SABRINA DE BONA SARTOR
COMPOSTOS VOLÁTEIS EM VINHOS CHARDONNAY (Vitis vinifera L.) PRODUZIDOS EM DIFERENTES REGIÕES BRASILEIRAS
Campinas 2014
Faculdade de Engenharia de Alimentos
SABRINA DE BONA SARTOR
COMPOSTOS VOLÁTEIS EM VINHOS CHARDONNAY (Vitis vinifera L.) PRODUZIDOS EM DIFERENTES REGIÕES BRASILEIRAS
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora, na área de Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. HELENA TEIXEIRA GODOY Co-orientador: Prof. Dr. RODRIGO RAMOS CATHARINO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA SABRINA DE BONA SARTOR E ORIENTADA PELO PROFa. DRa. HELENA TEIXEIRA GODOY.
________________________________________
Campinas 2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR
MÁRCIA REGINA GARBELINI SEVILLANO – CRB8/3647 - BIBLIOTECA DA FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS – UNICAMP
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Volatile compounds in Chardonnay (Vitis vinifera L.) wines produced in different regions of Brazil Palavras-chave em inglês: Volatile compounds; Aroma; Wine.
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutora em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Helena Teixeira Godoy [Orientador] Cláudia Hoffmann Kowalski Schröder Merenice Roberto Sobrinho
Daniele Rodrigues
Liliane Maria Ferrareso Lona Data da defesa: 26/02/2014
Programa de Pós Graduação: Ciência de Alimentos
Sartor, Sabrina de Bona, 1982-
Sa77c Compostos voláteis em vinhos Chardonnay (Vitis
vinifera L.) produzidos em diferentes regiões brasileiras /
Sabrina de Bona Sartor. -- Campinas, SP: [s.n.], 2014.
Orientador: Helena Teixeira Godoy.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1. Compostos voláteis. 2. Aroma. 3. Vinho. I. Godoy, Helena Teixeira. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
______________________________________ Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy
UNICAMP
______________________________________ Profa. Dra. Eliana Fortes Gris
UnB
______________________________________ Dra. Cláudia Hoffmann Kowalski Schröder
LANAGRO
______________________________________ Dra. Merenice Roberto Sobrinho
SENAI
______________________________________ Profa. Dra. Liliane Maria Ferrareso Lona
UNICAMP
______________________________________ Dra. Daniele Rodrigues
UNICAMP
______________________________________ Dr. Jean Pierre Rosier
EPAGRI
______________________________________ Profa. Dra. Alessandra Borin Nogueira
Wine aroma wine is formed by a large number of volatile chemical compounds, present in variable concentrations and detectable by the human olfactory system. The study of the volatile fraction of wines has been the aim of many research studies and those analytical methods including basic steps, such as: isolation and extraction of matrix, separation and detect by gas chromatography coupled to a detection system and finally, the identification and quantification of the individual components. The aim of this study was to extract, identify and quantify the volatile compounds of brazilian Chardonnay wines, produced in different regions, using solid phase microextraction in headspace mode (HS-SPME) and gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). Samples were produced in the main wine producing regions in Brazil: Serra Gaúcha and Campanha (Rio Grande do Sul state), Santa Catarinense and Região de Altitude (Santa Catarina state) and Sul de Minas (Minas Gerais state). A extraction method of aroma compounds was developed and optimized using HS-SPME and GC-MS/MS and multivariate central composite rotational design (CCRD) with response surface methodology to obtain an optimum extraction condition. The optimized conditions were temperature (°C) and time (minutes) of extraction. Multivariate optimization of extraction conditions for HS- SPME allowed to evaluate the effects of time and temperature of extraction allowing the achievement of the optimum extraction point of compounds representatives of the main classes of volatile compounds in Chardonnay wines. The optimum point observed is at temperature in 30 ° C and time in 45 minutes.
was carried out using the technique of GC-MS/MS. The method was validated and used for the analysis of 31 volatile compounds in samples of Chardonnay wines. From compounds analyzed, 30 compounds were used to perform PCA and HCA targeting regional differentiation of wines. The Principal Component Analysis (PCA) and Hierarchical Cluster Analysis (HCA) were performed with the data obtained. The results showed that samples produced in Minas Gerais and Serra Gaúcha shows high concentration of compounds with vegetal and herbaceous notes. Meanwhile, samples of Campanha, Serra Catarinense and Região de Altitude shoes high concentration of compounds with floral and fruity notes. These results reinforce the role of geographical origin in the formation and differentiation of aroma in wines.
O aroma final de um vinho é formando por um grande número de compostos químicos voláteis, presentes em concentrações variáveis e detectáveis pelo sistema olfativo humano. O estudo da fração volátil de vinhos tem sido o objetivo de muitas iniciativas de estudo, sendo que as metodologias de pesquisa de compostos voláteis em vinhos compreendem etapas fundamentais, tais como: a extração dos compostos, a separação das diferentes moléculas por cromatografia gasosa acoplada à um sistema de detecção e posteriormente, a identificação e quantificação dos compostos voláteis. O objetivo deste trabalho foi extrair, identificar e quantificar os compostos voláteis de vinhos Chardonnay produzidos em diferentes regiões brasileiras utilizando microextração em fase sólida no modo de headspace (HS-SPME) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas tandem (GC-MSMS). As amostras foram produzidas nas principais regiões vitícolas brasileiras: Serra Gaúcha e Campanha (Rio Grande do Sul), Serra Catarinense e Região de Altitude (Santa Catarina) e Sul de Minas (Minas Gerais). O método de extração de compostos de aroma foi desenvolvido usando a técnica de HS-SPME e GC-MS/MS e análise multivariada com delineamento composto central rotacional (CCRD) e metodologia de superfície de resposta para obtenção de um ponto ótimo de extração. As condições otimizadas foram temperatura (°C) e tempo (minutos) de extração. A otimização multivariada das condições de extração por HS-SPME permitiu avaliar os efeitos de tempo e temperatura de extração nesta metodologia, permitindo a obtenção de um ponto ótimo de extração, 30°C e 45 minutos, dos representantes das classes dos
qualitativa e quantitativa da fração volátil dos vinhos foi realizada usando a técnica de GC-MS/MS. O método foi validado e aplicado para a análise de 31 compostos voláteis nas amostras de vinhos Chardonnay. Destes compostos analisados, 30 foram utilizados para a realização de PCA e HCA visando a diferenciação regional dos vinhos. A Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise de Agrupamento Hierárquico (HCA) foram realizadas com os dados obtidos. Os resultados obtidos demonstraram que as amostras produzidas em Minas Gerais e na Serra Gaúcha possuem marcadores olfativos herbáceos e vegetais, enquanto as amostras produzidas na região da Campanha/RS, Serra Catarinense e Região de Altitude/SC possuem marcadores florais e frutados, reforçando o papel da origem geográfica na formação e diferenciação do aroma dos vinhos analisados.
