UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RENORBIO
KICIA KARINNE PEREIRA GOMES COPELAND
CALOGÊNESE E USO DE FATORES ABIÓTICOS E BIÓTICOS NA
PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA CATINGUEIRA
(Poincianella pyramidalis Tul.)
Salvador - BA
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RENORBIO
KICIA KARINNE PEREIRA GOMES COPELAND
CALOGÊNESE E USO DE FATORES ABIÓTICOS E BIÓTICOS NA
PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA CATINGUEIRA
(Poincianella pyramidalis Tul.)
Salvador - BA 2015
KICIA KARINNE PEREIRA GOMES COPELAND
CALOGÊNESE E USO DE FATORES ABIÓTICOS E BIÓTICOS NA
PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA CATINGUEIRA
(Poincianella pyramidalis Tul.)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO, Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia.
Orientadora: Dra. Juceni Pereira de Lima David Coorientadora: Dra. Ana da Silva Lédo
Salvador - BA 2015
Dedico este trabalho à minha família, em especial meu filho e marido, Davi e Klésio Copeland.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer ao Deus todo poderoso, por sempre se manter presente de diversas formas em minha vida, me dando força, coragem e paciência para seguir toda essa carreira acadêmica. Obrigada Senhor.
Aos meus pais, que sempre se fizeram presentes nos momentos em que eu precisava me ausentar, devido aos deveres acadêmicos, e que nunca se opuseram em não me ajudar, me davam segurança e tranquilidade, pois cuidavam, nessas minhas ausências, sempre com muito amor, do meu bem mais precioso, meu filho Davi. Sei que sem vocês, essa caminhada seria mais difícil.
Ao meu marido Klésio Copeland, pelo amor, companheirismo, parceria e cumplicidade, sempre tão presente em minhas caminhadas, torcendo muito por essa conquista, hoje, mais uma etapa dessa minha vida acadêmica concluída, e eu tenho a certeza, do quão feliz você está, porque sabe da minha felicidade com a conclusão desse sonho, te amo muito.
E sem falar no grande amor da minha vida, meu Davi, meu filho, minha luz, minha realização, fez esse meu doutorado ser mais suave e divertido. Amo você meu filho incondicionalmente.
À minha orientadora, Juceni David, por desde o primeiro contato acreditar em mim, e, pela confiança no trabalho desenvolvido. Obrigada Ju!
A todos do laboratório de cultura de tecidos de plantas (LabCult) pela alegria diária. Aos meus amigos mais que especiais, Caroline Machado, Inácio Roque, Leila Albuquerque, Aparecida Araújo e Bruno Cardoso pelo convívio diário, pelo companheirismo, união, risadas e risadas, palavras de conforto e força. Muito grata a Deus pela amizade de vocês. Obrigada e obrigada por tudo.
À Dra. Ana Lédo, pela confiança e carinho desde a minha iniciação científica, obrigada pelos conhecimentos adquiridos através da sua competência e dedicação no que faz.
À Dra. Ana Veruska, pelo apoio na estrutura física e elaboração do experimento de variabilidade genética. Bem como, ao técnico de laboratório Sílvio Gomes e a mestranda Marina da Vitória.
Às amizades que construí durante o doutorado, Luzia Tabosa, Karen Letícia, Daniela Castro.
Ao Prof. Jorge David pela disponibilidade do laboratório de Química, e aos doutores Darlan Santos e Rauldenis Almeida, pela ajuda na realização das análises químicas na UFBA.
Ao pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Dr. José Sá, ao técnico agrícola Paulo Sérgio e ao analista José Figueroa pela ajuda na concessão do material vegetal.
À Embrapa Tabuleiros Costeiros por dispor de uma excelente estrutura física.
À Universidade Federal da Bahia e a Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), pela oportunidade da realização deste doutorado.
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.
E por fim, gostaria de agradecer a aqueles que não participaram desse caminho acadêmico, mas que mesmo de fora, sem entender esse processo, torceram muito por mim. Obrigada pelo carinho.
GOMES-COPELAND, Kicia Karinne Pereira. Calogênese e uso de fatores abióticos e bióticos na produção e metabólitos secundários da Catingueira (Poincianella pyramidalis Tul.). 80 f.: il. 2015. Tese (Doutorado). Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2015.
RESUMO
A Caatinga a alguns anos atrás era dita como um ecossistema pobre no que tange a espécies endêmicas, fato esse que, após diversos estudos, são contestados, mostrando que possui uma rica biodiversidade e altos índices de endemismos. Dentre essas muitas espécies endêmicas, temos a Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz, sinônimo botânico Caesalpinia
pyramidalis Tul., conhecida por diversos nomes populares como pau-de-rato, catinga de porco,
catingueira, dentre outros. Apresenta diversos usos, dentre um dos mais importantes, o seu uso medicinal que, destaca-se pela produção de compostos bioativos como flavonoides, triterpenos, fenilpropanoides e biflavonóides; sendo este último grupo de bioativos, relativamente raro na família Leguminosae e, na subfamília Caesalpinaceae, onde foi isolado pela primeira vez. No perfil químico dessa espécie já foram identificadas a amentoflavona e agatisflavona pertencentes à classe dos biflavonóides. Fatores tais como, condições geográficas, sazonalidade, ambiente, entre outros, provocam oscilação na concentração de metabólitos secundários e, em árvores da Caatinga, em períodos de seca, a coleta do material vegetal é prejudicada, uma vez que não há frutos, folhas, flores, para extração de metabólitos secundários em qualquer época do ano. Assim, esses aspectos demonstram a necessidade urgente de implementação de programas voltados para a multiplicação, conservação, produção e potencialização dos bioativos de interesse de espécies vivendo nesses ambientes. Diante do exposto, esse trabalho teve como objetivos estabelecer a calogênese in vitro de P. pyramidalis visando construir um protocolo de produção da amentoflavona e agatisflavona, bem como, testar diferentes tipos de fontes de carbono, ausência/presença de luz, acessos e, diferentes concentrações de 2,4-D combinados ao meio de cultivo, no intuito de aumentar a produção de amentoflavona e agatisflavona a partir de cultura de calos de P. pyramidalis. Os estudos mostraram que o 2,4-diclorofenoxiacético induz calos em explantes nodal, foliar e internodal de P. pyramidalis e, que concentrações de 6,28 mg.L-1, 6,49 mg.L-1 e 4,91 mg.L-1 de 2,4-D nos segmentos nodal, internodal e foliar, respectivamente, favorecem a maior formação de calos aos 30 dias. Além disso, pode-se verificar que concentração de 10 mg.L-1 de 2,4-D proporciona
maior oxidação nos calos aos 30 dias de cultivo, sendo que a maior formação de calos ocorre na concentração de 4,91 mg.L-1 de 2,4-D para o explante foliar aos 30 dias de cultivo in vitro. O acesso de Pernambuco, produz uma maior biomassa (0,1882 g) dos calos de Catingueira. No entanto, em ambos os acessos (BA e PE), a produção de amentoflavona é maior do que da agatisflavona em todos os tratamentos. Pode-se ainda verificar que a maior biomassa em calos de P. pyramidalis ocorre no tratamento com sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D e, que o período de tempo de 60 dias é ideal para a produção da biomassa em calos de P. Pyramidalis; sendo que Sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D favorece uma maior produção de amentoflavona (16,44 mg.L-1) e agatisflavona (0,58 mg.L-1). Enquanto que, o tratamento GT3 (Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D) é ótimo para a biossíntese de agatisflavona (5,87 mg.L-1) e amentoflavona (6,27 mg.L-1) aos 70 dias após inoculação. A biossíntese da amentoflavona é superior a agatisflavona em todos os tratamentos estudados.
Palavras-Chave: Poincianella pyramidalis, cultura de tecidos, metabólitos secundários, amentoflavona, agatisflavona, variabilidade genética.
GOMES-COPELAND, Kicia Karinne Pereira. Callus formation and use of abiotic and biotic factors in production of Catingueira secondary metabolites (Poincianella pyramidalis Tul.). 80 f.: il. 2015. Thesis (Ph.D.). Institute of Health Sciences, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2015.
