Estudo da correlação das características clínico-patológicas do câncer colorretal com a expressão imunohistoquímica de proteínas da progressão tumoral

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. ESTUDO DA CORRELAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DO CÂNCER COLORRETAL COM A EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS DA PROGRESSÃO TUMORAL. GEORGE ALEXANDRE LIRA. NATAL/RN 2015.

(2) GEORGE ALEXANDRE LIRA. ESTUDO DA CORRELAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DO CÂNCER COLORRETAL COM A EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS DA PROGRESSÃO TUMORAL. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Raimundo Fernandes de Araújo Júnior.. NATAL/RN 2015.

(3) L228u. Lira, George Alexandre. Estudo da correlação das características clínico-patológicas do câncer colorretal com a expressão imunohistoquímica de proteínas da progressão tumoral/ George Alexandre Lira. – Natal/ RN: UFRN, 2015. 80f.: il. ; 31 cm. Orientador: Raimundo Fernandes de Araújo Júnior. Tese (mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Mestre em Ciências da Saúde, 2015. Referências bibliográficas: f. 43-44 1. Ciências da Saúde. I. Araújo, Raimundo Fernandes de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Mestrado em Ciências da Saúde. CDD – 616 Bibliotecária Mychelle Machado Alves CRB-15/362.

(4) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito.

(5) GEORGE ALEXANDRE LIRA. ESTUDO DA CORRELAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DO CÂNCER COLORRETAL COM A EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS DA PROGRESSÃO TUMORAL.. Aprovada em: . /. /. Banca Examinadora: Presidente da Banca:. ______________________________________________________________ Prof. Dr. Raimundo Fernandes de Araújo Júnior – UFRN ORIENTADOR Membros da Banca:. ______________________________________________________________ Profa. Dra. Aurigena Antunes de Araújo – UFRN AVALIADORA. ______________________________________________________________ Prof°. Dr. Jeymesson Raphael Cardoso Vieira – UFPE AVALIADOR.

(6) Aos meus pais, por tudo que fizeram, fazem e farão por mim..

(7) AGRADECIMENTOS A Deus, pela minha vida, minha saúde e minha família. Ao meu orientador, Prof. Raimundo Fernandes de Araújo Júnior, por ter me incentivado o lado científico e por ter me dado a oportunidade de estar ao seu lado aprendendo através de sua paciência, orientação, exigência, honestidade, persistência e, principalmente, sua dedicação como professor e pesquisador. Aos pacientes, pois sem eles nada disso poderia se realizar. A minha esposa, Carla Afonso Lira, por sua dedicação, compreensão e companheirismo na realização dos meus sonhos; e por tornar minha vida completa e feliz. Aos meus filhos, Giovanna e João Vitor, a quem tenho amor absoluto, por estarem sempre ao meu lado, mesmo quando estou ausente, dividindo comigo tanto os momentos difíceis quanto os felizes da vida. A Guilherme Afonso, meu cunhado, que luta contra o câncer e me ajudou nas correções e orientações gramaticais dessa dissertação. Aos meus familiares que me incentivaram, estimularam e torceram pela realização desse projeto. A toda equipe do Laboratório de Morfologia e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, através da representante Maria de Lourdes. À Universidade de São Paulo, que me concedeu a realização do armazenamento do material de estudo pela Técnica Tissue Microarray pelo Departamento de Patologia. À professora doutora patologista Ana Maria de Oliveira Ramos pela possibilidade de realização desse projeto. À Liga Norte-Riograndense contra o câncer, que me concedeu o espaço e as amostras para fazermos esse projeto significativo para a ciência. A todos que contribuíram diretamente ou indiretamente para a realização e finalização desse árduo e poderoso projeto..

(8) Na adversidade, uns desistem, enquanto outros batem recordes. Ayrton Senna.

(9) RESUMO Excluindo-se os tumores de pele não-melanoma, o câncer colorretal é o segundo mais comum no sudeste do Brasil; o terceiro na região sul e na região Centro-Oeste. Já no norte do Brasil, é o quarto e, na região Nordeste, o quinto. Avaliar variáveis clinico-patológicos do câncer colorretal é de fundamental importância para se conhecer possíveis desfechos na sobrevida dos pacientes portadores do câncer e pontuar características na progressão tumoral como o perfil da invasão tumoral e angiogênese. O objetivo desse trabalho foi estudar as características clínico-patológicas dos pacientes portadores do câncer colorretal (CCR) na Liga Norte Riograndense contra o câncer em Natal-RN/BR, correlacionando as variáveis clínicas e patológicas como parâmetros de prognóstico e determinando o nível de expressão de proteínas, tais como: E-caderina (E-cad), Beta-catenina (β-cat), Galectina-3 (Gal-3), Metaloproteinases de matriz (MMP) 2 e 9 e o Fator alfa de crescimento vásculo-endotelial (VEGF-α) nos tecidos tumorais. Foi realizado um estudo retrospectivo dos casos de câncer colorretal da Liga Norte Riograndense contra o Câncer no período de 1995 a 2005 em Natal-RN / Brasil. As variáveis clínico-patológicas, tais como: idade, sexo, etnia, hábitos de vida, história familiar, local do tumor primário, grau de diferenciação, estadiamento TNM, Dukes’ modificado, tratamento e sobrevida foram analisados. Os dados clínico-patológicos foram coletados dos prontuários médicos através de um formulário específico e os dados foram armazenados em uma planilha do Excel. Um total de 534 pacientes foi selecionado do arquivo do setor da patologia dessa instituição, mas 176 pacientes foram excluídos. Foram incluídos 358 pacientes para análise epidemiológica e suas correlações clínico-patológicas. Foram selecionados 180 pacientes para estudos histológicos e imunohistoquímicos. Proteínas participantes da progressão tumoral E-caderina, Beta-catenina, Galectina-3, Metaloproteinases 2 e 9 e o Fator alfa de crescimento endotelial vascular foram analisadas. Os blocos de parafina dessas amostras foram tratados pela técnica de Tissue Microarray e suas lâminas submetidas à imunohistoquímica para avaliar a intensidade de marcação dessas proteínas nos tecidos tumorais. Os resultados dessa análise foram correlacionados às variáveis clínico-patológicas dos pacientes. Análise estatística pelo Teste de qui-quadro de Pearson e análise de sobrevida pela Curva de Kaplan-Meier foram utilizados. Valores de p<0,05 foram considerados es-.

(10) tatisticamente significativos. A média de idade da nossa amostra foi de 58,8 anos e 51,7% foram do sexo feminino. O consumo de álcool aumentou em 1,71 vezes o risco de morte pelo CCR (p=0,034). Já o tabaco aumentou 2,7 vezes a chance de desenvolver tumores de alto estágio TNM (p=0,001). Os pacientes com histórico familiar de câncer tiveram 3,833 vezes a chance de desenvolver o CCR (p=0,002). A expressão da MMP-2 mostrou uma associação significativa com os tumores de alto estágio TNM (p<0,046) e mortalidade (p=0,041). A expressão do α VEGF teve correlação estatisticamente significante com o alto estágio TNM (p<0,009), grau de indiferenciação celular (p<0,025) e mortalidade (p<0,035). As expressões da E-caderina e Beta-catetina mostraram associação do tumor com alto estágio TNM (p=0,0001) e Dukes’ modificado (p=0,05), lesão em reto (p=0,03 e p=0,007, respectivamente), tabaco (p=0,05) e indiferenciação (p=0,001). A expressão das Gal-3 apresentou relevância estatística com pacientes de alto estágio TNM (p=0,01), fumantes (p=0,01), etilista (p=0,03), indiferenciação (p=0,0001) e mortalidade (p=0,0001). Frente aos resultados, pode-se perceber que o estilo de vida e histórico familiar teve correlação no prognóstico do CCR, assim como a expressão de MMP-2, MMP-9 VEGF alfa, E-caderina, Beta–catenina e Galectina-3 foram importantes marcadores de prognóstico na progressão tumoral no câncer colorretal. Descritores: Câncer colorretal, Tissue Microarray, marcadores prognósticos, sobrevida, MMP-2, MMP-9, VEGF-alfa, E-caderina, Beta-catenina e Galectina-3..

