values published in the literature. Our study produced distinct results in the mechanical properties of the Achilles tendon in the groups we examined. When compared to the control group, DM was found to result in significant decreases of 63.3% in elastic modulus and of 45.8% in the cross-sectional area and increases of 75.1% in specific strain properties, of 74.8% in the maximum tension strain and of 180% in energy/area. The elastic modulus is taken to be the slope of the best-fit straight line through the approximately linear region of the stress-strain curve (REDDY; STEHNO-BITTEL & ENWEMEKA, 2002), however, in biological materials it refers not only to elasticity, but also to visco-elasticity and failure (rupture) results (OXLUND; MANTHORPE & VIIDIK, 1981; VIIDIK; DANIELSON & OXLUND, 1982; ALMEIDA-SILVEIRA et al., 2000). Nevertheless, the reduction of elastic modulus in DM Achilles tendon was observed, and this corroborates with the results of Reddy, G.K, et al (2002), who described, when they studied the mechanical properties of the Achilles tendon with non-enzymatic glycation – a process that happens in DM – that tendons are stiffer and the elastic and visco-elastic. properties. have. alterations. (REDDY;. STEHNO-BITTEL. &. ENWEMEKA, 2002). We showed that the differences in cross-sectional area cannot be attributed only to the alterations in collagen components (LOREN & LIEBER, 1995). The results of this study corroborate with these findings, since the cross-.

(53) 52. sectional area of tendons has a strong correlation with the weight and diuresis of diabetic animals. According to Muller, S.S; et al (2004) (MÜLLER et al., 2004), with the reduction of elastic and visco-elastic properties, the capacity of the tendon to resist strain when stressed will be diminished, which agrees with the results of specific strain and maximum tension strain of this study. This research showed that on diabetic group, the stress-strain curve has a lower slope (elastic modulus) when compared to the control group. This indicates more rigidity on the early traction and therefore less mechanical efficiency of the Achilles tendon to resist the stress. FIGURE 3 The energy/area tendon is the resource that the tissue has to absorb the energy in the cross-sectional area of the tendon, indicating that if the energy absorption is higher this could lead to a lower efficiency of the structure. The collagen in connective tissue has organized fibers in parallel matrices to facilitate transmission of the energy (forces) of the muscle to the bone. In the presence of DM and non-enzymatic glycolization, manifestations could occur in physical properties of the tendon leading to a disorganization of fibers and consequently greater energy absorption and lower resistance of the tissue; this abnormality has been observed in other experimental studies of animal skin and tendon (ANDREASSEN; OXLUND & DANIELSEN, 1988; REDDY; STEHNOBITTEL & ENWEMEKA, 2002; MÜLLER et al., 2004)..

(54) 53. Grant, W.P et al (1997) (GRANT et al., 1997) demonstrated that the collagen fibers of the Achilles tendon in DM patients have a smaller diameter, are denser, stiffer and have morphological changes when compared to the collagen fibers in tendons of non-diabetic patients. Other authors correlate the alterations in visco-elastic capacity and, consequently, a lower capacity to dissipate energy, of the tendon with stress fractures and with skin injuries and feet collapse (VLASSARA; BUCALA & STRIKER, 1994; GRANT et al., 1997; REDDY; STEHNO-BITTEL & ENWEMEKA, 2002). Although we cannot explain the causal relationship between metabolic aspects with mechanical properties, this study shows important correlations between normal hydration of the animal with strain characteristics, also normalized. Furthermore, metabolic alterations due to DM, such as the great volume of diuresis, have strong correlations to the detectable increase in strain (r = 0.975; p = 0.037). Possibly, the hyperglycemic state can be a confounding variable. In the diabetic patient, dysfunctional, mechanical alterations or a ruptured Achilles tendon will predictably lead to further morbidity. The inability of the foot to clear the ground during the stance phase of gait, increased plantar pressures and eventual attenuation of the tibialis anterior tendon, are all likely consequences of an absent, ruptured, or dysfunctional Achilles tendon. Restoration of the function of Achilles tendon may resolve these pathologies and. restore. normal. function. to. the. foot. and. reduce. biomechanical. complications, and this may be particularly important in diabetic patients..

