Análises de propriedades eletrostáticas e estruturais de complexos de proteínas para...

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FACULDADE DE CI ÊNCIAS FARMAC ÊUTICAS DE RIBEIR ÃO PRETO

An´alises de propriedades eletrost´aticas e estruturais

de complexos de prote´ınas para o desenvolvimento de preditores de

complexac¸˜ao em larga escala

Tulio Marcus Ribeiro Calixto

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FACULDADE DE CI ÊNCIAS FARMAC ÊUTICAS DE RIBEIR ÃO PRETO

An´alises de propriedades eletrost´aticas e estruturais

de complexos de prote´ınas para o desenvolvimento de preditores de

complexac¸˜ao em larga escala

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do T´ıtulo de Mestre em Ciências

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Area de Concentração: F´ısica Biológica

Orientado: Tulio Marcus Ribeiro Calixto

Orientador: Fernando Lu´ıs Barroso da Silva

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AUTORIZO A REPRODUÇ ÃO E DIVULGAÇ ÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETR ÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Calixto, Tulio Marcus Ribeiro

Análises de propriedades eletrostáticas e estruturais de complexos de prote´ınas para o desenvolvimento de preditores de complexação em larga escala. Riberão Preto, 2010.

228p.; 30cm.

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP - Área de concentração: F´ısica Biológica.

Orientador: da Silva, Fernando Lu´ıs Barroso.

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Tulio Marcus Ribeiro Calixto

Análises de propriedades eletrostáticas e estruturais de complexos de prote´ınas para o desenvolvimento de preditores de complexação em larga escala

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do T´ıtulo de Mestre em Ciências

´

Area de Concentração: F´ısica Biológica

Orientador: Fernando Lu´ıs Barroso da Silva

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr.

Instituic¸˜ao: Assinatura:

Prof. Dr.

Instituic¸˜ao: Assinatura:

Prof. Dr.

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Agradecimentos

Inicio agradecendo a Deus, pela minha vida e pela força nos momentos de desânimo e cansaço.

A minha fam´ılia pelo amor, carinho e compreensão durante todo o tempo de realização da minha pós-graduação, especialmente ao meu irmão José Simão Calixto Júnior, pela boa convivência e paciência para comigo.

Ao amigo Rodrigo Faccioli, pela hospedagem em São Carlos, estudos, parceria no desenvolvimento desoftwares, desabafos e pelas longas conversas e discussões acadêmicas e alheias.

Ao Centro de Informática de Ribeirão Preto, especialmente a minha chefe Clélia Cardoso Camargo, que sempre me apoiou durante a pós-gradução e ao amigo Ali Faiez Taha, pelas discussões, cr´ıticas e incentivo aos estudos.

Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Fernando Lu´ıs Barroso da Silva, que me iniciou na área de F´ısica Biológica e forneceu o conhecimento necessário para o desenvolvimento deste trabalho. Reconheço e agradeço a oportunidade, apoio, dedicação, paciência, confiança e amizade.

A todos os amigos que passaram pela república, André Lara, Lucas At´ılio, Fábio Marcondez, Leandro Nassif, Marco Antônio, L´ıvio Leite, Ivan Farjala, Rodrigo Takeuchi, Flávio Neto, Eduardo, José Regis, Guilherme e em especial Flávio Henrique Alves, por todo apoio nesta nova fase da minha vida que se iniciou no ano 2000, pelas conversas e reflexões noturnas, projetos, sonhos, festas, caronas pra Itaú de Minas, enfim todos os momentos alegres e outros nem tanto.

Aos colegas do laboratório de F´ısica Biológica, João Dalmolin, Ricardo, Lariani, Eliamar, André, pela amizade e companheirismo.

Aos membros da banca do exame geral de qualificação Prof. Dr. Antônio Caliri e Prof. Dr. Renato Tinós pela disponibilidade de ler, criticar e fazer valiosas su-gestões para a melhoria deste trabalho.

A todos os funcionários da seção de pós-graduação e a Faculdade de Ciências Far-macêuticas de Ribeirão Preto pelo oportunidade de cursar o mestrado.

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Resumo

CALIXTO, T. M. R.An´alises de propriedades eletrost´aticas e estruturais de complexos de

prote´ınas para o desenvolvimento de preditores de complexac¸˜ao em larga escala. 2010.

228f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,

Uni-versidade de S˜ao Paulo, Ribeir˜ao Preto, 2010.

Estudos teóricos dos mecanismos moleculares responsáveis pela formação e estabilidade de complexos moleculares vêm ganhando relevância pelas possibilidades práticas que oferecem, por exemplo, na compreensão de diversas doenças e no desenho racional de fármacos. Neste projeto, nossa ênfase está no estudo de complexos de prote´ınas, extra´ıdos do banco de dados de prote´ınas (PDB), onde desenvolvemos ferramentas computacionais as quais permitem efetuar análises em duas direções: 1) efetuar previsões básicas, através do emprego de propriedades ele-trostáticas de prote´ınas, em diferentes condições e n´ıveis preditivos e 2) realização de um con-junto de análises estat´ısticas, como freqüência de contato, em busca de preditores de complexos de prote´ınas e identificar padrões de interação entre seus aminoácidos em função da distância de separação. Com base nos resultados obtidos por ambos os estudos, objetivamos quantificar as forças f´ısicas envolvidas na formação dos complexos protéicos. O foco do projeto, a longo prazo, é prever o fenômeno da complexação através da fusão dessas duas linhas de estudos: pre-ditor básico de complexos protéicos e análise do potencial estat´ıstico entre os aminoácidos que formam o complexo. O presente projeto é conclu´ıdo com a construção de portaiswebque dis-ponibilizarão os resultados obtidos por nossos trabalhos bem como a possibilidade de qualquer usuário, efetuar consultas por propriedades de prote´ınas e/ou grupo de prote´ınas.

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Abstract

CALIXTO, T. M. R.Analysis of electrostatics and structural properties of protein

comple-xes to the development of complexation predictors in high-throughput computing. 2010.

228f. Dissertation (Master) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,

Univer-sidade de S˜ao Paulo, Ribeir˜ao Preto, 2010.

Theoretical studies of the molecular mechanisms responsible for the formation and stability of molecular complexes are gaining relevance for the practical possibilities that they offer, for example, in the understanding of diverse diseases and the rational drug design. In this project, our emphasis is on the study of protein complexes, extracted from the protein data bank (PDB). We have developed computational tools which allow to perform analyses in two directions: 1) to make basic complexation forecasts, through the use of electrostatic properties of proteins, in different conditions and predictive levels, and 2) to carry out a set of statistical analyses, as contacts frequency, in order to build up predictors of protein complexes and to identify patters of interactions between the amino acids as a function of their separation distance. Based on the results obtained on both studies, we aim quantify the physical forces involved in the formation of protein complexes. The focus of the project, in the long run, is to foresee the phenomenon of the protein complexes through the fusing of these two study lines: a coarse-grained predictor of protein complexes and analysis of the statistical potentials between the amino acids that form the complex. The present project is concluded with the construction of web services where we make available the results obtained on our works. This server also has the possibility to be used by any computer user, that wishes to perform search on protein and/or protein group properties.

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Lista de Figuras

1 Diagrama esquem´atico dos portais desenvolvidos. Elementos em cinza indicam as ferramentas que ser˜ao implementadas no futuro. . . 15

2 Ilustração esquemática de funcionamento dos portais web propostos neste tra-balho. . . 16

3 Estrutura geral de um amino´acido. . . 21

4 Relação dos 20 aminoácidos existentes na natureza, adaptado da referência (1). 22

5 Exemplo de um arquivo no formato ogm, utilizado como entrada pelo pacote MEAD v.2.2.7. . . 30

6 Ilustração esquemática de uma prote´ına inserida em uma rede para execução do método de diferenças finitas para a solução da EPBL. . . 30

7 Modelo relacional do banco de dados. . . 47

8 P´agina inicial do portalwebPROMETHEUS. Dispon´ıvel em: http://glu. fcfrp.usp.br/services.htm. . . 50

9 Ferramenta ”Single amino acid properties”. . . 51 10 Curvas de titulação e capacitância ideais em função do pH do aminoácido ácido

glutâmico (GLU), obtidas pela ferramenta ”Single Amino acid Properties”. . . . 52 11 Curva de titulação ideal do aminoácido ácido glutâmico (GLU). pKa= 4,4 (2). . 52