ABSTRACT
A few years ago, the caatinga was said to be a poor ecosystem with respect to endemic species, a fact that, after several studies, are contested showing that boasts a rich biodiversity and high levels of endemism. Among these many endemic species, Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz, botanical synonymous Caesalpinia pyramidalis Tul., known by several common names as pau-de-rato, catinga de porco, catingueira, among others. This specie has several uses, among the most important, its medicinal use that stands out for the production of bioactive compounds such as flavonoids, triterpenes, phenylpropanoids and bioflavonoids. The latter bioactive group is relatively rare in the Leguminosae family and the subfamily Caesalpinaceae, which was first isolated. In the chemical profile of this specie have been identified amentoflavone and agatisflavone, compounds belonging to the biflavonoid groups. Among other factors, geographical conditions, seasonality, environment cause during dry periods, fluctuation in the concentration of secondary metabolites in the Caatinga trees, and, the collection of plant material is impaired, since there is no fruit, leaves and flowers for extraction of secondary metabolites in any season. These aspects demonstrate the urgent need for implementation of programs for multiplication, conservation, production and enhancement of bioactive interest species living in these environments. Thus, this study aimed to establish the
in vitro callus formation of P. pyramidalis in order to build a protocol of amentoflavone and
agatisflavone, productions as well as to test different types of carbon sources, absence/presence of light, access and different 2,4-D concentrations to the culture medium combinations to increase the production of amentoflavone and agatisflavone from culture of callus of P.
pyramidalis. The studies showed that 2,4-dichlorophenoxyacetic induces callus of P. pyramidalis nodal, leaf and internodal explants, and that 2,4-D concentrations of 6.28 mg.L-1, 6.49 mg.L-1 and 4.91 mg.L-1, in the nodal, internodal and leaf segments, respectively, favor higher callus formation at 30 days. Moreover, it can be seen that 2,4-D concentration of 10 mg.L-1 provides increased oxidation in callus after 30 days of cultivation, and the higher callus formation occurs at a 2,4-D concentration of 4.91 mg.L-1 to the leaf explant at 30 days of in
vitro culture. The Pernambuco access produces a greater biomass (0.1882 g) of Catingueira
calluses. However, in both access (BA and PE), the production of amentoflavone is greater than the agatisflavona in all treatments. It´s also observed that the higher biomass in P. pyramidalis callus occurs upon treatment with sucrose + 2,4-D 5 mg.L-1, and the 60 day time period is optimal for biomass production in P. Pyramidalis calluses; wherein Sucrose + 2,4-D 5 mg.L-1 favors an increased production of amentoflavone (16.44 mg.L-1) and agatisflavone (0.58 mg.L -1). While the GT3 treatment (Light - Glucose 30 mg.L-1 + 2,4-D 1 mg.L-1) is great for agatisflavona biosynthesis (5.87 mg.L-1) and amentoflavone (6,27 mg.L-1) at 70 days after inoculation. The biosynthesis of amentoflavone is greater than agatisflavone in all treatments.
Keywords: Poincianella pyramidalis, tissue culture, secondary metabolites, amentoflavone, agatisflavone, genetic variability.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição geográfica do bioma Caatinga. IBGE,
2004...6 Figura 2: Fotos da árvore da Poincianella pyramidalis, nos períodos chuvosos e de estiagem. Foto: belezadacaatinga.blogspot.com, 2015...8 Figura 3: Fotos das folhas, frutos e flores da P. pyramidalis. Foto: belezadacaatinga.blogspot.com, 2015...9 Figura 4: Forma explorada comercialmente da P. pyramidalis para fins medicinais, no
Mercado Municipal Albano Franco, Aracaju, SE. Foto: Kicia Gomes-Copeland...10 Figura 5: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários...14 Figura 6: Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários. Fonte: Gobbo Meto Lopes (2007)...21 Figura 7: Oxidação de calos em explantes nodal, internodal e foliar de P. pyramidalis aos
30 (A) e 60 (B) dias após inoculação...34 Figura 8: (A) Aspecto de formação de calo compacto com poucas áreas friáveis de P.
pyramidalis aos 60 dias de cultivo in vitro. (Barra=0,5cm); (B) Micrografia
eletrônica de varredura mostrando calo de P. pyramidalis. Barras (Barra= 100 µm). Fotos: Kicia Gomes-Copeland (A), Caroline Machado (B)...36 Figura 9: Porcentagem de explantes nodal, internodal e foliar de Poincianella
pyramidalis, responsivos à indução de calos em função da concentração de
2,4-D aos 30 (A) e 60 (B) dias após inoculação...37 Figura 10: Notas de intensidade de formação de calos nos explantes nodal, internodal e
foliar de P. pyramidalis aos 30 (A) e 60 (B) dias...38 Figura 11: Produção de massa fresca dos calos em explantes foliares de P. pyramidalis em
função de diferentes concentrações de 2,4-D...41 Figura 12: Massa fresca dos calos em explantes foliares de P. pyramidalis oriundos de dois acessos, Jeremoabo, Bahia e Petrolina, Pernambuco...42 Figura 13: Produção de amentoflavona e agatisflavona em cultura de calos de P.
pyramidalis, aos 60 dias após inoculação, em diferentes concentrações de
Figura 14: Produtos de amplificação de ISSR gerados em indivíduos de P. pyramidalis de ocorrência nos municípios de Jeremoabo, Bahia e Petrolina, Pernambuco...45 Figura 15: Calos de P. pyramidalis aos 60 dias após inoculação, em seis diferentes
tratamentos: T1 – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T2 – Frutose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D; T3 – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T4 – Glicose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D; T5 – Sacarose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T6 – Sacarose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D. Foto: Kicia Gomes-Copeland...47 Figura 16: Produção de amentoflavona e agatisflavona em cultura de calos de P.
pyramidalis, aos 60 dias após inoculação, com diferentes fontes de carbono e
concentrações de 2,4-D...49 Figura 17: Cromatograma dos padrões da agatisflavona e amentoflavona (A); UV/VIS dos padrões da agatisflavona (B) e amentoflavona (C)...51 Figura 18: Cromatogramas da agatisflavona e amentoflavona e seus respectivos UV/VIS referentes aos tratamentos de glicose + 1 mg.L-1 de 2,4-D (A1 e A2); sacarose + 1 mg.L-1 de 2,4-D (B1 e B2); sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D (C1 e C2)...53 Figura 19: Efeito da glicose e frutose na produção da massa dos calos aos 20, 40 e 60 dias após inoculação da P. pyramidalis. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade...54 Figura 20: Efeito das condições de luminosidade na produção da massa nos calos aos 20, 40 e 60 dias após inoculação de P. pyramidalis. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade...56 Figura 21: Concentrações da agatisflavona nos calos de Poincianella pyramidalis aos 40,
60 e 70 dias após inoculação, submetidos a diferentes tratamentos.
Tratamentos: Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT1); Claro – Glicose 30
g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT3); Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT2);
Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT4)...57
Figura 22: Concentrações da amentoflavona nos calos de Poincianella pyramidalis aos 40, 60 e 70 dias após inoculação, cultivados em diferentes tratamentos.
