Influência do cólon na regeneração hepática de ratos submetidos a hepatectomia e colectomia

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. INFLUÊNCIA DO CÓLON NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA DE RATOS SUBMETIDOS A HEPATECTOMIA E COLECTOMIA. MARÍLIA DANIELA FERREIRA DE CARVALHO MOREIRA. NATAL/RN 2017.

(2) MARÍLIA DANIELA FERREIRA DE CARVALHO MOREIRA. INFLUÊNCIA DO CÓLON NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA DE RATOS SUBMETIDOS A HEPATECTOMIA E COLECTOMIA. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde.. ORIENTADOR: Prof. Dr. ALDO DA CUNHA MEDEIROS. NATAL/RN 2017. ii.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS. Moreira, Marilia Daniela Ferreira de Carvalho. Influência do cólon na regeneração hepática de ratos submetidos a hepatectomia e colectomia / Marilia Daniela Ferreira de Carvalho Moreira. - 217. 74f.: il. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Natal, 2017. Orientador: Aldo da Cunha Medeiros. 1. Regeneração hepática - Tese. 2. Colectomia - Tese. 3. Hepatectomia - Tese. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II. Título. RN/UF/BS-CCS. CDU 616.36.

(4) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenador do Programa de pós-Graduação em Ciências da Saúde: Prof.a Dr.: Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito. iii.

(5) MARÍLIA'DANIELA'FERREIRA'DE'CARVALHO'MOREIRA' ' ' INFLUÊNCIA'DO'CÓLON'NA'REGENERAÇÃO'HEPÁTICA'DE'RATOS' SUBMETIDOS'A'HEPATECTOMIA'E'COLECTOMIA' ' ' Aprovada'em:'____/____/______' ' Presidente'da'Banca:' '' Prof.'Dr.'ALDO'DA'CUNHA'MEDEIROS'–'UFRN' ' ________________________________________' ' Mebros'da'Banca:' ' Dr.'CIPRIANO'DA'CRUZ'FORMIGA'–'EBSERH' ' ________________________________________' 'Examinador'Externo'à'Instituição' ' Dr.'DEBORAH'DE'MELO'MAGALHÃES'PADILHA'–'UnP' ' ________________________________________' Examinador'Externo'à'Instituição' '. Dr.'GERALDO'BARROSO'CAVALCANTI'JUNIOR'–'UFRN' ' ________________________________________' Examinador'Interno' ''. Dr.'VALERIA'SORAYA'DE'FARIAS'SALES'–'UFRN' ' ________________________________________' Examinador'Interno '. !. iv!.

(6) . A Riquinho, meu amor incondicional, com seu sorriso paz, és a razão de tudo, és a certeza nos momentos de incerteza, és luz quando paira a penumbra. Se não fosse você, meu pequeno, nada disso faria sentido.. v.

(7) AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida e pela graça da minha saúde e da minha família. Ao meu orientador, Prof. Aldo da Cunha Medeiros, por ter sido um exemplo e ter me estimulado desde a graduação, residência, mestrado e finalmente agora no doutorado, por ter me acolhido sempre com muito carinho e paciência. Esteja certo professor que: ”Um educador se eterniza em cada ser que ele educa” (Paulo Freire). Ao estatístico Ítalo Medeiros Azevedo, pela dedicação e presteza com que sempre trabalha nossos dados, pela grande competência na área, meu muito obrigada. Aos meus pais, Antônio Martins e Fátima, por terem se doado completamente a nossa família, estimulando nossas atividades intelectuais, passando-nos valores sólidos, muitas vezes deixaram de viver seus sonhos para realizar os nossos, minha gratidão e amor eternos. Ao meu marido, Ricardo Moreira, por toda essa jornada que escolheu dividir ao meu lado, pelo apoio incondicional apesar da minha ausência, meu reconhecimento por ser um pai tão presente, permitindo que eu pudesse concretizar mais essa etapa da minha vida profissional Aos meus irmãos Diva, Daniel e Michele, por toda trajetória que dividimos desde nossa infância, hoje não mais juntos fisicamente, mas com a certeza de que sempre teremos uns aos outros para nos apoiar. As minhas sobrinhas Júlia, Alice e Marina por preencher nossa família com tanta alegria e amor.. vi.

(8) “Enquanto ensino continuo buscando, reprocurando. Ensino porque busco, porque indaguei, porque indago e me indago. Pesquiso para constatar, constatando intervenho, intervindo educo e me educo. Pesquiso para conhecer o que ainda não conheço e comunicar ou anunciar a novidade”. Paulo Freire. vii.

(9) RESUMO Estudos sobre a influência do cólon na regeneração hepática são escassos. Alguns têm demonstrado que após a colectomia ocorre aumento da regeneração e sua redução em outros. Diante da controvérsia, este trabalho visou examinar se a colectomia associada à hepatectomia 70% influencia parâmetros de regeneração do fígado em ratos. Foram utilizados 18 ratos Wistar distribuídos em 3 grupos (6 animais cada). No grupo I (sham) foi realizada uma laparotomia com leve manipulação de alças; no grupo II uma colectomia + hepatectomia 70%; e no grupo III apenas hepatectomia 70%. No 6° dia pós-operatório foi colhido sangue por punção cardíaca sob anestesia, seguido de eutanásia. Realizadas dosagens séricas de alanina aminotransferase (ALT), aspartato amino transferase (AST), fosfatase alcalina (FA), albumina, fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e fator de crescimento transformador-α (TGF-α). A regeneração do fígado foi calculada pela fórmula: (razão do peso do fígado por 100g do peso corporal no momento da eutanásia/peso do fígado no pré-operatório projetado por 100g de peso corporal) × 100.. Os testes de análise de variância (ANOVA) e Tukey foram usados, com. significância p<0,05. Resultados: Houve uma menor e significante magnitude dos níveis de ALT e AST no grupo II comparados com o grupo III (p<0,001). A albuminemia mostrou níveis significativamente mais elevados no grupo II que no III. Os níveis de HGF (408±18,2 pg/mL) e TGF-α (3,8±0,3 ng/mL) no grupo II foram significativamente mais elevados que o HGF (360±58,6 pg/mL) e TGF-α (2,3±0,4 ng/mL) no grupo III, respectivamente (p<0,001). O percentual de regeneração hepática foi significativamente mais elevado no grupo II, do que no grupo III (p=0,003). Em conclusão, este estudo concluiu que a colectomia realizada simultaneamente à hepatectomia 70% influenciou positivamente na regeneração do fígado em ratos. Pesquisas adicionais são necessárias para revelar os mecanismos moleculares deste efeito e para caracterizar a influência do cólon na fisiologia do fígado. Descritores: Regeneração hepática. Colectomia. Hepatectomia. Cólon.. viii.