(55) 54. To analyze the mechanical properties on Achilles tendons we used a conventional mechanical traction performed in a single strain, therefore, the visco-elastic components of the tendons could not be separately quantified. The vitro analysis does not reflect important aspects such as the tipping point of the tendon insertion into calcaneus bone and the lack of activity of the triceps surae muscle. Other researches should be realized, describing the causality of these mechanical alterations on Achilles tendons. CONCLUSIONS The mechanical properties in tendons of animals chemically induced to diabetes mellitus have significant alterations when compared to a control group. The mechanical properties alterations of tendons can reduce the threshold of energy transmission to the periphery and predispose the tendon to premature rupture due to stress. This study may be useful to better understand the complications of musculoskeletal system caused by diabetes mellitus. FINANCING All authors provided concept, idea, research design, writing, and data analysis. We acknowledge the financial support provided by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq 477096/2008-5) and fellowship from the CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) to Mr. Oliveira.. REFERENCES.

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(61) 60. Figure 1 – Mechanical testing of the Achilles tendon. a: Tendon-Muscle complex was attached to metal connectors (2.5 X 3.5 cm). b: Calcaneus was fixed by to metal connectors (2.5 X 3.5 cm). L0, original length of the tendon..

(62) 61. Table 1 – Weight and metabolic assessment of the animals from diabetic and control groups in the periods before and after induction and pre-collection.. Pre-Induction Variable. CG. DG. After Induction CG. DG. Pre-collection CG. DG. Weight (g). 305.1 ± 30.80. 331.8 ± 22.70. 377.6 ± 35.25. 280.1 ± 23.71*. 437.4 ± 36.55. 236.0 ± 29.31*. Ingested Solids (g/100g). 14.84 ± 0.96. 13.56 ± 2.82. 8.00 ± 0.62. 18.24 ± 0.60*. 6.24 ± 0.36. 20.83 ± 3.3*. Ingested Liquids (ml/100g). 19.21 ± 1.21. 16.41 ± 1.83. 13.25 ± 1.90. 95.92 ± 13.32*. 11.01 ± 1.20. 111.15 ± 24.85*. Diuresis (ml/100g). 4.79 ± 0.61. 4.57 ± 0.36. 2.99 ± 0.19. 72.97 ± 13.74*. 2.95 ± 0.43. 95.36 ± 21.34*. Glucose (mg/dL). 110.2 ± 6.90. 112.40 ± 13.33. 109.60 ± 5.50. 362.4 ± 64.31*. 94.40 ± 7.50. 564.2 ± 35.84*. Creatinine (mg/dL). 2.78 ± 0.09. 2.52 ± 0.19. 2.18 ± 0.26. 0.27 ± 0.04*. 2.53 ± 0.17. 0.12 ± 0.5*. Statistical analysis and comparison of means for independent samples. – Student T Test Values expressed as Mean (X), Standard Deviation (SD). * p < 0.01..

(63) 62. Figure 2 – Classic stress-strain curve of the rat Achilles tendon. It shows the initial region characterized by low stiffness of the tendon and the second region, represented by the elastic modulus..

(64) 63. Figure 3 – Comparison of the mean stress-strain curve of the Achilles tendon in two groups of rats: Diabetic Group (DG) and Control Group (CG)..

(65) 64. Table 2 - Evaluation of mechanical properties of the Achilles tendon in diabetic and control groups. animals. Parameters. Control Group (n=11). Diabetic Group (n=7). Elastic Modulus (MPa). 10.17 ± 4.90. 3.73 ± 1.79*. Maximum tension (MPa). 5.48 ± 2.24. 7.58 ± 2.26. 113.62 ± 34.40. 198.99 ± 57.94*. 5.44 ± 1.86. 9.51 ± 3.66*. 16.87 ± 8.20. 47.29 ± 16.14*. Cross-sectional area (mm ). 6.76 ± 2.76. 3.68 ± 0.56*. Initial length (mm). 4.85 ± 0.94. 4.77 ± 0.78. Specific strain (%). Maximum Tension Strain (mm) 2. Energy/Tendon Area (N.mm/mm ) 2. n= number of animals / group; Student T Test Values expressed as Mean (X), Standard Deviation (SD). * p < 0.01..