Introdução Geral...25
Objetivos...29
Capítulo 1: Revisão Bibliográfica...31
1 Vitivinicultura...33
2 Vitivinicultura no Brasil...34
3 Cultivar Chardonnay (Vitis vinifera L.)...40
4 Compostos Aromáticos em Vinhos...42
5 Análise de Compostos Voláteis em Vinhos...54
6 Referências...63
Capítulo 2: Otimização Multivariada da Extração de Compostos Voláteis em Vinhos Chardonnay utilizando HS-SPME e GC-MS/MS...73
Resumo...77 Abstract...79 1 Introdução...81 2 Material e Métodos...85 3 Resultados...90 4 Discussão...95 5 Conclusões...99 6 Agradecimentos...99 7 Referências...99
Capítulo 3: Caracterização da Fração Volátil de Vinhos Chardonnay Brasileiros utilizando HS-SPME-GC-MS/MS...105
2 Material e Métodos...117 3 Resultados e Discussão...125 4 Conclusões...151 5 Agradecimentos ...151 6 Referências...151 Conclusão Geral........157
“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”.
Dedicatória:
Dedico esta tese a todos os professores que participaram e contribuíram para a minha formação, desde a alfabetização até a pós-graduação;
Aos meus primeiros mestres: Walmor e Elisa;
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Engenharia de Alimentos e ao Departamento de Ciência de Alimentos pela oportunidade de realização do doutorado e elaboração desta tese;
À professora Helena Teixeira Godoy, por me aceitar como sua aluna, pela amizade, pela orientação e, principalmente, por acreditar neste projeto desde o início.
Ao professor Rodrigo Ramos Catharino, pela co-orientação e por sua inestimável contribuição neste trabalho;
Ao CNPq, pela concessão de bolsa de estudo e auxílio financeiro ao trabalho;
Aos membros da banca examinadora, pelas correções e observações que foram imprescindíveis para este trabalho;
Á todos os amigos e funcionários do Laboratório de Análise Instrumental de Alimentos, ao longo do período de doutorado: Renata, sr. Dirceu, Marcela, Miriam, Mere, Dani Bio, Dani Pane, Vivian, Cíntia, Lucíula, Paula, Milene, Leonardo, Dani Neves, Adriana, Chico, Thais, Tayse, Wellington, Elenice, Danilo, Maria Rosa, Stefany. Em especial ao “baianucho” Janclei e ao Mateus, pela ajuda com as análises estatísticas.
Aos funcionários da Secretária de Pós-graduação: Cosme Perrota e Marcos Sampaio.
Aos amigos do LASSPQ/FEQ: Núria, Samara e Roni.
Aos amigos e colegas de doutorado, Marla Sganzerla (Felipe) e Cristiano Augusto Ballus, pelo apoio, pela amizade e pelos bons momentos de descontração;
A todos os amigos que me acompanharam durante o período do doutorado, de perto ou de longe e, em especial, a Robin Bahr e Susyane Cosme;
À família Mioli Botan, por me acolher e ser a minha família em Campinas;
À família de Bona Sartor, por todo amor, incentivo e dedicação, mesmo com a distância;
Ao Rodrigo Botan, meu companheiro nestes anos, que sempre me incentivou e sempre esteve ao meu lado, mesmo nas intermináveis horas no laboratório. Obrigada pelo seu amor, seu carinho, dedicação, amizade e companheirismo.
Muito obrigada!
Sabrina de Bona Sartor Campinas, fevereiro de 2014.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.1 - Principais monoterpenos encontrados em vinhos...45
Figura 1.2 - C13-norisoprenoides encontrados em vinhos...47
Figura 1.3 - Principais álcoois superiores encontrados em vinhos...49
Figura 1.4 - Ácidos graxos encontrados em vinhos...52
Figura 1.5 - Esquema de um espectrômetro de massas em tandem do tipo triplo quadrupolo...59
Figura 1.6 - Configurações de experimentos em MS/MS do tipo triplo quadrupolo...60
Figura 2.1 - Diagrama de Pareto dos efeitos dos fatores avaliados no delineamento fatorial 22...92
Figura 2.2 - Cromatograma obtido no ponto ótimo (30°C, 45 minutos) de extração dos compostos voláteis por HS-SPME em vinho Chardonnay...98
Figura 3.1 - Resultado da Análise dos Componentes Principais (PCA) dos compostos voláteis em vinhos Chardonnay brasileiros...144
Figura 3.2 - Dendograma da Análise de Agrupamento Hierárquico (HCA), com 56,6% de similaridade, dos compostos voláteis em vinhos Chardonnay brasileiros...150
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 - Diferentes ésteres presentes em vinhos...51 Tabela 2.1 - Tempo de retenção e parâmetros de GC-MS/MS dos compostos
monitorados...89
Tabela 2.2 - Fatores, níveis e domínio experimental das condições aplicadas na
otimização da extração por HS-SPME. ...90
Tabela 2.3 - Condições experimentais e respostas obtidos por DCCR para
otimização da extração HS-SPME e GC-MS/MS...93
Tabela 2.4 - Análise de variância pelo método de mínimos quadrados...94 Tabela 3.1 - Origem e safra das amostras de vinhos Chardonnay...118 Tabela 3.2 - Tempo de retenção (tR) e parâmetros de MS/MS para os compostos
analisados...121
Tabela 3.3 - Parâmetros de validação do método analítico utilizado na
determinação de compostos voláteis em vinhos Chardonnay brasileiros...126
Tabela 3.4 - Concentração dos 31 compostos voláteis quantificados por
GC-MS/MS em vinhos Chardonnay produzidos em diferentes regiões brasileiras...130
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância
CCRD Central Composite Rotational Design
cm centímetros
CID Collision Induced Dissociation
DCCR Delineamento Composto Central Rotacional DI-SPME Direct Immersion-Solid Phase Microextraction
DVB/CAR/PDMS Divinilbenzeno/Carboxen/Polimetilsiloxano EI Electron Impact
eV elétronvolt
g gramas
g.L-1 gramas por litro
GC Gas Chromatography
GC-MS Gas Chromatography/Mass Spectrometry
GC-MS/MS Gas Chromatography/tandem Mass Spectrometry
HCA Hierarchical Clustering Analysis
HS Headspace
HS-SPME Headspace-Solid Phase Microextraction
LLE Liquid-Liquid Extraction
LOD Limite de Detecção
LOQ Limite de Quantificação
M Molar
mg.L-1 miligramas por litro
min minutos
mL mililitros
mL.min-1 mililitros por minuto
mm milímetros
MRM Multiple Reaction Monitoring
MS/MS tandem Mass Spectrometry
m/z relação massa/carga
nd não detectado
ng.L-1 nanogramas por litro
Q1 Quadrupolo 1
Q2 Quadrupolo 2
Q3 Quadrupolo 3
QQQ Triplo Quadrupolo
Q-TOF Qudrupolo-Time of Flight
RSD Desvio Padrão Relativo
R2/r2 Coeficiente de Correlação
PCA Principal Component Analysis
PTFE Politetrafluoretileno
SCAN Scanning
SIM Single Ion Monitoring
SPE Solid Phase Extraction
SPME Solid Phase Microextraction
SRM Selective Reaction Monitoring
tR tempo de retenção
TOF Time of Flight
TOF-TOF Time of Flight-Time of Flight
V Volts
µg.L-1 microgramas por litro
µm micrômetro
°C graus Celsius
INTRODUÇÃO GERAL
A vitivinicultura brasileira é uma atividade com relevante importância socioeconômica nas principais regiões produtoras do país: os Estados da Região Sul, Sudeste e Nordeste. A produção de uvas ocupa uma área de, aproximadamente, 77 mil hectares, com vinhedos estabelecidos desde o extremo sul do país, entre o paralelo 30°S, no Estado do Rio Grande do Sul, e o paralelo 9°S, no Nordeste do país, região situada próxima a Linha do Equador [1, 2]. Em função da diversidade ambiental, o Brasil apresenta regiões produtoras com características temperadas, subtropicais e tropicais. Estas diferentes regiões, com distintas características de clima, solo, variedade de uvas cultivadas, sistemas de produção, de vinificação e envelhecimento possibilitam a produção de vinhos com ampla diversidade de características de sabor e aroma, o que constitui uma das características da vitivinicultura brasileira atual [2, 3, 4].