(10) ABSTRACT Studies on the influence of the colon on liver regeneration are scarce. Some have shown that after colectomy there is an increase in regeneration and its reduction in others. Faced with the controversy, this work aimed to investigate whether colectomy simultaneously performed with 70% hepatectomy influences liver regeneration in rats. Eighteen Wistar rats were distributed in 3 groups, 6 animals each. In group I (sham) only laparotomy was performed with mild manipulation of boweld loops; in group II 70% hepatectomy and simultaneous colectomy; in group III only 70% hepatectomy. On the 6th postoperative day, blood was collected by cardiac puncture under anesthesia, and remaining liver was removed. Serum measures of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (FA), albumin, hepatocyte growth factor (HGF) and transforming growth factor-α (TGF-α) were performed. Liver regeneration was calculated by (liver weight per 100g of the body weight at sacrifice/preoperative projected liver weight per 100g of the body weight) × 100. The Analyses of variance (ANOVA) and Tukey tests were used, with significance p<0.05. There was significant lower levels of ALT and AST in group II rats when compared to group III (p<0.001). Albuminemia showed significantly higher levels in group II rats than in III (p<0.01). Serum levels of HGF (408±18.2pg/mL) and TGF-α (3.8±0.3ng/mL) were significantly higher in group II rats than HGF (360±58.6pg/mL), TGF-α (2.3±0.4ng/mL) in group III, respectively. The percentage of liver regeneration was significantly higher in group II than in group III (p = 0.003). In conclusion, this study demonstrated that colectomy, performed simultaneously with 70% hepatectomy, positively influenced liver regeneration in rats. Further research is needed to reveal the molecular mechanisms of this effect and to characterize the effects of the colon on liver physiology. Keywords: Liver regeneration. Colectomy. Hepatectomy. Colon.. ix.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS DPO- Dia pós-operatório ALT- Alanina aminotransferase AST- Aspartato aminotransferase FA- Fosfatase Alcalina HGF- Fator de Crescimento de Hepatócitos TGF-α- Fator de Crescimento Transformador-α ANOVA- Análise de Variância a.C.- antes de Cristo HP- Hepatectomia Parcial DNA- Ácido Desoxirribonucléico TNF-α- Fator de Necrose Tumoral- α IL-1- Interleucina-1 IL-6- Interleucina 6 PI3K - Fosfoinositil(PI)-3-quinase CCR- Câncer colorretal HUOL- Hospital Universitário Onofre Lopes UFRN- Universidade Federal do Rio Grande do Norte CONCEA- Conselho Nacional de Experimentação Animal CCS- Centro de Ciências da Saúde IP- Intraperitoneal IM- Intramuscular ELISA- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay RMHMC- Razão Massa Hepática/Massa Corporal RH-Regeneração Hepática. x.

(12) LISTA DE FIGURAS FIGURA 1- Laparotomia mediana ------------------------------------------------------------ 24 FIGURA 2- Peça cirúrgica (lobos hepáticos mediano e esquerdo) ------------------ 24 FIGURA 3- Retirada das amostras após eutanásia -------------------------------------- 25 FIGURA 4- Lavagem das amostras e pesagem dos fragmentos hepáticos em balança de precisão ---------------------------------------------------------------------------25. xi.

(13) LISTA DE TABELAS TABELA 1- Valores bioquímicos da função hepática ----------------------------------- 31 TABELA 2- Valores dos fatores de crescimento ----------------------------------------- 31 TABELA 3- Valores descritivos e teste inferencial da regeneração hepática ----- 31. xii.

(14) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------------- 14 2. JUSTIFICATIVA ------------------------------------------------------------------------------ 19 3. OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------- 20 4. MÉTODO --------------------------------------------------------------------------------------- 21 5. ARTIGO PUBLICADO – OBJETO DA TESE 5.1. Influência do cólon na regeneração do fígado de ratos submetidos à hepatectomia e colectomia ----------------------------------------------------------- 26 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES ---------------------------------------- 37 7. REFERÊNCIAS ------------------------------------------------------------------------------- 41 8. APÊNDICES .................................................................................................... 50 8.1. Effect of pre-treatment with simvastatin in aged rats with abdominal sepsis50 8.2.. The renoprotective effect of oral Tadalafil pretreatment on ischemia/ reperfusion injury in rats ------------------------------------------------------------ 52. 8.3.. Anatomo-radiological correlation using 18-FDG-PET in abdominal sepsis model in rats. A preliminary study ------------------------------------------------ 52. 8.4.. Effects of cococonut water and simvastatin in the treatment of sepsis and hemorrhagic shock in rats ---------------------------------------------------------- 56. 8.5.. Heart and systemic effects of statin pretreatment in a rat model of 99m. abdominal sepsis. Assessment by Tc. -sestamibi biodistribition. ------ 58. 8.6.. The ileum positively regulates hepatic regeneration in rats --------------- 60. 8.7.. Attenuation of lung injury using simvastatin in a rat sepsis model- ------ 62. 8.8.. Effect of simvastatin in hepatic ischemia and reperfusion in rats ---------64. 10.9. Telesurgery in medical school and teaching hospital------------------------- 66 10.10. Laparoscopic versus open cholecystectomy: complications and cost..-.68 10.11. Volume replacement with coconut water in rats with hemorrhagic shock 70 10.12. Infection in surgery -------------------------------------------------------------------- 72 10.13. Surgical sutures ------------------------------------------------------------------------74 10.14. Ileal interposition and viability of pancreatic islets transplanted into intramuscular site of diabetic rats ------------------------------------------------ 76. xiii.

(15) . 14. 1. INTRODUÇÃO O fígado é o maior órgão sólido do corpo humano, sendo sua peculiar anatomia, suprimento sanguíneo (20% proveniente da artéria hepática e 80% da veia porta) e fisiologia importantes para a imunidade1,2. Ele é consagrado por sua complexidade e condição de exercer múltiplas funções, porém uma característica específica é a capacidade de regeneracão, que gera fascínio na humanidade3-6 desde a antiguidade como se pode atestar no mito do Prometheus acorrentado, que é uma das peças clássicas da tragédia grega escrita por Ésquilo em 470 a.C: ‘’Tendo descoberto o segredo do fogo dos Deuses do Olimpo, Prometheus foi condenado a alimentar diariamente uma águia com uma porção do seu fígado. No entanto, durante a noite, seu fígado regenerava provendo a águia com eterno alimento, submetendo Prometheus a uma eterna tortura7-10. A regeneração do fígado é um mecanismo de proteção deste contra as agressões que levam à perda de tecido funcionante independentemente da causa que a gerou (agressão química, viral, trauma ou intervenção cirúrgica)1,7,8,11. Higgins e Anderson, em 1931, desenvolveram o primeiro modelo experimental12 bem sucedido para o estudo da regeneração hepática que contemplava a remoção cirúrgica dos lóbulos lateral esquerdo e mediano do fígado de ratos4, constituindo aproximadamente 67 a 70% da massa hepática total desses animais5,8-11. Esta técnica é descrita como hepatectomia parcial a 70%, HP, hepatectomia parcial a Higgins-Anderson ou hepatectomia parcial a 2/3. Após a ressecção os lobos residuais, lateral direito e caudato, deflagram resposta essencialmente hiperplásica com regeneração de células e tecidos que culminam na restauração do volume original da glândula1,14-16. Esse processo dura em média de 5-14 dias, razão pela qual foi escolhido o sexto dia pós-hepatectomia, no presente trabalho de tese, para analizar o processo de regeneração1,3-5,14,17. A hepatectomia parcial tem a vantagem de induzir uma resposta regenerativa, sem a ocorrência de danos no tecido remanescente, que difere de outros modelos utilizados que são nocivos, pois baseiam-se em uso agentes tóxicos ou virais, cancerosos ou cirrose, em que a capacidade regenerativa do hepatócito é prejudicada. Inicialmente, acreditava-se que o fator desencadeador desse processo fosse o aumento do fluxo sanguíneo hepático. Porém, os trabalhos de Glinos e Grey em 1952 demonstraram que culturas de fibroblastos e hepátocitos proliferaram. 14.

