Análise de estruturas de proteínas

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(1)Universidade Federal de Pernambuco Centro de Informática. Pós-gradua¸cão em Ciência da Computa¸cão. ´ ANALISE DE ESTRUTURAS DE PROTEÍNAS Jeane Cec´ılia Bezerra de Melo TESE DE DOUTORADO. Recife 12 de Agosto de 2005.

(2) Universidade Federal de Pernambuco Centro de Informática. Jeane Cec´ılia Bezerra de Melo ´ ANALISE DE ESTRUTURAS DE PROTEÍNAS. Trabalho apresentado ao Programa de P´ os-gradua¸ c˜ ao em Ciˆ encia da Computa¸ c˜ ao do Centro de Inform´ atica da Universidade Federal de Pernambuco como requisito parcial para obten¸ c˜ ao do grau de. Doutor em Ciˆ encia da Com-. puta¸ c˜ ao.. Orientadora: Katia Silva Guimar˜ aes Co-orientadora: Marie-France Sagot. Recife 12 de Agosto de 2005.

(3) Melo, Jeane Cecília Bezerra de Análise de estruturas de proteínas / Jeane Cecília Bezerra de Melo. – Recife : O Autor, 2005. xv, 125 folhas : il., fig., tab. Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CIn. Ciência da Computação, 2005. Inclui bibliografia e apêndices. 1. Ciência da computação – Teoria da computação – Algoritmos. 2. Biologia computacional – Estruturas de proteínas. 3. Estrutura secundária – Predição – Redes neurais – Estrutura terciária – Comparação – Teoria dos grafos. 4. Predição – Aplicação de PCA (Principal Components Analysis) e ICA (Independent Components Analysis). 5. Comparação – Isomorfismo de grafos. I. Título. 004.021 006.32. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE BC2005-601.

(4) A Elione e Luisa, m˜ ae e filha..

(5) AGRADECIMENTOS. Meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas que contribu´ıram, direta ou indiretamente, para a realiza¸caõ deste trabalho. Aos membros da Banca Examinadora pelas cr´ıticas e sugestões. Em particular, a Ademir Amaral pelo despertar para a Ciência durante o 2o¯ Grau. A Katia pela orienta¸caõ e pela oportunidade de participar do BioLab. A Francisco, Obionor, Taciana, Walkiria e demais membros do BioLab pelo compa´ nheirismo e incentivo. Em particular, a Erico e Gustavo pela amizade, prestatividade, e colabora¸co˜es diretas no desenvolvimento deste trabalho. A Paulo Gustavo pelo incentivo e pelas dicas sobre o LATEX. A Marie-France pela forma atenciosa e sens´ıvel com que me recebeu em Lyon, pela orienta¸caõ e pelo apoio, fundamentais para a finaliza¸caõ deste trabalho. A Susana, Leonor, Said, Vincent, Eric e demais companheiros do Baobab. ` pessoas que compõem o LBBE, na Université Claude Bernard, pela hospitalidade. As Em particular, a Christian Gautier pelas sugestões e a Laurent Duret e Manolo Gouy pelo apoio. A Celine, Manon, Emilie, Rachid e Ann, pessoas especiais que conheci durante minha estadia na Fran¸ca. A Ahlem Hkimi pela amizade, pelo est´ımulo e pelos momentos divertidos e instrutivos que passamos juntas. A Enaura, Luciana e Rosana, amigas desde a adolescência. A Liliane e Patr´ıcia pela amizade e incentivo. A George pela amizade e pelas orienta¸co˜es em Redes Neurais. A Alcione, amiga sempre tão próxima mesmo morando distante. A Rosália pela disponobilidade e cuidados dispensados aos meus processos. A Adriana, Magnus e Gabriel, pelo apoio de sempre. A Marco pelo companheirismo, incentivo e apoio que colaboraram de maneira decisiva para a realiza¸caõ deste trabalho. Ao CNPq, a` AlBan e a` Universidade Federal Rural de Pernambuco pelo apoio financeiro. v.

(6) RESUMO. Neste trabalho são tratados dois problemas relacionados a` análise estrutural de prote´ınas. O primeiro, denominado Predi¸caõ de Estrutura Secundária, diz respeito a um importante passo na inferência da conforma¸caõ espacial de uma prote´ına: a localiza¸caõ de subestruturas recorrentes a partir de informa¸co˜es referentes a` sua seq¨ uência de aminoácidos. O segundo refere-se ao desenvolvimento de métodos para efetuar a Busca e Compara¸caõ de Padrões Estruturais, os quais podem ser utilizados para a classifica¸caõ de prote´ınas ou mesmo na localiza¸caõ de poss´ıveis s´ıtios ativos. A abordagem aqui apresentada para a predi¸caõ de estrutura secundária engloba um estudo cr´ıtico dos principais preditores dispon´ıveis na atualidade, além do desenvolvimento de um novo preditor objetivando propor um tratamento simples e eficiente para tal problema. Tal preditor alcan¸cou um percentual de acerto de 75,9%, o melhor desempenho conhecido sobre o banco de dados em que o mesmo foi desenvolvido. Os resultados significativos obtidos motivaram a realiza¸caõ de novos experimentos. Métodos de extra¸caõ de caracter´ısticas foram então aplicados aos dados informados ao preditor, um procedimento inédito para a predi¸caõ de estrutura secundária. Uma análise comparativa do comportamento do preditor mediante a presen¸ca ou não de uma fase de redu¸caõ de dimensionalidade foi também realizada. Para efetuar a busca e a compara¸caõ de padrões estruturais foi proposta uma representa¸caõ simplificada para as estruturas de prote´ınas. Tal representa¸caõ envolve informa¸co˜es sobre os elementos de estrutura secundária e intera¸co˜es espaciais entre estes, considerando a inclusão de parâmetros inéditos para este tipo de abordagem. Algoritmos clássicos da Teoria dos Grafos foram adaptados para tratar o problema de busca de ocorrências de “motivos”estruturais e deteçcaõ de subestruturas comuns a um dado conjunto de prote´ınas. O algoritmo para a busca por motivos estruturais mostrou-se eficiente em testes realizados com conjuntos de prote´ınas globulares. Um ponto diferencial do método desenvolvido para a deteçcaõ de subestruturas comuns é que este possibilita a análise de todas as prote´ınas do grupo ao mesmo tempo, enquanto a maioria das abordagens dispon´ıveis atualmente constroem o alinhamento m´ ultiplo comparando as prote´ınas duas a duas. vi.

(7) resumo. vii. Palavras-chave: Proteômica, predi¸caõ de estrutura secundária, extra¸caõ de caracter´ısticas, compara¸caõ de estruturas terciárias, redes neurais, isomorfismo de grafos..

(8) ABSTRACT. In this work two problems related to the protein structural analysis are dealt with. The first one, called Secondary Structure Prediction, concerns an important step in the inference of the space conformation of a protein: the localization of recurrent substructures from information related with its amino acid sequence. The second one, consists of the development of methods to perform Search and Comparison of Structural Patterns that can be used for protein classification or even in the localization of possible active sites. The approach here presented for secondary structure prediction includes a critical review of the main predictors available nowadays, besides the development of a new predictor aiming to propose a simple and efficient method for such a problem. Such a predictor reached a percentage of 75.9% correctness, the best performance known on the database in which it was developed. The significant results accomplished have motivated new performance experiments. Methods of feature extraction then have been applied to the data informing the predictor, an original procedure for the secondary structure prediction. A comparative analysis of the performance of the predictor by means of the presence or absence of a phase of dimensionality reduction was also performed. To perform the search and comparison of structural patterns a simplified representation for the protein structures was proposed. Such representation involves information about the secondary structure elements and interactions between them, considering the inclusion of original parameters for this approach. Classical Graph Theory algorithms have been adapted to deal with the problem of the search for structural “motifs”occurrences and detection of common substructures in a set of protein data. The algorithm for searching for structural motifs revealed efficiency in tests performed with sets of globular proteins. A differential point of the method developed for the detection of common substructures is that it makes possible the analysis of all the proteins of the group at the same time, while the majority of approaches currently available use to construct the multiple alignments by pairwise comparison. Keywords: Proteomics, secondary structure prediction, feature extraction, tertiary structure comparison, neural networks, graph isomorphism. viii.