A produção de vinhos nacionais desenvolveu-se com base na produção de vinhos de mesa, elaborados com uvas americanas e hibridas (Vitis labrusca,
Vitis bourquina). Mais recentemente, especialmente a partir da década de 70,
começaram a ocorrer investimentos com a implantação e/ou modernização de vinícolas, com produção de vinhos finos, varietais ou de corte, elaborados com uvas Vitis vinifera L., com maior valor agregado e, portanto, mais competitivos no mercado consumidor de vinhos finos [2, 3]. A legislação brasileira define como vinho varietal aquele produzido com, no mínimo, 75% de vinho da variedade de
uva indicada no rótulo e o restante de vinho de outra variedade, mas da mesma espécie [5].
Como consequência dos investimentos, os vinhos finos nacionais têm apresentado uma grande evolução sensorial e na qualidade global, sendo reconhecidos nacional e internacionalmente [2, 3]. Porém, os estudos de caracterização de aroma dos diferentes vinhos finos nacionais ainda são escassos. A composição aromática de vinhos tem uma grande importância em termos de qualidade e identificação pelo mercado consumidor. Além disso, está intimamente ligada ao conceito de terroir, termo francês que descreve a noção de que os vinhos de diferentes regiões geográficas podem ser percebidos como únicos, sendo resultado de características de solo, clima, condições geográficas do local de cultivo da uva e das técnicas enológicas empregadas na produção do vinho [6, 7] .
Uma das cultivares de uvas que mais recebeu atenção a partir da modernização da vitivinicultura brasileira foi a cultivar Chardonnay (Vitis vinifera L.) [3, 4, 8]. Esta cultivar é conhecida internacionalmente como a principal uva branca utilizada para a produção de vinhos brancos finos, varietal ou de corte, frutado e de médio envelhecimento [8, 9, 10]. No Brasil, está presente na maioria das regiões produtoras, originando vinhos varietais ou servindo de base para a produção de vinhos espumantes [11].
Considerando a importância da composição volátil de vinhos, e a diversidade das regiões produtoras brasileiras, este trabalho teve como objetivos:
(1) otimizar uma técnica de extração de compostos voláteis em vinho Chardonnay, utilizando microextração em fase sólida no modo de headspace (HS-SPME) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas tandem (GC-MS/MS); (2) validar um método de identificação e quantificação dos principais compostos voláteis presentes em vinhos Chardonnay varietais produzidos em diferentes regiões brasileiras utilizando microextração em fase sólida no modo de headspace e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas tandem; (3) identificar os compostos voláteis que formam o aroma dos vinhos Chardonnay brasileiros e através do uso de ferramentas estatísticas de análise, evidenciar suas diferenças e similaridades regionais, traçando um perfil aromático desses vinhos.
REFERÊNCIAS
[1] OIV. International Organisation of Vine and Wine. Statistical Report on World
Vitiviniculture 2013. Disponível em: http://www.oiv.int. Acesso em 08/09/13.
[2] MELLO, L. M. R. de. Vitivinicultura brasileira: Panorama 2012. Bento Gonçalves, 2012. Disponível em: http://www.cnpuv.embrapa.br. Acesso em 20/07/13.
[3] GUERRA, C. C.; MANDELLI, F.; TONIETTO, J.; ZANUS, M. C.; CAMARGO, U. A. Conhecendo o essencial sobre uvas e vinhos. Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinhos, 2009.
[4] IBRAVIN. Instituto Brasileiro do Vinho. Disponível em: http://www.ibravin.org.br. Acesso em 20/07/13.
[5] BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Lei N°7.678, de 08 de novembro de 1988. Produção, circulação e comercialização do vinho e derivados da uva e do vinho. Disponível em www.agricultura.gov.br. Acesso em 10/07/13.
[6] JACKSON, R. Chemical Constituents of grapes. In: Wine Science: principles
and applications. 3th ed. London: Academic Press, p. 270 - 331. 2008.
[7] RIBÉREAU-GAYON, P.; GLORIES, Y.; MAUJEAN, A.; DUBOURDIEU, D.
Handbook of Enology Volume 2 – The Chemistry of Wine: Stabilization and Treatments. 2 ed. West Sussex: John Wiley and Sons, Ltd., 2006.
[8] MIELE, A.; MIOLO, A. O sabor do Vinho. Bento Gonçalves: Vinícola Miolo: Embrapa Uva e Vinho, 2003. 136 p.
[9] WOLPERT, J.A. et al. Field performance of six Chardonnay clones in the Napa Valley. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v.45, n.4, p.393-400, 1994.
[10] FIDELIBUS, M. W.; CHRISTENSEN, L. P.; KATAYAMA, D. G.; THIBAUT-VERDENAL, P. Yield components and fruit composition of six Chardonnay grapevine clones in the Central San Joaquin Valley, California. American
Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 57, n.4, p.503-509, 2006.
[11] UVIBRA. Dados da vitivinicultura: quantidade de uvas processadas no Rio Grande do Sul. Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, 2008. Online. Disponível em: http:// www.cnpuv.embrapa.br/prodserv/vitivinicultura. Acesso em: 10/07/13.
OBJETIVOS
1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar os compostos voláteis presentes em vinhos Chardonnay (Vitis
vinifera L.) produzidos em diferentes regiões vitícolas brasileiras
2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.1 Otimizar a técnica de microextração em fase sólida no modo
headspace (HS-SPME) para a extração de compostos voláteis das amostras de vinhos Chardonnay.
2.2 Utilizar métodos multivariados para a otimização dos fatores
(temperatura e tempo) que influenciam no processo de extração dos compostos voláteis em vinhos Chardonnay.
2.3 Validar um método de identificação e quantificação dos principais
compostos voláteis presentes em vinhos Chardonnay varietais produzidos em diferentes regiões brasileiras utilizando microextração em fase sólida no modo de headspace (HS-SPME) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas tandem (GC-MS/MS).
2.4 Identificar e quantificar os principais compostos voláteis que formam o
aroma dos vinhos Chardonnay produzidos em diferentes regiões brasileiras
2.5 Utilizar ferramentas estatísticas de análise para evidenciar as
diferenças e similaridades dos compostos aromáticos dos vinhos Chardonnay brasileiros.
Sabrina de Bona Sartora, Helena Teixeira Godoya
a
Departamento de Ciência de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
Capítulo 1
Revisão Bibliográfica
1. VITIVINICULTURA
A videira pertence à família Vitaceae, sendo considerada a mais antiga espécie frutífera domesticada, devido ao grande número de registros feitos pelas antigas civilizações mundiais. Na família Vitaceae existem mais de 14 gêneros, sendo que o gênero Vitis apresenta, aproximadamente, 108 espécies e representa o de maior importância econômica, social e histórica. As plantas da família
Vitaceae são predominantemente tropicais e subtropicais, porém as plantas do
gênero Vitis são, primariamente, indígenas de áreas de clima temperado do Hemisfério Norte [1].