Tratamentos: Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT1); Claro – Glicose 30
g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT3); Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT2);
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Compostos químicos predominantes na espécie Poincianella pyramidalis encontrados em diferentes partes da planta (Mendes et al., 2000; Bahia et al., 2005; Bahia et al., 2010)...11 Tabela 2: Algumas estratégias para aumentar a produção de metabólitos secundários em células vegetais e cultura de órgãos otimizando o meio de cultura. Fonte: Murthy et al. (2014)...18 Tabela 3: Iniciadores ISSR testados, sendo a base Y (C,T) e R (A, G)...27 Tabela 4: Número de fragmentos gerados pelas reações de ISSR em dois acessos de
Catingueira...45 Tabela 5: Efeito de diferentes fontes de carbono combinados com duas concentrações de 2,4-D na produção de massa em calos de P. pyramidalis. Média seguida de mesma letra minúscula na coluna para tratamentos e, maiúsculas na linha para tempo, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade...48
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2,4-D Ácido 2,4-dicloofenoxiacético AIA Ácido indolácetico
ANA Ácido naftaleno acético MS Murashige & Skoog
ISSR Inter Repetições de Sequências Simples
PCR Polymerase Chain Reaction
CGEN Conselho de Gestão do Patrimônio Genético
HPLC/DAD High Perfomance Liquid Chromatography/Diode-array-detector
UV/VIS Ultravioleta/Visível ANAVA Análise de Variância CV Coeficiente de Variação
RNA Ácido Ribonucleico
DNA Ácido Desoxirribonucleico
GT1 Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D GT3 Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D FT2 Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D FT4 Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 5
2.1 Biotecnologia... 5
2.2 Bioma Caatinga... 6
2.3 Aspectos gerais sobre a espécie Poincianella pyramidalis... 7
2.4 Química do gênero Poincianella... 9
2.5 Uso da cultura de tecidos de plantas na produção de metabólitos secundários 12 2.6 Estratégias aplicadas ao cultivo in vitro de plantas para aumentar a produção dos metabólitos secundários 15 2.7 Biflavonóides na espécie Poincianella pyramidalis... 19
2.8 Fatores que interferem no metabolismo secundário de plantas... 20
2.9 Variabilidade Genética... 22
3 MATERIAL E MÉTODOS... 24
3.1 Material vegetal... 24
3.2 Germinação in vitro das sementes de Poincianella pyramidalis... 24
3.3 Estabelecimento in vitro e calogênese em diferentes explantes de Poincianella pyramidalis 24 3.4 Produção de biflavonóides e de massa dos calos de Poincianella pyramidalis provenientes de regiões do Nordeste Brasileiro 25 3.5 Análise de diversidade genética entre espécies de Poincianella pyramidalis oriundas de duas regiões do Nordeste Brasileiro 25 3.5.1 Material vegetal... 25
3.5.2 Extração de DNA... 26
3.5.3 Quantificação e diluição do DNA... 26
3.5.4 Iniciador e amplificação... 27
3.5.4.1 Inter Sequencias Simples Repetidas (ISSR)... 27
3.5.4.2 Eletroforese, visualização e fotodocumentação dos géis... 27
3.5.4.3 Análise estatística... 28
3.6 Efeito da interação de diferentes carboidratos com 2,4-D para a produção de amentoflavona e agatisflavona em calos de Poincianella pyramidalis 30 3.6.1 Preparação dos extratos de Poincianella pyramidalis provenientes de calos.... 30
3.7 Efeito dos fatores abióticos na produção de biflavonóides e massa dos calos da espécie Poincianella pyramidalis 33 3.8 Análise estatística... 33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 34
4.1 Estabelecimento in vitro e calogênese em diferentes explantes de Poincianella pyramidalis 33 4.2 Produção de biflavonóides e de massa nos calos de Poincianella pyramidalis em duas regiões provenientes do Nordeste Brasileiro 40 4.3 Efeito da interação de diferentes carboidratos com 2,4-D para a produção de amentoflavona e agatisflavona em calos de Poincianella pyramidalis 46 4.4 Efeito dos fatores abióticos na produção de biflavonóides e massa dos calos da espécie Poincianella pyramidalis 55 5 CONCLUSÕES... 60
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 61
1. INTRODUÇÃO GERAL
A caatinga a alguns anos atrás era dita como um ecossistema pobre no que tange a espécies endêmicas. No entanto, diversos estudos contestam esses fatos, mostrando que a Caatinga possui uma rica biodiversidade e altos índices de endemismos, com um mínimo de 318 espécies de plantas endêmicas (Gariglio et al., 2010). Sua biodiversidade ampara várias áreas econômicas, especialmente nos ramos farmacêutico, cosmético, químico e de alimento (MMA, 2014). Dentre essas muitas espécies endêmicas, temos a Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz, sinônimo botânico Caesalpinia pyramidalis Tul., conhecida por diversos nomes populares, tais como, pau-de-rato, catinga de porco, catingueira, dentre outros. Essa espécie tem ocorrência no Maranhão e, do Ceará até a Bahia, com uma disjunção no Estado do Amazonas (Queiroz, 2009), que carece de estudos, uma vez que é uma planta de rápido crescimento, após o período de seca, e com bom potencial de rebrota, tornando-se interessante para a primeira e segunda fase de recomposição florestal mista de área degradada.
Naturalmente essa espécie se propaga por sementes. No entanto, sua população tem sido afetada devido a coleta extrativista inadequada de uso, pois as folhas, flores e cascas do caule são as mais utilizadas no uso medicinal pela população em infecções catarrais, nas diarreias, hepatite e anemias, além do uso da sua madeira para obtenção de lenha e carvão (Queiroz, 2009; Maia, 2012). O uso medicinal destaca-se pela produção de compostos bioativos como flavonóides, triterpenos, fenilpropanóides e biflavonóides, sendo este último grupo de metabólitos especiais, relativamente raro na família Leguminosae e, na subfamília Caesalpinaceae. (Bahia et al., 2005).
Nessa espécie já foram identificadas a amentoflavona e agatisflavona (Bahia, 2005), pertencentes à classe dos biflavonóides. Estas substâncias merecem destaque, em razão dos inúmeros trabalhos científicos que demonstram suas atividades farmacológicas, sendo estas, fortes candidatas para o controle da epilepsia (Svenningsen et al., 2006); atividades antivirais (Lin et al., 1999; Lin et al., 1997); e um grande potencial antineoplásico (Chen et al., 2005; Lin et al., 2000; Silva et al., 1995; Lin et al., 1989).
Sendo uma árvore da Caatinga, a espécie P. pyramidalis perde suas folhas na estação seca, rebrotando apenas no início das chuvas, com floração acontecendo na época de transição seca-chuvosa e chuvosa, seguida pela frutificação, dificultando assim, trabalhos envolvendo a produção de princípios ativos de interesse da indústria farmacêutica (Maia, 2012). Dessa forma, torna-se inviável obter, a qualquer momento, material vegetal dessa espécie para a extração de metabólitos secundários que tenham relevância do ponto de vista terapêutico, uma vez que a
produção de metabólitos especiais realizada pela espécie in natura apresenta diversas desvantagens, tais como, rendimentos baixos e, alterações nas concentrações desses metabólitos devido às variações geográfica, sazonal e ambiental (Murthy et al., 2014).
Diante do exposto, a cultura de tecidos de plantas torna-se uma aliada importante, no que tange a produção de material vegetal em qualquer época do ano, bem como uma possível potencialização dos bioativos ou mesmo, produzir compostos que, por algum impedimento, não são sintetizados. Permitindo ainda, estabelecer protocolos padrão para a multiplicação massal de várias espécies (Morais et al., 2012). Com isso, a produção de metabólitos secundários associada a cultura de tecidos de plantas, vem sendo amplamente estudada (Charlet et al., 2000). Recentemente, essa técnica tem recebido uma maior atenção para a produção de compostos bioativos em plantas específicas, que têm aplicações em produtos farmacêuticos, cosméticos e indústrias de nutracêuticos (Rao e Ravishankar, 2002).
Embora a Catingueira apresente um grande potencial, principalmente, químico e farmacológico, estudos que envolvam morfogênese in vitro de espécies florestais nativas, ainda são escassos (Oliveira et al., 2013). Raros são os relatos sobre P. pyramidalis, sendo mais encontrados trabalhos na literatura para espécies do mesmo gênero, tais como, a Caesalpinia
echinata Lam. (Werner et al., 2007, 2009, 2010; Barbosa et al., 2014), Caesalpinia bonduc (L.)
Roxb (Cheruvathur et al., 2010). A relevância desses aspectos demonstra a necessidade urgente de implementação de programas voltados para a multiplicação, conservação e produção de bioativos dessa espécie.
Dessa forma, para aumentar a produtividade de metabólitos especiais de interesse nos vegetais, são utilizadas diversas estratégias, tais como, melhoramento de cepas, otimização de meios de cultura, nutrientes e precursor de alimentação, permeabilização, imobilização, métodos de biotransformação e elicitores (Murthy et al., 2014). Esta última estratégia citada, vem sendo amplamente usada como uma técnica eficiente para este fim (Bourgaud et al., 2001), pois em paralelo com a cultura de tecidos de plantas, é possível incrementar a produção de metabólitos secundários de interesse agrícola, farmacêutico e alimentar (Qin e Lan, 2004), embora, seus mecanismos de reação de alguns elicitores ainda não sejam muito bem compreendidos (Namdeo, 2007).