12 Curva da capacitância ideal em função do pH, do aminoácido ácido glutâmico (GLU). . . 53

13 Tela de aquisição de parâmetros para utilização da ferramenta “Single protein properties”. . . 54 14 Tela para apresentação dos resultados obtidos pela ferramenta “Single protein

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16 Curva da capacitância, em função do pH, da prote´ına lisozima (PDB: 2LZT). . 56

17 Tela para configuração dos parâmetros iniciais do portal PROMETHEUS. . . . 57

18 Tela para a especificação dos parâmetros f´ısico-qu´ımicos para entrada no pro-gramamultiflex. . . 58 19 Tela para apresentação das curvas de titulação e capacitância em função do pH,

geradas pela ferramenta “Single protein properties”. . . 58 20 Curva de titulação da prote´ına lisozima (PDB: 2LZT), no n´ıvel de predição

Poisson-Boltzmann. . . 59 21 Curva da capacitância, em função do pH, da prote´ına lisozima (PDB: 2LZT),

no n´ıvel de prediçãoPoisson-Boltzmann. . . 59 22 Tela para entrada dos parâmetros iniciais para a realização dos cálculos da

predição de complexação entre prote´ınas. . . 60

23 Tela para entrada dos parâmetros f´ısico-qu´ımicos para predição de complexos protéicos, no n´ıvel de predição ideal (anal´ıtico). . . 62

24 Tela para apresentação dos cálculos anal´ıticos de ∆Gele (em unidades de kBT)

em função da distância de separação (em ˚Angström) no pH 10,4 e doB23 em função do pH, em força iônica nula, para a complexação entre as prote´ınas liso-zima (PDB: 2LZT) e tirosina kinase (PDB: 1LCJ). . . 63

25 ∆Gele (anal´ıtico), no pH 10,4 e força iônica nula, para a complexação entre as prote´ınas lisozima (PDB: 2LZT) e tirosina kinase (PDB: 1LCJ). . . 64

26 B23(anal´ıtico) em função do pH, em força iônica nula, para a complexação entre as prote´ınas lisozima (PDB: 2LZT) e tirosina kinase (PDB: 1LCJ). . . 64

27 Tela para entrada dos parâmetros que serão utilizados para a construção dos arquivos de configuração utilizados pelo pacote MEAD para o cálculo dospKa’s

dos amino´acidos ioniz´aveis. . . 65

28 Tela para definição das condições experimentais das simulações com as estru-turas tridimensionais. . . 66

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30 Tela para apresentação do∆Gele, no pH 11,1 em força iônica igual a 0,01M, e do

B23, para a complexac¸˜ao entre as prote´ınas lisozima (PDB: 2LZT) e calbindina (PDB: 3ICB). . . 68

31 ∆Gele entre as prote´ınas calbindina (PDB: 3ICB) e lisozima (PDB: 2LZT), em forc¸a iˆonica igual a 0,01M. . . 69

32 B23 entre as prote´ınas calbindina (PDB: 3ICB) e lisozima (PDB: 2LZT). . . 69 33 Tela da ferramenta que permite criar um arquivo no formato PQR a partir de um

arquivo PDB. . . 71

34 Ferramenta “Create MEAD files”. . . 72 35 Tela para aquisição dos parâmetros experimentais, utilizados pela ferramenta

“Split proteins”. . . 73 36 Complexos de prote´ınas separados em prote´ınas independentes pela ferramenta

“Split proteins”. . . 74 37 Curvas de titulac¸˜ao ideal de cada prote´ına individual, presente no complexo

proteinase-inibidor (PDB: 2PTC). . . 75

38 Curvas de capacitância ideal em função do pH de cada prote´ına individual, pre-sente no complexo proteinase-inibidor (PDB: 2PTC). . . 75

39 Tela de aquisição dos parâmetros utilizados pela ferramenta “Find best case”. . 76 40 Tela para apresentação do resultado obtido pela ferramenta “Find best case”,

para um conjunto de prote´ınas, no pH 7,5. . . 77

41 Ferramenta que efetua a preparac¸˜ao inicial de um arquivo no formato PDB. . . 79

42 Exemplo de um arquivo no formato PDB após ser processado pela ferramenta “Clean PDB”. . . 80 43 Tela inicial para ordenação de prote´ınas e/ou complexos de prote´ınas pelo pI. . 81 44 Tela para entrada dos parâmetros f´ısico-qu´ımicos utilizados para a predição da

complexac¸˜ao entre duas prote´ınas. . . 82

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48 Tela para inserção dos códigos PDB’s dos complexos de prote´ınas que serão analisados pela ferramenta “Statistical potential” do portal MOLESA. . . 85 49 Tela para configuração dos parâmetros que serão utilizados pela ferramenta

“Statistical potential”. . . 87 50 Ilustração de um complexo protéico esquemático formado por duas prote´ınas

(representadas pelas cadeiasAeB) para a realização do cálculo da distância de separação entre os res´ıduos presentes em cada prote´ına. . . 87

51 Ilustração do contador de freqüências entre os aminoácidos i e j de um complexo protéico esquemático. . . 88

52 Freqüência de contatos e potencial de força média entre os res´ıduosie j. . . 89 53 Freqüência de contatos (com e sem normalização) entre os res´ıduosie j. . . 90 54 Potencial de força média entre os res´ıduosie j, normalizados de forma

proba-bil´ıstica e com base na FDR. . . 90

55 Curva de titulação ideal do aminoácido alanina (ALA). . . 94

56 Curva da capacitância ideal em função do pH, do aminoácido alanina (ALA). . 95

57 Curva de titulação ideal do aminoácido arginina (ARG). pKa= 12,0 (2). . . 96

58 Curva da capacitância ideal em função do pH, do aminoácido arginina (ARG). . 96

59 Comparação entre as curvas de titulação teórica e experimental da prote´ına li-sozima (PDB: 2LZT) em força iônica igual a 0,1M. . . 97

60 Comparação entre as curvas de titulação teóricas obtidas analiticamente e por simulação Monte Carlo da prote´ına calbindina (PDB: 3ICB) em força iônica nula. 98

61 Comparação entre a titulação ideal (curva vermelha), obtida pelo portal PROMETHEUS, e titulação MA, obtida por simulação Monte Carlo (curva verde - concentração da prote´ına: 150µM; concentração de sal: 0,15M (3)) da prote´ınaβ-lactoglobulina (PDB: 1BEB). pIexperimental: 5,18 (4). . . 99 62 Comparação entre a capacitância ideal em função do pH, da prote´ına lisozima

(PDB: 2LZT) provida pelo portal PROMETHEUS e a obtida da referˆencia (5). . 100

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64 RMSD dos pKa’s da lisozima (PDB: 2LZT) em func¸˜ao de diferentes valores de

EPSIN para o campo de força AMBER99. A concentração de sal foi variada de 0,01M a 0,15 M. A temperatura e a constante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K e 80, respectivamente. Os dados experimentais das referências (6–8) foram usados para o cálculo do RMSD. . . 115

65 RMSD dos pKa’s da BPTI (PDB: 4PTI) em func¸˜ao de diferentes valores de

EPSIN para o campo de força GROMOS96. A concentração de sal foi variada de 0,01M a 0,15 M. A temperatura e a constante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K e 80, respectivamente. Os dados experimentais das referências (9–12) foram usados para o cálculo do RMSD. . . 116

66 RMSD dos pKa’s da lisozima (PDB: 2LZT) em forc¸a iˆonica igual a 0,1M em

função de diferentes valores de EPSIN para os campos de força GROMOS96 e AMBER99. A temperatura e a constante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K e 80, respectivamente. Os dados experimentais das referências (6–8) foram usados para o cálculo do RMSD. . . 117

67 RMSD dos pKa’s da BPTI (PDB: 4PTI) em forc¸a iˆonica igual a 0,1M em

função de diferentes valores de EPSIN para os campos de força GROMOS96 e AMBER99. A temperatura e a constante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K e 80, respectivamente. Os dados experimentais das referências (9–12) foram usados para o cálculo do RMSD. . . 117

68 Comparação entre a titulação ideal e a titulação baseada na estrutura 3D (PB e MC), para a cabindina (PDB: 3ICB). pI experimental: 4,5 (14). Os dados de MC foram retirados da referência (15). . . 119

69 Comparação entre a capacitância ideal e a capacitância baseada na estrutura 3D (PB e MC) em função do pH, para a cabindina (PDB: 3ICB). Os dados de MC foram retirados da referência (15). . . 119