Após a separação dos continentes americano e euro-asiático houve o desenvolvimento de espécies em diferentes regiões. Através de seleção natural, a espécie Vitis labrusca se desenvolveu no continente americano e a espécie Vitis
vinifera desenvolveu-se na Europa, na Ásia e na região entre esses dois
continentes, formando assim três centros de origem: Americano, Euro-asiático e Asiático [1,2].
As cultivares Vitis labrusca, Vitis labruscana, Vitis aestivalis e Vitis
bourquina abrangem a maioria das variedades americanas produtoras de uvas
com relevante importância econômica, entre elas as cultivares Isabel, Concord, Niágara branca, Niágara rosada e Bordô. No Brasil essas cultivares são utilizadas, principalmente, para a fabricação de vinhos de mesa, sucos, geléias e também para consumo in natura. As cultivares Vitis vinifera, também chamadas de européias, são as mais difundidas em todo o mundo vitícola, apresentando grande
importância econômica nos principais países produtores. Dentre as cultivares mais conhecidas, podemos citar as tintas Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot, Syrah, Tannat, Pinot Noir, Carmenére, Nebbiolo, Gamay, Sangiovese, Tempranillo, Zinfandel. Entre as cultivares brancas, destacam-se a Chardonnay, Chenin Blanc, Moscatéis (Moscatel de Hamburgo, Moscato Blanc, Moscatel de Alexandria), Riesling, Sauvignon Blanc, Sémillon, Traminer e Gewürztraminer [1,2,3].
As atividades de cultivo de uvas e produção de vinhos estão amplamente difundidas em todo o mundo, com mais de 40 países cuja produção é reconhecida pela Organização Internacional da Uva e do Vinho (OIV). Segundo a OIV, os maiores produtores mundiais de vinho, no ano de 2012, foram: França, Itália, Espanha, Estados Unidos e China [4]. O Brasil ocupou o 14° lugar em produção de vinhos finos, com produção estimada em 2.917 milhões de hectolitros. Entre os principais consumidores mundiais de vinhos, destacam-se a França e os Estados Unidos, com cerca de 30.000 hectolitros anuais. O volume de vinho fino consumido no Brasil foi de aproximadamente 3.000 hectolitros em 2012 [4].
2. VITIVINICULTURA NO BRASIL
No Brasil a videira foi introduzida por Martim Afonso de Sousa, no século XVI, na capitania de São Vicente, no atual estado de São Paulo. Porém o desenvolvimento da viticultura nacional está fortemente ligado à chegada dos imigrantes europeus ao país, no final do século XIX [2]. O desenvolvimento da
vitivinicultura brasileira ocorreu com a produção de cultivares americanas, utilizadas para a elaboração de vinhos de mesa. Entretanto, a partir de meados do século XX começaram a ser elaborados vinhos finos, com uvas de variedades de
Vitis vinifera. Entre as principais variedades de Vitis vinifera cultivadas no Brasil,
podemos citar as tintas Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Merlot, Pinotage, Pinot Noir, Syrah e Tannat. Dentre as variedades brancas destacam-se a Chardonnay, Malvasia Branca, Moscato Branco, Moscato Canelli, Prosecco e Riesling Itálico [3].
Atualmente a viticultura brasileira ocupa uma área de, aproximadamente, 77 mil hectares, com vinhedos estabelecidos desde o extremo sul do país, em latitude de 30ºS, até regiões situadas próximas a Linha do Equador, em latitude de 9ºS. A produção de uvas é da ordem de 1,5 milhões de toneladas/ano [5]. Em 2012, a produção de uvas destinadas ao processamento (vinho, suco e derivados) foi de 830,92 milhões de quilos, representando 57,07% da produção nacional. O restante da produção (42,93%) foi destinado ao consumo in natura [5].
As principais regiões produtoras de uvas e vinhos encontram-se nos estados da Região Sul, Sudeste e Nordeste. Na Região Sul e Sudeste colhe-se uma safra por ano, assim como na clássica viticultura mundial, enquanto na Região Nordeste as colheitas se sucedem ao longo do ano. As diferentes regiões, com distintas características de clima, solo, cultivares de uvas, sistemas de produção, de vinificação e envelhecimento possibilitam a produção de vinhos com ampla diversidade de características de sabor e aroma, o que constitui uma das qualidades da vitivinicultura brasileira atual [3].
2.1 Rio Grande do Sul
O Estado do Rio Grande do Sul é o maior produtor nacional de uva e vinho e apresenta três regiões vitivinícolas: Serra Gaúcha, Campanha e Serra do Sudeste. Na região tradicional da Serra Gaúcha, cujo cultivo de uvas data do final do século XIX, a principal área de cultivo de uvas para a elaboração de vinhos finos está localizada nos municípios de Bento Gonçalves, Monte Belo do Sul, Garibaldi, Farroupilha, Caxias do Sul e arredores. Mais de 80% da produção da região se origina de variedades de uvas americanas (Vitis labrusca, Vitis bourquina) e outras híbridas. As variedades de maior expressão neste grupo são: Isabel, Bordô (Ives), Niágara Branca, Concord, Niágara Rosada, Jacquez e Seibel 1077. Dentre as cultivares Vitis vinifera, destacam-se as brancas Moscato Branco, Riesling Itálico, Chardonnay e Trebbiano (Ugni Blanc); e as tintas Cabernet Sauvignon, Merlot, Cabernet Franc, Tannat, Ancellota e Pinotage. A produção é de 10 a 30 toneladas/hectare, de acordo com a cultivar e as condições climáticas da safra. Nessa região destaca-se a área que constitui a primeira Indicação Geográfica do Brasil, a Indicação de Procedência Vale dos Vinhedos, obtida em 2002. Atualmente, a área detém o selo de Denominação de Origem [3,6].
A região da Campanha, localizada entre os municípios de Santana do Livramento, Dom Pedrito, Candiota e Bajé, apresenta aproximadamente 1.500 hectares plantados. O desenvolvimento do cultivo de uva e da produção de vinhos finos na região consolidou-se na década de 1980. Já na Serra do Sudeste,
localizada entre os municípios de Encruzilhada do Sul e Pinheiro Machado, a vitivinicultura veio a ganhar importância econômica recentemente, a partir de investimentos efetuados por vinícolas localizadas na Serra Gaúcha. Em ambos os pólos produtores são cultivadas exclusivamente cultivares Vitis vinifera, com predominância das uvas tintas Cabernet Sauvignon, Merlot, Tannat, Cabernet Franc, Pinot Noir; Touriga Nacional, Tempranillo e entre as uvas brancas destacam-se Chardonnay, Sauvignon Blanc, Pinot Griogio e Ugni Blanc (Trebbiano) [3,6].
2.2 Santa Catarina
O Estado de Santa Catarina apresenta duas regiões vitivinícolas tradicionais, o Vale do Rio do Peixe, no Meio-Oeste, e a região Carbonífera no Sul do Estado. A partir do ano 2000, foram implementados vinhedos destinados à produção de vinhos finos na Região do Planalto e Serra Catarinense, com destaque na produção de uvas viníferas (Vitis vinifera) para a produção de vinhos finos [7].
No Vale do Rio do Peixe a viticultura ocupa cerca de 2.200 hectares, sendo que a cultivar Isabel ocupa cerca de 75% da área de vinhedos, seguida por outras cultivares de Vitis labrusca e híbridas como Niágara Branca, Niágara Rosada, Ives e Couderc 13. Nesta região, a produção de uvas viníferas vem se desenvolvendo nos últimos anos. Na Região Sul do Estado destaca-se como principais produtores vinícolas os municípios de Urussanga e Pedras Grandes. A região possui como base da sua produção, vinhos brancos da variedade híbrida Goethe [6].