(11) ABSTRACT Except the non-melanoma skin tumors, colorectal cancer is the second most common in the Southeastern Region of Brazil, the third most common in the Southern and Central Regions. It is also the forth most common in the Northern Region and it is the fifth one in the Northeastern. To assess pathological and clinical variables of colorectal Cancer is crucial to know the possible conclusions for the survival of patients and point out the characteristics in the progress of tumor, such as the profile of tumor invasion and its angiogenesis. This work focuses on analyzing clinically and pathologically some settings in colorectal cancer patients (CRC) in the city of Natal and its countryside through those variables as parameters of prognosis and determine the level of protein expression, for instance: E-cadherin (E-cad), beta-catenin (β-cat), galectin-3 (gal-3), matrix metalloproteinases (MMP) 2 and 9 and vascular-endothelial growth factor alpha (α VEGF) in the tumor tissues. A retrospective study was done in colorectal cancer cases in the regions of Rio Grande do Norte state from 1995 to 2005, specifically in Natal city/RN/Brazil. The pathological and clinical variables, such as: age, gender, ethnicity, lifestyle, family history, the location of the primary tumor, level of differentiation, TDM staging, modified Dukes’, treatment and survival were analyzed. The pathological and clinical data were collected from medical records through a specific form and were filed on Excel. A total of 534 patients were selected from the Pathology Department file in this institution, however, 176 patients were excluded. 358 patients were included for Epidemiological analysis and its clinical and pathological correlations were selected. 180 patients were also selected for histological and immunohistochemical studies. The tumor progression of these selected proteins mentioned before were analyzed. The Paraffin blocks of these samples were treated by Microarray Tissue technique and its blades subjected to immunohistochemistry to test the intensity of these proteins in tumor tissues. The results of this analysis were correlated with clinicopathologic variables of patients. Statistical analysis using the chi-frame Pearson test and analysis of midlife by Kaplan-Meier curve was also utilized. P values < 0.05 were considered statistically significant. The average age of our sample was 58.8 years and 51.7 % were female. Alcohol consumption has increased by 1.71 time the risk of death by CCR (p = 0.034) and tobacco consumption increased 2.7 times the chance of developing.

(12) tumors of high TNM stage (p = 0.001). Cancer patients had a family history of 3,833 times the chance of developing the CCR (p = 0.002). The expression of MMP-2 showed a significant association with tumors of high TNM stage (p <0.046) and mortality (p = 0.041). The α VEGF expression had statistically significant correlation with high TNM stage (p <0.009), degree of cell indifferentiation (p <0.025) and mortality (p <0.035). Expressions of E-cadherin and beta-catetina demonstrated tumor linked to high TNM stage (p = 0.0001) and Dukes› modified (p = 0.05), lesions in the rectum (p = 0.03 and p = 0.007, respectively), smoking (p = 0.05) and indifferentiation (p = 0.001). The expression of Gal-3 showed statistical significance with high TNM stage of patients (p = 0.01), smokers (p = 0.01), alcohol drinking (p = 0.03), indifferentiation (p = 0.0001) and mortality (p = 0.0001). Based on the results, therefore, we could realize that lifestyle and family history had correlation in the CCR prognosis, as well as MMP-2 expression, MMP-9, VEGF alpha, E-cadherin, Beta-catenin and Galectin-3 were important prognostic markers in tumor progression in colorectal cancer. Keywords: Colorectal cancer. Tissue Microarray. Prognostic markers. Midlife. MMP2. MMP-9. VEGF-Alpha. E-Cadherin. Beta-Catenin. Galectin-3..

(13) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ∆. Diferenças ou variações. °C. Graus Celsius. µL Microlitro ANOVA. Análise de variância. BSA. Bovine Serum Albumin. RNA. Ácido Ribonucleico. Dr. Doutor EDTA. Ácido etilenodiamino tetra-acético. EUA. Estados Unidos da América. g Grama PBS. Tampão fosfato salino. pg/ml. Picograma por mililitro. Prof. Professor RN. Rio Grande do Norte. Rpm. Rotações por minuto. SP. São Paulo. TCA. Ácido tricloroacético. TIMPs. Inibidores teciduais de metaloproteinases. UFRN. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. LNRCC. Liga Norte-Riograndense contra o Câncer. CCR. Câncer colorretal. CEP. Comitê de Ética e Pesquisa. TCLE. Termo de consentimento livre esclarecido. INCA. Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva. VEGF alfa Fator alfa de Crescimento Endotélio Vascular E-cad E-caderina β-cat. Beta Catenina. Gal-3 Galectina-3 TNM. T – tamanho, N – linfonodo e M – metástase. UICC. União Internacional contra o câncer. CEA. Antígeno Carcinoembrionário.

(14) TMA. Tissue Microarray. USP. Universidade de São Paulo. IHQ Imunohistoquímica mAbs. Anticorpo monoclonal. AJCC. American Joint Committee on Cancer. HLA. Hospital Dr. Luiz Antônio. ECM. Matriz Extra-celular. TSP-1. Trombo-espondina 1. GSK-3. Glicogênio sintase quinase 3. WNT. Via de sinalização intracelular. VEGFR 1. Receptor do fator de crescimento endotélio vascular 1. VEGFR 2. Receptor do fator de crescimento endotélio vascular 2. VEGFR 3. Receptor do fator de crescimento endotélio vascular 3. XRT Radioterapia CT Quimioterapia SPSS. Statistical Package for Social Science. STATA. Programa de estatística. MO. Missouri – EUA. LR. Razão de verossimilhança. NJ. New Jersey – EUA. DAB. Diaminobenzidina. RCUI. Retocolite ulcerativa intestinal.

(15) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO. 15. 2 JUSTIFICATIVA. 22. 3 OBJETIVOS 23 3.1 Objetivo Geral. 23. 3.2 Objetivos Específicos. 23. 4 MÉTODOS. 24. 4.1 Delineamento do Estudo. 24. 4.2 Casuística. 24. 4.3 Princípios Éticos. 24. 4.4 Critérios de Inclusão. 24. 4.5 Critérios de Exclusão. 24. 4.6 Tamanho da Amostra. 24. 4.7 Variáveis Clínico-Patológicas. 25. 4.8 Método de Coleta de Dados. 26. 4.9 Processamento e Análise dos Dados. 27. 4.10 Tissue Microarray (Tma) 28 4.11 Imunohistoquímica. 29. 5 ARTIGOS PUBLICADOS. 31. 5.1 Lifestyle and Family History Influence Cancer Prognosis in Brazilian . 32. 5.2 Prognostic and Diagnostic Implications of Mmp-2, Mmp-9, and Vegf-Α Expressions in Colorectal Cancer. 37. 5.3 Clinicopathological and Prognostic Significance of E-Cadherin, Β-Catenin, Galectin-3 Expression in Colorectal Cancer Progression 6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES. 44 72. REFERÊNCIAS 73 APÊNDICES 77.