Sendo assim, carboidratos e reguladores de crescimento são utilizados como alternativas para aumentar a produção dos metabólitos secundários em cultura de tecidos de plantas e células vegetais in vitro. Partindo do princípio que a modificação dos nutrientes básicos do meio de cultivo, pode elevar a produção desses compostos, então, ao alterar as concentrações e o tipo da fonte de carbono e, reguladores de crescimento, como o ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D), por exemplo, pode-se ter um forte efeito sob o acúmulo desses bioativos na cultura de calos. Em outras palavras, o efeito do açúcar no produto de biossíntese secundária, poderia resultar em uma entrada específica de carbono, ou refletir numa mudança do metabolismo devido a alterações no equilíbrio geral do balanço carbono/nitrogênio, dependendo, evidentemente, do tipo de açúcar utilizado (Ong et al., 2011). E, apesar da sacarose ser o açúcar mais utilizado na cultura de tecidos de plantas, sabe-se que é rapidamente hidrolisado em glicose e frutose, duas hexoses que podem ser adicionadas ao meio de cultivo de calos para que ajam de maneira similar à sacarose, podendo ainda melhorar o desenvolvimento e acúmulo de bioativos nos calos, já que a captação é independente, e não possui qualquer efeito da glicose em relação a frutose e vice-versa (Botha e O´Kennedy, 1998). A biossíntese de Paclitaxel por cultura de células foi melhorada quando se adicionou frutose ao meio (Hirasuna et al., 1996).
Entretanto, a concentração utilizada desses dois açúcares, precisa ser bastante testada e estudada, para saber qual o efeito no tecido da planta, uma vez que pode conduzir a uma acumulação no meio, gerando um desequilíbrio, que pode ser em virtude da incapacidade das células em utilizar eficazmente a frutose, por exemplo (Botha e O´Kennedy, 1998). Mas, embora esses problemas no metabolismo possam ocorrer, ainda assim, o uso desses elicitores pode ser, uma estratégia importante para a melhoria do rendimento da massa dos calos, como também na síntese de metabólitos secundários.
A produção de metabólitos secundários em culturas de calos é controlada por fatores ambientais e de material vegetal. E os reguladores de crescimento, tais como o uso de auxinas, o ácido 2,4-diclorofenoxiacético, por exemplo, é, geralmente, o mais recomendado na indução de calos em tecidos de plantas (George et al., 2008), uma vez que demonstra uma notável influência no crescimento, diferenciação e no metabolismo das células em cultura. Esta por ser uma auxina mais ativa, pode substituir a auxina natural presente nas plantas, o ácido indolacético (AIA) que em meios de cultura é rapidamente oxidado. Pois calos com diferentes taxas de crescimento e níveis de diferenciação (friáveis, compactos) podem diferir na capacidade de sintetizar compostos bioativos (Navroski et al., 2012). De acordo com Chinnamadasamy et al. (2010), com aumento do nível de 2,4-D no meio de cultivo para
Catharanthus roseus L. ocorreu acumulação de vincristina. Com isso, está claro que o efeito
sobre o acúmulo de metabólitos secundários em plantas vai depender do tipo de auxina e das concentrações utilizadas.
É importante salientar que, diante do exposto, essa espécie está sob pressão antrópica e pode se tornar extinta, assim, a P. pyramidalis precisa de um bom programa de conservação da floresta a fim de obter sua proteção genética (Santos et al., 2012), bem como, exploração
racional da espécie. Portanto, conhecer a variabilidade genética dessa planta, pode ser essencial para a sobrevivência a longo prazo, além de ser útil na compreensão da estrutura, relações evolutivas, taxonomia, demografia da espécie além de, identificar características genéticas interessantes para usos futuros. A forma mais utilizada para verificar a distribuição da variabilidade genética em populações naturais, é com o uso de marcadores moleculares. O ISSR (Inter Repetições de Sequências Simples) é um tipo de marcador, que apresenta vantagem em virtude da sua simplicidade, aplicabilidade em um grande número de espécies sem conhecimento prévio das suas sequências de DNA, por permitirem a análise de um grande número de locos e, por fim, produzirem fragmentos com grande reprodutibilidade (Silva et al., 2011).
Assim, esse trabalho teve como objetivos estabelecer a calogênese in vitro de plantas de
Poincianella pyramidalis e, testar diferentes tipos de fontes de carbono, ausência/presença de
luz, acessos e, diferentes concentrações de 2,4-D combinados ao meio de cultivo, no intuito de aumentar a biomassa dos calos e o acúmulo de amentoflavona e agatisflavona.
Palavras-Chave: Poincianella pyramidalis, cultura de tecidos, metabólitos secundários, amentoflavona, agatisflavona, variabilidade genética.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁGICA
2.1. Biotecnologia
O desenvolvimento sustentável de um país depende essencialmente de uma política consistente de educação, ciência, tecnologia e inovação, sustentada na preservação da natureza, na biodiversidade e na exploração racional de fontes naturais necessárias para alimentação, avanço social e econômico, num cenário que assegura a manutenção da saúde e a cura de doenças (Braz Filho, 2010). Ou seja, a necessidade exige e a ciência busca a unificação do progresso com aquilo que a natureza oferece, respeitando a cultura do povo em torno do uso de produtos ou ervas medicinais para curar os males.
Portanto, a biotecnologia surge como uma ferramenta moderna, para promover esses avanços no setor da terapêutica, no aumento da produtividade do setor agrícola, na geração de novas técnicas de controle biológico, além de melhorar o teor nutritivo dos alimentos, dentre outros (MCT, 2009). E essa ferramenta atualmente, é considerada, no Brasil e no cenário mundial, como uma área estratégica para o desenvolvimento econômico de países desenvolvidos e em desenvolvimento. O Brasil identificou a biotecnologia como uma das áreas estratégicas que poderá contribuir para o desenvolvimento tecnológico do País e, consequentemente, o seu bem-estar social e desenvolvimento socioeconômico (Brasil, 2015).
Nesse contexto, as engenharias genética, metabólica e de micropropagação se somam para otimizar a produção de metabólitos secundários. Assim, atualmente, o uso dessas ferramentas citadas torna-se cada vez mais importante no aumento de constituintes ativos tanto na pesquisa como nas indústrias farmacêuticas (Zabala et al., 2009), uma vez que, o mercado de produtos naturais cresce exponencialmente a cada ano. No entanto, apesar dos avanços alcançados na área de biotecnologia vegetal para produção de metabólitos secundários de interesse, infelizmente, as taxas obtidas não atingem a aplicação comercial (Vasconsuelo e Boland, 2007).
Portanto, a biotecnologia na área de produtos naturais, é importante e necessária, haja vista que essa tecnologia poderá trazer uma variedade de produtos farmacêuticos de grande interesse socioeconômico, uma vez que a necessidade por novas e mais potentes drogas são demandadas a cada ano.
2.2. Bioma Caatinga
O Brasil ocupa uma área de cerca de 8,5 milhões de km2, abrangendo várias zonas climáticas, como por exemplo o trópico úmido do Norte, o semiárido do Nordeste e as áreas temperadas do Sul. Estas diferenças climáticas levam às grandes variações ecológicas, formando biomas distintos, como a caatinga (MMA, 2014).
Figura 1: Distribuição geográfica do bioma Caatinga. IBGE, 2004.
A Caatinga ocupa, aproximadamente, 844.453 km2 de área (Figura 1, p. 6), o que equivale a 9,9% do território nacional ou 55,6% do Nordeste (IBGE, 2004). Exclusivamente brasileira, engloba todos os estados do Nordeste e o norte de Minas Gerais (MMA, 2014). Assim, a caatinga caracteriza-se por apresentar clima semiárido, dispondo de abundante área luminosa durante todo o ano e temperaturas elevadas (médias anuais de 27 ºC a 29 ºC). Apresenta baixos índices pluviométricos, em torno de 500 mm a 700 mm anuais, e solos rasos e pedregosos, que tem baixa capacidade de acumular água (Silva et al., 2003; Neto, 2009; Sampaio, 2010). Relevo com planaltos, depressões e planícies, e sua rede fluvial composta por muitos rios temporários, que devido ao clima, passam boa parte do ano secos (Ribeiro et al., 2008). Sampaio (2010) acrescenta ainda que esse bioma apresenta plantas herbáceas anuais
com suculência, acúleos e espinhos ou, predominância de arbustos e arvoretas, com cobertura descontínua de copas.