Na Região de Altitude destacam-se os polos de Caçador, Campos Novos e São Joaquim, com altitudes variando entre 900 e 1.400 metros e clima temperado seco, com invernos rigorosos e temperatura média anual de 13º C. Os primeiros vinhedos foram plantados na região em 2001, chegando, em 2012, a uma área aproximada de 300 hectares. Entre as principais variedades cultivadas encontram-se as tintas: Cabernet Sauvignon, Merlot, Pinot Noir, Malbec e as brancas: Chardonnay e Sauvignon Blanc [3,6].
2.3 Vale do Sub-médio São Francisco
No Nordeste do Brasil, junto aos Estados de Pernambuco e da Bahia, encontra-se a região vitivinícola do Vale do Submédio São Francisco, situada em zona de clima tropical semi-árido. A viticultura voltada à produção de vinhos concentra-se no cultivo de cultivares Vitis vinifera, com destaque para Syrah, Cabernet Sauvignon e Ruby Cabernet, entre as tintas e Moscato Canelli e Chenin Blanc, entre as brancas. Estima-se a existência de uma área de 500 hectares de vinhedos com estas cultivares, originando cerca de sete milhões de litros de vinho/ano, destes 80% de vinho tinto e 20% de vinho branco. O clima vitícola da região apresenta variabilidade intra-anual, o que possibilita a produção de uvas e de vinhos ao longo de todos os meses do ano. Esta região é uma das regiões emergentes que teve início nos anos de 1980 e que hoje experimenta um período de expansão da produção de vinhos finos [3,6].
2.4 Minas Gerais
A Região Sul de Minas Gerais, com destaque para os municípios de Caldas e Andradas, é uma região tradicional no cultivo de uvas de origem americana (Vitis
labrusca e Vitis bourquina), com área de produção estabilizada em torno de 350
hectares. As principais cultivares utilizadas são Bordô (localmente também conhecida por Folha de Figo), Jacquez, Niágara Rosada e Niágara Branca. Aproximadamente 95% do vinho produzido na região é de mesa, sendo produzidos com uvas cultivadas na própria região e parte com uvas adquiridas no Rio Grande do Sul. A partir de meados dos anos 2000, empresários e a Empresa de Pesquisa e Desenvolvimento do Estado de Minas Gerais (EPAMIG) desenvolveram ações estratégicas para incentivar a produção de uvas viníferas na região [6].
2.5 São Paulo
No Estado de São Paulo, destacam-se dois pólos vitícolas: um na Região Noroeste (Regional Agrícola de Jales) e outro na Região Leste (Regionais Agrícolas de Campinas, Itapetininga e Sorocaba).
Na Região Noroeste do Estado, a área de vinhedos é de aproximadamente 900 hectares, com predomínio de uvas para consumo in natura. A principal cultivar
Vitis vinifera é a Itália, e suas mutações Rubi e Benitaka. Na Região Leste do
Estado destacam-se três grupos vitícolas: um primeiro grupo, centrado nos municípios de Jundiaí, Vinhedo, Indaiatuba, Valinhos e Campinas, onde a
produção de uva americana de mesa, representa cerca de 67% da área cultivada (5.270,2 hectares), com predomínio da cultivar Niágara Rosada; um segundo pólo de produção, centrado no município de São Roque, onde a produção de uva é destinada à elaboração de vinho de mesa, representando aproximadamente 4% da área cultivada (335 hectares); e no terceiro grupo, destaca-se o município de São Miguel Arcanjo, com produção de uvas finas de mesa, representadas pela cultivar Itália e suas mutações Rubi e Benitaka, e cerca de 29% da área cultivada (2.264,1 hectares) [6].
As vinícolas paulistas comercializam vinhos finos produzidos, quase que exclusivamente, no Rio Grande do Sul, porém o setor vitícola do Estado tem buscado reestruturar, melhorar e expandir sua cadeia produtiva, o que demanda uma avaliação do potencial produtivo para uvas destinadas à elaboração de vinhos finos, com base nas características de clima e solo do Estado [8].
3. CULTIVAR CHARDONNAY (Vitis vinifera L.)
A cultivar Chardonnay é originária da região da Borgonha, França, sendo responsável pela qualidade dos vinhos brancos elaborados nessa região, e está difundida nas principais áreas vitícolas do mundo [9, 10, 11]. Na França, além de ser a cultivar quase que exclusiva de vários vinhos da Borgonha, é uma das uvas clássicas utilizadas na produção do Champagne. É cultivada com sucesso nos Estados Unidos (Califórnia), Austrália, Nova Zelândia, Itália, Portugal, Chile, Argentina, África do Sul e Brasil [3, 12].
Foi introduzida no Brasil na década de 1930, na região de São Roque, em São Paulo, e no Rio Grande do Sul, por volta de 1948, mas somente na década de 1980 que ela adquiriu notoriedade na Serra Gaúcha, sendo utilizada como base para a produção de vinho espumante. Em 2007 a quantidade de uva Chardonnay processada no Rio Grande do Sul foi de 1.752,5 toneladas, representando, 6,3% do total de uvas viníferas brancas processadas no Estado [13].
A cultivar Chardonnay produz vinho branco frutado, de médio envelhecimento. É um dos vinhos brancos que aceita e se beneficia da fermentação e/ou maturação em barris de carvalho. Os principais descritores aromáticos relacionados ao vinho varietal Chardonnay são descritores frutados (citrus, abacaxi, maracujá, maçã, pêssego e melão), baunilha e manteiga [1, 12].
Mais de 140 compostos voláteis já foram identificados em vinhos Chardonnay. Destes, ésteres, álcoois, aldeídos e cetonas são considerados de maior relevância na formação do aroma final do vinho. As concentrações encontradas variaram em função do processo fermentativo adotado e/ou pelo processo de envelhecimento em barris de carvalho [14].
Segundo Lee e Noble [15], os vinhos Chardonnay californianos apresentaram aromas florais e frutados, relacionados com as concentrações dos compostos acetato de isopentila, acetato de 2-feniletanol e linalol. Em vinhos Chardonnay chineses, produzidos na Província de Changli, foram detectados 41 compostos voláteis, sendo álcoois superiores e ésteres de ácidos graxos, os principais grupos químicos encontrados. O composto 2-feniletanol, juntamente com sete ésteres,
foram descritos como responsáveis pelo aroma floral/frutado característico desse vinho [16].
Os compostos voláteis aldeído acético, acetato de etila, metanol, 1-propanol, 2-metil-1-propanol, 2-metil-1-butanol+3-metil-1-butanol foram analisados em vinhos Chardonnay produzidos na Serra Gaúcha. Estes compostos atuam na formação do aroma acético (acetato de etila), aroma de oxidação (aldeído acético) e aroma herbáceo (álcoois superiores) em vinhos e os resultados encontrados mostraram que estes compostos não apresentam grande participação na formação do aroma dos vinhos analisados [17].
4. COMPOSTOS AROMÁTICOS EM VINHOS
O vinho é uma solução hidroalcoólica contendo centenas de compostos químicos provenientes das uvas utilizadas na vinificação, além de compostos formados durante o processo de fermentação e envelhecimento. Muitos destes compostos participam da formação do aroma do vinho, servindo como parâmetro de qualidade e de identidade pelo mercado consumidor.