(9) ´ SUMARIO. Cap´ıtulo 1—Introdu¸c˜ ao. 1. Cap´ıtulo 2—Conceitos B´ asicos e Terminologia. 8. 2.1 2.2. 2.3. Introdu¸caõ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fundamentos Biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 Estrutura Primária . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2 Estrutura Secundária . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.3 Estruturas Intermediárias . . . . . . . . . . . . . 2.2.4 Estruturas Terciária e Quaternária . . . . . . . . Fundamentos Computacionais . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Redes Neurais Artificiais . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1.1 Apresenta¸caõ . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1.2 Unidade Básica . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1.3 Redes MLP e Algoritmo de Treinamento 2.3.1.4 Outros Exemplos de Redes . . . . . . . 2.3.2 Conceitos Básicos sobre Grafos . . . . . . . . . . 2.3.2.1 Defini¸co˜es Básicas e Terminologias . . . 2.3.2.2 Rela¸co˜es e Opera¸co˜es entre Grafos . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. 8 8 11 13 17 18 22 23 23 23 24 28 30 30 31. Cap´ıtulo 3—Predi¸c˜ ao de Estrutura Secund´ aria de Prote´ınas atrav´ es de Redes Neurais Artificiais 33 3.1 3.2. 3.3. Introdu¸caõ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estado da Arte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Abordagem Básica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 Varia¸co˜es na Entrada de Dados . . . . . . . . . . . . . 3.2.3 Abordagens através de Perfis e Alinhamentos M´ ultiplos O Preditor de Estrutura Secundária NNPSS . . . . . . . . . . ix. . . . . . .. . . . . . .. . . . . . .. . . . . . .. . . . . . .. . . . . . .. 33 34 34 36 40 45.

(10) ´ rio suma. 3.4 3.5 3.6. 3.3.1 Dados Utilizados . . . . . . . 3.3.2 Método de Avalia¸caõ . . . . . 3.3.3 Algoritmo de Treinamento . . 3.3.4 Combina¸caõ de Classificadores Resultados . . . . . . . . . . . . . . . Análise Estat´ıstica dos Resultados . . Versão webserver do NNPSS . . . . .. x . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . .. 46 47 48 48 50 53 54. Cap´ıtulo 4—Predi¸c˜ ao de Estrutura Secund´ aria com Extra¸c˜ ao de Caracter´ısticas 58 4.1 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. Introdu¸caõ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Extra¸caõ de Caracter´ısticas Através da PCA . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.1 O Método PCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2 Metodologia Aplicada no Experimento com a PCA . . . . . . . 4.2.2.1 Dados Utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2.2 Método de Avalia¸caõ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2.3 Algoritmo de Treinamento . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2.4 Arquitetura e Regras de Combina¸caõ de Classificadores 4.2.3 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Extra¸caõ de Caracter´ısticas Através da ICA . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1 O Método ICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 Metodologia Aplicada no Experimento com a ICA . . . . . . . . 4.3.2.1 Dados Utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2.2 Método de Avalia¸caõ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2.3 Algoritmo de Treinamento . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2.4 Arquitetura e Regras de Combina¸caõ de Classificadores 4.3.3 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Análise Comparativa dos Experimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.1 Medidas de Desempenho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.2 Arquitetura e Dados de Entrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.3 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Análise Estat´ıstica dos Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Cap´ıtulo 5—Compara¸c˜ ao e Deteçc˜ ao de Padr˜ oes Estruturais em Prote´ınas 5.1 5.2. Introdu¸caõ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Compara¸caõ de Prote´ınas Através de Elementos de Estrutura Secundária. 58 60 60 63 63 64 64 64 65 68 69 70 70 71 71 71 72 74 75 75 76 78 80 80 83.

(11) ´ rio suma 5.3 5.4 5.5 5.6. Representa¸caõ de Estruturas de Prote´ınas . . . . . . . . . . Algoritmo para Busca de Ocorrências de Motivos Estruturais Algoritmo para Busca de Subestruturas Maximais . . . . . . Resultados e Discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. xi . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. Cap´ıtulo 6—Conclus˜ oes e Trabalhos Futuros 6.1 6.2. 90 95 97 101 103. Predi¸caõ de Estrutura Secundária de Prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . Compara¸caõ e Deteçcaõ de Padrões Estruturais em Prote´ınas . . . . . . .. 103 105. Apˆ endice A—Tabelas de Experimentos Realizados com os Dados Completos. 108. Apˆ endice B—Tabelas de Experimentos Realizados com a PCA. 110. Apˆ endice C—Tabelas de Experimentos Realizados com a ICA. 111. Apˆ endice D—Tabela de Experimentos Realizados com o Perfil PSI Blast. 112.

(12) LISTA DE FIGURAS. 1.1 1.2 1.3. Dos genes a`s prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gráfico de crescimento do conte´ udo do PDB . . . . . . . . . . . . . . . . Identifica¸caõ de SSEs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 2.15 2.16 2.17 2.18 2.19 2.20 2.21 2.22 2.23 2.24. Alinhamento m´ ultiplo de prote´ınas . . . . . . . . . Os quarto n´ıveis de arquitetura de uma prote´ına . . A estrutura básica de um aminoácido padrão . . . . Liga¸co˜es covalentes na molécula de prote´ına . . . . Parte inicial da estrutura primária da hemoglobina Ilustra¸caõ dos aˆngulos φ, ψ e ω . . . . . . . . . . . Representa¸co˜es esquemáticas de uma hélice α . . . Hélices α na conforma¸caõ coiled-coil . . . . . . . . . Folhas β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prote´ına tioredoxina da E. coli . . . . . . . . . . . . Representa¸caõ esquemática de um hairpin-loop . . . Exemplos de motivos hélice-la¸co-hélice . . . . . . . Motivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Exemplo de dom´ınio α . . . . . . . . . . . . . . . . Exemplo de dom´ınio β . . . . . . . . . . . . . . . . Exemplo de dom´ınio α/β . . . . . . . . . . . . . . . Exemplo de dom´ınio α + β . . . . . . . . . . . . . . Raio de van der Waals . . . . . . . . . . . . . . . . Gráfico de Ramachandran . . . . . . . . . . . . . . Modelo MCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Exemplo de arquitetura MLP . . . . . . . . . . . . Exemplo de arquitetura RBF . . . . . . . . . . . . Exemplo de rede recorrente . . . . . . . . . . . . . Exemplo de grafo . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. xii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2 4 5 10 11 12 13 13 14 14 15 15 16 16 18 19 20 20 20 20 21 22 24 25 29 30 31.

(13) xiii. LISTA DE FIGURAS 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10. Estrutura da rede proposta por Qian e Sejnowski . . . . . . . . . . Exemplo de perfil PSI Blast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Arquitetura de uma rede BRNN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Arquitetura do preditor NNPSS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resultados obtidos com o banco RS126, utilizando perfis PSI Blast Resultados obtidos com o banco CB396, utilizando perfis PSI Blast Janela inicial do NNPSS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Exemplo de entrada do NNPSS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N´ umero de identifica¸caõ da submissão . . . . . . . . . . . . . . . . Resultado do NNPSS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. 35 40 41 49 51 52 55 56 57 57. 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11. Conjunto de pontos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Componentes principais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rota¸caõ do conjunto de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Arquitetura utilizada no experimento com a PCA . . . . . . . . . . Extra¸caõ de caracter´ıstica de perfis PSI Blast através da PCA . . . Extra¸caõ de caracter´ıstica dos perfis PSI Freq através da PCA . . . Extra¸caõ de caracter´ıstica dos perfis PSI Blast CS através da PCA Arquitetura usada no experimento com a ICA . . . . . . . . . . . . Extra¸caõ de caracter´ısticas de perfis PSI Blast através da ICA . . . Compara¸caõ dos melhores desempenhos Q3 obtidos . . . . . . . . . Arquitetura utilizada nos três experimentos . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. 61 62 63 65 66 67 68 71 72 73 76. 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9. Exemplo de cartão TOPS . . . . Exemplo de diagrama TOPS . . . Exemplo de container . . . . . . . Enquadramento do eixo da hélice Vetor associado a uma fita . . . . Classes de geometria de intera¸caõ Duas formas de dividir os aˆngulos Prote´ına acylphospahtase . . . . . Exemplo de produto de grafos . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. 86 87 89 91 91 92 92 93 98. . . . . . . . . . . . . em . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . quadrantes . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . ..