Apesar da sua aparente fragilidade, a Caatinga possui uma rica biodiversidade e altos índices de endemismo, sendo cerca de 1512 espécies vegetais e, dentre essas, no mínimo 318 endêmicas (Gariglio et al., 2010).
Sua biodiversidade ampara várias áreas econômicas, especialmente nos ramos farmacêutico, cosmético, químico e de alimento (MMA, 2014). Mas, apesar de toda essa importância econômica e de posição única no mundo, já que dispõe de um considerável número de espécies endêmicas e, que deveriam ser consideradas como um patrimônio biológico de valor incalculável, esse bioma não vem tendo a devida importância pelo poder público, que a coloca em segundo plano (Nea, 2011; Kill, 2011). O maior exemplo disso, é que a Constituição Federal de 1988, em seu artigo 225, não inclui o Cerrado e a Caatinga na lista de biomas brasileiros designados como Patrimônios Nacionais (Maciel, 2010). A prova disso são o desmatamento de cerca de 46% dessa área, e a exploração de fauna e flora de forma ilegal e insustentável (MMA, 2014). No entanto, a caatinga diante de toda sua flora “sofrida”, nos traz alternativas a tratamentos convencionais, tendo como base o conhecimento construído pelas famílias que lá se encontram. Nesse contexto, estudos etnodirigidos e pesquisas com plantas medicinais estão demostrando a sua importância. Ressalta-se que, em um desses estudos identificou-se que num total de 126 espécies utilizadas como medicinais, seis pertenciam ao gênero Poincianella (Agra et al. 2008). E dentro desse gênero, a P. pyramidalis é ainda uma das espécies que carecem de estudos, pois apresenta múltiplas utilidades, tais como, potencial madeireiro, medicinal, uso veterinário, restauração florestal, forragem para gado e aplicações industriais (Maia, 2012).
2.3. Aspectos gerais sobre a espécie Poincianella pyramidalis
Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz, sinônimo botânico Caesalpinia pyramidalis Tul., é uma espécie presente no bioma Caatinga pertencente à família
Leguminosae, subfamília Caesalpinioideae (Figura 2, p. 8). Conhecida por diversos nomes populares tais como, catinga-de-porco, catingueira-das-folhas-largas, mussitaiba, pau-de-porco, pau-de-rato e catingueira, este último devido ao cheiro desagradável de suas folhas verdes (Queiroz, 2009).
Esta planta é descrita como uma árvore de porte médio, sem espinhos, com 4-6 metros de altura, podendo atingir 12 metros. Esta possui copa aberta e irregular, ramos verdes, com abundantes lenticelas esbranquiçadas e, sua casca é de cor cinza-claro, às vezes levemente
castanho, largando a camada superficial em lâminas um pouco alongadas, de bordo irregular, dando à casca um aspecto liso com coloração de “camuflagem”, com manchas de cor amarelo, verde e branco. As folhas da P. pyramidalis são bipinadas, com 5-11 folíolos alternos ou opostos, 1-3 cm nas folhas de ramos adultos e com menos de 1 cm em folhas de rebrotos, sendo que as folhas novas têm coloração rosada e, só depois de se tornarem verdes apresentam um cheiro desagradável, característico. Essa espécie possui flores amarelas, dispostas em racimos curtos e, o fruto é uma vagem achatada, pontada, de 8-11 cm de comprimento e 2 cm de largura, de cor castanho claro, contendo 5-7 sementes (Figura 3, p. 9). A madeira branco-amarelada com cerne escuro, muito pesada, contendo grandes quantidades de lignina e celulose (Maia, 2012).
Figura 2. Fotos da árvore da P. pyramidalis nos períodos chuvosos e de estiagem. Fotos: belezadacaatinga.blogspot.com, 2015.
A catingueira tem ocorrência no norte e nordeste do Brasil, sendo encontrada no Maranhão e, do Ceará até a Bahia, com uma disjunção no estado do Amazonas (Queiroz, 2009). Considerada endêmica da Catinga, ela pode ser encontrada em diversas associações vegetais, crescendo tanto nas várzeas úmidas, onde chega a atingir 10 metros de altura, ou, como no Seridó do semiárido, quando reduz-se a arbustos de menos de dois metros de altura (Maia, 2012). Devido a essas caraterísticas e facilidade em ser encontrada, tem-se essa espécie como uma das que mais contribuem para fisionomia desse Bioma.
Figura 3. Fotos das folhas, frutos e flores da P. pyramidalis. Fotos: belezadacaatinga.blogspot.com, 2015.
A espécie P. pyramidalis perde suas folhas na estação seca e, é uma das primeiras árvores a rebrotar com o início das chuvas, isso ocorre em, aproximadamente, 30 dias após o começo da estação chuvosa. A floração ocorre na época de transição seca-chuvosa e chuvosa, seguida pela frutificação (Maia, 2012). A propagação se dá por sementes, e a germinação ocorre dentro de uma ou duas semanas. Devido ao tipo de madeira que oferece, pode ser usada como lenha, carvão, estacas, mourões, na construção de casas de taipa, como também para a produção de álcool combustível e coque metalúrgico. Na medicina popular as folhas, flores e cascas são utilizadas no tratamento das infecções catarrais, nas diarreias, hepatite e anemia. Em animais domésticos, no tratamento de verminoses. Além disso, por ser uma planta de crescimento rápido e com bom potencial de rebrota, é indicada para a primeira e segunda fase de recomposição florestal mista de áreas degradadas (Queiroz, 2009; Maia, 2012).
2.4. Química do gênero Poincianella
A utilização de plantas para curar os mais diversos males é tradicionalmente conhecida e utilizada desde sempre pela espécie humana, mostrando ser uma atividade atávica dessa espécie e de outros primatas. A origem, portanto, desse conhecimento, confunde-se com a própria história da humanidade. A busca pela indústria farmacêutica por novas drogas cresce, sendo que os vegetais são uma excelente fonte dessas novas substâncias bioativas, pois oferecem uma vasta diversidade molecular de produtos naturais e, a demonstração do interesse nesses compostos, pode ser verificado pelo grande avanço científico envolvendo os estudos
químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos compostos com propriedades terapêuticas (Cavalheiro et al., 2009).
Nesse contexto, o gênero Poincianella possui espécies que sintetizam algumas dessas moléculas bioativas importantes para a indústria farmacêutica, sendo comprovada atividades biológicas interessantes, tais como a ação como antibióticos (Saaede e Sabir, 2001) e antidiabéticos para a P. bonducella (Sharma et al., 1997), antimaláricos (Kuria et al. 2001; para
P. volkensii e P. pluviosa (Deharo et al., 2001), anti-inflamatória (Hikino et al., 1997; Carvalho
et al., 1996) para P. sappan e P. ferrea. Além disso, as espécies desse gênero são amplamente utilizadas na medicina popular, como por exemplo P. pyramidalis que é usada para tratar a tosse, bronquite, infecção respiratória, asma, gastrite, cólica, febre, azia, diarreia, diabetes, dor de estômago, além de ser usada como um afrodisíaco (Albuquerque et al., 2007) (Figura 4, p. 10).
Figura 4. Forma explorada comercialmente da P. pyramidalis para fins medicinais, no Mercado Municipal Albano Franco, Aracaju, SE. Fotos: Kicia Gomes-Copeland.
Os constituintes químicos relatados do gênero Caesalpinia totalizam 280 compostos, incluindo diterpenos, triterpenos, flavonóides, fenóis aromáticos, fenilpropanóides, biflavonóides, dentre outros (Wu et al., 2011). A Tabela 1 (p. 11) apresenta algumas estruturas químicas encontradas na espécie em estudo, Poincianella pyramidalis.
Tabela 1. Compostos químicos predominantes na espécie P. pyramidalis encontrados em diferentes partes da planta (Mendes et al., 2000; Bahia et al., 2005; Bahia et al., 2010).