O aroma é formado por um grande número de moléculas químicas, com média hidrofobicidade, baixo peso molecular e baixo ponto de ebulição sendo, consequentemente, voláteis. Estas moléculas possuem a capacidade de estimular os órgãos sensoriais responsáveis pelo olfato, sendo detectáveis pelo nariz humano. As concentrações variam de mg.L-1 a ng.L-1, ou em quantidades ainda menores (traços). Certos compostos, mesmo presentes em quantidades mínimas
podem desempenhar um importante papel no aroma final de um vinho, enquanto outros, muito mais abundantes, podem fazer apenas uma pequena contribuição [18].
Mais de 1000 compostos voláteis já foram identificados em vinhos, mas aproximadamente 10% possuem participação efetiva na formação do seu aroma final. A participação de cada um dos componentes depende da correlação entre a composição química e o limiar de percepção de cada um desses compostos, pois a maioria dos compostos voláteis encontra-se abaixo ou muito próximo ao limiar sensorial individual [19].
A composição e intensidade desses compostos dependem de vários fatores entre eles: a cultivar de uva utilizada, as características edafoclimáticas do local de cultivo da uva, fatores agronômicos empregados na produção e manejo do vinhedo, técnicas enológicas empregadas durante a produção do vinho e as condições de armazenamento dos vinhos engarrafados [20, 21, 22, 23, 24, 25].
4.1 Classificação dos Compostos Aromáticos de Vinhos
Os compostos voláteis pertencem a grupos químicos heterogêneos, tais como: álcoois superiores, ésteres, monoterpenos, compostos sulfurados, norisoprenoides, entre outros. Considerando a sua origem e sua natureza química, o aroma pode ser classificado em quatro diferentes grupos: aromas varietais, provenientes da cultivar utilizada e que depende das condições edafoclimáticas do local de cultivo; aromas pré-fermentativos, formados durante o processamento das
uvas, em etapas como transporte, prensagem e maceração; aromas fermentativos, produzidos pelas leveduras durante o processo de fermentação alcoólica e por bactérias láticas durante o processo de fermentação malolática, que dependem da temperatura de fermentação e das cepas de microrganismos utilizados; e por último os aromas pós-fermentativos, formados durante o processo de conservação e envelhecimento do vinho [1, 18, 26].
4.1.1 Aromas Varietais
Os compostos de aroma varietal mais conhecidos são os monoterpenos, responsáveis pelo aroma floral característico nas uvas e vinhos das variedades Moscatéis, as metoxipirazinas, características da família de uvas Cabernet, os tióis voláteis, presentes em uvas Sauvignon e os C13-norisoprenoides, característicos
de uvas Chardonnay [1, 18, 26, 27, 28].
Os monoterpenos são C10-terpenoides formados na planta pela fusão de
duas moléculas de isopentenilpirofosfato através da rota do isopreno e posterior reação enzimática. Considerando as suas propriedades aromáticas, os monoterpenos mais conhecidos são o linalol, hotrienol, α-terpineol, nerol e geraniol, além de dois óxidos monoterpênicos, o óxido de rosa e o óxido de nerol (Figura 1.1). Estes compostos possuem baixo limiar de percepção olfativa e estão presentes em baixas concentrações nos vinhos, na ordem de µg.L-1, contribuindo para a formação de aromas florais [18].
As metoxipirazinas são compostos nitrogenados heterocíclicos formados, provavelmente, durante o catabolismo de aminoácidos, porém suas origens ainda não são totalmente elucidadas [18, 26]. Contribuem na formação de aromas vegetais, tais como pimentão verde e aspargo, possuem limiar de percepção muito baixo e as concentrações encontradas em vinhos são da ordem de ng.L-1. Os principais compostos dessa classe são 3-isobutil-2-metoxipirazina, 3-isopropil-2-metoxipirazina e 3-secbutil-2-metóxi-pirazina [18].
Figura 1.1. Principais monoterpenos encontrados em vinhos: (1) linalol; (2) α-terpineol; (3) nerol; (4) geraniol; (5) óxido de rosa; (6) óxido de nerol e (7) hotrienol.
(1) (2) (3) (4)
Os principais tióis voláteis identificados em vinhos são 4-mercapto-4-metil-2-pentatona, 4-mercapto-4-metil-2-pentanol, 3-mercapto-1-hexanol, 3-mercapto-3-metil-1-butanol e acetato de 3-mercaptohexila [29, 30]. Estes compostos estão presentes em uvas na forma de cisteina-S-conjugados, sendo enzimaticamente liberados durante o processo de vinificação. São responsáveis pelos aromas vegetais e frutados, tipicamente observados em vinhos provenientes da cultiva Sauvignon blanc [30].
C13-norisoprenoides são formados a partir da degradação oxidativa de
carotenoides e usualmente divididos em dois grupos: megastigmanos e não-megastigmanos. No grupo de megastigmanos, destacam-se as iononas (molécula de oxigênio em C9) e as damasconas (molécula de oxigênio em C7). Estes
compostos estão presentes em uvas em sua forma glicosilada, sendo hidrolisados enzimaticamente ou no meio acido dos vinhos [1, 18]. Dentre os compostos do grupo de não-megastigmanos, destacam-se o vitispirano e 1,1,6-trimetil-1,2-diidronaftaleno (TDN), responsáveis pelos aromas canforados e de solventes, respectivamente.
A α-ionona, β-ionona e a β-damascenona são os principais compostos C13
-norisprenoides presentes em vinhos, contribuindo na formação de aromas florais e frutados (Figura 1.2) [1, 18]. A exposição solar favorece a síntese de carotenoides nos frutos antes do véraison (aproximadamente metade do ciclo de maturação das uvas) e sua degradação em C13-norisprenoides após esse período [31].
Figura 1.2. C13-norisoprenoides encontrados em vinhos: (1) α-ionona; (2) ionona; (3)
β-damascenona.
4.1.2 Aromas Pré-fermentativos
Compostos pré-fermentativos são formados em etapas anteriores à fermentação alcoólica. Durante a colheita, transporte, trituração e prensagem, bem como durante a maceração, ocorrem reações enzimáticas, em presença de oxigênio, originando compostos pertencentes aos grupos de C6-alcoois e C6
-aldeídos, principalmente. Os compostos voláteis produzidos são hexanal, Z-3-hexenal, E-2-hexenal e os álcoois correspondentes Estes compostos são derivados da fração lipídica as uvas (ácidos linoléico e linolênico), tendo como principais descritores os aromas herbáceos e vegetais [32, 33, 34].
(1) (2)
4.1.3 Aromas Fermentativos
O processo de fermentação é a etapa essencial para a transformação do mosto em vinho, com a produção de etanol a partir das moléculas de açúcares (principalmente glicose e frutose) presentes nas uvas. Esse processo ocorre pela presença de microrganismos no mosto, sendo que as leveduras do gênero
Saccharomyces são as mais comuns associadas ao processo de vinificação [25].
Durante a etapa de fermentação, além do etanol, são formados compostos secundários pertencentes à diversos grupos químicos, como álcoois superiores, acetatos de álcoois superiores, ésteres, etílicos de ácidos graxos e ácidos graxos. Estes compostos posuem intensa capacidade odorífera, que desempenham importante papel na formação do aroma de um vinho, contribuindo para a formação de aromas frutados, característicos de vinhos brancos jovens [1].