(16) . 15. quando foi administrado soro de animais submetidos à hepatectomia parcial, levando à proposição de que há fatores tróficos que são importantes na regeneração hepática18. O sangue proveniente do sistema porta tem-se mostrado ainda mais hepatotrófico do que o sangue venoso19. Apesar de o termo "regeneração" ser largamente utilizado, este é biologicamente controverso, uma vez que a resposta induzida pelo dano tecidual hepático promove hiperplasia e hipertrofia compensatória do tecido remanescente1 até o restabelecimento da massa hepática primitiva (variação de 5 a 10%)14, porém os lobos ressecados não são integralmente recuperados1,4,7,15. A regeneração do fígado tem sido objeto de estudos ao longo dos anos, todavia os mecanismos pelos quais o órgão é estimulado à replicação e a relação entre as células e citocinas ainda não foram totalmente elucidados. Fatores nutricionais e outros têm sido avaliados,. todos 10,19,20. regeneração. demonstrando. alguma. influência. no. processo. de. . Novos conhecimentos têm surgido sobre a regeneração. hepática, dando ênfase à atuação de fatores de crescimento e citocinas7,21-23. O início, a proliferação e o final da resposta regenerativa são eventos que requerem a ativação de múltiplos fatores e estes não atuam independentemente, mormente a angiogênese11. A forma como esses fatores interagem é extremamente complexa, podendo ser simultâneos, sequenciais, em diferentes etapas do processo e em diferentes células 13,15,22. Do ponto de vista celular, a regeneração após lesão hepática é caracterizada pela proliferação de todas as linhagens celulares do órgão, sendo o hepatócito a célula central neste processo, pois compreende 60-90% da massa hepática. Outras células como as estreladas, epiteliais, e de Kupffer. 4-8,13,15. também participam ativamente deste processo. Após aproximadamente de 12 a 16 horas da hepatectomia parcial se inicia a síntese de DNA que atinge um pico por volta das 24-26 horas, sendo seguida por inicialização das mitoses entre 22-24 horas, atingindo seu ápice próximo das 32-34 horas após o procedimento cirúrgico14. As citocinas têm papel fundamental na regeneração hepática13,24,25. Os hepatócitos expressam precocemente o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1(IL-1) e a interleucina-6 (IL-6) produzidos principalmente pelas células de Kupffer, de modo que já se elevam nas primeiras horas após a hepatectomia a 70%25. No entanto, a sua produção excessiva após hepatectomia a 90% tem sido associada a efeitos adversos na microcirculação hepática e na regeneração do. 15.

(17) . 16. fígado26,27. Acredita-se que o aumento dos níveis de IL-6 gera ativação dos fatores de transcrição levando à ativação dos genes alvo e então a proliferação e o crescimento de hepatócitos28,29. Além deste, sabe-se também que tanto o TNF-α como o óxido nítrico sensibilizam os hepatócitos a produzirem os fatores de crescimento25. O fator de crescimento de hepatócitos (HGF), potente agente mitogênico, é um peptídeo secretado pelas células não parenquimatosas após um dano hepático que atua precocemente no processo regenerativo22,30-32 restaurando a massa, com capacidade de induzir diferenciação de células-tronco25. Após se ligar ao seu receptor Met, o HGF ativa as vias de sinalização do fosfoinositil (PI)-3-quinase (PI3K) e os caminhos de sinalização da proteína quinase (MAPK)31. Além da sua ação no processo regenerativo do fígado, acredita-se que esse fator também pode ser utilizado em crianças com síndrome do intestino curto. O HGF pode melhorar a regeneração do intestino, provavelmente aumentando a proliferação de células intestinais ou diminuindo a apoptose celular32. Além do HGF há outro fator de crescimento que induz a proliferação e o crescimento dos hepatócitos que é o fator de crescimento transformador-α (TGF-α). Ambos os fatores foram dosados no nosso estudo como uma forma de mensurar o processo regenerativo. Os testes de função hepática podem avaliar o grau de injúria do fígado através da quantificação dos seus valores, entre eles a aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA) e albumina que funcionam como marcadores da agressão ao hepatócito33. Atualmente são realizadas ressecções hepáticas extensas e transplantes de fígado com excelentes resultados, com mortalidade aproximada de 5%34. Isso se deve a três principais fatores: aos avanços na técnica cirúrgica, na anestesia e no tratamento intensivo pós-operatório, além do melhor conhecimento da anatomia segmentar hepática e do reconhecimento de como ocorre o processo de regeneração do fígado 18,35. O câncer colorretal corresponde à segunda causa de morte por câncer no Estados Unidos e Reino Unido35-38, além de ser o terceiro mais prevalente no mundo38 depois do câncer de pulmão e estômago39. Aproximadamente 150.000 casos de câncer colorectal (CCR) ocorrem todos os anos nos Estados Unidos40 com 63.000 mortes anualmente35. No Brasil o câncer colorretal também é o terceiro mais. 16.

(18) . 17. comum. No ano de 2012, ocorreram 14.180 casos novos de câncer do cólon e reto em homens e 15.960 em mulheres41. O fígado é o sítio mais frequente de metástases do câncer de cólon e reto e estas podem ocorrer em até 60% dos pacientes37,40,42-47 porque a drenagem venosa do cólon e reto superior ocorre através da veia porta que drena diretamente para o fígado. Sabe-se que 60-70% do câncer colorretal recorrente envolve o fígado e que este é o órgão unicamente envolvido em 20-35% dos casos. 39,40,48. . No momento do diagnóstico, entre 15-25% dos pacientes. têm metástases hepáticas clinicamente detectáveis16,34-38,44,49-51 e em torno de 20%45% dos pacientes vão desenvolver metástase hepática metacrônica16,35-39,52 após a cirurgia16,35 com sobrevida de 5 anos entre 22 e 65%16,34,35. Porém apenas entre 1030% dos pacientes possuem doença ressecável38,39. As recidivas após ressecção primária das lesões estão confinadas ao fígado, em aproximadamente, 50% dos casos39. Durante as duas últimas décadas, ocorreram melhorias substanciais na sobrevida de pacientes com esta neoplasia que foi resultante de um diagnóstico mais precoce, maior eficiência da quimioterapia e radioterapia, avanços nas técnicas cirúrgicas, melhorias na área da anestesia e cuidados pós-operatórios. No entanto, a melhor promessa de cura continua sendo a excisão cirúrgica adequada do tumor e das metástases hepáticas16,34,35,37,38,41-43. Porém a literatura ainda apresenta controvérsia sobre o melhor momento de abordar as lesões16. Com base nesses dados compreende-se que esses pacientes poderão ter indicação de realizar colectomia associada a hepatectomia, e é nessa situação clínica que enquadramos o nosso estudo. Procuramos estudar se a colectomia associada à hepatectomia traz alguma implicação, no processo de regeneração hepática, pois sabe-se que os fatores envolvidos na regeneração do fígado são provenientes da circulação sanguínea e que o fígado, como mencionado no início, é perfundido pela circulação porta19,53. Para estudar a regeneração hepática adequadamente é necessário um método objetivo e confiável para quantificá-la. Vários são os métodos descritos para avaliação da regeneração hepática: determinação da massa hepática (peso do fígado),. contagem. de. mitoses,. estudo. da. síntese. de. DNA. e. métodos. 4,8. imunohistoquímicos para detecção de moléculas endógenas . A massa hepática é regulada em uma proporção precisa com a massa corporal nos mamíferos3, e esta razão (fígado/peso corporal) é especificamente restaurada pela regeneração após lesão hepática ou ressecção3,5,6. Algumas análises têm sido conduzidas para. 17.

(19) . 18. investigar os mecanismos que regulam a massa hepática e regeneração, mas a natureza precisa dos sinais envolvidos ainda não foram completamente elucidados3. Há indícios de que alguns mecanismos derivados do intestino54 e derivados da circulação porta contribuem para a regulação da relação fígado/massa corpórea55. Foi demonstrado que a ressecção de 50% do intestino proximal está associada com uma significante redução da massa hepática total 56. Além disso, o papel do intestino delgado na regulação da recuperação da massa hepática após lesão, isto é, regeneração, tem sido investigado, com alguns estudos sugerindo que o intestino é fonte de algum fator humoral essencial para a regeneração hepática após hepatectomia parcial20,54,57-59. Outros estudos indicam que o intestino delgado pode não ser necessário para essa resposta regenerativa60,61. Tentaremos avaliar através deste estudo se o intestino grosso também teria influência na regeneração hepática. Um dos primeiros estudos a investigar a participação do cólon na regeneração hepática analisou o efeito da ileocolectomia + hepatectomia a 50% na resposta regenerativa, onde foram avaliadas a atividade de timidina-quinase e as figuras de mitose, como marcadores de regeneração. Este procedimento cirúrgico gerou uma resposta regenerativa significativamente maior do que somente a hepatectomia ou após hepatectomia com ressecção do íleo, quando foram comparados entre si19. Moser et al (2006) estudaram a participação de fatores genéticos na regeneração hepática após colectomia54. Entretanto, estudo de Hachiya et al (2008) concluiu pela redução no processo de regeneração hepática após ressecção sincrônica do fígado e cólon em ratos62. Diante da controvérsia, procuramos contribuir com o tema avaliando a influência da ressecção do intestino grosso na função e regeneração do fígado em modelo experimental em ratos.. 18.