Apesar da diversidade de metabólitos especiais da espécie P. pyramidalis, para este trabalho de pesquisa foram estudados apenas dois desses compostos, a agatisflavona e amentoflavona, biflavonóides que apresentam um alto potencial farmacológico, uma vez que, pesquisas demonstraram que esses compostos suprimem a expressão de moléculas pró-inflamatórias. Portanto, devido a esta propriedade única, biflavonóides são promissores como drogas anti-inflamatórias, especialmente para tratamento de doenças inflamatórias crônicas (Kim et al., 2008). Por isso, o grande interesse da pesquisa em buscar meios alternativos para aumentar a produção desses bioativos.
2.5. Uso da cultura de tecidos de plantas na produção de metabólitos secundários.
O conceito sobre metabolismo secundário foi descrito por Kossel (1891) como opostos ao metabolismo primário, ou seja, são compostos estruturalmente diferentes, não sendo essenciais para todas as plantas, embora desempenhem um papel na interação da célula (organismo) com seu meio ambiente decorrente da sobrevivência do organismo em seu ecossistema (Verpoorte, 2000), diferentemente do que acontece no primário, no qual produz substâncias como aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios e ácidos nucléicos, que tem a função de manter as estruturas celulares, armazenamento e utilização de energia, fatores esses, imprescindíveis à vida. Os produtos desse metabolismo primário têm um papel fundamental na
adaptação das plantas aos seus ambientes, proporcionando assim, um aumento da probabilidade de sobrevivência de uma espécie (Fumagali et al., 2008). Com isso, esses produtos oriundos de uma situação de estresse ou defesa da planta, proporcionam usos tanto na medicina popular, como para serem comercializados como medicamentos, cosméticos, matéria-prima para a química fina, ou mais recentemente, como nutracêuticos.
Ao longo dos últimos anos, tem havido um grande número de drogas sintéticas usadas na medicina moderna, mas a necessidade para encontrar novas substâncias em face a um grande número de doenças, abriu espaço para a exploração de outros tipos de drogas naturais, dos quais os metabólitos secundários de plantas constituem a maior parte. Eles representam uma fonte importante de produtos farmacologicamente ativos, e isso faz gerar diferentes estratégias, usando sistemas in vitro, com o objetivo de melhorar a produção de substâncias de interesse. Os compostos recebidos a partir de plantas ou de culturas de células e de tecidos in vitro, podem ser utilizados diretamente como drogas, sem quaisquer alterações, ou esses compostos podem sofrer novas modificações, os chamados semissintéticos (Stafford et al., 1986, Bourgaud et al., 2001). Neste sentido, a espécie Poincianella pyramidalis (Bahia et al., 2005), os membros da família Asteraceae (Grech-Baran et al., 2012), e o gênero Erythrina (Gonçalves et al., 2014) destacam-se por produzirem bioativos importantes para a indústria farmacêutica, tais como biflavonóides, flavonóides, isoflavonoóides, alcaloides, dentre outras classes de compostos.
Nesse contexto, a técnica de cultura de tecidos de plantas se apresenta como uma ferramenta vantajosa do ponto de vista ecológico e econômico, pois pode proporcionar uma maior potencialização de produção desses bioativos, uma vez que é possível controlar condições do meio de cultivo, temperatura, luz, fontes de carbono, entre outros fatores. Permitindo ainda, ser uma alternativa sustentável para algumas espécies, principalmente em ecossistemas ameaçados, bem como, estabelecer protocolos padrão para a multiplicação massal de várias espécies (Morais et al., 2012). É sabido que existem empresas como a Nitto Denko Co., Japão, com produção comercial de biomassa de células de ginseng (Panax ginseng) em biorreatores de tanque agitado de 20 m3 com produção de 500 – 700 mg/L/dia (DiCosmos e Misawa, 1995; Wu e Zhong, 1999), e a Ajinomoto e Nippon Shin-Yaku, que vem concentrando esforços para aumentar os níveis de acumulação de alcalóides, esteróides e outros produtos secundários em cultura de células (Misawa, 1994).
Assim, entende-se que a técnica de cultura de tecidos de plantas se baseia na totipotencialidade da célula vegetal, ou seja, na sua capacidade de, por si só, originar uma nova planta, devido às mesmas apresentarem em seu núcleo, toda informação genética (Grattapaglia e Machado, 1998). Apesar dessa ferramenta exigir profissionais treinados, laboratórios
próprios, reagentes, dentre outros, ainda assim, torna-se vantajoso seu uso, pois os benefícios proporcionados são superiores à técnica convencional, quando se trata da produção desses metabólitos secundários que tenham relevância do ponto de vista terapêutico e que, por algum tipo de impedimento, não são sintetizados, ou quando isso ocorre, sua produção apresenta baixas concentrações pelas plantas cultivadas no modo tradicional (Pereira, 2009).
A cultura de tecidos de plantas tem como princípios básicos para a obtenção de culturas assépticas de plantas, a escolha do explante, a assepsia, o meio nutritivo e as condições ambientais de cultivo. Como fontes de explantes são usados ápices caulinares, ápices radiculares, gemas axilares ou gemas laterais, segmentos foliares, cotilédones, entrenós, anteras, ovários, óvulos, nucelos, embriões zigóticos, inflorescências e, inclusive, tecidos altamente diferenciados, como os provenientes de frutos (Mroginski e Roca, 1991; Barrueto Cid, 2000; Moraes et al., 2007).
Com isso, a produção de metabólitos secundários associada a cultura de tecidos de plantas, vem crescendo o interesse pelo estudo (Charlet et al., 2000) com maior atenção em plantas com grande potencial químico e farmacêutico. Uma vez que, grandes quantidades de metabólitos secundários podem ser sintetizadas dentro de um período de cultivo de duas semanas, por exemplo. Isto se torna muito favorável em relação a produção na planta, para as quais o espaço de tempo para o acúmulo desses metabólitos pode variar de uma estação para plantas anuais ou diversos anos no caso de plantas perianuais (Crouteau et al., 2000; Santos et al., 2007), a exemplo de Hypericum perforatum que no inverno a produção de hiperecina e pseudo-hiperecina aumentam de 100 ppm para mais de 3000 ppm no verão (Southwell e Bourke, 2001). A Artemisia sp, para a qual diversas pesquisas vêm sendo desenvolvidas com modificações no meio de cultivo in vitro, a fim de aumentar a produção de massa e de artemisinina (Aslam et al., 2006, Nin et al., 1996, Liu et al., 2003, Liu et al., 2004). André et al (2003) fizeram um estudo comparativo da produção de metabólitos secundários em cultura de células e na planta in natura de Gomphrena globosa (Amaranthaceae) e observaram que calos possuem potencial para a produção de vários metabólitos in vitro, inclusive compostos não observados na planta matriz.
Deste modo, pode-se acreditar que a concentração de determinados metabólitos secundários pode estar relacionada aos estágios de desenvolvimento do vegetal, ocorrendo o acúmulo de diferentes compostos devido a processos de síntese e transporte nas diferentes etapas do desenvolvimento da planta (Figura 5, p. 14). Nesse sentido, trabalhos envolvendo calogênese e cultivo de células in vitro para a P. pyramidalis são necessários, já que protocolos de produção de massa de calos para essa espécie, são o ponto inicial para a obtenção de substâncias como a amentoflavona e agatisflavona, que são biflavonóides e, que, mostraram-se farmacologicamente ativos para diversas doenças.
2.6. Estratégias aplicadas ao cultivo in vitro de plantas para aumentar a produção dos metabólitos secundários.
Nos últimos anos, percebeu-se uma crescente popularidade dos medicamentos fitoterápicos, que segundo a legislação sanitária brasileira, são medicamentos obtidos empregando exclusivamente matérias-primas ativas vegetais (Brasil, 2015). Além disso, houve também o aumento do interesse por moléculas bioativas oriundas de plantas, uma vez que se percebeu que essas substâncias não apenas desempenham um papel no crescimento e
desenvolvimento da planta, mas também, apresentam um papel relevante na produção de compostos farmacologicamente ativos de grande importância para a medicina.