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71 Curva de titulação da prote´ına lisozima (PDB: 2LZT), em várias concentrações de sal. A temperatura, a constante dielétrica da prote´ına e a constante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K, 40 e 80, respectivamente. Campo de força: GROMOS96. . . 122

72 Curva de titulação da prote´ına calbindina (PDB: 3ICB), em várias concentrações de sal. A temperatura, a constante dielétrica da prote´ına e a cons-tante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K, 40 e 80, respectivamente. Campo de força: GROMOS96. . . 122

73 Comparação do∆Gele do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), com e sem o mecanismo de regulação de cargas em força iônica igual a 0,01M. . . 123

74 Comparação do B23, do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), com e sem o mecanismo de regulação de cargas em força iônica igual a 0,01M. . . 124

75 Curva de titulação do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), separado em duas prote´ına, em força iônica nula. . . 125

76 Curva da capacitância em função do pH, do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), separado em duas prote´ına, em força iônica nula. . . 125

77 Curvas de titulação de cada prote´ına que forma o complexo protético tripsina– inibidor (PDB: 2PTC). . . 126

78 Curvas da capacitˆancia de cada prote´ına que forma o complexo prot´etico tripsina–inibidor (PDB: 2PTC). . . 127

79 ∆Gele formando o complexo protéico tripsina–inibidor (PDB: 2PTC). O pH foi fixado em 10 e força iônica nula. . . 127

80 B23 formando o complexo prot´eico tripsina–inibidor (PDB: 2PTC). pH experimental:10 (16, 17). . . 128

81 Comparação do ∆Gele do complexo HyHEL-10 Fab–lisozima (PDB: 3HFM), com e sem o mecanismo de regulação de cargas. O pH e a força iônica foram fixados 10,6 e 0,01M, respectivamente. . . 129

82 Comparação do B23, do complexo HyHEL-10 Fab–lisozima (PDB: 3HFM), com e sem o mecanismo de regulação de cargas em força iônica igual a 0,01M. 129

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84 ∆Gele do complexo formado por duas lisozimas (PDB: 2LZT) com e sem o mecanismo de regulação de cargas, em força iônica nula e 0,01M. O pH, a temperatura e a constante dielétrica do solvente foram fixados em 10,6, 298,15 K e 78,5, respectivamente. . . 131

85 ∆Gele, nos n´ıveis de predição anal´ıtico ePoisson-Boltzmann, do complexo for-mado por duas lisozimas (PDB: 2LZT) com e sem o mecanismo de regulação de cargas em força iônica igual a 0,01M. A temperatura, a constante dielétrica da prote´ına e a constante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K, 40 e 80, respectivamente. O pH foi mantido constante em 10,6 para os cálculos anal´ıticos e 11,2 para os cálculos utilizando PB. Campo de força: GROMOS96. 132

86 B2 de complexação entre duas lisozimas (PDB: 2LZT), com o mecanismo de regulação de cargas, em vários regimes de força iônica. . . 133

87 Comparação do B2 de complexação entre duas lisozimas (PDB: 2LZT), nos n´ıveis de predição anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,005M. Nos cálculos por PB, εpfoi definido como igual a 40. Os campos

de força estão citados nas legendas das curvas do próprio gráfico. Os dados experimentais foram obtidos da referência (18). . . 133

88 Comparação do B2 de complexação entre duas lisozimas (PDB: 2LZT), nos n´ıveis de predição anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,1M. Nos cálculos por PB, εp foi definido como igual a 40. Os campos

de força estão citados nas legendas das curvas do próprio gráfico. Os dados experimentais foram obtidos da referência (18). . . 134

89 Comparação do B2 de complexação entre dois quimotripsinogênios (PDB: 1CHG), nos n´ıveis de predição anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,005M. Nos cálculos por PB,εpfoi definido como igual a

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90 Comparação do B2 de complexação entre dois quimotripsinogênios (PDB: 1CHG), nos n´ıveis de predição anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,01M e 0,005. Nos cálculos por PB,εpfoi definido como

igual a 40. As cargas foram definidas de acordo com o campo forc¸a AMBER99. Os dados experimentais foram obtidos da referˆencia (18). . . 136

91 Comparação do B2, com e sem o potencial de dispersão de Hamaker, de complexação entre duas lisozimas (PDB: 2LZT), com o mecanismo de regulação de cargas e força iônica nula. . . 137

92 Comparação do∆Gele com e sem o mecanismo de regulação de cargas. O pH foi fixado em 4,5 e força iônica nula. . . 138

93 Freqüência de contatos entre os res´ıduos ALA–ALA para as prote´ınas dos conjuntos 3, 4, 5 e controle. A normalização das curvas seguiu o critério 1. Os conjuntos estão especificados nas legendas no interior do gráfico. . . 141

94 Freqüência de contatos entre os res´ıduos GLU–GLU para as prote´ınas dos conjuntos 3, 4, 5 e controle. A normalização das curvas seguiu o critério 1. Os conjuntos estão especificados nas legendas no interior do gráfico. . . 142

95 Freqüência de contatos entre os res´ıduos ILE–VAL para as prote´ınas dos conjuntos 3, 4, 5 e controle. A normalização das curvas seguiu o critério 1. Os conjuntos estão especificados nas legendas no interior do gráfico. . . 142

96 PFM obtido a partir da freqüência de contatos entre os res´ıduos ALA-ALA presentes nas prote´ınas pertencentes aos conjunto 3, 4, 5 e controle. A normalização foi feita pelo critério 1. . . 143

97 PFM obtido a partir da freqüência de contatos entre os res´ıduos GLU-GLU presentes nas prote´ınas pertencentes aos conjunto 3, 4, 5 e controle. A normalização foi feita pelo critério 1. . . 144

98 PFM obtido a partir da freqüência de contatos entre os res´ıduos ILE-VAL presentes nas prote´ınas pertencentes aos conjunto 3, 4, 5 e controle. A normalização foi feita pelo critério 1. . . 144

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100 PFM obtido a partir da freqüência de contatos entre os res´ıduos GLU-GLU presentes nas prote´ınas pertencentes aos conjunto 3, 4, 5 e controle. A normalização foi feita pelo critério 2. . . 145

101 PFM obtido a partir da freqüência de contatos entre os res´ıduos ILE-VAL presentes nas prote´ınas pertencentes aos conjunto 3, 4, 5 e controle. A normalização foi feita pelo critério 2. . . 146

102 Comparação entre os critérios de normalização 1 e 2 no cálculo do PFM entre os res´ıduos ALA–ALA presentes nas prote´ınas pertencentes ao conjunto controle. 147

103 Modelo do arquivo de informações criado após a conclusão do processamento da ferramenta “Single protein properties”, para o cálculo da titulação ideal da prote´ınaβ-lactoglobulina bovina (PDB: 1BEB). . . 151

104 Ilustração do modelo MVC (Model View Control) utilizado no desenvolvimento dos portaisweb. . . 153 105 Organização do sistema em relação à origem da fonte de dados que serão

pro-cessados. . . 154

106 Exemplo de um arquivo no formato PQR, mostrando o primeiro amino´acido de uma prote´ına. . . 188

107 Exemplo de um arquivo de configuração no formatosites. . . 189 108 Exemplo de um arquivo de configuração no formato st do aminoácido ácido

glutâmico (GLU). Neste exemplo utilizamos o campo de força AMBER99 para prover as cargas e os raios de cada átomo. . . 189

109 Exemplo de um arquivo de configuração no formatomgm. . . 190 110 Estrutura gerada pela classePDBParser, obtida do tutorial do Biopython v.1.52. 193 111 Arquivos no formato st utilizando o campo de força GROMOS96, conforme

proposto pela referˆencia (19). . . 197

112 Arquivos no formatostutilizando o campo de forc¸a AMBER99, conforme pro-posto pela referˆencia (20). . . 198

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Lista de Tabelas

1 Valores depKa’s dos amino´acidos “isolados” obtidos experimentalmente a

tem-peratura de 25◦C. . . 38

2 Valores do raio, volume e peso molecular de cada amino´acido. . . 41

3 Comparação entre os pI’s experimentais e os calculados pelo PROMETHEUS no n´ıvel anal´ıtico. Os dados experimentais foram obtidos da referência (21). . . 95

4 Comparação entre os pontos isoelétricos experimentais e teóricos, com os cal-culados pelo PROMETHEUS no n´ıvel de predição anal´ıtico. . . 101

5 Comparac¸˜ao dos valores de pKa’s da prote´ına lisozima em diversas

concentrações de sal, alterando-se a constante dielétrica da prote´ına (εp). A

última coluna apresenta os pKa’s obtidos pelo serviço H++ e a penúltima os

pKa’s experimentais. A temperatura e a constante diel´etrica do solvente foram

fixadas em 298,0 K e 80,0, respectivamente. Dados obtidos utilizando o campo de forc¸a GROMOS96. . . 103

6 Comparac¸˜ao dos valores de pKa’s da prote´ına lisozima em diversas

concentrações de sal, alterando-se a constante dielétrica da prote´ına (εp). A

última coluna apresenta os pKa’s obtidos pelo serviço H++ e a penúltima os

pKa’s experimentais. A temperatura e a constante diel´etrica do solvente foram

fixadas em 298,0 K e 80,0, respectivamente. Dados obtidos utilizando o campo de forc¸a AMBER99. . . 104

7 Comparação dos valores de pKa’s da prote´ına BPTI em diversas concentrações

de sal, alterando-se a constante diel´etrica da prote´ına (εp). A ´ultima coluna

apre-senta os pKa’s obtidos pelo servic¸o H++ e a pen´ultima os pKa’s experimentais.