(20) . 19. 2. JUSTIFICATIVA Já é bem estabelecido na literatura que o mecanismo de regeneração hepática é dependente de vários fatores associados que atuam de forma sequencial e/ou simultâneos como as citocinas e fatores de crescimento. Mas ainda existem dúvidas a cerca do real papel que a ressecção de vísceras como o cólon e o intestino delgado, exercem na regeneração hepática. Este estudo se propõe a avaliar se o cólon interfere no mecanismo de regeneração hepático ou seja: qual seria a influência de uma colectomia na regeneração do fígado após uma hepatectomia em modelo murino? Isso será quantificado através da estimativa de exames laboratoriais como as enzimas hepáticas e os fatores de crescimento e da quantificação da massa de regeneração hepática. Devido ao câncer colorretal (CCR) ser uma doença muito prevalente38, e as metástases hepáticas relacionadas a este tipo de câncer serem muito frequentes3638. , temos na cirurgia (colectomia associada a hepatectomia) a melhor opção de. tratamento para esta doença37,38,44-46. Por isso, escolhemos o procedimento em questão como modelo de cirurgia desse estudo pois esta abordagem revolucionou o tratamento do câncer colorretal nas últimas décadas, elevando os pacientes portadores do CCR com metástase hepática de uma situação de tratamento paliativo a uma de potencial cura. Pesquisa bibliográfica minuciosa em bases de dados eletrônicas revelou grande escassez de estudos nesta linha de pesquisa: alteração na regeneração hepática após colectomia simultânea com hepatectomia. Desse modo, o presente estudo experimental justifica-se pela grande frequência com que as duas intervenções cirúrgicas são realizadas simuntaneamente. O nosso protocolo experimental teve a intenção de dar contribuição importante para o conhecimento de aspectos ainda não completamente esclarecidos onde existem poucos trabalhos elucidativos na área.. 19.

(21) . 20. 3. OBJETIVOS. 3.1 Objetivo geral Avaliar. se. a. realização. de. uma. colectomia,. quando. associada. à. hepatectomia, exerce influência na regeneração hepática. 3.2 Objetivos específicos Avaliar se o procedimento cirúrgico descrito altera os valores das provas de função hepática AST, ALT, albumina e FA. Avaliar se o procedimento cirúrgico simultâneo altera os valores dos fatores de crescimento: HGF e TGF-a. Avaliar a razão massa hepática/massa corporal dos animais em estudo.. 20.

(22) . 21. 4. MÉTODOS A Comissão Institucional de Ética no Uso de Animais aprovou o projeto de pesquisa sob protocolo n° 054-10, que foi executado no Núcleo de Cirurgia Experimental do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL)/Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). O cuidado com o uso de animais seguiu as regras da legislação brasileira para o uso científico de animais (Lei 11.794/2008 CONCEA). Foram utilizados 18 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, adultos, com peso de 294±13 gramas, fornecidos pelo Biotério do Centro de Ciências da Saúde da UFRN. Foram mantidos em gaiolas individuais de polipropileno com ciclos de 12 horas de claro-escuro, umidade e temperatura controladas, com acesso ‘’ad libitum’’ a água e ração para roedores (PresenceÒ). Por 7 dias, que antecederam ao experimento, permaneceram no laboratório para aclimatação. Procedimento cirúrgico Um dia antes das intervenções cirúrgicas os animais foram submetidos a jejum oral de sólidos, sendo ofertado apenas água. Foram anestesiados com injeção intraperitonial (i.p) de cetamina (70 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), em seguida realizada tricotomia da parede abdominal e antissepsia com álcool etílico 70%. Os animais foram operados com técnica asséptica, e a divisão dos grupos se baseou no procedimento cirúrgico ao qual foram submetidos, sendo assim nomeados: Grupo 1 denominado sham, grupo 2 hepatectomia + colectomia, e grupo 3 hepatectomia apenas - cada grupo com 6 animais. Os animais do grupo hepatectomia + colectomia foram submetidos a laparotomia mediana. Em seguida foram identificados o ceco e o cólon proximal, prosseguindo com a dissecção e ligadura com fio de algodão 3.0 dos vasos do mesentério e a ressecção de todo o ceco além de 5 cm do cólon proximal. O trânsito alimentar foi reconstruído procedendo-se a uma anastomose término-terminal ileocólica em plano único com fio de polipropileno 6-0 em pontos simples separados, com auxílio de microscópio cirúrgico DFV (São Paulo, Brasil), com aumento 10x. Concomitantemente, foram ressecados os lobos esquerdo e mediano do fígado (hepatectomia 70%), através de ligadura dos vasos e ductos destes lobos hepáticos com fio de algodão 2.0. No grupo hepatectomia, os animais foram submetidos à ressecção dos lobos esquerdo e mediano do fígado (hepatectomia 70%) sendo este. 21.

(23) . 22. procedimento realizado com a mesma técnica da hepatectomia realizada no grupo anterior. No grupo sham, os animas foram submetidos à laparotomia, assim como nos grupos anteriores, e apenas leve manipulação do ceco e fígado nas mesmas condições de anestesia e antissepsia. Após cada intervenção ser concluída, em cada animal de cada grupo, a cavidade abdominal foi lavada com 10 mL de solução salina 0,9%, a hemostasia conferida e a incisão abdominal foi fechada com sutura contínua em dois planos utilizando fio de nylon 4-0. Os procedimentos cirúrgicos estão representados nas figuras de 1 a 4. Terminadas as intervenções cirúrgicas, realizou-se analgesia com meperidina intramuscular (i.m.) na dose de 10 mg/Kg, uma vez ao dia, nos três primeiros dias, sempre no mesmo horário. Os animais permaneceram em observação pós-operatória por 6 dias, durante os quais foram anotados os parâmetros de perda de peso através da pesagem diária em balança digital (Toledo, São Paulo, Brasil), com sensibilidade para variação a partir de 1 grama. Os animais receberam apenas água nas primeiras 24 horas do pósoperatório, seguido de dieta sólida até a eutanásia. Todos os procedimentos foram realizados na sala de cirurgia do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN e no pósoperatório todos os animais foram mantidos na sala de controle pós-operatório em gaiolas individuais. No sexto dia pós-operatório os animais foram pesados e anestesiados com a mesma técnica antes descrita, sendo colhida amostra de 5 ml de sangue por punção cardíaca, e submetidos a eutanásia com superdose de anestésico (thiopental sódico 100mg/Kg i.p.). O fígado remanescente foi ressecado, lavado com solução salina 0,9% e pesado em balança de precisão (Bel-Mark 160- IIItalyÒ). Dosagens séricas O soro de sangue total colhido dos animais no 6° dia pós-operatório foi processado por centrifugação a 3.000 rpm por 10 minutos, e estocado a –40°C. Foram dosados os níveis séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), albumina e fosfatase alcalina (FA) em todos os grupos de animais com kits Wiener, Autoanalisador Konelab, Finland. O método ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) foi usado para dosagem do fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e do fator de crescimento transformador-α (TGF-α) utilizando Kits ABCAM, (Massachusetts, USA) e leitora de. 22.