Apesar dos grandes avanços na química sintética, ainda assim, por muito tempo, a produção de metabólitos secundários de plantas vem sendo realizada pelo cultivo da planta em campo, principalmente, de folhas, caules, raízes. Entretanto, esse tipo de coleta para fins medicinais apresentava desvantagens como plantas de biótipo específico, que podem ter muita dificuldade em crescer fora de seus ecossistemas locais; algumas espécies podem não ser cultivadas em larga escala, devido à sua susceptibilidade a patógenos (Fumagali et al., 2008); rendimentos baixos, e as flutuações nas concentrações devido às condições geográfica, sazonal e ambiental (Murthy et al., 2014); além do extrativismo exacerbado, podendo provocar extinção da espécie coletada. Isto tem conduzido os cientistas e biotecnologistas a considerar as culturas de células, tecidos e órgãos como uma maneira alternativa para produzir os correspondentes metabólitos secundários em um sistema in vitro.
A cultura de tecidos vem sendo apontada como valioso instrumento para estudos dos metabólitos primários e especiais, constituindo um sistema apropriado para a produção de compostos farmacológicos importantes. Pesquisas têm demonstrado sucesso na produção de metabólitos especiais em diferentes órgãos e culturas não organizadas como calos e suspensão celular, que nada mais são que um grupo ou massa de células, com crescimento desordenado que podem apresentar certo grau de diferenciação (Torres et al., 2000; Schripsema e Verpoorte, 1994; Karam et al., 2003; Furden et al., 2005; Gyorgy et al., 2005). As principais vantagens dessa produção in vitro são a independência de fatores ambientais, o aumento do controle da produção, o uso de linhagens celulares que garanta uma qualidade consistente do produto, a viabilização econômica de produtos oriundos de espécies de difícil cultivo e a utilização de elicitores ou indutores no direcionamento da produção (Ayako et al., 2004).
Nos últimos anos, têm sido desenvolvidas várias estratégias para acumulação de massa e a síntese de compostos secundários, tais como, otimização do meio de cultura (Tabela 2, p. 18), elicitores, nutrientes e precursor de alimentação, permeabilização, imobilização, e métodos de biotransformação (Murthy et al., 2014). Drapeau et al. (1986) verificaram que a concentração de açúcar no meio influencia fortemente a taxa de crescimento e a razão entre peso fresco e peso seco de células de Dioscorea deltoidea e de Catharanthus roseus. Ainda estes mesmo autores, citam que a biossíntese de diosgenina é acrescida com o aumento de 2,4-D no meio de cultura.
A variedade de meios para o cultivo de células e órgãos vegetais é enorme, normalmente, para cada cultura existe um meio que se adapta melhor, ou até mesmo, dentro da
mesma cultura, há um meio próprio para ela. E isso ocorre devido a composição de nutrientes que constitui esse meio de cultura. Por exemplo, o meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi adequado para culturas de células em suspensão de Sylvestre gymnema para acúmulo de massa e produção de ácido gimnemico (Nagella et al., 2011). Werner et al. (2010) obtiveram melhores resultados na calogênese da espécie C. echinata (pau-brasil) com os meios de cultura White (White 1943), MS e B5 (Gamborg et al., 1968), e muito embora o meio WPM (Lloyd e Mccown, 1981) seja bastante utilizado na promoção da calogênese e da organogênese em lenhosas (Glocke et al., 2006), para o pau-brasil não se mostrou eficiente. De qualquer modo, a comparação de meios de cultura é uma tarefa complexa, devido as interações entre os nutrientes minerais, potencial osmótico do meio e as exigências nutricionais de cada planta (Werner et al., 2010). Em todo o meio de cultivo, além dos nutrientes presentes na sua formulação, é sempre necessário suplementá-lo com uma fonte de carbono, geralmente utiliza-se a sacaroutiliza-se, um dissacarídeo que gera energia e carbono nos processos biossintéticos. Mas, outros carboidratos estão sendo utilizados não apenas como fonte de energia para a planta metabolizar seus nutrientes, mas também para modificar esse metabolismo, e favorecer a biossíntese dos metabólitos secundários. Os mais comumente usados são, a frutose, glicose, maltose, galactose e lactose.
Em culturas de células em suspensão de Gymnema sylvestre, a utilização de vários açúcares foi testada, e a sacarose foi considerada a fonte de carboidrato ideal para acumulação de massa (11,56 g.L-1) e produção de ácido gimnemico (9,95 mg.g-1) (Nagella et al., 2011). Wang e Weathers (2007) verificaram o efeito de concentrações equimolares (30 g.L-1) de açúcares individuais, tais como a sacarose, glicose, frutose ou na produção da artemisinina culturas de raiz de Artemisia annua e relataram uma melhoria significativa na acumulação de artemisinina em meio suplementado com glicose.
Esses açúcares adicionados ao meio de cultura, além de estimular o crescimento, podem atuar como moléculas de sinalização que regulam a divisão, diferenciação e o metabolismo das células (Ong et al., 2011). Estes mesmos autores, observaram em estudos com Ficus deltoidea que, a glicose (0,167 M) foi a fonte de carbono que melhor favoreceu a produção da rutina, quercetina e naringenina. Iranbakhsh et al. (2007), usando a concentração de 0,167 M de glicose em cultura de células de Datura stramonium, obtiveram uma ótima quantidade de alcaloides. Portanto, cada cultura vai demandar um tipo de fonte de carbono diferente, dependendo também do que se pretende obter com aquela cultura. Embora, os efeitos dos tipos dos carboidratos e concentrações sejam visíveis, ainda não há entendimento claro sobre o que eles promovem no metabolismo da planta (Grech-Baran e Pietrosiuk, 2012).
Tabela 2. Algumas estratégias para aumentar a produção de metabólitos secundários em células vegetais e cultura de órgãos otimizando o meio de cultura. Fonte: Murthy et al. (2014).
Otimização do meio
- Influência da fonte de carbono e suas concentrações - Influência da fonte de nitrogênio
- Influência de nutrientes no meio de cultivo
- Influência dos tipos e concentrações dos reguladores de crescimento - Influência da densidade do inóculo
- Otimização do ambiente de cultivo - Influência da temperatura
- Influência da qualidade e intensidade da luz - Influência do pH no meio de cultivo
- Influência da aeração e agitação do meio de cultivo.
Cultura de calos e células vegetais de uma maneira geral, requerem um fornecimento exógeno de reguladores de crescimento para o desenvolvimento, proliferação de massa e acúmulo de metabólitos. Uma das características mais notáveis das plantas está na capacidade de suas células somáticas desdiferenciar e retomar a divisão celular e produzir novas plantas. Entretanto, a alteração do programa ontogenético não é tão simples assim, pois nem todas as células adquirem competência para expressar a desdiferenciação celular. Assim o uso de reguladores de crescimento torna-se indispensável nesse processo.
Reguladores de crescimento como auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico, etileno, entre outros são bastante conhecidos por terem os maiores efeitos sobre os metabolismos primário e secundário, pois são capazes de desencadear processos específicos para cada desenvolvimento da célula ou parte de um segmento da planta. Dentre esses, as auxinas, destacam-se por estimular os processos de desdiferenciação (modelo indireto) e rediferenciação (modelo direto) in vitro, alterando a determinação e conferindo novas competências às células responsivas dos explantes (Fehe´r et al., 2003). Resultados experimentais recentes têm mostrado que a aplicação exógena de reguladores de crescimento
também influencia o crescimento e o acúmulo dos metabólitos em culturas de raízes (Vanhala et al., 1998; Weathers et al., 2005). E, novamente, a relação planta e tipo de regulador usado é o que vai influenciar na produção ou não do metabólito em questão. Por isso, diversos são os experimentos apresentados no mundo científico para a produção de massa e, principalmente, para o acúmulo de metabólitos secundários. Ong et al. (2011) verificaram um maior acúmulo de flavonóides em Ficus deltoidea quando adicionaram ao meio de cultura 10,74 µM de ANA. Ionkova (2009) observou que o conteúdo de flavonóides em cultura de células de Astragalus
missouriensis foi severamente diminuído com o aumento da concentração de 2,4-D. Duangpon
e Siripong (2009) relataram que o 2,4-D e o ANA tiveram efeito significativo sobre a produção de philantusol A em calos. Chinnamadasamy et al. (2010) verificaram que aumentando o nível de 2,4-D, estimulava a acumulação de vincristina enquanto o ANA produzia resultados contrários.