(14) LISTA DE TABELAS. 2.1. Os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente nas prote´ınas. . . . . . . .. 3.1. Desempenho Q3 médio para predi¸co˜es sobre os bancos RS126 e CB396. 4.1. .. 9 53. 4.3. Compara¸caõ do desempenho Q3 médio para experimentos com CB396 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Compara¸caõ do desempenho Q3 médio incluindo experimentos tra¸caõ de caracter´ısticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Compara¸caõ dos Experimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . .. o banco . . . . . com ex. . . . . . . . . .. 74 77. 5.1. Representa¸caõ matricial para a estrutura da prote´ına acylphosphatase . .. 93. A.1 Resultados obtidos com os perfis PSI Blast e PSI Freq - Banco CB396 . . A.2 Perfil PSI Blast (sem filtro) - Banco RS126 . . . . . . . . . . . . . . . . .. 109 109. B.1 Método PCA aplicado a perfis PSI Blast (sem filtro) - Banco CB396. . .. 110. C.1 Método ICA aplicado a perfis PSI Blast (sem filtro) - Banco CB396 . . .. 111. D.1 Experimentos realizados com os perfis PSI Blast - Banco CB396 . . . . .. 112. 4.2. xiv. 69.

(15) LISTA DE ABREVIATURAS. BRNN - Redes neurais recorrentes bidirecionais (do inglês Bidirectional Recurrent Neural Networks) ´ DNA - Acido desoxirribonucléico (do inglês DeoxyriboNucleic Acid) HMM - Modelo Oculto de Markov (do inglês Hidden Markov Model) HSSP - Homology-derived Secondary Structure of Proteins ICA - Análise de componentes independentes (do inglês Independent Components Analysis) MLP - Multi-Layer Perceptron NNPSS - Neural Network based Protein Secondary Structure prediction NCBI - National Center for Biotechnology Information PCA - Análise de componentes principais (do inglês Principal Components Analysis) PDB - Protein Data Bank PSI-Blast - Position Specific Iterative Blast PSSM - Position Specific Scoring Matrix RBF - Rede de fun¸caõ de base radial (do inglês Radial Basis Function) RCSB PDB - Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank RMSD - Desvio quadrático médio (do inglês Root Mean Squared Deviation) RNAs - Redes Neurais Artificiais RPROP - Resilient PROPagation SSE - Elemento de estrutura secundária (do inglês Secondary Structure Element) xv.

(16) lista de abreviaturas SSMMs - Segmental Semi-Markov Models SSSD - Structurally-Similar, Sequence-Dissimilar. xvi.

(17) CAPÍTULO 1. ˜ INTRODUC ¸ AO. O interesse pela Genética e pela Análise de Seq¨ uências Biológicas tais como DNA e prote´ınas aumentou significantemente desde o in´ıcio do projeto Genoma Humano em meados de 1990. Projetos de seq¨ uenciamento de outros organismos ganharam espa¸co no ambiente acadêmico impulsionados pela amplitude de suas aplica¸co˜es. Especificamente no Brasil, pode-se observar contribui¸co˜es significativas nesta a´rea através de projetos como Xylella Fastidiosa Genome Project [Simpson et al., 2000], Sugar Cane EST Genome Project (http://sucest.lad.ic.unicamp.br/en/) e Human Cancer Genome Project (http://www.ludwig.org.br/ORESTES/). O grande n´ umero de dados gerados tornou necessário a aplica¸caõ e o desenvolvimento de métodos computacionais para tratá-los. Dentre as a´reas da Ciência da Computa¸caõ que têm contribu´ıdo para o avan¸co da Biologia Molecular podemos destacar a Teoria da Computa¸caõ, devido a` necessidade de utiliza¸caõ de algoritmos e estruturas de dados para tratar os problemas NP-completos relacionados a análise de seq¨ uências. A diversidade de problemas em aberto bem como solu¸co˜es que precisam ser otimizadas motivam pesquisas e projetos multidisciplinares para atender a esta demanda. As possibilidades de aplica¸co˜es em a´reas estratégicas tais como agricultura, biodiversidade, desenvolvimento de drogas e métodos de diagnóstico para doen¸cas como câncer e AIDS estimulam o investimento de institui¸co˜es governamentais e particulares. No entanto, obter o genoma dos organismos é considerado como um primeiro passo para possibilitar as aplica¸co˜es citadas previamente. Uma vez conhecido o genoma é necessário identificar todas as prote´ınas por ele expressas, bem como determinar todas as suas fun¸co˜es patológicas e fisiológicas (Figura 1.1). E, embora a era Genômica ainda possua muitos problemas em aberto, a recente finaliza¸caõ do seq¨ uenciamento do genoma humano provocou um novo direcionamento nas pesquisas visando obter tais elementos inaugurando assim uma nova fase, denominada Proteômica. A fun¸caõ de uma prote´ına está intrinsecamente ligada a` sua conforma¸caõ espacial. Em contraste com a relativa facilidade da determina¸caõ de sua seq¨ uência de aminoácidos, descobrir a estrutura tridimensional de uma prote´ına não é uma tarefa fácil. Métodos tradicionais de obten¸caõ da conforma¸caõ espacial, tais como cristalografia e ressonância 1.

(18) õ introduc ¸a. 2. Figura 1.1. Dos genes às prote´ınas. magnética nuclear, são custosos e muitas vezes não são pass´ıveis de serem aplicados. Esse fato promove uma grande diferen¸ca entre o n´ umero de seq¨ uências e o n´ umero de estruturas conhecidas, o que pode ser observado a partir do n´ umero de seq¨ uências depositadas no Swiss-Prot [Boeckmann et al., 2003], que chegou a 192799 em agosto de 2005, contra as 32520 estruturas depositadas no mesmo per´ıodo no Protein Data Bank (PDB) [Berman et al., 2000], um dos principais bancos de estruturas de prote´ınas da atualidade, também referenciado como Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB). A exemplo do que ocorreu na era Genômica, métodos computacionais surgem como uma alternativa rápida e econômica para diminuir este gap, baseando-se no fato de que a fun¸caõ de uma prote´ına está diretamente relacionada com a seq¨ uência de aminoácidos que a compõe [Nelson and Cox, 2000]. O problema de determinar a fun¸caõ de uma prote´ına vem sendo abordado de diversas formas. A análise pode ser puramente seq¨ uencial, através da busca por padrões prédeterminados ou não, ou pode usar informa¸co˜es de prote´ınas de estruturas conhecidas, através de métodos preditivos ou comparativos. Para a análise seq¨ uencial, métodos comparativos são tradicionalmente utilizados. A seq¨ uência sobre a qual desejamos obter mais informa¸co˜es é comparada com outras de fun¸caõ conhecida procurando alinhar res´ıduos idênticos ou similares, de modo a evidenciar semelhan¸cas locais ou globais. Dependendo do grau de similaridade alcan¸cado, a fun¸caõ da prote´ına pode ser inferida. Uma outra op¸caõ é efetuar a busca por ocorrências.