(24) . 23. microplacas BioTek, Vermont USA). Cálculo da regeneração hepática Inicialmente foi calculada a razão massa hepática/massa corporal dos animais do grupo sham. (RMHMC). Após o período de observação os ratos foram pesados (B) em balança de precisão, o fígado totalmente removido e igualmente pesado (A). Os dados adquiridos foram expressos como percentagem da razão de A para B, multiplicada por 100, calculada pela fórmula:. !"#"$ =. "&''& )*+á-./& 3455 "&''& /01+01&2. Essa razão multiplicada por 100 estabeleceu o percentual que o fígado representa sobre a massa corporal de cada animal. As alterações na RMHMC dos animais dos grupos estudados foram avaliadas como grau de regeneração hepática. A Regeneração hepática (RH) foi definida como:. !# =. !"#"$*6-& − !"#"$+ó' 3455 !"#"$+ó'. Onde: RH è Percentual de regeneração hepática; RMHMCeuta è Razão de Massa Hepática com relação à Massa Corporal na eutanásia (após período de observação); RMHMCpós è Razão de Massa Hepática com relação à Massa Corporal no pós-operatório imediato (logo após a hepatectomia).. Análise estatística O teste ANOVA seguido do teste de Tukey foram usados para comparar os parâmetros de dosagens laboratoriais entre os grupos. Para avaliar a diferença entre as médias da regeneração hepática entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student. Para todos os testes adotou-se o nível de significância de 5%, utilizando o pacote estatístico SPSS®21.. 23.

(25) . 24. Figura 1- Laparotomia mediana. Figura 2- Peça cirúrgica (lobos hepáticos mediano e direito). 24.

(26) . 25. Figura 3- Retirada das amostras após a eutanásia. Figura 4- Lavagem das amostras e pesagem em balança de precisão. 25.

(27) . 26. 5. ARTIGO PUBLICADO. Artigo publicado na Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões: Rev Col Bras Cir 2017; 44(5): 476-481. O periódico é indexado no Pubmed, tem fator de impacto 0,45 e Qualis CAPES B3 para o setor Medicina II.. 5.1- Influência do cólon na regeneração do fígado de ratos submetidos à hepatectomia e colectomia Influence of the colon in liver regeneration of rats submitted to hepatectomy and colectomy Marília Carvalho Moreira1; Ítalo Medeiros Azevedo1; Cláudia Nunes Oliveira1; Aldo Cunha Medeiros, ECBC-RN1. RESUMO Objetivo: avaliar se a colectomia, associada à hepatectomia 70%, influencia a regeneração do fígado em ratos. Métodos: foram utilizados 18 ratos Wistar distribuídos em três grupos de seis animais cada. No grupo I (sham) foi realizada laparotomia; no grupo II colectomia + hepatectomia 70%; no grupo III apenas hepatectomia 70%. No sexto dia pós-operatório foi colhido sangue por punção cardíaca, sob anestesia, seguido de eutanásia. Foram realizadas dosagens séricas de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), albumina e fosfatase alcalina (FA), fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e fator de crescimento transformador-α (TGF-α). A regeneração do fígado foi calculada pela fórmula: razão peso do fígado por 100g do peso corporal no momento da eutanásia/peso do fígado no pré-operatório projetado por 100g de peso corporal ×100. Resultados: Os níveis de ALT e AST foram significativamente menores no grupo II quando comparados com o grupo III (p<0,001). A albuminemia mostrou níveis significativamente mais elevados no grupo II. Os níveis de HGF e TGF-α no grupo II foram significativamente mais elevados que no grupo III. O percentual de regeneração hepática foi significativamente mais elevado no grupo II do que no grupo III. Conclusão: o estudo demonstrou que a colectomia realizada simulta. 26.

(28) . 27. neamente à hepatectomia 70% influenciou positivamente na regeneração do fígado em ratos. Pesquisas adicionais são necessárias para revelar os mecanismos moleculares deste efeito e para caracterizar a influência do cólon na fisiologia do fígado. Descritores: Regeneração Hepática. Colectomia. Hepatectomia. Ratos. INTRODUÇÃO O fígado é um dos órgãos mais complexos do corpo humano. Sua massa é mensurada em uma proporção com o peso corporal dos indivíduos1, e esta razão é restaurada após uma ressecção hepática2. Metade de todos os pacientes com câncer colorretal desenvolve metástases hepáticas no decurso dessa doença3. Pacientes com metástases podem se beneficiar com a ressecção hepática, pois proporciona uma oportunidade para a cura4, sendo a segmentectomia isolada e a lobectomia as intervenções cirúrgicas mais comuns. Os resultados têm sido relativamente bons, desde que a margem de segurança da ressecção e a reserva funcional hepática sejam adequadas5. Tem sido relatado que a sobrevida em longo prazo após. ressecção. hepática. para. metástases. colorretais. tem. melhorado. significativamente nos últimos anos6. Estes fatos justificam o estudo da regeneração hepática na vigência de colectomia simultânea, pela alta incidência da doença colorretal com metástases e pela frequência com que essas operações são realizadas no mesmo tempo operatório. A regeneração do fígado tem sido objeto de estudos ao longo dos anos. Todavia os mecanismos pelos quais o órgão é estimulado à replicação e a relação entre as células e citocinas ainda não foram totalmente elucidados. Fatores nutricionais e outros têm sido avaliados, todos demonstrando alguma influência no processo de regeneração7-9. Novos conhecimentos têm surgido sobre a regeneração hepática, dando ênfase à atuação de fatores de crescimento e outras citocinas10,11. Em modelos animais, os mecanismos de regeneração hepática têm sido investigados em detalhes. Os hepatócitos expressam precocemente o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e a interleucina-6 (IL-6), produzidos principalmente pelas células de Kupffer, e a proliferação e o crescimento de hepatócitos são induzidos principalmente em resposta ao fator de crescimento transformador- α (TGF- α) e ao fator de crescimento hepatócitos (HGF), entre outros10.. 27.

(29) . 28 Um dos primeiros estudos a investigar a participação do cólon na. regeneração hepática analisou o efeito da ileocolectomia associada a hepatectomia a 50% na resposta regenerativa, onde foram avaliadas a atividade de timidinaquinase e as figuras de mitose, como marcadores de regeneração. Este procedimento cirúrgico gerou uma resposta regenerativa significativamente maior do que somente a hepatectomia ou após hepatectomia com ressecção do íleo, quando foram comparados entre si12. Moser et al.13, em 2006, estudaram a participação de fatores genéticos na regeneração hepática após colectomia. Entretanto, estudo de Hachiya et al.14, em 2008, concluiu pela redução no processo de regeneração hepática após ressecção sincrônica do fígado e cólon em ratos. Diante da controvérsia, procuramos contribuir com o tema. O objetivo do presente estudo foi examinar a influência da ressecção extensa do cólon na função e regeneração do fígado em modelo experimental em ratos. MÉTODOS O Comitê Institucional de Ética no Uso de Animais aprovou o projeto de pesquisa sob protocolo no 054-10. O cuidado com o uso dos animais seguiu os padrões da legislação brasileira para o uso científico de animais (Lei 11.794/2008, CONCEA). Foram utilizados 18 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, adultos com peso de 294±13 g, fornecidos pelo biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais de polipropileno com ciclos de 12 horas claro-escuro, umidade e temperatura controladas, com acesso ‘’ad libitum’’ a água e ração para roedores. Por sete dias, que antecederam ao experimento, permaneceram no laboratório para aclimatação. Um dia antes das intervenções cirúrgicas ingeriram apenas água, sendo então divididos aleatoriamente em três grupos com seis ratos cada: no grupo I (sham) foi realizada laparotomia; no grupo II colectomia + hepatectomia 70%; no grupo III apenas hepatectomia 70%. Todos os animais foram anestesiados com injeção intraperitonial de cetamina (70mg/kg) e xilazina (10mg/kg), e operados com técnica asséptica após tricotomia da parede abdominal e antissepsia com álcool etílico 70%. Os animais do grupo II, hepatectomia a 70% + colectomia, foram submetidos. 28.