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8 Comparação dos valores de pKa’s da prote´ına BPTI em diversas concentrações

de sal, alterando-se a constante diel´etrica da prote´ına (εp). A ´ultima coluna

apre-senta os pKa’s obtidos pelo servic¸o H++ e a pen´ultima os pKa’s experimentais.

A temperatura e a constante diel´etrica do solvente foram fixadas em 298,0 K e 80,0, respectivamente. Dados obtidos utilizando o campo de forc¸a AMBER99. . 106

9 Comparac¸˜ao dos valores de pKa’s dos res´ıduos lisina presentes na prote´ına

cal-bindina, alterando-se a constante diel´etrica da prote´ına (εp). A ´ultima coluna

apresenta os pKa’s medidos experimentalmente. A forc¸a iˆonica, a temperatura

e a constante diel´etrica do solvente foram fixadas em 0,1M, 298,0K e 78,5, res-pectivamente. Dados obtidos utilizando o campo de forc¸a GROMOS96. . . 108

10 Comparação dos valores de pKa’s dos res´ıduos ácido glutâmico presentes na

prote´ına calbindina, alterando-se a constante diel´etrica da prote´ına (εp). A

última coluna apresenta os pKa’s medidos experimentalmente. A força iônica,

a temperatura e a constante diel´etrica do solvente foram fixadas em 1M, 298,0K e 77,8, respectivamente. Dados obtidos utilizando o campo de forc¸a GROMOS96.109

11 Comparac¸˜ao dos valores de pKa’s dos res´ıduos presentes na prote´ına

ribonucle-ase A (PDB: 3RN3), em várias concentrações de sal, alterando-se a constante dielétrica da prote´ına (εp). A penúltima coluna apresenta os pKa’s medidos

experimentalmente e a ´ultima, os pKa’s preditos pelo servic¸owebPCE. A

tem-peratura e a constante diel´etrica do solvente foram fixadas em 298,0K e 80, respectivamente. Dados obtidos utilizando o campo de forc¸a GROMOS96. . . . 110

12 Comparação dos valores de pKa’s da prote´ına lisozima obtidos pelo serviço

H++ e PROMETHEUS alterando-se a constante diel´etrica da prote´ına (εp). A

´ultima coluna apresenta os pKa’s medidos experimentalmente. Dados obtidos

utilizando o campo de forc¸a AMBER99. . . 113

13 Comparação dos valores de pKa’s da prote´ına BPTI obtidos pelo serviço H++ e

PROMETHEUS alterando-se a constante diel´etrica da prote´ına (εp). A ´ultima

coluna apresenta os pKa’s medidos experimentalmente. Dados obtidos

utili-zando o campo de forc¸a AMBER99. . . 114

(19)

15 Códigos PDBs dos complexos protéicos utilizados no cálculo da freqüência de contato em função da distância de separação entre os res´ıduos de aminoácidos presentes em cadeias distintas da prote´ına. . . 140

16 Relação dos conjuntos de prote´ınas e os respectivos erros encontrados em relação ao conjunto controle, exibidos na Tabela 15. . . 148

17 Quantidade de cada res´ıduo presente nos conjuntos de prote´ınas exibidos na Tabela 15. . . 148

18 Comparativo entre o uso de banco de dados e arquivos texto a respeito da organização, armazenamento e recuperação de dados. . . 150

19 Comparac¸˜ao dos valores de pKa’s da prote´ına lisozima (distribu´ıdo junto

com o pacote MEAD) e os providos pelo PROMETHEUS com o parˆametro

epsave oldway. . . 163 20 Comparac¸˜ao dos valores de pKa’s da prote´ına lisozima, distribu´ıdo junto

com o pacote MEAD e os providos pelo PROMETHEUS sem o parˆametro

(20)

Lista de Algoritmos

1 Pseudocódigo utilizado para realizar a normalização dos dados, pelo critério 1. p. 92

2 Pseudoc´odigo do algoritmo utilizado para realizar o c´alculo do grau de

dissociação de um próton (αi) de um aminoácidoi. . . p. 157

(21)

Lista de abreviaturas e siglas

ATOM Atomo.´ Campo pertencente ao arquivo no formato PDB que contém as coordenadas atômicas dos átomos presentes nos grupos de aminoácidos padrões.

BPTI Basic pancreatic trypsin inhibitor (inibidor da tripsina pancre´atica b´asica).

Cr Creighton.

DM Dinˆamica molecular.

EPB Equação dePoisson-Boltzmann. EPBL Equação dePoisson-Boltzmannlinear. EPSIN Constante dielétrica do soluto.

EPSSOL Constante dielétrica do solvente. FDR Função de distribuição radial.

GNU General public license(licenc¸a p´ublica geral).

GRASP Graphical representation and analysis of surface-properties

(representação gráfica e análises das propriedades de superf´ıcie). GROMACS Groningen machine for chemical simulations(máquina de

Gronin-gen para simulac¸˜oes qu´ımicas).

GROMOS Groningen molecular simulation(simulac¸˜ao molecular de Gronin-gen).

(22)

HTML HyperText Markup Language(Linguagem de marcac¸˜ao de texto).

MA Modelo atom´ıstico.

MC Monte Carlo.

MDC Mapas de contato.

MEAD Macroscopic electrostatics with atomic detail (eletrost´atica ma-crosc´opica com detalhes atom´ısticos).

MI M´etodos inversos.

MJ Miyazawa e Jernigan.

MOLESA Molecular structures analysis(an´alise de estruturas molecular). MVC Model view control(modelo vis˜ao controle).

NBO N´ıvel deBorn-Oppenheimer. NMM N´ıvel deMcMillan-Mayer.

NMR Nuclear magnetic resonance(ressonância magnética nuclear). NS N´ıvel deSchrödinger.

NT Nozaki e Tanford.

PDB Protein data bank(banco de dados de prote´ınas).

PDBid Código de identificação de uma prote´ına utilizado pelo PDB. PFM Potencial de força média.

PROMETHEUS Protein-Protein complexes by macroscopic electrostatic theories and user-friendly simulations(complexos prote´ına-prote´ına por te-oria eletrostática macroscópica e simulações amigáveis).

(23)

Lista de s´ımbolos

∆Gele Variação da energia livre eletrostática de complexação (dada em unidades de kBT).

αi Grau de dissociação de um aminoácidoi.

λ Parˆametro de carregamento.

φ(r) Potencial eletrostático em uma determinada posiçãor.

ρ(r) Densidade de carga média na posiçãor.

σ Distância m´ınima de separação entre duas prote´ınas.

ε0 Constante diel´etrica do v´acuo (ε0=8,85.10−12C2/Nm2).

εp Constante diel´etrica do interior da prote´ına.

εs Constante diel´etrica do solvente (para H2O,εs=77,8, em T = 298

K).

◦_C _{Grau Celsius.}

a Coeficiente de atividade qu´ımica.

B23 Segundo coeficiente cruzado de virial.

B23(ele) Termo eletrost´atico do segundo coeficiente cruzado de virial.

B23(er) Termo repulsivo do segundo coeficiente cruzado de virial.

B2 Segundo coeficiente de virial.

Cideal Capacitˆancia ideal de uma prote´ına.

C_aideal Capacitˆancia ideal de um amino´acidoa.