(19) õ introduc ¸a. 3. de padrões, os quais podem representar, por exemplo, s´ıtios ativos determinados previamente, ou simplesmente subseq¨ uências que se repetem de forma exata ou aproximada [Benson and Waterman, 1994, Kannan and Myers, 1996, Sagot, 1998]. Pode-se ainda verificar se a prote´ına pertence a uma determinada fam´ılia, através da obten¸caõ ou localiza¸caõ de regiões conservadas caracter´ısticas de seus membros. Tais elementos fornecem ind´ıcios para uma análise mais aprofundada, em se utilizando algoritmos e estruturas de dados desenvolvidos especialmente para estes fins. A análise funcional também pode ser efetuada através da compara¸caõ de estruturas conhecidas. Embora o n´ umero de estruturas determinadas seja bastante inferior ao n´ umero de seq¨ uências, atualmente na propor¸caõ aproximada de uma estrutura para seis seq¨ uências, bancos de estruturas vêm crescendo rapidamente [Berman et al., 2000] (Figura 1.2) motivando o desenvolvimento de técnicas que permitem a busca e compara¸caõ de tais elementos de maneira eficiente. A busca por motivos ou dom´ınios estruturais auxilia na determina¸caõ da fun¸caõ de uma prote´ına bem como na sua classifica¸caõ em fam´ılias. Tal procedimento contribui para a análise de novas estruturas, as quais recaem, em sua maioria, em fam´ılias previamente determinadas. A compara¸caõ de estruturas é um recurso utilizado, por exemplo, na análise de prote´ınas homólogas. Tais prote´ınas descendem de uma prote´ına ancestral comum que sofreu mudan¸cas devido a fatores relacionados com a evolu¸caõ. A busca por subestruturas comuns nesses conjuntos de prote´ınas pode determinar a localiza¸caõ de s´ıtios funcionais e mesmo explicar as mudan¸cas ocorridas em sua a´rvore evolutiva [Higgins and Taylor, 2000]. Uma outra abordagem utilizada é a inferência da estrutura tridimensional a partir da seq¨ uência propriamente dita, conhecida como o Problema do Dobramento de Prote´ınas (do inglês Protein Folding Problem), o qual foi demonstrado ser NP-dif´ıcil [Hart and Istrail, 1997], sendo um dos principais problemas em aberto da Biologia Computacional. Devido a` sua complexidade, o processo da obten¸caõ da estrutura é comumente dividido numa série de passos intermediários. Por exemplo, a localiza¸caõ, a partir da seq¨ uência, de subestruturas comuns na conforma¸caõ 3D, tais como hélices α, fitas β e coils (Figura 1.3), sem considerar suas intera¸co˜es espaciais. Este problema é conhecido como a Predi¸caõ de Estrutura Secundária de Prote´ınas. Neste trabalho são considerados dois problemas relacionados a análise de estrutura de prote´ınas: a predi¸caõ de estrutura secundária e a busca e compara¸caõ de padrões estruturais. A predi¸caõ de estrutura secundária é um problema bem estabelecido na Biologia Com-.

(20) õ introduc ¸a. 4. Figura 1.2. Gráfico de crescimento do conte´ udo do PDB.. putacional para o qual foram propostas diversas abordagens nos u ´ltimos vinte anos. Em virtude da sua velocidade e baixo custo, métodos computacionais surgem como uma forte alternativa para tal problema, sendo os métodos de aprendizagem de máquina, em particular redes neurais, os que têm produzido resultados mais satisfatórios [Lin et al., 2005, Pollastri et al., 2002, Baldi and Brunak, 2001, Petersen et al., 2000], [Jones, 1999]. A abordagem aqui proposta para tal problema envolveu um estudo sobre os principais preditores da atualidade, onde técnicas, algoritmos e dados de entrada utilizados em cada preditor foram analisados. A utiliza¸caõ de Perfis PSI Blast [Altschul et al., 1997] das seq¨ uências como dado de entrada para as redes e a combina¸caõ das sa´ıdas das mesmas são técnicas recorrentes para a maioria dos bons classificadores. Com base nesse estudo podemos observar ainda que, para obter melhores resultados, os recursos computacionais requeridos são cada vez maiores. Além da complexidade intr´ınseca a cada classificador individualmente, a maioria dos preditores combina algo como oito, onze, doze, ou mesmo oitocentas predi¸co˜es [Baldi et al., 1999], [Pollastri et al., 2002], [Rost and Sander, 1993b], [Petersen et al., 2000]. Num esfor¸co para modificar esta tendência, e tendo como base o estudo relatado neste trabalho, desenvolvemos um preditor de estrutura secundária apresentado em [Guimarães et al., 2002, Guimarães et al., 2003, Guimarães and Melo, 2003]. O objetivo foi obter um preditor que fosse ao mesmo tempo simples, buscando reduzir o n´ umero de.

(21) õ introduc ¸a. 5. Figura 1.3. Identifica¸caõ de elementos de estrutura secundária a partir da seq¨ uência de prote´ına (figura retirada de [Brown, 2003]).. classificadores envolvidos, e eficiente, visando alcan¸car resultados no m´ınimo comparáveis aos métodos desenvolvidos previamente. A modifica¸caõ na forma de obten¸caõ dos perfis PSI Blast, a utiliza¸caõ de diferentes algoritmos de treinamento e regras de combina¸caõ de sa´ıdas permitiram uma redu¸caõ considerável no n´ umero de classificadores envolvidos na predi¸caõ, mantendo ou mesmo melhorando o percentual de acerto do nosso classificador em rela¸caõ aos melhores dentre aqueles conhecidos e desenvolvidos em condi¸co˜es similares. Os resultados significativos alcan¸cados motivaram a realiza¸caõ de novos experimentos com o preditor, os quais consistiram da aplica¸caõ de técnicas de extra¸caõ de caracter´ısticas nos dados de entrada. Análise de Componentes Principais (do inglês Principal Components Analysis) [Bishop, 1995, Johnson and Wichern, 1992] e Análise de Componentes Independentes (Independent Components Analysis) [Hyvärinen and Oja, 2000, Hyvärinen, 1999b] foram utilizadas no problema de predi¸caõ de estrutura secundária. Os percentuais obtidos com cada uma das técnicas foram comparáveis aos obtidos com os dados completos [Melo et al., 2003a, Melo et al., 2003b]. Os três experimentos foram posteriormente analisados objetivando identificar novas diretivas de melhoramento.

(22) õ introduc ¸a. 6. [Melo et al., 2004].. O segundo problema abordado neste trabalho trata da busca e compara¸caõ de padrões conservados em prote´ınas. Algoritmos e estruturas de dados foram estudados objetivando a obten¸caõ de uma representa¸caõ simplificada para estruturas de prote´ınas e sua utiliza¸caõ em algoritmos para deteçcaõ e identifica¸caõ de subestruturas [Guimarães and Melo, 2003]. Inicialmente, duas abordagens foram consideradas no desenvolvimento do método de busca e compara¸caõ de estruturas a ser apresentado [Lesk, 1995, Jonassen et al., 1999], as quais diferem principalmente nos elementos escolhidos para a representa¸caõ das estruturas de prote´ınas. Jonassen et al [Jonassen et al., 1999] propõe a representa¸caõ através de um conjunto de pontos, sendo as informa¸co˜es sobre os res´ıduos e sua vizinhan¸ca armazenadas numa lista de descri¸caõ, a qual inclui o tipo dos elementos onde os res´ıduos estão localizados e coordenadas dos a´tomos das cadeias laterais. Arthur Lesk [Lesk, 1995] por sua vez utiliza informa¸co˜es relativas aos elementos de estrutura secundária, sendo os elementos associados a seus vetores axiais e suas orienta¸co˜es relativas armazenadas numa matriz. Objetivando contemplar a compacticidade e simplicidade da representa¸caõ, bem como os aspectos biológicos que favorecem a utiliza¸caõ de informa¸co˜es sobre elementos de estrutura secundária, a abordagem proposta por Arthur Lesk foi escolhida como base para o método de compara¸caõ desenvolvido. Propostas de representa¸caõ das estruturas protéicas através de elementos de estrutura secundária foram também estudadas. Observou-se que a maioria dos métodos efetua a compara¸caõ entre pares de prote´ınas, ou constrói alinhamentos m´ ultiplos a partir da compara¸caõ entre pares [Kleywegt and Jones, 1997], [Michalopoulos et al., 2004], sendo poucos os que se propõem a considerar todo um grupo de prote´ınas [Eidhammer et al., 2000], [Dror et al., 2003]. Concomitantemente, a descri¸caõ proposta por Arthur Lesk foi analisada objetivando detectar pontos que poderiam ser melhorados. O modelo original foi então modificado para considerar mais informa¸co˜es, bem como para permitir um maior grau de flexibilidade para as medidas de intera¸caõ entre pares de vetores. As matrizes utilizadas para representar as estruturas de prote´ınas foram substitu´ıdas por grafos, cujos nós correspondem a elementos de estrutura secundária e as arestas indicam os diferentes relacionamentos entre eles. Usando este modelo, os problemas relacionados a` busca e a` compara¸caõ de estruturas protéicas foram reduzidos a problemas t´ıpicos de Teoria dos Grafos, especificamente, a busca por subgrafos isomorfos e a busca por.