(30) . 29. à laparotomia mediana, através da qual se realizou a ressecção de todo o ceco e 5cm do cólon proximal, procedendo-se à anastomose término-terminal íleo-cólica, em plano único, com fio de polipropileno 6-0, com pontos simples separados, com auxílio de microscópio cirúrgico DFV (São Paulo, Brasil), aumento 10x. Concomitantemente, foram ressecados os lobos esquerdo e mediano do fígado (hepatectomia 70%). No grupo III, hepatectomia, os animais foram submetidos à ressecção dos lobos esquerdo e mediano do fígado (hepatectomia 70%). No grupo sham, procedeu-se à laparotomia mediana e leve manipulação do ceco e fígado nas mesmas condições de anestesia e antissepsia. Após conferida a hemostasia em todos os animais, a incisão abdominal foi suturada em dois planos com fio de nylon 4-0. Terminadas as intervenções cirúrgicas, o controle da dor pós-operatória foi feito com meperidina intramuscular na dose de 10mg/Kg, uma vez ao dia, nos três primeiros dias. Os animais permaneceram em observação por seis dias, durante os quais foram observados os parâmetros de perda de peso através da pesagem em balança digital, com sensibilidade para variação a partir de um grama. Os animais receberam apenas água nas primeiras 24 horas do pósoperatório, seguido de dieta sólida até a eutanásia e, no período de observação, foram mantidos em sala de controle pós-operatório. No sexto dia pós-operatório os animais foram pesados e anestesiados com a mesma técnica antes descrita, e colhidas amostras de 5ml de sangue, por punção cardíaca, para realização de exames laboratoriais, e submetidos à eutanásia com superdose de anestésico (thiopental sódico 100mg/Kg intraperitonial). O fígado remanescente (lobo direito) foi ressecado, lavado com solução salina 0,9% e pesado em balança de precisão. No grupo sham o fígado completo foi pesado. Dosagens séricas O soro de sangue total colhido dos animais no sexto dia pós-operatório foi processado por centrifugação a 3000 rpm por dez minutos, e estocado a -40°C até dosagem. Foram dosados os níveis séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), albumina e fosfatase alcalina (FA) em todos os animais com kits Wiener, Autoanalisador Konelab, Finland. O método ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) foi usado para dosagem do fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e do fator de crescimento transformador-α (TGFα) utilizando Kits ABCAM, (Massachusetts, USA) e leitora de microplacas (BioTek,. 29.

(31) . 30. Vermont USA). Cálculo da regeneração hepática Inicialmente foi calculada a razão massa hepática/massa corporal dos animais do grupo sham (RMHMC). Após o período de observação os ratos foram pesados (B) em balança de precisão, o fígado foi totalmente removido e igualmente pesado (A). Os dados adquiridos foram expressos como percentagem da razão de A para B, multiplicada por 100, calculada pela fórmula: RMHMC= (Massa hepática / Massa corporal) x 100. Essa razão estabeleceu o percentual que o fígado representa sobre a massa corporal de cada animal. As alterações na RMHMC dos animais dos grupos estudados foram avaliadas como grau de regeneração hepática. A Regeneração hepática (RH) foi definida como: RH= ([RMHMCeuta-RHMCpós] / RHMCpós) x 100. Onde: RH é o Percentual de regeneração hepática; RMHMCeuta é Razão de Massa Hepática com relação à Massa Corporal na eutanásia (após período de observação); RMHMCpós é Razão de Massa Hepática com relação à Massa Corporal no pósoperatório imediato (logo após a hepatectomia). Análise estatística O teste ANOVA seguido do teste de Tukey foi usado para comparar os parâmetros de dosagens laboratoriais entre os grupos. Para avaliar a diferença entre as médias da regeneração hepática entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student. Para todos os testes adotou-se o nível de significância de 5%, utilizando o pacote estatístico SPSS®21. RESULTADOS Todos os animais sobreviveram aos experimentos e não houve diferença significativa na evolução de seus pesos corporais, comparando os grupos. As dosagens. bioquímicas. demonstraram,. no. sexto. dia. pós-operatório,. níveis. significativamente mais elevados de ALT nos animais submetidos a hepatectomia 70% + colectomia quando comparado com o grupo sham (p<0,01). Entretanto, os níveis de ALT, AST e FA no grupo de animais submetidos apenas à hepatectomia 70% mostraram-se significativamente mais elevados do que no grupo hepatectomia 70% + colectomia (p<0,01). A albuminemia mostrou-se significativamente maior nos. 30.

(32) é Percentual de regeneração hepática; RMHMCeuta é Razão de Massa Hepática com relação à Massa Corporal na eutanásia (após período de observação); RMHMCpós é Razão de Massa Hepática com relação à Massa Corporal no pós-operatório imediato (logo após a hepatectomia).. po de animais submetidos apenas à hepatectomia 70% mostraram-se significativamente mais elevados do que no grupo hepatectomia 70% + colectomia (p<0,01). A 31 albuminemia mostrou-se significativamente maior nos ratos dos grupos sham e hepatectomia 70% + colecto-. ratos dos grupos sham e hepatectomia mia 70% + nocolectomia do que noNão grupo do que grupo hepatectomia (p<0,01). hou-. ve diferença significante entre os níveis de albuminemia dos grupos sham e hepatectomia 70% + colectomia O teste ANOVA seguido do teste de Tukey foi (p>0,05). 70% Os valores dados bioquímicos estão resualbuminemia dosos grupos e hepatectomia + dos colectomia (p>0,05). Os usado para comparar parâmetrossham de dosagens labomidos na tabela 1. ratoriais entre os grupos. Para avaliar a diferença entre. Análise estatística hepatectomia (p<0,01). Não houve diferença significante entre os níveis de. valores dos dados bioquímicos estão resumidos na tabela 1. Tabela 1. Valores de dados bioquímicos e respectiva interpretação estatística.. Sham. Hepatectomia 70% + colectomia. Hepatectomia 70%. ALT(ui/l). 46,6±3,01a. 128,7±5,1a. 208,4±19,3a. AST (ui/l). 50,05±2,17a. 49,1±2,04b. 69,7±2,7ab. F A (ui/l). 154,6±15,3a. 161,5±6,1b. 211,6±13,7ab. 4,6±0,4a. 4,1±0,2b. 3,4±0,3ab. Albumina (g/l). Teste de Tukey: Valores de média±dp seguidos de mesma letra têm diferenças estatisticamente significantes com p<0,01. AST, Aspartato aminotransferase; ALT, Alanina aminotransferase; FA, Fosfatase alcalina.. Observa-se na tabela quedas osdosavalores das dosagens do HGFdeeregeneração do TGF-α dos Observa-se na tabela 2 que os 2valores O cálculo do percentual hepátigens do HGF e do TGF-α dos animais do grupo submetido a ca revelou que nos animais do grupo hepatectomia 70% animais do grupo submetido a hepatectomia 70% + colectomia foram hepatectomia 70% + colectomia foram significativamente. + colectomia ocorreu regeneração significativamente maior. 70% (p<0,01).. (p=0,003). Os dados estão resumidos na tabela 3.. significativamente maiores do eque nos ratosdodos grupos e hepatectomia 70% maiores do que nos ratos dos grupos sham hepatectomia que nos animaissham submetidos a hepatectomia isolada Moreira (p<0,01). Influência do cólon na regeneração do fígado de ratos submetidos à hepatectomia e colectomia. 479. Rev Col Bras Cir 2017; 44(5): 476-481. Tabela 2. Valores de dados dos fatores de crescimento e respectiva interpretação estatística.. HGF (Fator de crescimento de hepatócitos) pg/ml TGF- α (Fator de crescimento transformador- α) ng/ml Moreira. Sham. Hepatectomia 70% + colectomia. Hepatectomia 70%. 282,8±13,3a. 408±18,2a. 360±58,6a. 0,93±0,1a. 3,8±0,3a. 2,3±0,4a 479. Influência do cólon na regeneração do±fígado de ratos submetidos hepatectomia e colectomia Teste de Tukey: Valores de média dp seguidos de mesma àletra têm diferenças estatisticamente significantes com p<0,01.. Tabela 3. 2. Dados Valoresdescritivos de dados dos fatores de crescimento e respectiva interpretação estatística. Tabela e teste inferencial da regeneração hepática.. Sham. Hepatectomia Grupos 70% + colectomia. Hepatectomia 70%. O cálculo do percentual de regeneração hepática revelou que nos animais do HGF (Fator de crescimento de. Hepatectomia 282,8±13,3a. Hepatectomia 70%+colectomia a 408±18,2. 18,8±8,90. 52,7±16,32. 0,93±0,1. 3,8±0,3. p-valor a 360±58,6. grupo hepatectomia 70% +70% colectomia ocorreu regeneração significativamente maior hepatócitos) pg/ml Regeneração (%). 0,003. TGFα (Fator do que nos animais submetidos a hepatectomia isolada (p=0,003). Os dados estão Média ± desvio padrão (teste t de Student). a a a de crescimento transformadorng/ml resumidos naα)tabela. 3.. 2,3±0,4. Teste de Tukey: Valores de média ± dp seguidos de mesma letra têm diferenças estatisticamente significantes com p<0,01.. DISCUSSÃO. Uma crítica que pode ser feita ao seu modelo, é que foi acrescentada ressecção de íleo aos animais. SabidamenTabela 3. Dados descritivos e teste inferencial da regeneração hepática. te, o íleo é essencial ao processo de regeneração hepátiA regeneração hepática é um tema muito comca15. Estudo em ratos submetidos à hepatectomia e resplexo e que desperta grande interesse devido à formaGrupos Hepatectomia secção simultânea de segmento de apenas 1cm do cólon como acontece, através interações celulares, mecanisHepatectomia 70%+colectomia p-valor 70% concluiu que houve maior grau de regeneração hepática mos humorais, moleculares e influência de órgãos do sisRegeneração (%) 0,003 isolada16. do 52,7±16,32 que nos animais submetidos a hepatectomia tema porta, que ainda não foram18,8±8,90 integralmente elucidaMédiaEm ± desvio padrão (teste t de Student). dos. estudo anterior, demonstramos que o íleo atua positivamente nos parâmetros de regeneração hepática em ratos15DISCUSSÃO . DISCUSSÃO O presente estudo mostrou que os animais. Percebe-se que o tema é controverso, os estudos são escassos na literatura e a metodologia muito variada. Analisamos grau de écomproUma crítica que pode indiretamente ser feita ao seuomodelo, que foi metimento hepático devido à injúria provocada pelas inacrescentada ressecção de íleo aos animais. Sabidamen-. tervenções no fígadoao e no cólon, de através dos marcadores submetidos a hepatectomia 70% ésimultânea a umacomreste, o íleo é essencial processo regeneração hepátiA regeneração hepática um tema muito 15 ALT,. AST, FA em e albumina. Tratando-se de uma enzima cisecção e parte do cólon tiveram regeneração Estudo ratos submetidos à hepatectomia e resplexo edo quececo desperta grande interesse devido à forma 31 ca toplasmática e mitocondrial, a AST encontrada emcólon muihepática significativamente melhor durante período secção simultânea de segmento de éapenas 1cm do como acontece, através interações celulares,o mecanistos órgãos do maior fígado, incluindo coração, hepática músculo de que os animais submetidos à hepatecconcluiu quealém houve grau de regeneração mosobservação humorais, do moleculares e influência de órgãos do sis-.