CMpx Coordenada no eixo X do centro geom´etrico de uma prote´ına.

CMpy Coordenada no eixo Y do centro geom´etrico de uma prote´ına.

CMpz Coordenada no eixo Z do centro geom´etrico de uma prote´ına.

d Distância do átomo mais distante do centro geométrico da prote´ına (em ˚Angström).

dr Variação da distância de separação entre duas prote´ınas.

dx Distância no eixo X em relação ao centro geométrico da prote´ına.

dy Distância no eixo Y em relação ao centro geométrico da prote´ına.

(24)

e Carga elementar (e=1,6.10−19C).

gi j(r) Função de distribuição radial dos res´ıduosie j.

gi j(r)∗ Freqüência de contatos entre os res´ıduosi e j na distância r (em

˚

Angstr¨om).

I Forc¸a iˆonica do meio.

K Constante de equil´ıbrio termodinˆamica.

k Inverso do comprimento deDebye.

Ka Constante de equil´ıbrio termodinˆamica de um amino´acidoa.

kB Constante deBoltzmann(kB = 1,381.10−23JK−1).

L Tamanho do lado da caixa de simulação utilizada para a resolução da EPBL, utilizando o método das diferenças finitas.

lBox Tamanho do lado de cada elemento cúbico da rede de simulação

utilizada para resolução da EPBL, utilizando o método das diferenças finitas.

lB Comprimento deBjerrum.

Nσ Taxa empregada para o aumento da distância de separação entre duas prote´ınas.

Na N´umero de Avogadro (Na=6,02.1023mol−1).

NBox Quantidade de elementos cúbicos presentes na caixa de simulação

utilizada para resolução da EPBL, utilizando o método das diferenças finitas.

ni Densidade de ´ıons do tipoipor unidade de volume em uma dada

regi˜ao do espac¸o.

n0_i Densidade de ´ıons do tipoipor unidade de volume para o seio da soluc¸˜ao.

pH Potencial hidrogeniˆonico.

pI Ponto isoel´etrico de uma mol´ecula.

pK Forma logar´ıtma da constante de equil´ıbrio termodinˆamica.

pKa Forma logar´ıtma da constante de equil´ıbrio termodinˆamica de um

amino´acido da esp´eciea.

qi Carga correspondente ao ´ıoni.

r Distância de separação entre duas prote´ınas (em ˚Angström).

r′ Próxima distância de separação entre duas prote´ınas.

(25)

RF Distância máxima de separação entre duas prote´ınas.

T Temperatura absoluta em Kelvin (K).

wi j(r) Potencial de força média em função da distância de separação r

entre os res´ıduosie j.

z Valˆencia de um amino´acido.

zi Valˆencia de um amino´acidoi.

(26)

Sum´ario

Resumo i

Abstract ii

Lista de figuras iii

Lista de tabelas xi

Lista de algoritmos xiv

Lista de abreviaturas e siglas xv

Lista de s´ımbolos xvii

1 INTRODUÇ ÃO E REVIS ÃO DA LITERATURA 1

1.1 Biocomputac¸˜ao . . . 1

1.2 Ferramentas para Biologia Estrutural . . . 3

1.2.1 Banco de dados de prote´ınas . . . 3

1.2.2 Validac¸˜ao de estruturas de prote´ınas . . . 3

1.2.3 Serviços dispon´ıveis naweb . . . 4 1.3 A importância dos complexos protéicos . . . 7

1.4 Abordagem do problema . . . 9

1.4.1 Estrat´egia 1: Propriedades eletrost´aticas de prote´ınas . . . 12

1.4.2 Estratégia 2: Análise de propriedades estruturais para a construção de potenciais estat´ısticos . . . 13

(27)

1.5 Sumário de nossas contribuições . . . 16

2 OBJETIVOS 18

3 ASPECTOS IMPORTANTES SOBRE PROTE´INAS 20

3.1 Amino´acidos . . . 21

3.2 Ligac¸˜oes pept´ıdicas . . . 21

3.3 Estrutura prim´aria de prote´ınas . . . 22

3.4 Estrutura secund´aria de prote´ınas . . . 23

3.5 Estrutura terci´aria de prote´ınas . . . 23

3.6 Estrutura quatern´aria de prote´ınas . . . 23

3.7 Métodos para determinação da estrutura tridimensional das prote´ınas . . . 23

4 TRABALHANDO COM INFORMAÇ ÕES BIOL ÓGICASIN SILÍCIO 25

4.1 N´ıveis de detalhamento do modelo . . . 25

4.2 Modelagem do sistema . . . 26

4.3 Soluc¸˜ao do modelo . . . 26

4.4 Equação dePoisson-Boltzmann . . . 27 4.4.1 Método das diferenças finitas . . . 29

4.5 Função de distribuição radial . . . 31

4.6 Potencial de forc¸a m´edia . . . 31

4.7 Campos de forc¸a . . . 32

5 MATERIAL E M ´ETODOS 34

5.1 Teoria . . . 34

5.1.1 Equil´ıbrio ´acido-base . . . 34

5.1.2 C´alculo de pKa’s em prote´ınas . . . 35

(28)

5.1.4 N´ıvel de predição ideal (anal´ıtico) – Predição a partir da seqüência primária da prote´ına . . . 37

5.1.5 N´ıvel de predição baseado na estrutura 3D da prote´ına – através da utilização da EPBL . . . 43

5.1.6 Análise da freqüência de contatos entre os aminoácidos de complexos protéicos do PDB e potencial estat´ıstico . . . 44

5.2 Infra-estrutura computacional . . . 45

6 FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS DESENVOLVIDAS 49

6.1 Estrat´egia 1: Desenvolvimento de um portal web que permite o estudo de propriedades eletrost´aticas em prote´ınas . . . 49

6.1.1 Cadastramento . . . 50

6.1.2 Propriedades dos aminoácidos isolados (Single amino acid properties) . . . 51 6.1.3 Propriedades de prote´ınas isoladas (Single protein properties) . . . 53 6.1.4 Interação Prote´ına-Prote´ına (Protein-protein interaction) . . . 60 6.1.5 Ferramentas auxiliares desenvolvidas (Tools) . . . 70 6.2 Estratégia 2: Desenvolvimento de um portal web que permite a análise da

freqüência de contatos entre os aminoácidos que formam um complexo protéico . 85

6.2.1 Funcionamento do portal MOLESA . . . 91

7 RESULTADOS 93

7.1 O portal PROMETHEUS - predição com base nas propriedades eletrostáticas das prote´ınas . . . 93

7.1.1 Validação das propriedades eletrostáticas dos aminoácidos . . . 94

7.1.2 Validação das propriedades eletrostáticas de prote´ınas . . . 97

7.2 Interac¸˜ao prote´ına–prote´ına . . . 123

7.2.1 Mecanismo de regulac¸˜ao de cargas . . . 137

7.3 O portal MOLESA - an´alise estrutural de complexos de prote´ınas . . . 139

(29)

8.1 Enfoque computacional . . . 149

8.1.1 An´alise da complexidade de algoritmos . . . 157

8.2 Enfoque f´ısico . . . 159

8.2.1 Critérios para a predição dos pKa’s dos aminoácidos ionizáveis . . . 161

9 CONCLUS ˜AO E TRABALHOS FUTUROS 166

9.1 Perspectivas de Trabalho Futuro . . . 167

REFER ˆENCIAS 169

Apêndice A -- Avaliação dos serviços dispon´ıveis naweb 182

Apêndice B -- Descrição das principais classes desenvolvidas 184

Apêndice C -- Descrição dos programas auxiliares utilizados 187

C.1 MEAD . . . 187

C.2 Biopython . . . 192

C.3 GROMACS . . . 194

C.4 PDB2PQR . . . 195

Apêndice D -- Criação dos arquivos no formatostem função do campo de força 196

(30)

1 INTRODUC

¸ ˜

AO E REVIS ˜

AO DA

LITERATURA

1.1 Biocomputac¸˜ao

A enorme profusão de dados de seqüência e estruturais, gerados nas últimas décadas, levaram a criação de um novo campo de investigação, o da Bioinformática, o qual é definido genericamente como estando na interseção entre a Biotecnologia e a Ciência da Computação (22).