Outro fator que também afeta a produção de massa e de metabólitos secundários é a luz. As condições de iluminação são fatores conhecidos que afetam o metabolismo primário e secundário em cultura de células de plantas (Ramakrishna e Ravishankar, 2011). Por exemplo, Kokotkiewicz et al. (2014) provaram que as condições de luz afetaram significativamente o acúmulo de biflavonóides em Cyclopia subternata. Chan et al. (2010) investigaram os efeitos de diferentes fatores ambientais, tais como a intensidade e irradiação da luz (irradiação contínua e escuro contínuo) sobre o rendimento de massa celular e produção de antocianina em culturas de Melastoma malabathricum, e perceberam que a intensidade moderada da luz (300-600 Lux) induziu um aumento na acumulação de antocianinas nessa espécie. Guo et al. (2007) constataram que estimular culturas de calos na espécie Saussurea medusa, aumenta a produção de flavonóides.
2.7. Biflavonóides na espécie Poincianella pyramidalis
A primeira biflavona foi isolada em 1929 e é conhecida como ginkgentina. Desde então, mais de mil ocorrências de biflavonóides foram registradas em plantas e muitas atividades biológicas, têm sido relacionadas a essa classe de substâncias. De acordo com Simões et al. (1999) os biflavonóides são espécies diméricas formadas por monômeros idênticos ou distintos, os quais podem ainda ser mistos quanto à categoria das unidades, e podem apresentar vários tipos de conectividades entre si. A possiblidade de atropisomerismo (estereoisomeria de eixo) entre os monômeros também contribui para a diversidade de estruturas biflavonoídicas.
A nomenclatura dos biflavonóides é feita de modo análogo a dos flavonoides monoméricos, obedecendo a mesma ordem de numeração. No entanto, há duas possibilidades de denominação dos anéis aromáticos: na primeira, as unidades são referidas através de algarismos romanos (I e II), na segunda, a estrutura é subdividida em dois conjuntos de anéis (1- A, B e C; 2- D, E e F). As posições são diferenciadas apenas pelo acréscimo de linhas sobrescritas (”). Os carbonos 9 e 10 também podem ser chamados 8a e 4a, respectivamente (Simões et al., 1999). Esta classe são substâncias polares, solúveis em solventes hidrofílicos (metanol, DMSO, piridina), por isso suas metodologias de isolamento, em geral, requerem a aplicação de cromatografia de adsorção de fase reversa (octadecilsilano, ciano) e de exclusão (Sephadex LH-20) (Simões et al., 1999).
Os biflavonóides são encontrados em grande variedade ou quantidade em diferentes plantas e em muitos tecidos vegetais, acredita-se que essa quantidade seja superior a duzentas substâncias dispersas, principalmente entre as plantas gimnospermas e angiospermas (Canuto, 2007). No entanto, seu papel biológico ainda não é claro. Dentre essa variedade de plantas, a espécie P. pyramidalis se destaca, pois produz biflavonóides, entre esses destacando-se, a amentoflavona e agatisflavona (Tabela 1, p. 11), substâncias raras para a família Leguminosae, relatadas por Bahia et al. (2005).
Esta classe de substâncias é reconhecidamente de alto valor farmacológico, uma vez que apresentam afinidade por receptores GABAA/benzodiazepínicos, sendo fortes candidatos para o controle da epilepsia (Svenningsen et al., 2006). Atividades antivirais também foram relatadas para a amentoflavona e agatisflavona em ensaios frente aos vírus Myxovirus influenzae (gripe),
Herpes simplex (Lin et al., 1999) e HIV (Lin et al., 1997), além de um potencial antineoplásico,
avaliado com sucesso, em testes de citotoxidade frente a linhas de células tumorais (Chen et al., 2005; Lin et al., 2000; Silva et al., 1995; Lin et al., 1989) e mediante ensaios de inibição da enzima DNA topoisomerase (Grynberg et al., 2002).
Diante do exposto, tem-se a necessidade urgente em definir protocolos de calogênese in
vitro de Catingueira para produzir as substâncias agatisflavona e amentoflavona em qualquer
período de tempo visando uma produção em escala industrial que pode ser obtida por exemplo, com o uso de biorreatores.
2.8. Fatores que interferem no metabolismo secundário de plantas.
Desde muito tempo, carrascos gregos que coletavam amostras de veneno da cicuta (Conium maculatum) perceberam que pela manhã os níveis desta substância eram maiores nas
plantas (Lopes e Gobbo-Neto, 2007). Assim sendo, têm-se que a biossíntese de metabólitos secundários se encontra intimamente relacionada às variações sazonais, circadianas, intra e inter planta, que mesmo existindo um controle genético, a expressão pode sofrer modificações resultantes da interação de processos bioquímicos, fisiológicos e evolutivos (Darrow e Bowers, 1997; Bowers e Stamp, 1993; Waterman e Mole, 1989; Hartmann, 1996). Dessa maneira, percebe-se que o metabolismo secundário segue atrelado a interface química das plantas e ao ambiente.
Diversos são os fatores que alteram a síntese e a concentração dos metabólitos secundários nas plantas (Figura 6, p. 21). A natureza química destes constituintes ativos pode não se manter constante durante todo o ano, bem como atuar como fator limitante do crescimento e da produtividade (Gobbo-Neto e Lopes, 2007; Atienza et al., 2004).
Figura 6. Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários. Fonte: Gobbo Meto Lopes (2007).
Blank et al. (2007), estudando diferentes horários e épocas de coleta de folhas de citronela de java (Cymbopogon winterianus Jowitt), concluíram que a época seca reduziu o conteúdo de limoneno, citronelol, geraniol, e farnesol e aumentou o conteúdo de citronelal e neral. Já Botrel et al. (2010), observaram que o maior teor de óleo essencial de Hyptis.
relativa (%) dos componentes majoritários de α e β-tujona. E de acordo com Ncube et al. (2010), as maiores concentrações de flavonóides em Hypoxis hemerocallidea e Merwilla plumbea acontecem no inverno, enquanto Tulbaghia violacea e Drimia robusta no verão.
Zobayed et al. (2005) verificaram que as temperaturas maiores que 35 ºC e menores que 15 ºC, reduziram a eficiência fotossintética das folhas de Hypericum perforatum, resultando na alteração da concentração de metabólitos secundários dessa espécie. Ao avaliar a influência da indução de UV-B na mudança na produção de metabólitos secundários em folhas de Ginkgo
biloba, Sun et al. (2010) constataram que houve um aumento no teor de flavonóides, à medida
que o tempo de exposição aumentava, chegando a 57,2% em 240 minutos com posterior decréscimo de 40,7% aos 360 minutos de exposição.
2.9. Variabilidade Genética
Poincianella pyramidalis é uma espécie endêmica da caatinga, e que apresenta diversas
ações farmacológicas, tais como, atividade anti-inflamatória, antioxidante, antifúngica contra a candidíase, além de um grande potencial como recuperação de áreas degradadas e madeiras recomendadas para lenha, carvão e estaca (Bahia et al., 2005; Alviano et al., 2008; Luna et al., 2005; Cruz et al., 2007). Por essas razões, esta espécie está sob pressão antrópica e pode se tornar extinta, sendo assim, faz-se necessário um bom programa de conservação da floresta, a fim de obter a proteção de sua variabilidade genética.
Nesse contexto, o uso da biologia molecular vem sendo determinante em estudos sobre a variabilidade genética das populações e na estimativa da diferenciação genética existente entre as espécies. Estudos sobre a identificação e caracterização da variabilidade genética em plantas medicinais concentram-se em aspectos fenotípicos, tais como os caracteres morfológicos, aspectos do DNA e seus fragmentos, genes mutantes, cromossomos e, finalmente, marcadores genéticos, como o ISSR (Inter Repetições de Sequências Simples), que se baseiam na amplificação de regiões entre sequências microssatélites adjacentes do DNA via PCR (Polymerase Chain Reaction), por exemplo. Fatores externos influenciam na composição fitoquímica dessas plantas (Frisvad et al., 2008; Spitaler et al., 2006), podendo ter reflexo no efeito terapêutico final. Portanto, similaridades e variações no padrão fitoquímico interpopulacional, poderão ser geneticamente determinadas, usando análises genéticas, a partir da aplicação do marcador como anteriormente citado.
Esses marcadores não são afetados por condições ambientais, e tornaram-se cada vez mais importantes para o levantamento da diversidade genética e para a identificação de