(16) 1 INTRODUÇÃO Os tumores malignos que acometem o cólon e reto, câncer colorretal (CCR), são responsáveis, a cada ano, por cerca de 950 mil novos casos, sendo a quarta causa mais comum de câncer no mundo e a segunda em países desenvolvidos (JAMEL et al, 2008). Aproximadamente, 153.760 norte-americanos são diagnosticados com câncer colorretal anualmente, dos quais 52.180 morrerão desta doença: a maioria por doença metastática, correspondendo a um terço dos pacientes diagnosticados (KOHLER et al, 2015). No Brasil, em 2014, o número estimado de casos novos de câncer colorretal foi de 15.070 casos em homens e de 17.530 em mulheres, valores que correspondem a um risco estimado de 15,44 casos novos a cada 100 mil homens e de 17,24 para cada 100 mil mulheres, dos quais 50% morrerão desta doença, devido à doença metastática. Na região Nordeste do Brasil, o câncer colorretal em homens é o quinto mais frequente (6,9/100.000), e o terceiro nas mulheres (7,81/100.000). No Rio Grande do Norte, a estimativa para 2014 foi de 130 casos novos em homens e 150 casos novos em mulheres, dados revelados pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) e fornecidos pela instituição da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (LNRCC). Os tumores colorretais tiveram incidência e prevalência aumentadas nos países em desenvolvimento nos últimos anos, devido aos hábitos de vida e ao envelhecimento da população, associados a maior procura dos serviços médicos especializados e facilidade em realizar os exames complementares para o diagnóstico. Entretanto, essa doença tem ainda índices alarmantes de diagnóstico tardio, correspondendo a um importante problema de saúde pública. Apesar da influência de tratamentos modernos e adequados do câncer colorretal, apoiados pelo desenvolvimento clínico científico e pelo surgimento de novos tratamentos, ainda se evidenciam os índices alarmantes de mortalidade, podendo corresponder a até 50% dos pacientes com CCR (MEDEIROS, 2009; HAN et al, 2006; LEVIN, 2006; INCA, 2015). Apesar da evolução genética molecular e das pesquisas científicas, os resultados finais são desanimadores, quando se observa a manutenção dos índices de mortalidade (HUGHES et al, 1986). Hoje as evoluções da radicalidade do tratamento cirúrgico com ressecções sincrônicas de metástases, da quimioterapia e da radioterapia, ainda não são 15.

(17) suficientes para modificar o prognóstico do paciente (GRAMONT et al, 2012). Sendo assim, compreender os mecanismos envolvidos desde a origem da carcinogênese do CCR até o tratamento específico, é fundamental para se encontrar novas alternativas de cura. Com ações mais precisas na doença em órgãos afetados, teremos um grande impacto na redução do índice de mortalidade e na história natural dos pacientes portadores do câncer colorretal (HWANG et al, 2014). Os fatores prognósticos e preditivos do câncer colorretal são muito bem estabelecidos na literatura, por isso a importância na contribuição da decisão do tratamento e na avaliação da sobrevida do paciente (BOLOCAN et al, 2012). Os principais fatores de risco para o câncer colorretal são a idade, sexo, raça, tabagismo, etilismo, obesidade, história familiar, doença inflamatória intestinal, doença polipoide intestinal, antecedentes de câncer colorretal, dieta e sedentarismo (WCRF, 2007). Alguns fatores patológicos que influenciam a sobrevida dos pacientes e são decisivos para o tratamento neoadjuvante ou adjuvante são tamanho tumoral, tipo e subtipo histológico, a presença de morfologia de anel de sinete, grau de diferenciação, presença de invasão angiolinfática e o envolvimento linfonodal, assim como a margens de infiltração tumoral e número de linfonodos ressecados (TREANOR; QUIRKE, 2007). No entanto, a compreensão dos mecanismos moleculares e histológicos subjacentes ao processo metastático auxiliam a identificar aqueles pacientes com maior risco de recorrência e de encontrar novos alvos tumorais para prevenir a progressão das doenças, favorecendo o advento de novas terapias e criando o caminho para uma abordagem personalizada ao paciente (DIVITIIS et al, 2014), levando em consideração os mecanismos genéticos complexos envolvidos na carcinogênese e as avaliações clínicas e patológicas clássicas (DIVITIIS et al, 2014). Na evolução da carcinogênese do câncer colorretal, após o processo mitogênico inicial desencadeada por ação proto-oncogênica ou inibição do gene supressor, já existem ações de proteínas intracelular e extracelular (interstício) que participam no desenvolvimento tumoral, atuando como intermediadora na capacidade de adesão celular, proliferação celular, evasão a apoptose, invasão tumoral e angiogênese. Essas ações de proteínas agem como agentes promotores, podendo influenciar na resposta ao tratamento e servir de novos elos para entender a evolução do câncer (COPPEDÈ et al, 2014). 16.

(18) Sinalização da Proliferação Sustentada. Resistência à Morte Celular. Evasão dos Supressores de Crescimento. Indução à Angrogênese. Ativação para Invasão e Metástese. Permissão da Imortalidade de Replicação Figura 1 - Características principais de malignidade. Fonte: Hanahan, Douglas e Weinberg, Robert A., 2000.. Segundo Hanahan; Weinberg (2000), o câncer apresenta algumas características importantes para o seu desenvolvimento que compreendem seis capacidades biológicas. As características biológicas constituem um princípio organizador para racionalizar as complexidades da doença neoplásica. Elas incluem: A: a manutenção da capacidade de sustentação da sinalização proliferativa que, através da desregulamentação deste sinal, torna-se dono de seu próprio destino e regula a progressão através do ciclo celular e o crescimento das células em seu tamanho; B: a evasão da sinalização dos supressores de crescimento. As células cancerosas devem também contornar poderosos programas que regulam negativamente a proliferação celular, muitos destes programas dependem das ações dos genes supressores tumorais; C: a resistência à morte celular ou apoptose. As células tumorais desenvolvem uma variedade de estratégias para limitar ou evitar a apoptose; D: a permissão da imortalidade replicativa. A aquisição tardia da função telomerase serve para gerar mutações promotoras do tumor, enquanto sua ativação subsequente estabiliza o genoma mutante e confere a capacidade ativa da replicação ilimitada; 17.

(19) E: a indução angiogênica, que durante a progressão do tumor, serve de interruptor angiogênico iniciador, quase sempre é ativado e assim permanece, causando o brotamento contínuo de novos vasos que ajudam a sustentar a expansão do crescimento neoplásico; F: a ativação da invasão e da metástase ocorre devido à perda de junções aderentes e pela destruição da matriz, influenciando as alterações na sua forma, bem como na sua fixação a outras células e à matriz extracelular (ECM); Características Emergentes. Desregulamentada da Energia Celular. Evitando a Destruição pelo Sistema Imunológico. Instabilidade do Genoma e Mutação. Promoção do Tumor pela Inflamação. Características Permitidas Figura 2 - Novas características associadas a malignidade. Fonte: Hanahan, Douglas e Weinberg, Robert A., 2011.. Quase 10 anos depois, Hanahan; Weinberg (2011) publicaram novos conceitos para a biologia tumoral, abordando novas capacidades biológicas, consideradas emergentes, tais como: G: desenvolvimento de instabilidade genômica em células, o que gera mutações aleatórias, incluindo rearranjos cromossômicos, favorecendo ao câncer; H: ação do processo inflamatório, que para alguns cânceres serve para promover o progresso tumoral através de vários meios inflamatórios; I: a reprogramação do metabolismo da energia celular, a fim de suportar o crescimento e proliferação celular contínua, substituindo o programa metabólico que 18.