(23) õ introduc ¸a. 7. subgrafos maximais isomorfos. Algoritmos clássicos [Valiente, 2002], [McGregor, 1982], [Ullmann, 1976] foram modificados e adaptados de modo a considerar as especificidades de nosso modelo, bem como as informa¸co˜es introduzidas. O processo e resultados advindos das abordagens desenvolvidas para ambos os problemas encontram-se descritos neste trabalho, o qual está organizado como segue. No Cap´ıtulo 2 são introduzidos os principais conceitos biológicos e computacionais utilizados. Defini¸co˜es relativas a`s prote´ınas e seus diferentes n´ıveis de expressão são apresentados juntamente com as classes em que estas podem estar dispostas e alguns esclarecimentos em rela¸caõ a terminologia da a´rea. Os aspectos computacionais básicos sobre elementos de Redes Neurais Artificiais e Teoria dos Grafos também são apresentados. O problema da predi¸caõ de estrutura secundária é tratado no Cap´ıtulo 3. Neste, um resumo cr´ıtico de abordagens representativas para a predi¸caõ de estrutura secundária é apresentado. Os métodos utilizados no preditor desenvolvido com base neste estudo são então descritos. A arquitetura das redes, algoritmos e técnicas utilizadas em cada um dos três experimentos realizados são apresentados, juntamente com uma discussão sobre os resultados obtidos. No Cap´ıtulo 4 a aplica¸caõ de técnicas de extra¸caõ de caracter´ısticas ao problema de predi¸caõ de estrutura secundária é apresentada. O comportamento do preditor apresentado no Cap´ıtulo 3 mediante o pré-processamento dos dados de entrada utilizando a Análise de Componentes Principais e a Análise de Componentes Independentes é discutido. Uma análise comparativa dos resultados obtidos com preditor, considerando ou não a fase de extra¸caõ de caracter´ısticas, finaliza o cap´ıtulo em questão. O Cap´ıtulo 5 trata do problema de busca e compara¸caõ de padrões estruturais em prote´ınas. As considera¸co˜es a serem feitas no desenvolvimento de representa¸co˜es de estruturas são explanadas. A representa¸caõ desenvolvida para o problema é apresentada, seguida de um resumo cr´ıtico de abordagens baseadas em representa¸co˜es similares. Os algoritmos e respectivas adapta¸co˜es são explicados e os resultados obtidos nas duas abordagens são apresentados. Conclusões e diretivas futuras para os problemas e abordagens aqui apresentados compõem o Cap´ıtulo 6..

(24) CAPÍTULO 2. ´ CONCEITOS BASICOS E TERMINOLOGIA 2.1. ˜ INTRODUC ¸ AO. O caráter multidisciplinar da Biologia Computacional motivou a introdu¸caõ do atual cap´ıtulo, o qual apresenta os conceitos básicos e terminologias referentes aos problemas abordados neste trabalho. O cap´ıtulo encontra-se dividido em duas se¸co˜es. Aspectos biof´ısicos e bioqu´ımicos relativos a`s prote´ınas, tais como defini¸caõ, classes e os diferentes n´ıveis de arquitetura são explanados na Se¸caõ 2.2. Conceitos introdutórios relativos a Redes Neurais Artificiais e Teoria dos Grafos, considerados nos problemas tratados, são discorridos na Se¸caõ 2.3. Defini¸co˜es e técnicas especificamente relacionadas a`s abordagens desenvolvidas para ambos os problemas são apresentadas oportunamente ao longo deste trabalho. 2.2. ´ FUNDAMENTOS BIOLOGICOS. Genoma é o conjunto completo de informa¸co˜es necessárias para o desenvolvimento de um organismo. Estes dados encontram-se armazenados nos cromossomos, que são constitu´ıdos essencialmente de ácido desoxirribonucléico, DNA (do inglês Deoxyribonucleic Acid). Esta cadeia de DNA contém milhares de genes, a partir dos quais são fabricadas todas as prote´ınas de um organismo. As prote´ınas por sua vez têm um papel essencial no metabolismo, participando praticamente de todas as atividades celulares. Elas colaboram com cerca de 20% do peso das células, perdendo em contribui¸caõ apenas para a a´gua, que participa com 70% do peso da célula. Existem diferentes tipos de prote´ınas, as quais exercem fun¸co˜es fundamentais nas células, tais como, suporte de filamentos, catálise bioqu´ımica, regula¸caõ do volume celular e imuniza¸caõ, entre outras [Nelson and Cox, 2000]. As prote´ınas podem ser divididas em duas classes: prote´ınas de membrana e prote´ınas globulares. As prote´ınas de membrana representam cerca de 25% das prote´ınas num genoma t´ıpico. Por estarem localizadas nas membranas das células, estas se encontram em um ambiente lip´ıdico, podendo agir como um receptor para que a célula capture informa¸co˜es 8.

(25) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 9. do exterior. Devido a tais propriedades as prote´ınas de membrana são freq¨ uentemente usadas como alvo no desenvolvimento de drogas. No entanto, as prote´ınas de membrana são mais dif´ıceis de serem cristalizadas e, portanto, possuem menos estruturas conhecidas. As prote´ınas globulares por sua vez compõem os 75% restantes das prote´ınas de um genoma t´ıpico e encontram-se em ambiente aquoso, tais como n´ ucleo e citoplasma, podendo ser secretadas pela célula. As prote´ınas globulares possuem mais estruturas dispon´ıveis e, por representarem uma boa fra¸caõ das prote´ınas, são as mais pesquisadas [Baldi and Pollastri, 2002]. Os aćidos nucléicos e as prote´ınas são moléculas formadas pela liga¸caõ de várias unidades semelhantes, estas denominadas monômeros. No DNA os monômeros são nucleot´ıdeos, também referenciados como bases, que são simbolizados por A (adenina), C (citosina), G (guanina) e T (timina). Nas prote´ınas os monômeros são os aminoácidos [Setubal and Meidanis, 1997]. Um total de 20 aminoácidos ocorre naturalmente nas prote´ınas, sendo cada um deles representado simbolicamente por uma letra (Tabela 2.1). A representa¸caõ de uma prote´ına através de sua seq¨ uência de aminoácidos é denominada estrutura primária, a qual será tratada com mais detalhes posteriormente. A determina¸caõ da seq¨ uência exata de monômeros que compõem tais moléculas é denominada seq¨ uenciamento. Tabela 2.1. Os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente nas prote´ınas.. Aminoácido Alanina Arginina ´ Acido aspártico Asparagina Ciste´ına ´ Acido glutâmico Glutamina Glicina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofan Tirosina Valina. Abrevia¸caõ ALA A ARG R ASP D ASN N CYS C GLU E GLN Q GLY G HIS H ILE I LEU L LYS K MET M PHE F PRO P SER S THR T TRP W TYR Y VAL V.

(26) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 10. Alguns aspectos costumam ser analisados ao considerarmos seq¨ uências de DNA ou de prote´ınas. A análise neste n´ıvel consiste da busca por similaridades com seq¨ uências já estudadas, visando identificar aspectos funcionais e morfológicos. Estas informa¸co˜es encontram-se em bancos de dados biológicos, mantidos geralmente por entidades p´ ublicas. Dentre tais bancos podemos citar o GenBank [Benson et al., 2002], o DNA Data Bank of Japan [Tateno et al., 2000] e o EMBL [Stoesser et al., 2003].. A busca por similaridades pode ser feita de várias formas, sendo o alinhamento de seq¨ uências uma das mais utilizadas. Alinhar duas seq¨ uências consiste em estabelecer uma correspondência entre os s´ımbolos das duas obedecendo a` sua ordem, e dando prioridade a procurar fazer corresponder caracteres iguais, o que se chama casamento (do inglês matching). Alternativamente, um s´ımbolo pode corresponder a um caractere diferente na outra seq¨ uência, chamando-se a isto uma substitui¸caõ, ou pode corresponder a um s´ımbolo especial “-”, o que representa a inser¸caõ ou a remo¸caõ daquele caractere. Cada casamento, substitui¸caõ, inser¸caõ e remo¸caõ tem uma pontua¸caõ (ou score) associada. Quanto maior a soma destas pontua¸co˜es melhor o alinhamento obtido, indicando que aquelas seq¨ uências possuem um bom grau de similaridade. O alinhamento que envolve mais de duas seq¨ uências é denominado alinhamento m´ ultiplo. Um alinhamento m´ ultiplo é definido de maneira semelhante ao de duas seq¨ uências. Seja s1 , · · · , sk um conjunto de seq¨ uências sobre um mesmo alfabeto. O alinhamento m´ ultiplo entre s1 , · · · , sk é obtido inserindo espa¸cos nas seq¨ uências de modo que elas fiquem to´ feito das do mesmo tamanho, não sendo permitida uma coluna apenas com espa¸cos. E um casamento entre os elementos (caracteres ou espa¸cos) que pertencem a uma mesma coluna, buscando maximizar a pontua¸caõ (Figura 2.1).. Figura 2.1. Alinhamento m´ ultiplo de 8 fragmentos de seq¨ uências de imunoglobulinas.. A pontua¸caõ de um alinhamento m´ ultiplo pode ser definida de várias formas. Uma delas, conhecida como SP, do inglês Sum-of-Pairs, consiste em atribuir uma pontua¸caõ.