Segundo a revista ERCIM News No. 43, de Outubro de 2000 (23), Biologia Com-putacional e Bioinformática são termos utilizados em um campo interdisciplinar unindo a informação tecnológica com a biológica, que por sua vez tem crescido rapidamente durante os últimos anos. Este campo é localizado entre duas áreas: cient´ıfica e tecnológica, no qual a Biologia Computacional refere-se à parte mais cient´ıfica desde campo, empregando as técnicas computacionais para a Biologia Molecular, enquanto que a Bioinformática é mais voltada à parte de infra-estrutura computacional e análises estat´ısticas dos dados, embora na prática há uma grande sobreposição entre suas atividades.

Combinando caracter´ısticas dessas duas áreas afins, temos o que nós chamamos de Biocomputação1, que compreende ao desenvolvimento de aplicações computacionais (softwares) aplicadas para o entendimento de sistemas biológicos, e que ofereçam facilidade de uso de forma a dispensar o conhecimento profundo na área das ciências da computação para a utilização das mesmas por um público externo, provendo ao mesmo tempo a infra-estrutura necessária para que as operações realizadas em dados biológicos sejam executadas emlarga escala.

1_{Entendemos que o termo “Biocomputação” (24, 25) é mais abrangente do que “Bioinformática” [esse}

(31)

Dentro deste contexto de conceituação da Biocomputação, é notável que a utilização de ferramentas computacionais nas diversas áreas do saber vem rapidamente crescendo, permitindo um amplo espectro de tarefas, desde as mais corriqueiras, como a otimização de processos, a aceleração de cálculos e a armazenagem de um antes inimaginário conjunto de dados biológicos, a outras mais amplas, como novas possibilidades e perspectivas de abordagens cient´ıficas e o tratamento em larga escala de sistemas biológicos tradicionalmente estudados em pequena escala. O desenvolvimento da computação e sua inserção na solução de problemas f´ısicos e qu´ımicos biológicos exemplificam tal tendência (29–32), quer para um maior entendimento dos mecanismos moleculares, quer auxiliando no planejamento de poss´ıveis aplicações industriais, ou ainda, procurando compreender e controlar a fronteira entre a saúde e a doença (26, 33–36).

Em um cenário pós-Genoma, onde um conjunto considerável de informações já se en-contra dispon´ıvel, a Biocomputação se torna ainda mais relevante, contribuindo com o aux´ılio de diversas ferramentas, como o Sistema Gerenciador de Banco de Dados (SGBD) (37, 38), linguagens de programação multi-plataformas (38–40), poder de processamento relativamente alto a custos reduzidos, os quais possibilitam o armazenamento da informação biológica e, prin-cipalmente, um conjunto de diferentes e complementares formas de extração e manipulação destes dados (41). Por exemplo, a partir de estruturas tridimensionais de macromoléculas depo-sitadas no Banco de Dados de Prote´ınas (RCSB Protein Data Bank– PDB) (42), vários estudos podem ser realizados (43–47), procurando-se melhor caracterizar um dos grandes paradigmas da Biologia Molecular: correlacionar aestruturacom afunçãobiológica (48).

Além de bancos de dados contendo informações sobre estruturas biológicas, sejam eles de prote´ınas (49), DNA (50), nucleot´ıdeos (51), fármacos (52), e outros (53), há também diver-sas ferramentas dispon´ıveis gratuitamente à comunidade (54–57) que permitem a manipulação de estruturas biológicas, dentre as quais destacamos o Biopython (58). Biopython2 é um con-junto de programas desenvolvidos em linguagem Python, para a Biologia Molecular, onde é poss´ıvel, por exemplo, criar estruturas de dados em Python a partir de informações biológicas contidas em arquivos textos, como os disponibilizados pelo PDB e outros, e, então, manipu-lar tais informações de maneira bastante simplificada, através do uso de métodos ou funções implementadas pela ferramenta, tornando poss´ıvel dessa forma a manipulação de estruturas biológicas, tanto por profissionais não familiarizados com métodos e estruturas computacionais tradicionalmente empregados para este fim, quanto pelos mais especialistas nesta área (enge-nheiros da computação/hardware, “bio-informatas”, analistas de sistemas e outras áreas afins), o que torna poss´ıvel expandir as funcionalidades providas por esta ferramenta conforme as ne-cessidades das análises que serão feitas.

(32)

O trabalho aqui apresentado contempla tanto o uso de banco de dados para extração da informação, como a geração de novos bancos de dados, além do desenvolvimento de di-versas ferramentas computacionais as quais permitem efetuar diferentes análises em complexos protéicos. As próximas seções apresentam uma descrição de algumas das ferramentas existentes para o uso em Biologia Estrutural.

1.2 Ferramentas para Biologia Estrutural

1.2.1 Banco de dados de prote´ınas

Dentre os diversos bancos de dados de estruturas e informações biológicas dispon´ıveis naweb, como SCOP (59), STING (60) e outros (61), focamos no banco de dados de prote´ınas deBrookhaven (PDB), por ser este uma grande fonte de informações a respeito de estruturas de prote´ınas bem como o ponto de partida inicial escolhido para a realização das análises que serão desenvolvidas neste trabalho as quais estarão dispon´ıveis gratuitamente à comunidade.

Criado em 1971 pelo Laborat´orio Nacional deBrookhaven, o PDB, hoje mantido pelo

Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB), armazena estruturas de macro-moléculas biológicas (42), obtidas por técnicas experimentais (NMR e Cristalografia de raios X). Além das coordenadas espaciais de cada átomo da prote´ına, a´ı estão dispon´ıveis, para extração, dados como a identificação dos res´ıduos de contato, caracterização da área superficial, o número de pontes de hidrogênio e de contatos devan der Waals, a magnitude de mudanças conformacionais associadas com a formação de complexos, etc (62). Entretanto, continua sendo dif´ıcil de se prever experimentalmente as conseqüências estruturais e funcionais da substituição de aminoácidos espec´ıficos assim como as próprias condições necessárias para a obtenção dos cristais (63) utilizados no processo de obtenção da estrutura tridimensional de uma prote´ına.

1.2.2 Validac¸˜ao de estruturas de prote´ınas

Apesar do conjunto de testes que são realizados nos dados antes dos mesmos serem depositados no PDB (42, 62), estes ainda não estão livres de incertezas e problemas (64). A mai-oria das estruturas tridimensionais de prote´ınas atualmente conhecidas são obtidas por técnicas de cristalografia de raios X ou ressonância nuclear magnética, e, como todo experimento, estão sujeitos a erros (65).

(33)

prote´ınas que tiveram sua estrutura resolvida por cristalografia de raios X e verificaram que os resultados podem conter alguns erros os quais são dif´ıceis de identificar. É tarefa do cris-talógrafo se certificar que estruturas de prote´ınas incorretas não sejam disponibilizadas na li-teratura (67). Além dos erros intr´ınsecos, arquivos PDB podem conter átomos faltantes e/ou duplicados, aminoácidos desconhecidos, etc. Por esta razão é necessário o tratamento (testes de qualidade e consistência, como os realizados peloWHATIF(64, 67, 68) e outros) dos arqui-vos advindos do PDB, garantindo assim que as análises posteriores, por exemplo, os potenciais estat´ısticos e outros resultados gerados, como, por exemplo, o estudo das propriedades ele-trostáticas de prote´ınas, sejam confiáveis.

1.2.3 Servic¸os dispon´ıveis na

web

Devido ao alto grau de complexidade do desenvolvimento de programas computacio-nais, principalmente envolvendo sistemas biológicos onde a generalização de um caso muitas vezes não atende todos os requisitos de outro sistema, e a grande heterogeneidade de profissio-nais (f´ısicos, qu´ımicos, biólogos, engenheiros, analistas de sistemas, farmacêuticos, etc.) inte-ressados em estudar sistemas biológicosin sil´ıcio, muitos grupos têm disponibilizado, através de servidoresweb(web sites), ferramentas e/ou serviços que proporcionam, ainda que de ma-neira limitada, o estudo de biomoléculas. Neste cenário, o usuário pode escolher o sistema de interesse e a metodologia de estudo (n´ıvel de detalhamento do modelo, quais fatores – tempe-ratura do sistema, concentração do soluto, concentração do solvente, ´ıons livres na solução, etc. – serão considerados, entre outras configurações e/ou possibilidades) e simplesmente aguardar uma resposta (arquivo texto, texto no formato HTML3, e-mail, etc.) do programa (portal,web site) a qual deverá ser cuidadosamente analisada.