(33) . 32 A regeneração hepática é um tema muito complexo e que desperta grande. interesse devido à forma como acontece, através interações celulares, mecanismos humorais, moleculares e influência de órgãos do sistema porta, que ainda não foram integralmente elucidados. Em estudo anterior, demonstramos que o íleo atua positivamente nos parâmetros de regeneração hepática em ratos15. O presente estudo mostrou que os animais submetidos a hepatectomia 70% simultânea a uma ressecção do ceco e parte do cólon tiveram regeneração hepática significativamente melhor durante o período de observação do que os animais submetidos à hepatectomia 70% isolada. A ressecção hepática 70% simultanea à colectomia não aumentou o risco de complicações pós-operatórias e todos os ratos sobreviveram até o final dos experimentos. Nossos resultados sugerem que a ressecção simultânea do cólon e do fígado contribuiu para melhorar os parâmetros de regeneração hepática avaliada no sexto dia pós-operatório e, ao mesmo tempo, as provas de lesão e função hepática tiveram níveis mais favoráveis do que nos animais com hepatectomia isolada. Hachiya et al.14 realizaram uma ileocolectomia simultaneamente à hepatectomia em ratos e concluíram que houve redução na regeneração e comprometimento na função das células endoteliais no fígado remanescente. Uma crítica que pode ser feita ao seu modelo, é que foi acrescentada ressecção de íleo aos animais. Sabidamente, o íleo é essencial ao processo de regeneração hepática15. Estudo em ratos submetidos à hepatectomia e ressecção simultânea de segmento de apenas 1cm do cólon concluiu que houve maior grau de regeneração hepática do que nos animais submetidos a hepatectomia isolada16. Percebe-se que o tema é controverso, os estudos são escassos na literatura e a metodologia muito variada. Analisamos indiretamente o grau de comprometimento hepático devido à injúria provocada pelas intervenções no fígado e no cólon, através dos marcadores ALT, AST, FA e albumina. Tratando-se de uma enzima citoplasmática e mitocondrial, a AST é encontrada em muitos órgãos além do fígado, incluindo coração, músculo esquelético, rins e tecidos cerebrais. Entretanto, a ALT é citoplasmática, principalmente encontrada no fígado e mais específica do que a AST17. As transaminases séricas são sensíveis na demonstração de danos aos hepatócitos e independente de fatores etiológicos, seus valores permanecem em. 32.

(34) . 33. níveis elevados enquanto as lesões hepáticas persistem17. Na tabela 1 observa-se que os níveis de ALT foram mais elevados no grupo hepatectomia + colectomia em relação ao sham, e esse nível sérico foi significativamente menor do que no grupo hepatectomia isolada. No que diz respeito à AST, FA e albumina, seus níveis séricos não tiveram diferença significante comparando os grupos hepatectomia + colectomia e sham. Esses dados são relevantes, pois podem significar que a ausência do cólon deve ter exercido um efeito protetor hepático e influiu positivamente na regeneração do fígado. Para o cálculo do percentual de regeneração hepática optou-se por comparar apenas os dois grupos com hepatectomia, pois no grupo sham não houve intervenção no fígado e a regeneração hepática foi considerada nula. Existem muitos fatores de crescimento produzidos pelos hepatócitos durante a regeneração18. O TGF-α tem demonstrado ser mitogênico para os hepatócitos em culturas, sendo mais ativo que outros fatores de crescimento, que são mitogênicos para vários tipos de células não parenquimatosas, especialmente as células endoteliais. Camundongos deficientes em TGF-α têm uma resposta normal em termos de regeneração hepática após hepatectomia19. É bem conhecido que o HGF é um potente fator de proliferação de hepatócitos10. No presente estudo, a associação da colectomia com a hepatectomia teve uma relação positiva com os níveis séricos de HGF e TGF-α no sexto dia pós-operatório, coincidindo com maior percentual de regeneração hepática do que no grupo de animais submetidos à hepatectomia isolada. Esses achados são consistentes com resultados de outros autores20. Nosso estudo demonstrou que a colectomia influenciou positivamente na regeneração do fígado após hepatectomia 70% em ratos. Pesquisas adicionais são necessárias para revelar os mecanismos moleculares deste efeito e para caracterizar a influência do cólon em outros parâmetros da fisiologia do fígado. ABSTRACT Objective: to evaluate whether colectomy, associated with 70% hepatectomy, influences liver regeneration in rats. Methods: we distributed 18 Wistar rats in three groups of six animals each. In group I (sham), we performed laparotomy; In group II, colectomy + 70% hepatectomy; In group III, only 70% hepatectomy. On the 6th. 33.