(27) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 11. para cada coluna e tomar a soma destes valores como sendo a pontua¸caõ do alinhamento, onde a pontua¸caõ de uma coluna é dada pela soma das pontua¸co˜es de cada par de elementos. Em abordagens tradicionais, a complexidade temporal e espacial para construir alinhamentos m´ ultiplos torna-se exponencial [Setubal and Meidanis, 1997].. Na determina¸caõ da fun¸caõ de uma prote´ına é importante conhecermos quais as suas poss´ıveis formas de apresenta¸caõ a fim de determinarmos qual forma de análise é mais adequada. As prote´ınas podem ser consideradas em quatro n´ıveis de arquitetura (Figura 2.2): • Estrutura primária • Estrutura secundária • Estrutura terciária • Estrutura quaternária. Figura 2.2. Os quarto n´ıveis de arquitetura de uma prote´ına (figura retirada de [Branden and Tooze, 1999]).. Cada um desses n´ıveis é explicado nas subse¸co˜es seguintes. Adicionalmente são apresentadas defini¸co˜es de combina¸co˜es espec´ıficas de elementos de estrutura secundária, a saber motivos e dom´ınios. Tais estruturas são classificadas como estruturas intermediárias. 2.2.1. Estrutura Prim´ aria. Na estrutura primária, brevemente apresentada na se¸caõ anterior, as prote´ınas são representadas por subunidades monoméricas denominadas aminoácidos. Neste n´ıvel de.

(28) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 12. representa¸caõ, o arranjo espacial dos aminoácidos não é especificado. São em n´ umero de vinte os aminoácidos que ocorrem naturalmente nas diferentes formas de vida (Tabela 2.1). Estes aminoácidos são comumente denominados aminoácidos padrão, para diferenciálos daqueles modificados no interior das prote´ınas ou dos que estão no organismo mas não nas prote´ınas. Cada um dos vinte aminoácidos padrão, aqui referenciados simplesmente por aminoácidos, possui um grupo amino (N H2 ) e um grupo carboxil (COOH) ligados a um a´tomo de carbono (C), denominado Carbono α (Cα ). A diferen¸ca entre eles é determinada por sua cadeia lateral ou grupo R (Figura 2.3). Os grupos R influenciam, por exemplo, na solubilidade do aminoácido em a´gua e possuem diferentes estruturas, tamanhos e valências.. Figura 2.3. A estrutura básica de um aminoácido padrão.. Liga¸co˜es covalentes, denominadas pept´ıdicas, unem um certo n´ umero de aminoácidos durante a s´ıntese de prote´ınas. O n´ umero de prote´ınas envolvidas pode variar. Se este é pequeno, a cadeia resultante é denominada oligopept´ıdica. Se o n´ umero de aminoácidos envolvidos é grande então a cadeia é denominada polipept´ıdica. Os termos prote´ınas e cadeias polipept´ıdicas são intercambiáveis, embora os polipept´ıdios possuam pesos moleculares inferiores a dez mil daltons (um dalton é uma unidade de massa usual em bi1 oqu´ımica e é equivalente a 12 da massa do 12 C). As prote´ınas por sua vez não possuem esta limita¸caõ e podem ser definidas como uma macromolécula resultante da composi¸caõ de uma ou mais cadeias polipept´ıdicas. Durante a s´ıntese de prote´ınas, os aminoácidos que se ligam perdem uma molécula de a´gua, formada por um hidrogênio (H) do grupo amino com o hidroxil (OH) do grupo carboxil. Por esta razão, os aminoácidos nas prote´ınas são muitas vezes referenciados como res´ıduos. O grupo amino do primeiro aminoácido na cadeia polipept´ıdica e o grupo carboxil do u ´ltimo aminoácido permanecem intactos. O res´ıduo que está localizado na extremidade que exibe o grupo amino é denominado aminoterminal ou N-terminal. Na.

(29) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 13. outra extremidade, o res´ıduo que exibe o grupo carboxil é denominado carboxi-terminal ou C-terminal (Figura 2.4). A estrutura primária de uma prote´ına é convencionalmente lida da extremidade N-terminal para a C-terminal.. Figura 2.4. Liga¸co˜es covalentes na molécula de prote´ına. Três aminoácidos delimitados pelos átomos C e N são exibidos. Os c´ırculos pequenos representam átomos de hidrogênio.. A estrutura primária de uma prote´ına determina em muitos casos as suas propriedades. A mudan¸ca de apenas um de seus aminoácidos pode provocar a perda de sua fun¸caõ. A anemia que deforma as hemácias, por exemplo, ocorre devido a` substitui¸caõ do aćido glutâmico pela valina na sexta posi¸caõ da hemoglobina (os primeiros 26 aminoácidos da hemoglobina são mostrados na Figura 2.5). Devido a tal rela¸caõ busca-se inferir a estrutura tridimensional a partir da seq¨ uência de aminoácidos.. Figura 2.5. Parte inicial da estrutura primária da hemoglobina.. A sucessão de liga¸co˜es pept´ıdicas gera ainda uma outra forma de representar uma prote´ına: a cadeia principal (ou backbone). Os a´tomos que formam o backbone são o Cα , o grupo N H e o grupo carboxil ligados a este. A cadeia principal é completamente determinada em termos dos aˆngulos φ e ψ. Estes aˆngulos são definidos como rota¸co˜es sobre as liga¸co˜es Cα − N e Cα − C, respectivamente. Existe ainda o aˆngulo de rota¸caõ da liga¸caõ pept´ıdica, denominado ω, o qual tende a ser plano assumindo na maioria das vezes ´ importante observar que nesta representa¸caõ a disposi¸caõ o valor de 180o (Figura 2.6). E espacial dos a´tomos é considerada, o que não ocorre quando usamos a estrutura primária. 2.2.2. Estrutura Secund´ aria. Os arranjos recorrentes de res´ıduos no espa¸co são denominados estruturas secundárias. Estes elementos regulares podem ser distribu´ıdos em três classes: hélices α, folhas β e.

(30) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 14. Figura 2.6. Ilustra¸caõ dos aˆngulos φ, ψ e ω.. coils. Uma hélice α é um dos principais elementos de estrutura secundária, consistindo de um arranjo de aproximadamente dez a quarenta res´ıduos consecutivos em forma de uma hélice. A cadeia principal de uma hélice possui aˆngulos φ e ψ negativos, com valores t´ıpicos de −60o e −50o . Cada volta em uma hélice α possui em média 3, 6 res´ıduos. Liga¸co˜es de hidrogênio são observadas entre o grupo CO do i-ésimo res´ıduo na hélice e o grupo N H do res´ıduo i + 4 (Figura 2.7), sendo i uma posi¸caõ qualquer dos res´ıduos na hélice. Existem ainda varia¸co˜es de hélices cujas liga¸co˜es são realizadas entre os grupos do res´ıduo i com o i + 5 ou com o res´ıduo i + 3. Estas são chamadas hélices π e hélices 310 , respectivamente. Porém, tais varia¸co˜es não são energeticamente favoráveis e não ocorrem, portanto, tão freq¨ uentemente quanto as hélices α.. Figura 2.7. Representa¸co˜es [Branden and Tooze, 1999]).. esquemáticas. de. uma. hélice. α. (figura. retirada. de. Uma informa¸caõ importante sobre as hélices α diz respeito a` sua estabiliza¸caõ, que.