A maioria dos serviçoswebe programas de computador atualmente dispon´ıveis é de-senvolvida valendo-se dos conhecimentos advindos da F´ısica, como o cálculo de distância, velocidade, massa, carga, pH, etc. A escolha do modelo normalmente está relacionada com os recursos computacionais dispon´ıveis, o que se deseja medir e em qual tempo. Por exemplo, po-demos desenvolver programas que computam o sistema no seu n´ıvel máximo de detalhamento (quântico), onde as posições de todas as part´ıculas (prótons, elétrons, etc.) são calculadas, ou seja, tem-se um sistema que opera em n´ıvel quântico ou, podemos desenvolver ferramentas que trabalham com um modelo mais simplificado, por exemplo, considerando apenas a seqüência primária de uma prote´ına, sem se importar com sua estrutura 3D. A escolha do modelo também está intimamente relacionada com um compromisso entre o poder computacional dispon´ıvel, o

(34)

tempo de resposta esperado e o tamanho do problema (sistema de interesse).

Com o intuito de exemplificar e ao mesmo tempo familiarizar o leitor com as soluções já existentes, exploraremos algumas ferramentas atualmente dispon´ıveis na web. Tais ferra-mentas são responsáveis por: validação de estrutura, adição de átomos ausentes, cálculos de propriedades eletrostáticas em prote´ınas e outros.

1. PDB2PQR (69, 70): Dispon´ıvel em: http://pdb2pqr-1.wustl.edu/

pdb2pqr/ou emhttp://nbcr.net/pdb2pqr/, ´e um programa desenvolvido em linguagem Python que converte um arquivo originalmente no formato PDB para um ar-quivo no formato PQR4. A ferramenta realiza as seguintes tarefas:

• Adição de um número limitado de átomos que não estão presentes no modelo;

• Determinação dos pKa’s5 dos res´ıduos de aminoácidos, utilizando o programa

PROPKA (71, 72);

• Adição de átomos de hidrogênio6;

• Otimização das ligações de hidrogênio favoráveis7;

• Provê as cargas e os raios para os átomos a partir do campo de força8escolhido.

2. H++ (20): Dispon´ıvel em http://biophysics.cs.vt.edu/H++/ hppdetails.php, ´e um programa que calcula os valores de pKa’s de grupos de

aminoácidos ionizáveis presentes em macromoléculas e acrescenta átomos de hidrogênio que não estão presentes na estrutura. O H++ recebe como entrada um arquivo no formato PDB e retorna como sa´ıda arquivos nos formatos PDB, PQR e AMBER (73, 74). Ao submeter uma estrutura no formato PDB, o H++ realiza as seguintes tarefas:

• Remoc¸˜ao de todos os campos HETATM9presentes no arquivo no formato PDB;

• Remoção de todas as moléculas de água e contra-´ıons;

4_{Arquivo contendo as coordenadas, raio e carga para cada ´atomo presente no arquivo PDB. ´}_{E largamente}

empregado em pacotes de simulação de propriedades eletrostáticas de prote´ınas.

5_{pK: constante de ligação/equil´ıbrio termodinâmica. Propriedade que pode ser utilizada para analisar vários}

comportamentos em sistemas biomoleculares.

6_{Atomos de hidrogênio, pertencentes aos aminoácidos, geralmente não são identificados nas estruturas das}_´

prote´ınas resolvidas por cristalografia de raios X devido a limitações da técnica. Uma das necessidades de se obter os átomos de hidrogênio é determinar valores, mais próximos aos dados experimentais, para o volume e o raio de prote´ına, visto que quase 50% dos átomos de uma prote´ına são átomos de hidrogênio.

7_{A otimização da ligação é feita buscando um m´ınimo de energia para o sistema.} 8_{Apresentamos a definição e o uso de campo de força na Seção 4.7 -}_{Campos de força}_.

9_{Campo contido no arquivo no formato PDB que representa as coordenadas atômicas de átomos que não}

(35)

• Verificação da seqüência de átomos e configuração do nome dos átomos para o padrão utilizado pelo pacote AMBER99 (73, 75);

• Adição de átomos de hidrogênio e otimização de suas ligações;

• Padronização dos raios dos átomos;

• Cálculos eletrostáticos através da utilização do pacote MEAD (76);

• Cálculo da curva de titulação de cada aminoácido ionizável;

• Adição ou remoção de prótons, na estrutura da prote´ına, de acordo com os pKa’s

calculados.

• Minimização de energia da estrutura da prote´ına em um dado pH utilizando o campo de força AMBER99.

3. WHATIF (68): Dispon´ıvel em: http://swift.cmbi.ru.nl/servers/html/

index.html, é um pacote de programas desenvolvido em linguagem FORTRAN 77 para modelagem molecular especializado para trabalhar com prote´ınas; seu desenvolvi-mento teve in´ıcio em 1987 e prossegue até a presente data. WHATIFprovê um ambiente flex´ıvel para visualizar, manipular e analisar pequenas moléculas também. Neste contexto é poss´ıvel efetuar: comparação de moléculas de prote´ınas com base em sua estrutura 3D, visualizar mapas de densidade eletrônica de estruturas de prote´ınas, efetuar mutações na seqüência de aminoácidos da prote´ına, análise e predição de átomos de hidrogênio, etc.

4. RosettaDock(77): Dispon´ıvel em http://rosettadock.graylab.jhu.edu/, é um pacote de programas desenvolvido em linguagem C++ para predição e modelagem (design) de estruturas de prote´ınas, mecanismos de enovelamento (folding) de prote´ına e interações prote´ına-prote´ına.

5. PCE (78): Dispon´ıvel em: http://bioserv.rpbs.jussieu.fr/Help/PCE. html, é uma interfacewebpara o programa MEAD. Os serviços dispon´ıveis são: PCE-pot e PCE-pKa, os quais, respectivamente realizam as seguintes tarefas:

• Cálculo do potencial eletrostático de uma prote´ına em função de condições expe-rimentais, resolvendo numericamente a equação de Poisson-Boltzmann10. O pro-grama recebe como entrada um arquivo no formato PDB, para o qual é gerado um arquivo no formato PQR utilizando o campo de força PARSE (82, 83), ou um ar-quivo no formato PQR. O programa retorna como resultado imagens que represen-tam graficamente o potencial eletrostático na superf´ıcie da molécula em estudo.

(36)

• Cálculo dos valores de pKa’s dos aminoácidos ionizáveis da prote´ına. O programa

recebe como entrada um arquivo no formato PDB e fornece a resposta em uma p´agina HTML.

Outros servic¸oswebpodem ser encontrados na literatura (52, 60, 84–87).

Nossa primeira contribuição será no sentido de complementar estas ferramentas, através da construção de portaisweb que auxiliem na predição da complexação de prote´ınas. Propomos, além do fornecimento de propriedades dispon´ıveis em outros serviços, a possibili-dade de efetuar um estudo das propriepossibili-dades eletrostáticas em prote´ınas, através de um preditor inicial de complexos protéicos, chamado PROMETHEUS (esta será a primeira frente do traba-lho), em diversas condições e n´ıveis preditivos. No futuro, a ferramenta também permitirá:

• Geração de pept´ıdeos derivados de uma dada seqüência, de forma combinatória, para classificação dos mais adequados à complexação com prote´ınas-alvo.

• Acoplamento a outros serviços, como o MHOLline (88, 89), utilizado para predição de estrutura de prote´ınas.

Além disso, os dados presentes em nossa base de dados serão disponibilizados gratui-tamente à comunidade onde, a partir dos mesmos, vários estudos podem ser realizados, e com o benef´ıcio que as estruturas de prote´ınas presentes na nossa base de dados já estarem validadas.

1.3 A importˆancia dos complexos prot´eicos

Interações prote´ına-prote´ına são de grande interesse na indústria farmacêutica, alimen-tos, biotecnologia, processos de biosseparação, purificação de prote´ınas, micro-encapsulação, biomateriais, etc. (90–92). Além disso, complexos protéicos estão envolvidos na maioria dos processos biológicos, como por exemplo, catálise enzimática, transporte de substâncias (93) e doenças como Alzheimer, Parkinson, Diabetes tipo II, Anemia Falciforme e outros (91, 92, 94), o que torna o entendimento racional dessas interações um tema de grande interesse, sendo ex-plorado pelas mais diversas áreas do conhecimento, como a F´ısica, Bioqu´ımica, Biologia, etc.