Os álcoois com mais de dois átomos de carbono são conhecidos como álcoois superiores ou álcoois fúseis, sendo praticamente ausentes em uvas e mostos, mas encontrados em vinhos em concentrações relativamente mais elevadas, atingindo valores superiores a 100 mg.L-1 [1, 18]. Estes álcoois e os seus ésteres possuem intensa capacidade odorífera, desempenhando um papel de extrema importância para o aroma final de um vinho. Os principais compostos desta classe são o 2-metil-1-propanol (álcool isobutílico), 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol (álcool isoamílico), 2-feniletanol (álcool feniletílico), 1-propanol e 1- hexanol (Figura 1.3) [1].
Figura 1.3. Principais álcoois superiores encontrados em vinhos: (1) 2-metil-1-propanol; (2) 2-metil-1-butanol; (3) 3-metil-1-butanol; (4) 2-feniletanol; (5)1-propanol; (6) 1-hexanol.
A concentração de álcoois fúseis em vinhos varia de 140 a 420 mg.L-1 [35]. Com exceção do 2-metil-1-butanol e do 2-feniletanol, estes compostos estão presentes, geralmente, em concentrações abaixo de seus limiares de percepção olfativa, porém quando os níveis de álcoois fúseis estão acima dessas concentrações, podem apresentar impacto negativo no aroma [36].
Os ésteres são um dos principais componentes dos vinhos, logo após a água, etanol e álcoois fúseis. São produtos da condensação entre o grupo carboxílico de um ácido orgânico e o grupo hidroxílico de um álcool ou fenol. Mais de 160 moléculas de ésteres já foram identificadas em vinhos, porém os mais
(1) (2)
(3) (4)
comuns são os acetatos de ésteres, formados pela condensação do ácido acético e um álcool fúsel e os ésteres etílicos de ácidos graxos, formados entre etanol e ácidos graxos [1]. Com o grande número de diferentes álcoois e ácidos em vinhos, o potencial de formação de uma grande gama de diferentes ésteres é considerável. Assim, é possível dividir o grupo de ésteres em classes, tais como acetatos de álcoois superiores, ésteres etílicos de ácidos graxos, ésteres etílicos de ácidos orgânicos, entre outros [37]. A Tabela 1.1 apresenta alguns representantes das principais classes de ésteres presentes em vinhos e seus principais descritores aromáticos.
Estes compostos são de extrema importância para o perfil aromático das bebidas fermentadas, especialmente vinhos, pois a presença de diferentes ésteres apresenta um efeito sinérgico, contribuindo para uma maior percepção dos aromas individuais que estão abaixo do limiar de percepção. Apresentam, em geral, aromas frutados, característicos de vinhos brancos jovens [1]. Durante o envelhecimento dos vinhos, os ésteres são lentamente hidrolisados, perdendo sua capacidade odorífera [1, 38, 39].
Tabela 1.1. Diferentes ésteres presentes em vinhos.
Éster Molécula Descritores Aromáticosa
Acetatos de álcoois Acetato de etila C H3 O O CH3 Solvente Acetato de isoamila C H3 O O CH3 CH3 Banana
Ésteres de ácidos organicos
Succinato de dietila O O O C H3 O CH3 Floral, frutado Lactato de etila O CH3 O C H3 OH Frutado, amanteigado
Ésteres etílicos de ácidos graxos
Butanoato de etila O O C H3 CH3 Frutado, morango Hexanoato de etila C H3 O CH3
O Frutado, maçã verde
Octanoato de etila C H3 O O CH3 Doce, frutado Decanoato de etila C H3 O O CH3
Frutado, uva, floral
a
Os ácidos graxos voláteis presentes no vinho podem derivar do anabolismo de lipídios, resultando em compostos com número par de átomos de carbono, por descarboxilação oxidativa de α-cetoácidos ou por oxidação de aldeídos. Os ácidos graxos voláteis sintetizados a partir de α-cetoácidos são, principalmente, o ácido propanóico, o ácido propanóico (ácido isobutírico), ácido 2-metil-1-butanóico e ácido 3-metil-1-2-metil-1-butanóico (ácido isovalérico, ácido 3-metilbutirico). A partir do metabolismo lipídico, os seguintes ácidos graxos são relatados: butanóico (butírico), ácido hexanóico (capróico), ácido octanóico (caprílico) e ácido decanóico (cáprico) (Figura 1.4) [42].
Figura 1.4. Ácidos graxos encontrados em vinhos: (1) ácido butanoico; (2) ácido hexanóico; (3) ácido octanóico (4) ácido decanóico.
(1)
(2)
(3)
Embora os ácidos graxos estejam descritos por notas desagradáveis em vinhos, tais como rançoso, queijo e sabão, apenas alguns compostos desta família atingem o seu limiar de percepção. No entanto, são considerados essenciais para o equilíbrio aromático do vinho [36].
4.1.4 Aromas Pós-Fermentativos
O aroma de um vinho pode mudar drasticamente durante o período de envelhecimento em barris e/ou em garrafa. As reações químicas que ocorrem durante esse período ainda são pouco compreendidas, porém sabe-se que o conteúdo de oxigênio desempenha papel relevante na formação de novos compostos e na evolução de compostos já presentes. Em geral, o conteúdo de oxigênio está relacionado com a formação de determinados compostos com aromas oxidativos (por exemplo, aldeídos ou sotolon) e a formação/degradação de compostos orgânicos sulfurados voláteis [43].
Em vinhos que passam pelo processo de envelhecimento, principalmente em barris de carvalho, ocorre a formação de alguns compostos de aroma característicos, como por exemplo, -metil-octalactona, composto que participa da formação de aroma contribuindo com o odor de amadeirado, carvalho, baunilha e/ou coco [44].
5. ANÁLISE DE COMPOSTOS VOLÁTEIS EM VINHOS
A fração volátil do vinho é extremamente complexa, principalmente devido ao grande número de compostos, de diferentes classes químicas, cobrindo uma vasta gama de polaridades, solubilidade, volatilidade e concentração variáveis. Além disso, os compostos voláteis estão contidos em matrizes complexas e de composição muito variável, onde podem estar associados e, portanto, a sua volatilidade é modulada por outros macrocomponentes dos vinhos (polifenóis, etanol, polissacarídeos, etc.) [45].
As metodologias de pesquisa de compostos voláteis em vinhos compreendem etapas fundamentais, entre elas a extração dos compostos voláteis da matriz (vinho), a separação e detecção das diferentes moléculas por cromatografia gasosa acoplada à um sistema de detecção e posteriormente, a identificação e quantificação dos compostos voláteis [46].
5.1 Extração dos Compostos Voláteis
A determinação de compostos voláteis em uvas e vinhos requer, muitas vezes, extensa extração e preparação das amostras antes da análise instrumental. Historicamente, os voláteis de vinhos foram isolados usando destilação ou técnicas de extração por uso de solventes [47, 48].
Atualmente, há ampla disponibilidade de ferramentas analíticas para a extração de compostos, sendo que os métodos mais comumente utilizados são a extração líquido-líquido (Liquid-Liquid Extraction, LLE), extração em fase sólida
extração (Solid Phase Extraction, SPE) e microextração em fase sólida (Solid
Phase Microextraction, SPME). LLE é uma tecnologia versátil, que possibilita
extrações simultâneas utilizando solventes com polaridades distintas, porém são utilizados grandes volumes de solventes, acarretando em impactos ambientais e à saúde do analista [48]. A SPE utiliza pequenos volumes de solvente e apresenta a vantagem de ser uma técnica seletiva usando fases adsorventes apropriados para as classes de compostos de interesse [49].