(31) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 15. é maior quando as hélices são colocadas juntas através de intera¸co˜es entre as cadeias laterais. Estas intera¸co˜es são maximizadas quando as hélices se conformam em um arranjo denominado coiled-coil, onde as hélices são enla¸cadas umas nas outras (Figura 2.8).. Figura 2.8. Hélices α [Branden and Tooze, 1999]).. na. conforma¸caõ. coiled-coil. (. figura. retirada. de. Diferentemente das hélices α, que são formadas por regiões cont´ıguas, as folhas β, são formadas pela combina¸caõ de várias regiões, denominadas fitas β (ou β strands). Tais elementos são formados por cinco a dez res´ıduos adjacentes e são ligados a outras fitas através de liga¸co˜es de hidrogênio que ligam o grupo CO de uma fita ao grupo N H de uma outra adjacente. Os valores t´ıpicos para os aˆngulos φ e ψ em uma folha β são −140o e 130o , respectivamente. A dire¸caõ bioqu´ımica, do N-terminal para o C-terminal, de duas fitas adjacentes pode ser a mesma ou alternada. No primeiro caso, a folha β formada é dita paralela e, no segundo caso, é classificada como antiparalela (Figura 2.9). Em folhas paralelas, normalmente, são encontrados res´ıduos hidrofóbicos em ambas as fitas, enquanto nas folhas antiparalelas eles são encontrados em apenas uma das fitas.. Figura 2.9. Folhas β. Em (a) representa¸caõ gráfica comumente utilizada. Em (b) podemos observar as liga¸co˜es antiparalelas (superior) e paralelas (inferior) entre as fitas (figura retirada de [Branden and Tooze, 1999]).. Um n´ umero considerável de folhas β encontradas em prote´ınas globulares encontramse “torcidas” (do inglês twisted), fenômeno que ocorre mais freq¨ uentemente em folhas antiparalelas do que em folhas paralelas. A tor¸caõ total da folha resulta em uma rota¸caõ relativa de 0o a 30o dos res´ıduos nas fitas (Figura 2.10)..

(32) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 16. Figura 2.10. Prote´ına tioredoxina da E. coli. As setas representam as fitas β (figura retirada de [Branden and Tooze, 1999]).. Diferentemente das hélices e folhas, os la¸cos (do inglês loops) são segmentos irregulares que podem assumir diferentes formas e tamanhos. La¸cos longos são dif´ıceis de serem caracterizados pelo método de raio-X e não são determinados por ressonância magnética nuclear, porém costumam estar envolvidos nas fun¸co˜es das prote´ınas. Os la¸cos conectam os outros elementos de estrutura secundária, podendo receber diferentes denomina¸co˜es dependendo dos elementos por ele ligados. Por exemplo, os la¸cos que ligam duas fitas β antiparalelas, num tipo de subestrutura rotulada β-hairpin, são chamados hairpin-loops (Figura 2.11). Além de conectar outras estruturas secundárias, os la¸cos podem participar na forma¸caõ de s´ıtios ativos e de liga¸caõ. Por exemplo, os s´ıtios de liga¸caõ ant´ıgenos nos anticorpos são formados por seis regiões de la¸cos. Varia¸co˜es de tamanho e de elementos na seq¨ uência de aminoácidos dos la¸cos resultam em anticorpos diferentes.. Figura 2.11. Representa¸caõ esquemática de um hairpin-loop..

(33) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 17. Os la¸cos localizam-se fora do n´ ucleo hidrofóbico da prote´ına. Eles podem ser encontrados na superf´ıcie da molécula, sendo compostos principalmente por res´ıduos hidrof´ılicos [Branden and Tooze, 1999]. Estas regiões não são tão estáveis quanto o n´ ucleo da prote´ına, estando mais suscet´ıveis a mudan¸cas durante a evolu¸caõ. Quando seq¨ uências de prote´ınas são alinhadas, as inser¸co˜es e remo¸co˜es ocorrem mais freq¨ uentemente nas regiões de la¸co. Apesar de sua natureza variável, as conforma¸co˜es dos la¸cos recaem em um conjunto limitado de estruturas. Alguns textos utilizam o termo la¸co para referenciar a uma terceira classe de elementos de estrutura secundária: os coils. Esta abrange os demais arranjos recorrentes que não estão inclu´ıdos nas duas primeiras classes (hélices α e folhas β), como por exemplo, as hélices que não são energeticamente favoráveis, como as π e 310 . 2.2.3. Estruturas Intermedi´ arias. Existem ainda alguns n´ıveis intermediários de estruturas, que são as estruturas supersecundárias e os dom´ınios. As estruturas supersecundárias, ou motivos (do inglês motifs), são conjuntos estáveis de elementos de estrutura secundária que formam arranjos particulares através de intera¸co˜es entre as cadeias laterais. Os motivos podem ocorrer várias vezes numa mesma prote´ına ou em prote´ınas diferentes, estando ou não associados a fun¸co˜es. Exemplos de estruturas supersecundárias associadas a fun¸co˜es são os motivos hélicela¸co-hélice. Estes podem efetuar tarefas diferentes, dependendo de seu arranjo geométrico, tais como liga¸caõ com moléculas de DNA (Figura 2.12.a) ou com a´tomos de cálcio (Figura 2.12.b). Um exemplo de motivo que não está associado a uma fun¸caõ é o β hairpin (Figura 2.13). Diferentes combina¸co˜es de motivos estruturais formam estruturas globulares denominadas dom´ınios. O n´ umero de combina¸co˜es dos motivos é limitado e alguns arranjos são energeticamente mais favoráveis do que outros. Os dom´ınios são regiões compactas que podem compreender de 40 a 400 aminoácidos, formando uma unidade estrutural distinta na região conservada da prote´ına (o n´ ucleo). Uma prote´ına pode ter um ou vários dom´ınios, os quais estão necessariamente associados a uma fun¸caõ, sendo estes utilizados na classifica¸caõ das estruturas tridimensionais ´ oportuno observar que na literatura da Bioinformática [Branden and Tooze, 1999]. E estes termos podem ter outras conota¸co˜es, sendo associados, por exemplo, a elementos caracter´ısticos de seq¨ uências..

(34) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 18. Figura 2.12. Em (a) um motivo ligante de DNA. Em (b) um motivo ligante de cálcio (figuras (a) e (b) retiradas de [Branden and Tooze, 1999]).. 2.2.4. Estruturas Terci´ aria e Quatern´ aria. Essencialmente, a estrutura terciária de uma prote´ına consiste na conforma¸caõ tridimensional dos elementos de estrutura secundária numa u ńica cadeia polipept´ıdica. Esta pode ser definida como a forma em que uma cadeia polipept´ıdica se dobra num u ńico ou em vários dom´ınios. Como foi dito anteriormente, podemos classificar a estruturas 3D das prote´ınas pela presen¸ca de certos dom´ınios. Um exemplo é a classifica¸caõ proposta por Levitt e Chothia [Levitt and Chothia, 1976] que propõe três grupos principais de estruturas: • Dom´ınios α: grupos de hélices α no n´ ucleo da prote´ına conectadas por la¸cos localizados na superf´ıcie (Figura 2.14, obtida em [Branden and Tooze, 1999]). • Dom´ınios β: o n´ ucleo é formado por folhas β antiparalelas, usualmente duas folhas conformadas como um sandu´ıche (Figura 2.15). Este dom´ınio é comum em enzimas, anticorpos e v´ırus. • Dom´ınios α/β: Composto principalmente por folhas β paralelas cercadas por hélices α (Figura 2.16, obtida em [Branden and Tooze, 1999]). Esta estrutura é comum em enzimas metabólicas. Uma outra pequena classe pode ainda ser considerada. Rotulada α + β, esta classe compreende principalmente hélices α segregadas e, numa outra parte do dom´ınio, algumas folhas β antiparalelas (Figura 2.17)..