(20) opera na maioria dos tecidos normais e alimenta as operações fisiológicas das células associadas; J: a capacidade da ação do sistema imunológico que se destaca na dicotomia que tanto antagoniza e melhora o desenvolvimento e progressão tumoral, enquanto favorece a evasão ativa por células cancerosas de ataque e eliminação por células do sistema imunológico. O câncer tem algumas capacidades biológicas de organização e sobrevivência que fornecem um quadro notável do desenvolvimento proliferativo e metastático. Dessa forma, pode-se observar a manutenção da sinalização proliferativa da célula, influenciando as ações da E-caderina e β catenina. A galectina-3 permite a fuga dos crescimentos supressores, que resistem à morte celular e permite a imortalidade replicativa. Já o alfa VEGF tem ação indutora na angiogênese. Por sua vez, a ativação da invasão e da metástase é intermediada pela ação das metaloproteinases de matriz 2 e 9 (HANAHAN; WEINBERG, 2000). A perda de adesão celular é um evento importante para transição epitélio-mesenquimal (disseminação) pelas células invasoras no estroma e desempenha um papel fundamental na progressão do tumor colorretal através da ação da E-caderina e β-catenina. A E-caderina, presente nas zônulas aderentes entre as células epiteliais, é dependente de cálcio e possui correlação com a aquisição de propriedades invasivas. Enquanto a β-catenina forma complexos com a própria E-caderina, mediando à ligação do citoesqueleto de actina. Por isso, o complexo caderina-catenina diminuído é fundamental na cascata da metástase. Esse complexo é reconhecido como um antagonista de invasão e metástase; enquanto a redução da expressão destas proteínas foi bem reconhecida como potencializadores destes fenótipos (CHEN et al, 2008; HAN et al, 2006). O marcador biológico protéico pleiotrópico, Galectina-3 está implicado no crescimento celular, diferenciação, adesão, o processamento do RNA, apoptose e transformação maligna. O aumento da Galectina-3 determina o potencial metastático e também medeia a sinalização de Wnt para regulação por GSK-3 (TSUBOI et al, 2007). Durante a progressão do tumor, um estimulador angiogênico quase sempre é ativado. Alguns destes reguladores angiogênicos são proteínas de sinalização e se ligam aos receptores de superfície da célula sendo estimuladores ou inibidores 19.

(21) exibidos por células endoteliais vasculares. Os protótipos conhecidos de indutores e inibidores da angiogênese são fatores de crescimento endotelial vascular alfa (VEGF-α) e trombo-espondina-1 (TSP-1), respectivamente. A sinalização do VEGF ocorre através de três receptores tirosina-quinase (VEGFR-1-3). Essa sinalização, regulada em vários níveis, reflete essa complexidade de propósito. Assim, a expressão do gene de VEGF pode ser por regulada positivamente tanto por hipoxia e pela sinalização de oncogenes (FERRARA, 2009; MAC GABHANN E POPEL, 2008; CARMELIET; JAIN, 2011). Metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2) e a metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) estão envolvidas na degradação da matriz extracelular no processo fisiológico normal e, também, em processos de doença, como invasão tumoral e metástase (SHI et al, 2013; LI et al, 2013). Nos últimos anos, (SAID et al, 2014), as superexpressões das MMPs têm sido mostradas em vários cânceres humanos e muito associadas com o desenvolvimento de malignidade, sendo intensamente investigados como possíveis biomarcadores e fatores desfavoráveis em uma variedade de tipos de câncer, incluindo CRC (SAID et al, 2014). Os genes MMPs codificam uma enzima que degrada o componente estrutural principal das membranas basais, colagénio do tipo IV, e assim desempenha um papel importante em promover a invasão e metástases das células do tumor (SHI et al, 2013; LI et al, 2013). Sabe-se que um dos prognósticos dos pacientes doentes com câncer colorretal é determinado pelo desenvolvimento de metástases. A cascata metastática começa com a quebra da integridade epitelial que permite que as células tumorais possam deixar as estruturas epiteliais, para invadirem o estroma circundante e entrarem em vasos sanguíneos e/ou vasos linfáticos e extravasam nos órgãos-alvo. A diferenciação epitelial é altamente dependente da formação adequada das junções intercelulares por moléculas de adesão célula-célula. A Disfunção das junções permite a invasão de células epiteliais e a progressão de carcinomas (HANAHNA; WEINBERG, 2011). A formação do ambiente favorável para a proliferação e sobrevivência celular do tumor tem sido o ponto crucial para a progressão do câncer, afetando, em muito, nos diferentes processos da carcinogênese, tais como, no metabolismo do crescimento tumoral, na angiogênese, no apoptose, na inflamação local, imunossupressão tumoral e invasividade (HANAHNA; WEINBERG, 2011). Podemos destacar 20.

(22) vários tipos de moléculas e proteínas, que são consideradas como biomarcadores protéicos: E-caderina, Beta-catenina, Galectina-3 (Gal-3), Metaloproteinase-2 (MMP-2), Melatoproteinase-9 (MMP-9) e o fator alfa de crescimento do endotélio vascular (VEGF-α). Elas podem ser quantificadas pela expressão protéica por imunohistoquímica para informar seu papel dentro do processo da oncogênese do câncer colorretal, podendo inferir o prognóstico do paciente e influenciar o tratamento (ZLOBEC; LUGLI, 2008). Face ao exposto, é nosso objetivo avaliar a correlação entre as características clínico-patológicas do câncer colorretal e a expressão imunohistoquímica de proteínas da progressão tumoral, como a E-cad, β-cat, Gal-3, MMP-2, MMP-9 e VEGF-α em pacientes portadores do câncer colorretal.. 21.

(23) 2 JUSTIFICATIVA Com o crescente número de casos de câncer colorretal nos países em desenvolvimento, associado ao alto índice de mortalidade, surgiu a necessidade de desenvolvimento de dois aspectos: uma nova visão de avaliação clínico-patológico, correlacionada ao prognóstico e uma demonstração de sua importância aos conhecimentos da evolução dos pacientes com câncer colorretal. Apesar de existirem dados estabelecidos na literatura científica oncológica, há muito a se descobrir sobre fatores preditivos e de prognósticos, além da necessidade de se tentar justificar os principais contribuintes para o insucesso no tratamento. Apesar das confirmações dos fatores prognósticos já estabelecidos pela literatura mundial para a disseminação da doença, que são importantes na determinação da sobrevida dos pacientes, tais como, a invasão tumoral no local, linfonodos comprometidos, tamanho do tumor, invasão angiolinfática na lesão e estadiamento clínico, ainda não se têm estabelecidas as correlações com as expressões proteicas participantes da progressão tumoral. Com isso, o prognóstico do aparecimento de marcadores proteicos extracelulares e intracelulares informa diretamente a capacidade de progressão tumoral do câncer colorretal, quando esses marcadores são analisados por níveis de invasão do tumor, metástase, proliferação, diferenciação e disseminação da doença. Os resultados desta pesquisa, também, proporcionam a ampliação de conhecimentos sobre a epidemiologia do câncer colorretal da Liga Riograndense contra o Câncer e contribui na investigação para alguns novos sinalizadores proteicos de importância no prognóstico do paciente. Contudo, os marcadores proteicos Beta Catenina, E-Caderina, Galectina-3, MMP-2, MMP-9 e VEGF-alfa podem ajudar no tratamento em decisão do tratamento ao paciente com câncer.. 22.

(24) 3 OBJETIVO 3.1 Objetivos Gerais Correlacionar variáveis clínico-patológicas à expressão imunohistoquímica de proteínas em pacientes portadores de câncer colorretal da Liga Norte Riograndense contra o câncer em Natal-RN no período de 1995 a 2005. 3.2 Objetivos Específicos Analisar as variáveis clínico-patológicas de pacientes portadores de câncer colorretal da Liga Norte Riograndense contra o câncer do período de 1995 a 2005; Conhecer a correlação entre a expressão dos marcadores de progressão tumoral, tais como, E-caderina, β-catenina, galectina-3, MMP-2, MMP-9 e VEGF α com a sobrevida de pacientes portadores de câncer colorretal da Liga Norte Riograndense contra o câncer do período de 2000 a 2005; Estudar a correlação da expressão de marcadores imunohistoquímicos de adesão celular, tais como E-caderina, β-catenina e galectina-3 com variáveis clínico-patológica (estadiamento TNM, critério modificado de Duke’s e diferenciação histológica) de pacientes portadores de câncer colorretal da Liga no período de 2000 a 2005; Observar a correlação da expressão de marcadores imunohistoquímicos de invasão tumoral, tais sejam MMP-2, MMP-9 e VEGF-α com variáveis clínico-patológica (estadiamento TNM, critério modificado de Duke’s e diferenciação histológica) de pacientes portadores de câncer colorretal da Liga do período de 2000 a 2005;. 23.