(35) . 34. postoperative day, we collected blood by cardiac puncture under anesthesia, followed by euthanasia. We performed serum dosages of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), albumin and alkaline phosphatase (AF), hepatocyte growth factor (HGF) and transforming growth factor-α (TGF-α). We calculated liver regeneration by the formula: liver weight ratio per 100g body weight at the time of euthanasia / liver weight preoperatively projected for 100g body weight × 100. Results: ALT and AST levels were significantly lower in group II when compared with group III (p<0.001). Albuminemia showed significantly higher levels in group II. Levels of HGF and TGF-α in group II were significantly higher than in group III. The percentage of hepatic regeneration was significantly higher in group II than in group III. Conclusion: Colectomy performed simultaneously with 70% hepatectomy had a positive influence on liver regeneration in rats. Further research is needed to reveal the molecular mechanisms of this effect and to characterize the colon influence in liver physiology. Keywords: Liver Regeneration. Colectomy. Hepatectomy. Rats. REFERÊNCIAS 1.Tarlás MR, Ramalho FS, Ramalho LNZ, Castro-e-Silva T, Brandão DF, Ferreira J, et al. Cellular aspects of liver regeneration. Acta Cir Bras. 2006;21(Suppl. 1):63-6. 2. Fausto N. Liver regeneration. J Hepatol. 2000;32(Suppl. 1):19-31. 3. Faivre J, Manfredi S, Bouvier AM. [Epidemiology of colorectal cancer liver metastases]. Bull Acad Natl Med. 2003;187(5):815-22. French. 4. Wicherts DA, Miller R, de Haas RJ, Bitsakou G, Vibert E, Veilhan LA, et al. Longterm results of two-stage hepatectomy for irresectable colorectal cancer liver metastases. Ann Surg. 2008;248(6):994-100. 5. Inoue Y, Hayashi M, Komeda K, Masubuchi S, Yamamoto M, Yamana H, et al. Resection margin with anatomic or nonanatomic hepatectomy for liver metastasis from colorectal cancer. J Gastrointest Surg. 2012;16(6):1171-80. 6. Tomlinson JS, Jarnajin WR, DeMatteo RP, Fong Y, Kornprat P, Gonen M, et al. Actual 10-year survival after resection of colorectal liver metastases defines cure. J Clin Oncol. 2007;25(29):4575-80.. 34.

(36) . 35. 7. Silva RM, Malafaia O, Torres OJ, Czeczko NG, Marinho Jr CH, Kozlowski RK. Evaluation of liver regeneration diet supplemented with omega-3 fatty acids: experimental study in rats. Rev Col Bras Cir. 2015;42(6):393-7. 8. Toderke EL, Baretta GAP, Gama Filho OP, Matias JEF. Sirolimus influence on hepatectomy-induced liver regeneration in rats. Rev Col Bras Cir. 2014;41(3):203-7. 9. Salomão LS, Young SB, Galhardo MA, Pereira LA, Pires AR, Boaventura GT, et al. Evaluation of liver regeneration by modulation with ischemic preconditioning after ischemia. and. reperfusion. and. partial. hepatectomy.. Rev. Col. Bras. Cir.. 2012;39(3):211-5. 10. Fausto N, Campbell JS, Riehle KJ. Liver regeneration. Hepatology. 2006;43(2 Suppl 1):S45-53. 11. Jesus RP, Waitzberg DL, Campos FG. Regeneração hepática: papel dos fatores de crescimento e nutrientes. Rev Assoc Med Bras. 2000;46(3):242-54. 12. Kahn D, Von Sommoggy S, Hickman R, Terblanche J. Ileocolectomy enhances the regenerative response after partial hepatectomy in the pig. S Afr J Surg. 1990;28(1):11-3. 13. Moser MJ, Gong Y, Zhang MN, Lipschitz J, Cohen A, Minuk GY. The effects of colectomy on immediate- early proto-oncogene expression and hepatic regeneration in the rat. Dig Dis Sci. 2006;51(7):1179- 82. 14. Hachiya Y, Chijiiwa K, Noshiro H, Tanaka M. Impaired liver regeneration after synchronous liver and colon resection in rats. Hepatogastroenterology. 2008;55(8283):641-6. 15. Medeiros AC, Azevedo AC, Oséas JM, Gomes MD, Oliveira FG, Rocha KB. The ileum positively regulates hepatic regeneration in rats. Acta Cir Bras. 2014;29(2):938. 16. Sasanuma H, Mortensen FV, Knudsen AR, Funch-Jensen P, Okada M, Nagai H, et al. Increased liver regeneration rate and decreased liver function after synchronous liver and colon resection in rats. Ann Surg Innov Res. 2009;3(1):1-7. 17. McGill MR. The past and present of serum aminotransferases and the future of. 35.

(37) . 36. liver injury biomarkers. EXCLI J. 2016;15(6):817-28. 18. Matsumoto K, Miyake Y, Umeda Y, Matsushita H, Matsuda H, Takaki A, et al. Serial changes of serum growth fator levels and liver regeneration after partial hepatectomy in healthy humans. Int J Mol Sci. 2013;14(10):20877-89. 19. Russell WE, Kaufmann WK, Sitaric S, Luetteke NC, Lee DC. Liver regeneration and hepatocarcinogenesis in transforming growth factor-alpha-targeted mice. Mol Carcinog. 1996;15(3):183-9. 20. Efimova EA, Glanemann M, Nussler AK, Schumacher G, Settmacher U, Jonas S, et al. Changes in serum levels of growth factors in healthy individuals after living related liver donation. Transplant Proc. 2005;37(2):1074-5.. Recebido em: 24/04/2017 Aceito para publicação em: 01/06/2017 Conflito de interesse: nenhum. Fonte de financiamento: Conselho Nacional de desenvolvimento Científico e Tecnológico Protocolo no 4449083/2014-4. Endereço para correspondência: Marília Carvalho Moreira E-mail: mariliarn@gmail.com / cirurgex.ufrn@gmail.com. 36.

(38) . 37. 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES A inspiração para o tema deste doutorado surgiu a partir de questionamentos levantados durante análise estatística dos resultados da minha dissertação de mestrado, em área correlata, onde estudamos a presença de alterações na biodistribuição do radiofármaco fitato-99mtecnécio, usado para realização de cintilografias em roedores submetidos a um procedimento cirúrgico de grande porte, além de avaliar a marcação e morfometria das hemácias. Nesse trabalho escolhemos aleatoriamente o prazo de 30 dias para sacrifício das animais e coleta dos exames laboratoriais e entendemos, após pesquisa na literatura pertinente. Os resultados foram pouco expressivos, pois após esse prazo a regeneração hepática já havia sido concluída. No rato a regeneração hepática ocorre muito rapidamente, completando-se em aproximadamente uma semana4,14. Continuamos pesquisando sobre a regeneração do fígado, tentando compreender sua complexidade e observando os fatores que interferiam nesta de forma positiva e/ou negativa, e nos deparamos com a seguinte pergunta: se um animal (roedor), é submetido a uma colectomia associada a uma hepatectomia, a regeneração hepática seria prejudicada ou otimizada? Escolhemos então responder a esta pergunta, visto que são escassos os trabalhos que encontramos na pesquisa da literatura que tratam do tema. Além disso, há trabalhos que enfatizam a ação protetora do íleo63 porém não se sabe ao certo qual seria a função que o cólon exerce na regeneração hepática, como também não sabemos se a associação da colectomia à hepatectomia aumenta a morbidade por possível interferência na resposta regenerativa. Após esses questionamentos resolvemos estudar o tema buscando respostas para essas indigações. Elegemos a colectomia associada à hepatectomia, em virtude da colectomia se tratar de um procedimento que ao longo do tempo tem sido bastante indicado e realizado nos pacientes portadores de câncer colorretal (CCR) com metástase hepática, ou seja, pela sua abrangente aplicabilidade clínica em humanos. Este procedimento revolucionou o tratamento do câncer colorretal nas últimas décadas, devolvendo em alguns casos a chance de cura aos pacientes com doença avançada. Não foi objetivo deste estudo a carcinogênese do câncer colorretal, logo esta não foi induzida nos animais. O CCR é o terceiro tipo de neoplasia maligna mais frequente38,39,68-71 e as metástases hepáticas estão presentes em 15% a 25% dos pacientes no momento do diagnóstico39,51,68,72-75. Cerca de 50% dos pacientes. 37.