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Através da análise das propriedades termodinâmicas das prote´ınas11 como, por exem-plo, ponto isoelétrico (pI), energia livre, segundo coeficiente cruzado de virial (B23)12e outros, visamos contribuir para o progresso nas seguintes áreas e suas correlações:

• Determinação da estrutura protéica: A cristalização de uma prote´ına em solução é o passo inicial para a determinação de sua estrutura utilizando difração por raios-X13 (95). Entretando a obtenção de um cristal de alta qualidade é um dos passos mais dif´ıceis e que consome o maior tempo no processo de determinação da estrutura da prote´ına, uma vez que a condição de cristalização depende de um grande número de parâmetros e condições experimentais (96).

Estudos demonstram que o segundo coeficiente de virial B2 (e conseqüêntemente o segundo coeficiente cruzado de virial - B23) está intimamente relacionado com a cristalização protéica, uma vez que valores negativos deste indicam atração entre as prote´ınas, o que é pré-condição para a cristalização (18, 97, 98).

A utilização de um preditor básico de complexação a partir da seqüência linear dos aminoácidos, como dispon´ıvel no PROMETHEUS, auxilia na determinação das poss´ıveis condições f´ısico-qu´ımicas, nas quais poderiam ocorrer a cristalização das prote´ınas (ja-nelas de cristalização). Dependendo da qualidade dos resultados que o usuário deseja obter, esses testes podem ser realizados em larga escala para um grande conjunto de prote´ınas em diversas condições experimentais, proporcionando dessa forma a obtenção das pré-condições f´ısico-qu´ımicas iniciais para a determinação experimental da estrutura protéica.

• Ind ústrias de alimentos: Produtos aliment´ıcios são compostos por uma grande diversi-dade de ingredientes como prote´ınas e polissacar´ıdeos (90, 99). As interações entre estas macromoléculas desempenham um papel importante na estrutura e estabilidades destes produtos. Controlar ou manipular estas interações macromoleculares é o fator chave para o desenvolvimento de novos processos e produtos na indústria de alimentos (90). Predizer estas interações facilita tal tarefa.

• Ind ústrias farmacêucias: A habilidade das prote´ınas se dissolverem em solução aquosa é uma importante propriedade. Esta habilidade é medida pela solubilidade da prote´ına, 11_{Esta abordagem é realizada pelas ferramentas computacionais desenvolvidas e acopladas ao portal}

PROMETHEUS, o qual permite o estudo e a predição de complexos protéicos com base nas propriedades ele-trostáticas das prote´ınas, em diversos n´ıveis preditivos.

12_{Esta expressão é derivada do coeficiente de virial para medir a pressão osmótica de uma solução.}_B

23mede a

energia de interação de dois corpos. Uma abordagem mais detalhada sobre oB23é exibida na Seção 5 -Material e métodos.

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a qual possui grande importância no processo de purificação de prote´ınas e sérias implicações em muitas doenças associadas com a agregação protéica (91, 92). A so-lubilidade da prote´ına é m´ınima ao redor do pI(100), e seu estudo é de grande interesse na indústria farmacêutica na busca por novos fármacos e prote´ınas recombinantes para o tratamento destas doenças (Alzheimer, Parkinson, etc.). A solubilidade de uma prote´ına depende de sua carga14 e dos estados de ionização15 (101) dos res´ıduos ionizáveis que a constituem. O portal PROMETHEUS permite o estudo das propriedades eletrostáticas das prote´ınas em diversas condições experimentais (informadas pelo usuário) e n´ıveis de predição, possibilitando que diversas análises computacionais sejam realizadas com o objetivo de se obter os melhores ligantes para uma prote´ına e/ou complexo protéico.

O processo de purificação de prote´ınas, por precipitação induzida por sal, tem sido lar-gamente empregada na indústria para separar prote´ınas como, por exemplo, prote´ınas do plasma do sangue (102), prote´ınas de extratos vegetais (103) e de bactérias (104). En-tretanto a obtenção da condição de solubilidade não é trivial, pois depende de uma série de fatores como, pH, distribuição de cargas na prote´ına, concentração de sal e tempera-tura. Testar cada uma destas configurações experimentalmente é uma tarefa que consome muito tempo e possui alto custo. A gama de possibilidades pode ser reduzida através da utilização de um preditor, que seja capaz de identificar (em tempo hábil) quais são as melhores condições f´ısico-qu´ımicas para a precipitação protéica.

1.4 Abordagem do problema

Apesar do conhecimento bem estabelecido que se dispõe das principais forças f´ısicas da natureza (105), a quantificação da contribuição de cada uma destas interações envolvidas nos mecanismos moleculares responsáveis pela formação de um complexo prote´ına-prote´ına ainda é um problema não resolvido (27). A situação é equivalente a se conhecer os “ingredientes” (eletrostática,van der Waals, hidrofobicidade, etc.) para o preparo de um delicioso bolo, porém, não se tem a quantidade necessária de cada um deles (falta a “receita”!). De forma análoga, não se conseguiu ainda quantificar a exata contribuição destas interações no processo conhecido comofoldingde prote´ınas (ou “enovelamento” protéico), onde se procura obter (e entender os mecanismos) uma estrutura espacial (tridimensional) de uma prote´ına (forma nativa) a partir da seqüência primária (sem muitas aplicações práticas) dos elementos que a constituem (seus

14_{A abordagem teórica sobre a origem das cargas em prote´ınas é exibida na Seção 5.1.1 -}_{Equil´ıbrio ácido-base}_. 15_{Os estados de ionização são determinados através do estudo da diferença dos valores de} _pK

a’s, dos res´ıduos

ionizáveis, entre a estrutura terciária e primária da prote´ına. Detalhes sobre a determinação dos valores depKa’s

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aminoácidos). Em ambos os problemas (foldinge complexação), as mesmas interações f´ısicas estão presentes, e há a necessidade de se quantificar a participação de cada uma delas para o completo entendimento dos mecanismos moleculares (106). Em outras palavras: procura-se também pela “receita” (27).

Duas principais tendências de investigação teórica normalmente são empregadas com o intuito de se elucidar estes processos: (a) tendência mais f´ısica, e (b) tendência mais com-putacional. Na primeira, assume-se um modelo para o sistema (onde se define as interações f´ısicas que se acredita serem as mais relevantes para o processo e estas são posteriormente analisadas) e resolve-se este modelo através de simulações computacionais, calculando-se as propriedades estruturais, dinâmicas e termodinâmicas de interesse. O modelo é aferido através de comparações com observações experimentais e/ou previsões por outras teorias16. Na outra abordagem, mais computacional, procura-se valer de informações experimentais dispon´ıveis para descrever, analisar estatisticamente e eventualmente até mesmo prever o comportamento do sistema, mesmo que não se desvende a “f´ısica” do problema. O folding de prote´ınas e a predição de estruturas podem ser citados como exemplos clássicos, respectivamente, de cada uma destas duas abordagens, assim como o entendimento do fenômeno da complexação e a mera predição da complexação (aqui, sem se importar com as causas).

Por outro lado, os chamados métodos inversos (MI) (107, 108) permitem combinar ambas as tendências, possibilitando inclusive a obtenção deHamiltonianas efetivas(modelos) (109, 110) a partir de dados experimentais. Para os sistemas com prote´ınas, o PDB é a principal fonte de informações “experimentais” estruturais. Entretanto, além das dificuldades intr´ınsecas dos MI, encontramos outras adicionais, por exemplo, a determinação de quais informações ex-tra´ıdas das estruturas protéicas são relevantes e precisam ser empregadas, visto que, moléculas de solvente (água) e até mesmo a posição do aminoácido na cadeia podem interferir diretamente no processo, pois podem alterar as propriedades f´ısico-qu´ımicas do sistema (p.ex. a carga total de uma prote´ına é uma função do meio e de sua própria conformação).

Miyazawa e Jernigan (MJ) (111) estabeleceram a possibilidade de se extrair potenciais efetivos (chamados de “estat´ısticos” ou “baseados em conhecimento”) de interação a partir de análises de estruturas de prote´ınas dispon´ıveis no PDB. Desde então, diversos trabalhos, princi-palmente direcionados para o problema de enovelamento (folding) de prote´ınas, seguiram esta linha (43, 44, 46, 112–114). Apesar de algumas cr´ıticas serem também reportadas (115, 116), acreditamos que “pistas” podem ser encontradas na análise destes potenciais estat´ısticos, especi-almente quando associadas a comparações com resultados obtidos por simulações moleculares

16_{Esta é a linha que adotamos na primeira parte do trabalho (construção de um portal} _web_{, chamado}