(25) 4 MÉTODO 4.1 Delineamento do Estudo Trata-se de um estudo de tipo descritivo, analítico, observacional, retrospectivo, transversal, não controlado, não randomizado e quantitativo. 4.2 Casuística Pacientes com câncer colorretal diagnosticado na Liga Norte Riograndense contra o Câncer no período de 1995 a 2005. 4.3 Princípios Éticos Os métodos utilizados nesta investigação do estudo e o termo de confidencialidade foram aprovados pela Comissão de Ética no Ensino e Pesquisa da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (Números de aprovação: 024/0030/2006 e 030/0030/2006). 4.4 Critérios de Inclusão Pacientes com tumor primário referente ao câncer colorretal diagnosticados na Liga Norte Riograndense contra o Câncer no período de 1995 a 2005, com prontuários, com todas as variáveis clínico-patológicas, preenchidos corretamente e blocos de parafina em bom estado de conservação referente aos casos de câncer colorretal da LNRCC. 4.5 Critérios de Exclusão Os prontuários preenchidos incorretamente e falta de dados no prontuário e blocos de parafina em mal estado de conservação. 4.6 Tamanho da Amostra Pacientes que atenderam aos critérios de inclusão do período de 1995 a 2005 foram selecionados da lista de pacientes coletados no banco de dados registrados no departamento de patologia da LNRCC. Foram no total de 534 pacientes, selecionados para a análise epidemiológica dessa amostra.. 24.

(26) 4.7 Variáveis Clínico-Patológicas Foram analisadas as seguintes variáveis clínico-patológicas, coletadas em formulário específico (Apêndice A): idade, sexo, raça, tabagismo, etilismo, história familiar, apresentação clínica do tumor, localização do tumor, grau de diferenciação, estadiamento cirúrgico pelo TNM e Dukes Modificado, tratamento e evolução do paciente. A variável idade foi numérica, mas demais variáveis foram categorizadas, como o sexo em masculino e feminino, raça em branco, pardo e negro, tumor primário com a localização do tumor em ceco, ascendente (tumores de cólon direito foram localizados a partir do apêndice da flexura hepática e cólon transverso), descendente (a partir da flexura esplênica para o cólon sigmoide), junção retossigmoideana e reto. O estadiamento cirúrgico CCR foi baseado na sétima edição do American Joint Committee on Cancer (AJCC) e pela União Internacional Contra o Câncer (UICC) através do manual de estadiamento do câncer. Para a análise, os estágios 3 e 4 foram considerados de “alto risco”; já os estágios 1 e 2 foram considerados “de baixo risco”. No estadiamento, pelo critério de Dukes’ Modificado, foram incluídos no estágio 1 tumores limitados à submucosa; no 2, foram incluídos aqueles que se estendem na muscular própria e serosa; no 3, incluídos aqueles que estão com metástase linfonodal; já no 4, aqueles que se estendem para além do próprio órgão com metástase à distância. Para a análise em Dukes Modificado, também tivemos os estágios 3 e 4 considerados de “alto risco”, e os estágios 1 e 2 considerados “de baixo risco”. Os protocolos de tratamento foram separados em cirurgia; radioterapia; quimioterapia; cirurgia e radioterapia (XRT); cirurgia e quimioterapia (CT); cirurgia, radioterapia e quimioterapia; radioterapia e quimioterapia. Para definir a diferenciação do tumor, cânceres mal diferenciados e indiferenciados foram descritos como aqueles que tiveram nenhum ou <50% da formação glandular, independentemente de uma produção de mucina ou padrão invasivo. Cânceres moderadamente diferenciados tiveram > 50% da região de formação glandular. Já os cânceres bem diferenciados tiveram > 95% formação glandular e nenhum padrão invasivo. Essa formação ocupou totalmente o campo microscópico de uma lente objetiva de 40x. A sobrevida global foi medida a partir do momento do diagnóstico até o final de 60 meses (cinco anos), com dados categorizados da seguinte forma: um “grupo de vivo” (pacientes atualmente livres da doença ou em tratamento); 25.

(27) e um “grupo óbito” que foram todos os pacientes acompanhados de diagnóstico até a morte ou até que os dados foram censurados (ou seja, o paciente não possui mais nenhum tipo de acompanhamento, não se sabendo se está vivo ou já faleceu). 4.8 Método de Coleta de Dados A coleta dos dados foi realizada por pesquisadores treinados, os quais recolheram, analisaram e revisaram as informações escritas nos prontuários. Os números dos prontuários foram selecionados dos bancos de dados do Departamento de Patologia da LNRCC no total de 534 pacientes dentro dos critérios já pré-determinado. Posteriormente, realizou-se busca ativa dos prontuários no arquivo da LNRCC que se encontrava no Hospital Dr. Luiz Antônio (HLA) no período de agosto de 2007 a maio de 2008. A partir dos 534 pacientes, 176 foram excluídos por não possuírem dados clínico-patológicos suficientes nos prontuários, amostras tumorais na patologia e perda de seguimento dos pacientes. Restaram para a pesquisa 358 pacientes, incluídos no estudo das características clínico-patológicas com análise epidemiológica, através das variáveis coletadas, tais como, idade, sexo, raça, tabagismo, etilismo, história familiar, apresentação clínica do tumor, localização do tumor, grau de diferenciação, estadiamento cirúrgico pelo TNM e Dukes’ Modificado, tratamento e evolução do paciente. Essas variáveis foram anotadas em um formulário específico (Apêndice A). Após a fase inicial da coleta dos dados, dentro da amostra dos 358 pacientes, foi realizada nova análise dos blocos e lâminas dos pacientes, a fim de separar as amostras factíveis de realizarem a análise da expressão proteica do câncer colorretal pela técnica de imunohistoquímica. Com isso, foram excluídos 178 pacientes, devido a má conservação dos blocos de parafina e a falta de dados clínico patológicos completos no prontuário. Um total de 180 pacientes foram incluídos no mesmo estudo de prognóstico da expressão de proteínas. As amostras desses pacientes foram rearranjadas em blocos e lâminas pela técnica de Tissue Microarray (TMA) no Departamento de Patologia da Universidade de São Paulo (USP). A nova construção de lâminas e blocos das amostras tumorais foi a base de realização da análise das expressões proteicas da E-caderina, β-catenina, Galectina-3, MMP-2, MMP-9 e VEGF-α.. 26.

(28) MÉTODO Seleção dos pacientes CRC no banco de dados da patologia da LNRCC 1995 - 2005. 534 pacientes. Coleta dos dados nos prontuários no Hospital Dr. Luiz Antonio. Excluídos 178 pacientes. 358 pacientes Avaliação clínico-patológica. Excluídos 176 pacientes. Coletados 180 blocos de parafina do arquivo da patologia LNRCC 2000 a 2005. Avaliação das expressões protéicas através da técnica de imunohistoquímica. TMA. E-caderina, Beta catenina, Galectina-3, MMP-2 e 9 e VEGF alfa. Figura 3 - Fluxograma dos pacientes selecionados para análise clínico-patológica e expressão proteica.. 4.9 Processamento e Análise dos Dados As informações obtidas foram transportadas a uma base de dados nas planilhas do Excel com posterior processamento no SPSS (Stastitical Package for the Social Science) para Windows, versão 16.0.1 (SPSS Inc., Chicago, EUA) e pacotes de software STATA / SE 10.1 (Stata Corp., Texas, EUA). A análise dos dados foi desenvolvida em três etapas distintas. Em um primeiro momento, foi utilizado o teste Qui-quadrado de Person com uma razão de verossimilhança (LR) e Odds Ratio com intervalo de confiança de 95% (IC 95%). Os dados foram calculados, quando apropriado, utilizando o método exato de Fisher para observar as diferenças entre grupos (tabela de contigência). O Segundo momento foi caracterizado pelo uso do teste Qui-quadrado e teste Exato de Fisher na correlação de variáveis de desfecho (TNM, grau de diferenciação, critérios de Dukes’ Modificado e sobrevida global) com a expressão dos referidos marcadores proteicos. Em um último momento, foi utilizado o modelo de sobrevida de Kaplan-Meier no GraphPad Prism (versão 5.0), sendo observados os comportamentos da sobrevida global em 5 anos (60 meses). Foi utilizado o log-rank (Mantel-Cox) para com27.