(35) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. Figura 2.13. Prote´ına que [Branden and Tooze, 1999]).. 19. possui. dois. motivos. β. hairpin. (figura. retirada. de. A análise da estrutura tridimensional de uma prote´ına pode ser feita através de seus aˆngulos de torsão. Na conforma¸caõ espacial de uma cadeia polipept´ıdica as liga¸co˜es N-C α e Cα -C possuem um certo grau de liberdade para rotacionar. Tais rota¸co˜es, representadas pelos aˆngulos φ e ψ respectivamente (Figura 2.6), são restritas pelos contatos entre os a´tomos que compõem as cadeias laterais dos aminoácidos. No in´ıcio dos anos 60, G. N. Ramachandran [Ramachandran et al., 1963], [Ramachandran and Sasisekharan, 1968], propôs um modelo computacional para cadeias polipept´ıdicas pequenas onde os aˆngulos φ e ψ variavam sistematicamente em busca de conforma¸co˜es espaciais estáveis. Tais conforma¸co˜es foram propostas calculando probabilidade de ocorrência das combina¸co˜es desses aˆngulos, utilizando para isto a equa¸caõ de Arrhenius (Equa¸caõ .), onde A é um fator de freq¨ uência, ∆ξ é a varia¸caõ de energia, kB é a constante de Boltzmann e T a temperatura. A energia correspondente para cada conforma¸caõ foi obtida com base no conhecimento de distâncias interatômicas. Hipóteses sobre forma e parâmetros de potenciais interatômicos também foram seguidas [Cotterill, 2002]. −∆ξ. P = A · e kB T. (.). Os aˆngulos φ e ψ assumiam valores entre +180o e −180o , sendo as combina¸co˜es que levavam a colisões desconsideradas. As colisões são determinadas em fun¸caõ do campo elétrico que define o per´ımetro de cada a´tomo. Nas intera¸co˜es intermoleculares, os a´tomos.

(36) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 20. Figura 2.14. Exemplo de dom´ınio α.. Figura 2.15. Exemplo de dom´ınio β.. Figura 2.16. Exemplo de dom´ınio α/β.. Figura 2.17. Exemplo de dom´ınio α + β.. se aproximam uns dos outros buscando conforma¸co˜es de maior estabilidade. Uma colisão ocorre quando, para uma dada conforma¸caõ, a distância entre os a´tomos é menor que o raio de van der Waals, o qual é determinado a partir de medidas do espa¸camento atômico entre pares a´tomos não ligados em cristais (Figura 2.18). Em outras palavras, no modelo proposto por Ramachandran os a´tomos são tratados como esferas r´ıgidas cujas dimensões correspondem a seus raios de van der Waals. Os aˆngulos φ e ψ que levam a colisões correspondem a conforma¸co˜es não permitidas (ou pouco prováveis) para a cadeia polipept´ıdica. Os estudos realizados por Ramachandran levaram a` determina¸caõ de poss´ıveis valores de φ e ψ para cada estrutura recorrente na conforma¸caõ tridimensional de uma prote´ına, isto é, para os elementos de estrutura secundária, sendo tais valores listados a seguir: • hélice α (direita): −60o < ψ < +30o e −120o < φ < −30o • folha β: +90o < ψ < +180o e −180o < φ < −60o • hélice α (esquerda): 0o < ψ < +60o e +45o < φ < +90o A ocorrência ou não de colisões na análise de poss´ıveis conforma¸co˜es de prote´ınas é considerada no gráfico de Ramachandran (do inglês Ramachandran plot). Três regiões.

(37) ´ gicos 2.2 fundamentos biolo. 21. Figura 2.18. Raio de van der Waals.. são definidas neste gráfico: • N´ ucleo (core): Regiões onde não há colisões de van der Waals. Nelas são permitidas conforma¸co˜es hélices α (direita) e folhas β. • Permitida (allowed): Regiões aceitáveis onde raios ligeiramente menores que os de van der Waals são usados no cálculo, ou seja, é permitido que os a´tomos estejam um pouco mais próximos. • Não Permitida (disallowed): Regiões onde os a´tomos estão a uma distância bem menor que o raio de van der Waals. Um exemplo de gráfico de Ramachandran é exibido na Figura 2.19. Nesta, as regiões do tipo N´ ucleo são exibidas em cinza escuro, as regiões do tipo Permitida em cinza claro e as regiões do tipo Não Permitida em branco. Estes gráficos são utilizados para diversos fins. Por exemplo, na monitora¸caõ do progresso e refinamento da constru¸caõ do modelo da prote´ına, na identifica¸caõ de conforma¸co˜es pouco prováveis em modelos já existentes e na indica¸caõ de res´ıduos que ainda devem ser trabalhados. A utiliza¸caõ do gráfico se dá calculando, para cada res´ıduo que não está nas extremidades da cadeia, os aˆngulos φ e ψ do modelo proposto. Os aˆngulos determinam pontos que são marcados no gráfico, identificando assim res´ıduos que estão em regiões não permitidas..

(38) 2.3 fundamentos computacionais. 22. Figura 2.19. Gráfico de Ramachandran.. Atualmente, novos limites de varia¸caõ dos aˆngulos φ e ψ são utilizados, os quais foram definidos através da análise de diversas estruturas presentes no Protein Data Bank. A cada ano as regiões N´ ucleo, Permitida e Não Permitida tornam-se menores, aumentando assim a precisão na análise de estruturas. Prote´ınas com várias cadeias polipept´ıdicas têm ainda um n´ıvel adicional de arquitetura, a estrutura quaternária. Esta especifica os relacionamentos espaciais entre os polipept´ıdios ou subunidades destes. Cada subunidade pode executar uma fun¸caõ diferente ou elas podem agir cooperativamente para efetuar uma determinada fun¸caõ. 2.3. FUNDAMENTOS COMPUTACIONAIS. A presente se¸caõ introduz os principais conceitos computacionais utilizados nos problemas tratados neste trabalho, quanto a`s Redes Neurais Artificiais, utilizadas na Predi¸caõ de Estrutura Secundária, e sobre Grafos, estruturas utilizadas na Busca e Compara¸caõ de Estruturas Protéicas..

(39) 2.3 fundamentos computacionais 2.3.1. 23. Redes Neurais Artificiais. Uma breve introdu¸caõ a`s redes neurais artificiais é apresentada nesta subse¸caõ. A unidade básica de uma rede neural é explicada juntamente com uma das suas mais conhecidas arquiteturas, a Multilayer Perceptron. Em seguida é apresentado o algoritmo de treinamento mais utilizado nas diferentes abordagens para o problema da predi¸caõ de estrutura secundária, o backpropagation. Adicionalmente, exemplos de outros modelos de redes são brevemente explanados. 2.3.1.1 Apresenta¸c˜ ao Inspiradas em sistemas nervosos biológicos, como o cérebro humano, as Redes Neurais Artificiais (RNAs) são sistemas paralelos distribu´ıdos compostos por unidades de processamento denominadas nós (nodos ou ainda neurônios). Os nodos são responsáveis pelo cálculo de determinadas fun¸co˜es matemáticas, normalmente não lineares. Tais unidades são dispostas em uma ou mais camadas e interligadas por um grande n´ umero de conexões. Na maioria dos modelos, a estas conexões são associados pesos, os quais armazenam o conhecimento representado no modelo e servem para ponderar a entrada recebida por cada nodo da rede, ou seja, o peso indica a importância do sinal recebido para aquela entrada. O procedimento para a utiliza¸caõ de redes neurais na resolu¸caõ de problemas inicia-se pela apresenta¸caõ de um conjunto de exemplos a` rede, denominado conjunto de treinamento, a partir do qual é extra´ıda a informa¸caõ necessária para generalizar as caracter´ısticas do problema e, em seguida, fornecer respostas coerentes para dados não apresentados anteriormente. 2.3.1.2 Unidade B´ asica A unidade básica desse sistema, o nodo, é um modelo simplificado de um neurônio biológico. Um exemplo de tal modelo é o nodo MCP (Figura 2.20), proposto por McCulloch e Pitts [McCulloch and Pitts, 1943]. Neste modelo são apresentados p sinais de entrada, denotados por xi . Cada sinal xi é multiplicado por um valor wi , o peso. A soma ponderada dos valores de entrada corresponde a um n´ıvel de atividade do neurônio. Se o n´ıvel de atividade for superior a um determinado limite Θ, uma sa´ıda y de valor 1 será produzida. Caso contrário, a sa´ıda será o valor 0 (Equa¸caõ .). y=. (. P 1 se i wi x i > Θ 0 caso contrário. (.).