(29) paração da sobrevida, de acordo com o número de fatores prognósticos presentes. As variáveis categóricas são apresentadas como frequência absolutas ou relativas e percentagem. Em todos os testes, os valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. 4.10 Tissue Microarray (Tma) Amostras de tecido de CCR de arquivo embebido em parafina foram usadas para gerar blocos e lâminas pela técnica tissue microarray (TMA) para posterior análise de imunohistoquímica (IHQ). Áreas de 1 mm de diâmetro foram escolhidas e marcadas com hematoxilina e secções de 4 mm de espessura, com manchas de eosina sob microscopia de luz. Em todos os tumores, foram escolhidas as áreas invasivas com vários graus de diferenciação. Vastas áreas homogêneas (compatível com atipia celular e pobre diferenciação) foram preferidas. Para evitar a contaminação, as áreas de pelo menos 2 mm, a partir de tecido normal ou adenoma, foram escolhidas. Áreas necróticas e autolíticas e áreas ricas em reação estromal foram descartadas. Para os tumores que produziram abundante mucina intracelular ou extracelular, as áreas invasivas com o maior número de células epiteliais foram escolhidas. Um cilindro de diâmetro de 1 mm foi cortado com um instrumento TMA (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, EUA) e incorporado em um novo bloco de parafina e seccionados em secções cilíndricas. A lâmina foi realizada por secções de 4 micrômetros e montada em Chem Mate ™ Capilar Gap Mais Slides (Grey) (Chem Mate®; Dako). Mucosa colorretal normal também foi marcada pelo patologista e obtida apartir de áreas com 2 mm de distância de tumores adjacentes. Para obter mucosa suficiente para a TMA, tangencialmente áreas cortadas foram descartadas. A preparação de blocos para TMA foi realizada no laboratório de Patologia da Faculdade de Medicina da USP, São Paulo, Brasil.. 28.

(30) Figura 4. Visão geral sobre as técnicas para a construção de matrizes de tecido. (A-C) Tissue Microarray: bloco de parafina com uma pequena biópsia (A). Bloco de parafina com o tumor de um espécime de ressecção: o bloco de parafina pode ser riscado para obter vários pequenos fragmentos de tumor de uma secção (B). Secções de oito amostras diferentes são dispostas sobre uma lâmina para criar um macroarranjo tecidual (C). (D) A tissue microarray com 561 biópsias de tecidos (controle numérico de computador do bloco receptor pré-perfurados, implantados manualmente biópsias de tecidos de parafina 0,6 milímetros de diâmetro). (E) Hastes de tecido cortado com uma lâmina de barbear como material para a construção de TMA. (F) Punch de tecidos de parafina (1 mm de diâmetro, Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI, EUA), com um core biópsia de tecido de parafina saliente na ponta. (G) secção de parafina grossa (100 mm) sendo cortado em micrótomo rotativo como material para a construção de TMA. (H) Hastes de tecido num aço rotina incorporação de molde a ser vertida com parafina para obter camadas de tecido de parafina, que podem ser empilhadas para produzir um TMA. Biópsias (I) Núcleo de parafina de tecido sobre uma fita adesiva de face dupla, que está montada sobre um filme de raios-x de rotina colocada num molde de aço de embutir padrão. (J) Muitas seções de parafina espessa diferentes são empilhadas para criar uma TMA parafina. (K) O bloco receptor CNC pré-perfurado tornar-se-á um TMA parafina (completamente cheia em D). (L) Um bloco parafinado (a) agar pré-perfurado incorporado em um bloco de parafina padrão funcionar como corpo de estabilização. Fonte: Vogel, UF, 2014.. 4.11 Imunohistoquímica Para análise imunohistoquímica, 3 µm de espessura de secção foram montadas em lâminas de vidro previamente preparadas com o adesivo organosilano (3-aminopropiltritoxisilano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) e foram submetidas ao método da estreptavidina-biotina. Os cortes histológicos foram despa29.

(31) rafinados em xilol e reidratados em uma série de banhos de álcool. As secções foram, então, submetidas à recuperação de antigênicos e bloqueio de peroxidase endógena com 10 volumes de peróxido de hidrogênio. Depois, lavou-se em água e foram incubados com tampão Tris-HCl (pH 7,4) durante 10 min. Em seguida, as secções foram incubadas com anticorpos primários (Apêndice B), os quais tinham sido diluídos em 1% de albumina sérica bovina (BSA) / tampão Tris-HCl (pH 7,4) durante à noite (cerca de 16h) a 4°C. As reações foram reveladas com 0,03% de diaminobenzidine (DAB), e as lâminas foram contrastadas com hematoxilina de Mayer durante 10 min. Finalmente, os cortes foram desidratados em álcool e apuradas em xilol para montagem em resina Permount (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, EUA), sob uma lamela. Secções de fígado e rim foram usadas como controles positivos para a E-caderina, β-catenina, galectina-3, MMP-2, MMP-9 e VEGF α. Para controles negativos, as amostras foram tratadas como descrito acima, exceto o anticorpo primário, que foi substituído com uma solução de BSA numa solução salina tamponada com fosfato (PBS). A semi-quantificação da imunohistoquímica E-caderina, β-catenina, galectina-3, MMP-2, MMP-9 e VEGF α nas expressões no tecido do tumor e no tecido do estroma circundante foram avaliados de forma independentes por dois observadores (RA e CR) que estavam cegos aos dados clínicos. As expressões foram ponderadas de acordo com a percentagem de expressão na área total do tumor. A coloração citoplasmática foi classificada em duas categorias: “1” – “fraco”: sem coloração ou coloração que foi <10% do total da amostra detectável ou até 25% da amostra detectável; “2” – “forte”: a coloração que foi entre 25% e 75% da amostra total ou a coloração que era >75% da amostra total. Este sistema de classificação foi adotado para todos os cálculos estatísticos. Avaliação semiquantitativa das lâminas de TMAs foi realizada com um microscópio de luz Nikon com uma ampliação de 40x, sem o conhecimento associado do grau do tumor, estágio ou evolução clínica.. 30.

(32) 5 ARTIGOS 5.1 Lifestyle and Family History Influence Cancer Prognosis in Brazilian (Publicado) O Artigo foi publicado no periódico Pathology – Research and practive. 2013 Dec; 209(12): 753-757. ISSN 0344-0338, que possui fator de impacto 1.258, Qualis B2 da Capes para Área Medicina III. 5.2 Prognostic and Diagnostic Implications of Mmp-2, Mmp-9, and Vegf-Α Expressions in Colorectal Cancer (Publicado) O Artigo foi publicado no periódico Pathology – Research and practive. 2015 Jan; 211(1): 71-7. ISSN 0344-0338, que possui fator de impacto 1.258, Qualis B2 da Capes para Área de Medicina III. 5.3 Clinicopathological and Prognostic Significance of E-Cadherin, Β-Catenin, Galectin-3 Expression in Colorectal Cancer Progression (Submissão) O Artigo foi aceito para publicação no periódico Annals of Human Biology. ISSN 0301-4460, que possui fator de impacto 1.273, Qualis BI da Capes para Área de Medicina III.. 31.

(33) Pathology – Research and Practice 209 (2013) 753–757. Contents lists available at ScienceDirect. Pathology – Research and Practice journal homepage: www.elsevier.com/locate/prp. Original Article. Lifestyle and family history influence cancer prognosis in Brazilian individuals Raimundo F. Araújo Jr. a,b,c,∗ , George A. Lira b,e , Hugo G. Guedes c , Marília A. Cardoso c , Francisco J. Cavalcante c , Ana Lucia M. Araújo d , Carlos César O. Ramos e , Aurigena Antunes de Araújo f,g a. Post Graduation Program in Functional and Structural Biology, UFRN, Natal, RN, Brazil Post Graduation Program Health Science, UFRN, Natal, RN, Brazil Department of Morphology, UFRN, Natal, RN, Brazil d Clinical Decision Unit, Department of Acute Medicine, St Thomas’s Hospital, Westminster Bridge Road, SE1 7EH London, England, United Kingdom e Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal, RN, Brazil f Postgraduation Program in Public Health, UFRN, Natal, RN, Brazil g Postgraduation Program in Pharmaceutical Science, UFRN Natal, RN, Brazil b c. a r t i c l e. i n f o. Article history: Received 19 March 2013 Received in revised form 12 July 2013 Accepted 7 August 2013 Keywords: Colorectal cancer Brazil Survival Neoplasm by site Public health. a b s t r a c t The aim of this research was to study prognostic parameters of CRC by analyzing clinical and pathological variables associated with cancer patients at a northeastern Brazilian Hospital. This was a retrospective study evaluating CRC-diagnosed patients across a 10-year period (1995–2005) at Dr. Luiz Antônio Hospital in Natal, RN, Brazil. Data were collected from patients’ medical files. A total of 358 patients were included over the 10-year period. The average age at diagnosis was 58.8 years (S.D. = 15.26), 48.3% of the patients were males and 51.7% were females. Alcohol consumption significantly increased the chance of dying (p < 0.023) from colorectal cancer; this increased risk of death was approximately 71%, compared to 52.2% of the non-alcoholics. In addition, tobacco increased the chance of developing high TNM stage tumors (level III, IV; p < 0.001). Another risk factor for increased mortality was a family history for colorectal cancer (p < 0.002). Our analysis found that patients with an unhealthy lifestyle and/or family history of colorectal cancer were more likely to develop advanced stage colorectal cancer and to have a poor disease prognosis compared to patients with healthy lifestyle and/or sporadic colorectal cancer. These data suggest that a mass screening program should be implemented in northeastern Brazil in order to better prevent and treat colorectal cancer. © 2013 Elsevier GmbH. All rights reserved.. Introduction Excluding non-melanoma skin tumors, male cancer of the colon and rectum is the second most common cancer in the southeast of Brazil (22/100 000) and third in the southern region (18/100 000) and mid-western region (14/100 000). It ranks fourth in the north of Brazil (4/100 000), and fifth in the northeastern region (5/100 000). For females, cancer of the colon and rectum is the second most frequent tumor in the southeastern (23/100 000) and southern region (20/100 000). It comes third in the Midwest (15/100 000) and Northeast (7/100 000), and it is sixth in northern Brazil (5/100 000) [1]. In a northeastern city, Fortaleza/Ceará State, 1019 new cases. ∗ Corresponding author at: Post Graduation Program in Functional and Structural Biology, UFRN, Natal, RN, Brazil. E-mail address: aurigena@ufrnet.br (R.F. Araújo Jr.).. were diagnosed from 1990 to 1999 (475 male/544 female). The mean age-specific colorectal cancer incidence rates for 1990 to 1999 show that the disease incidence begins to appear in the 50–59-year-old age group in both genders in Fortaleza [2]. The American Cancer Society has a pre-established screening for colorectal cancer that basically recommends colonoscopy every 10 years or early fecal blood test or/plus flexible sigmoidoscopy every 5 years, and to begin screening at 50 years of age or more younger if there is a familial risk factor [3]. Cigarette smoking causes many non-pulmonary cancers, including those of the oral cavity, pancreas, and kidney. However, the association between smoking and CRC remains controversial. While many early studies failed to find a relationship between cigarette use age and CRC, research published after 1970 supports an association between these variables. One explanation for the discrepancy between the findings may be the 35- to 40-year lag time between exposure and disease, which would not have been. 0344-0338/$ – see front matter © 2013 Elsevier GmbH. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.prp.2013.08.007. 32.

(34) 754. R.F. Araújo Jr. et al. / Pathology – Research and Practice 209 (2013) 753–757. captured by earlier studies or those with short-term follow up. Irrespective of this, neither the International Agency for Research on Cancer (IARC) nor the U.S. Surgeon General recognizes smoking as a risk factor for CRC [4]. Nevertheless, smoking may alter gene expression, which may then influence one’s health. For example, tobacco smoke contains various types of carcinogens, such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), heterocyclic amines, aromatic amines, and N-nitrosamines. Each of these carcinogens requires metabolic activation and detoxification by different enzymatic pathways, including cytochrome P-450 (CYP), glutathione-S-transferase (GSTs), and NAD(P)H:quinoneoxidoreductase 1 (NQO1). CYP1A1 is a phase I, predominantly extrahepatic, microsomal enzyme involved in the bioactivation of PAHs, including benzo(a)pyrene. Two functional CYP1A1 polymorphisms are known; CYP1A1*2A and CYP1A1*2C. Importantly, both of these normal genes have been associated with a risk for colorectal cancer [5]. Ever-smokers were at a moderately increased risk for incident colorectal cancer as compared with never-smokers. Higher risk estimates were observed for current smokers with microsatellite instability (MSI)-high tumors, CpG island methylator phenotype (CIMP)-positive tumors, and BRAF mutation-positive tumors. Other smoking-related variables (ie, age at initiation, total duration, average number of cigarettes smoked per day, cumulative pack-years, and induction period) were also associated with MSI-high, CIMPpositive, and BRAF mutation-positive tumor subtypes [6,7]. Global DNA hypomethylation can be measured indirectly by assessing the methylation status of long interspersed nucleotide element-1 (LINE-1) repeat sequences, and the degree of LINE-1 hypomethylation has been recognized as an independent factor for increased cancer-related mortality and overall mortality in CRC patients [8]. In addition to smoking, chronic alcohol consumption is a risk factor for cancer of the oropharynx, hypopharynx, larynx, esophagus, liver, colorectum, and breast [9]. According to a World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research review [4], consuming more than 30 g/day of ethanol from alcoholic drinks places males at a “convincing” risk for colorectal cancer and females at a “probable” risk for the disease. There are several possible carcinogenic actions of alcohol, and one mechanism of action may be through rectal changes. Alcohol can potentially induce folate deficiency in the colon and rectum by causing folate malabsorption or inhibiting critical enzymes. Intestinal bacteria with high alcohol dehydrogenase activity are able to oxidize ethanol in the colon; however, the activity produces substantial levels of acetaldehyde [10]. In rats, concomitant ethanol administration in a liquid diet promotes rectal carcinogenesis, which is induced by 1,2-dimethylhydrazine, 10-azoxymethane, and azoxymethylmethylnitrosamine (AMMN). Since ethanol causes AMMN-induced rectal carcinogenesis, and this effect does not require metabolic activation, it is postulated that local, not systemic, ethanol effects may contribute to carcinogenic effects in the rectum [11]. In addition, alcohol may suppress tumor immune surveillance, affect DNA repair, alter the composition of bile acids, or induce the expression of liver cytochrome P-450 enzymes, which may consequently activate other carcinogens [12]. Length of alcohol exposure is also an important variable. For example, heavy drinking causes increased rectal mucosa cell proliferation, as shown by increased detection of different proliferation markers, such as PCNA and Ki67. In humans, chronic alcohol abuse leads to rectal mucosal hyperproliferation, a condition associated with increased cancer risk [13]. Alcohol consumption increases colorectal cancer risk, likely through its anti-folate effects [14]. Folic acid and related B vitamins are essential for DNA methylation. Several studies indicate a relation between global DNA hypomethylation and chromosomal instability (CIN) in tumor cells [15,16].. Family history is an independent risk factor for developing colorectal cancer. People with a family history of CRC are 2.3 to 4.3 times more likely to develop CRC than those without it, depending on the number, relation, and the age of onset of the relative(s) with cancer [17]. People whose relatives have early-onset CRC (diagnosed before age 50) have a higher risk than those with relatives diagnosed later in life [18]. A potential mechanism of familial clustering of CRC may be heritable predisposition to epigenomic instability and the development of tumors with hypomethylation in long interspersed nucleotide element 1 (LINE-1) [19]. Improving access to appropriate services is crucial to reducing colorectal cancer mortality, and should be given priority by all levels of the service-primary care, hospital Trusts, and Cancer Networks in all world. The NHS Bowel Cancer Program (London, UK) reduced deaths from colorectal cancer. This program has three main strands: the development of a national screening program, streamlining care for symptomatic patients, and improving treatment. This will be underpinned by expansion and modernization of endoscopy services and a communications strategy for patients and professionals. Research centers, universities and hospitals have played an important role in the implementation of population screening for colorectal cancer, with improvements in the European health population [20]. Despite the growing research investigating the effects of smoking, alcohol, and family history on CRC, data relating to the prevalence of the disease in northeast Brazil remain scarce. An efficient screening method for CRC is still needed in Brazil in order to enhance diagnosis and prognosis of the disease for patients. The aim of this study was to identify the clinical and pathological features of CRC from hospital records in Brazil.. Methods We conducted a retrospective study of all patients diagnosed with CRC at Dr. LuizAntônio Hospital in Natal, RN, Brazil. Between 1995 − 2005, 534 cases of colorectal cancer were documented at this Hospital. Documented cases were found by searching for colorectal cancer in endoscopy reports, and then medical files and imaging reports were reviewed for each of these cases. Patient records with incomplete information were excluded from the study, which left 358 CRC documents for analysis. We evaluated numerous patients’ variables including age, sex, history of smoking or alcohol consumption, and the relevant past or current family history. In addition, we used pathology reports and medical records to assess tumor location, differentiated tumor differentiation grade, TNM stage, treatment protocol, and evolution of the disease following five years of treatment. Tumor location was categorized as right colon and/or left colon. Right colon tumors were of the appendix extending to the hepatic flexure and transverse colon, whereas left colon tumors were of the splenic flexure extending to the sigmoid colon and rectum. Treatment protocols were separated into surgery, radiotherapy (XRT), and/or chemotherapy (CT). Regarding the evolution of the disease, data were categorized into either a living group (patients currently free from disease or in treatment) or a deceased group. Tumor staging was based on the Seventh Edition of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual. For analysis, III and IV stage were considered High Stage and I and II stage were considered Low Stage. In tumor differentiation, the poorly differentiated and undifferentiated components were defined as a region in which a cancer has no or <50% glandular formation, irrespective of a mucin-producing or invasive pattern. The welldifferentiated component was defined as a region in which a cancer has >95% glandular formation, and no invasive pattern fully occupied the microscopic field of a 40× objective lens and medium. 33.

(35) 755. R.F. Araújo Jr. et al. / Pathology – Research and Practice 209 (2013) 753–757 Table 1 Descriptive Data. Variable. %. N. Sex Male Female Race White Mixed Black Alcoholism Yes No Smoking Yes No Family history of colorectal cancer Yes No Primary tumor site Right colon Left colon Rectum. 173 185. 48.3 51.7. 73 207 2. 25.9 73.4 0.7. 130 161. 44.7 55.3. 163 117. 58.2 41.8. 63 55. 53.4 46.6. 58 54 218. 17.6 16.4 66.1. differentiated component as a >50% glandular formation region [21]. The chi-square and Fisher’s exact tests were used for subgroup analyses of clinical-pathological features in patients: patients under 50 years of age were compared with those above 50 years of age. Statistical significance was determined by a p value of <0.05. The Departmental Ethics Committee of Dr. LuizAntônio Hospital approved this project (024/0030/06).. Results A total of 534 patients were diagnosed with CRC over the 10year period between 1995 − 2005. Of these patients, 185 subjects were excluded due to incomplete data; therefore, 358 patients were included in this analysis. Table 1 presents descriptive measures from the data. The average age at diagnosis was 58.84 years (S.D. = 15.26, Med: 60 years) with a minimum age of 15 and maximum age of 101 years. Males represented 48.3% of the patients, and females 51.7%. Forty-two patients (37%) were 50 years of age or younger. The most common clinical presentation was abdominal pain (n = 77; 68%) followed by rectal bleeding (62%), weight loss (55%), constipation (50%), melena (14%), and fever and anemia (6%). Sixty-five patients (53.4%) had a family history of colon cancer. Other descriptive data are given in Table 1. Similar to alcohol, smoking increased the chance for developing stage III and IV tumors; however, tobacco did not significantly interfere with overall mortality (Table 2). Interestingly, due to the strong association between alcohol consumption and smoking. Variable Differentiation grade Well Medium Undifferentiated TNM 1 2 3 4 Treatment Radiotherapy (XRT) Chemotherapy (CT) Surgery XRT + CT XRT + Surgery CT + Surgery XRT + CT + Surgery Death Yes No. n. %. 27 289 37. 7.6 81.9 10.5. 28 110 107 113. 7.8 30.7 29.9 31.6. 17 21 33 26 35 125 98. 4.8 5.9 9.3 7.3 9.9 35.2 27.6. 106 252. 29.6 70.4. (f < 0.001; Odds ratio = 6.918. 95% CI: 3.837–12.475), we conducted a follow-up multivariate regression analysis, which revealed that only smoking was independently related to higher stage tumors (p = 0.002. Odds ratio = 2.461. 95% CI: 1.409–4.298).. Discussion This study found that three independent risk factors influenced CRC outcomes: smoking, alcohol consumption, and family history. Specifically, smoking increased the TNM stage of cancer to a III and IV level, and both alcohol consumption and family history increased the risk for death in CRC patients. Recent evidence supports our finding that smoking is associated with CRC. In fact, smoking history may be a particularly important risk factor for the CRC subtype characterized by microsatellite instability [22], and by CpG island methylatorphenoptype (CIMP) status and BRAF mutations [23]. Smoking-related risk may pertain to specific molecularly defined colorectal cancer subtypes that develop through epigenetically mediated carcinogenic pathways [6]. Therefore, these data suggest that smoking may be primarily associated with a CRC subtype characterized by a pathway involving hyperplastic (serrated) polyps, BRAF mutations, and positive CIMP status [15]. Colorectal cancer is a complex disease resulting from somatic genetic and epigenetic alterations, including locus-specific CpG island methylation and global DNA or long interspersed nucleotide element-1 (LINE-1) hypomethylation (b). The association between LINE-1 hypomethylation and colon cancer-specific mortality has. Table 2 Statistical results. TNM. Death a. High stage (%) Alcoholism Yes No Smoking Yes No Family history of colorectal cancer Yes No. p. OR (IC 95%). p = 0.001. OR: 2.22 (1.36–3.62). 92 (70.8) 84 (52.2) p < 0.001 115 (70.6) 55 (47.0) p = 0.430 40 (63.5) 31 (56.4). OR: 2.70 (1.65–4.43). Yes (%). p. OR (IC 95%). p = 0.034. OR: 1.71 (1.04–2.82). p = 0.407. –. p = 0.002. 3.833 (1.60–9.16). 49 (37.7) 42 (26.1) 55 (33.7) 34 (29.1). – 27 (42.9) 9 (16.4). “p”=Chi-square test. a High stage = III and IV TNM staging.. 34.