A microextração em fase sólida (SPME) é a técnica mais empregada atualmente para isolamento dos compostos voláteis em vinhos. Foi introduzida por Arthur e Pawliszyn em 1990 [50] e oferece muitas vantagens em relação às técnicas convencionais de preparo de amostras, entre as principais podemos citar a simplicidade, rapidez, utilização de pequenos volumes de amostras, extração isenta de solventes e manipulação mínima das amostras [51].
O dispositivo utilizado em SPME consiste em um holder (suporte), um êmbolo e uma agulha de aço. Quando o embolo é deslocado para baixo, uma haste metálica e/ou de sílica fundida que se encontra dentro da agulha é exposta. Na extremidade da haste um pequeno segmento é recoberto com material polimérico adsorvente, responsável pela extração dos compostos de interesse. Esse segmento será exposto à amostra, por imersão direta ou no modo de espaço confinado (headspace) [51, 52].
Na extração por SPME as moléculas do analito têm de se deslocar da matriz e penetrar no recobrimento e, para isto, resistências a transferências de massa devem ser vencidas, até que se estabeleça um equilíbrio de partição (ou de adsorção, para o caso de recobrimentos sólidos) do analito, entre a fibra e o meio que a envolve. Portanto, a teoria de SPME baseia-se na cinética de transferência de massa entre fases e na termodinâmica que descreve o equilíbrio de partição do analito entre elas [51, 52].
As características do material de recobrimento da fibra (espessura, polaridade, natureza do material polimérico) devem ser escolhidas de acordo com as características da(s) molécula(s) de interesse. Após a extração, a fibra extratora é transferida diretamente para o injetor de um cromatógrafo à gás onde os analitos sofrem dessorção térmica, podendo ser subsequentemente analisados qualitativamente e/ou quantitativamente [51, 52].
Considerando que a técnica de SPME não é uma extração exaustiva, mas sim uma técnica de equilíbrio, com o máximo de sensibilidade obtido em um determinado ponto, o desenvolvimento de um método de SPME requer a otimização de alguns parâmetros, tais como: tipo e modo de amostragem (imersão direta ou headspace), as condições de agitação (velocidade, tempo e temperatura), a força iônica, o pH, o volume da amostra, o volume de headspace, as condições de dessorção, entre outros [39, 33, 53, 54, 55, 56, 57].
A técnica SPME realizada no modo headspace (HS) acoplada com a cromatografia gasosa (GC) e/ou cromatografia gasosa/espectrometria de massas
(GC/MS) tem sido amplamente utilizado para analisar e monitorar o aroma de uvas e vinhos [16, 55, 58, 59, 60, 61].
5.2 Análise dos Compostos Voláteis por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
A mistura complexa de compostos voláteis obtida através da etapa de extração requer, para a sua separação, o uso de cromatografia gasosa (gas
chromatography, GC). A separação baseia-se na diferente distribuição dos
compostos da amostra entre uma fase estacionária (líquida ou sólida) e uma fase móvel (gasosa). As substancias presentes na amostra passam através da coluna cromatográfica, onde são separadas, e chegam ao sistema de detecção [62].
Diferentes detectores podem ser acoplados à GC e suas características (sensibilidade, seletividade, linearidade e quantidade mínima detectável) diferem significativamente. Dentre os detectores mais utilizados destacam-se o de Ionização de Chama e o de Espectrometria de Massas. O detector por Ionização de Chama é considerado universal para compostos orgânicos. A Espectrometria de Massas, em inglês Mass Spectrometry (MS), é uma das técnicas mais importantes de análise molecular devido ao seu potencial em fornecer informações de massa molar, bem como da estrutura do analito [46, 62].
Atualmente alguns sistemas apresentam o acoplamento entre GC e a espectrometria de massas tandem ou espectrometria de massas sequencial, também chamada de MS/MS ou MSn. Nesta técnica, as moléculas de interesse,
após um processo de ionização, sofrem uma sequência de análises: primeiro ocorre a seleção de um íon precursor ou íon pai, em seguida ocorre a ruptura deste íon precursor para gerar íons-fragmentos e ao final ocorre a análise e detecção dos fragmentos formados [63, 64].
Para realização de análises do tipo tandem, são necessários equipamentos apropriados que permitam a seleção específica de cada íon desejado. As configurações mais comuns são os do tipo triplo quadrupolo (QQQ),
quadrupolo-time of flight (Q-TOF) e quadrupolo-time of flight - quadrupolo-time of flight (TOF/TOF). Esses
equipamentos apresentam três componentes em sequência, sendo dois analisadores e uma câmara de fragmentação ou colisão [63, 64].
O analisador do tipo triplo quadrupolo é constituído por três quadrupolos em série, Q1, Q2 e Q3, sendo que o Q2 atua como uma célula de colisão, onde ocorrem as fragmentações dos íons selecionados anteriormente (Q1) (Figura 1.5).
O processo de colisão utiliza um gás inerte para induzir a dissociação do íon, Collision-Induced Dissociation (CID). O Q2 também é empregado como direcionador dos íons produzidos ao terceiro quadrupolo [65].
Figura 1.5. Esquema de um espectrômetro de massas em tandem do tipo triplo quadrupolo.
Em um espectrômetro de massas do tipo triplo quadruplo, diferentes configurações de experimentos podem ser realizados, incluindo os modos SCAN (varredura) e SIM (Single Ion Monitoring), ambos em modo MS tradicional. No modo MS/MS, as configurações utilizadas podem ser: monitoramento seletivo de reações (SRM, Selective Reaction Monitoring) ou monitoramento múltiplo de reações (MRM, Multiple Reaction Monitoring), varredura de íons produtos, varredura de íons precursores e varredura de perda neutra [63, 64]. A figura 1.6 mostra uma representação esquemática dos tipos de experimentos em MS/MS.
Na configuração Monitoramento Seletivo de Reações, MSR, o Q1 monitora a fragmentação de um íon precursor previamente selecionado e os seus correspondentes íons produtos. Quando se monitora a fragmentação de vários íons precursores simultaneamente, este modo de varredura é denominado Monitoramento de Reações Múltiplas, MRM [65].
A varredura dos íons produto (Product Ion Scan) isola o íon de interesse em Q1 que, em seguida, é fragmentado na cela de colisão (Q2). No Q3 é realizada a varredura dos íons produzidos a partir da fragmentação do íon de interesse isolado em Q1 para obtenção do espectro de massas [65].
Figura 1.6. Configurações de experimentos em MS/MS do tipo triplo quadrupolo.
Já a varredura do íon precursor (Precursor Ion Scan) é realizada quando o Q1 é ajustado para transmitir íons dentro de um intervalo de m/z de interesse, os quais são fragmentados na cela de colisão (Q2), sendo transmitidos íons de uma
única razão m/z (íon produto de fragmentação) para o Q3 [65]. Por sua vez, a varredura da perda neutra (Neutral Loss Scan) permite observar íons que se fragmentam perdendo uma massa de estrutura química específica e neutra [65].
Uma das principais vantagens do acoplamento entre cromatografia gasosa e espectrometria de massas em tandem é a identificação de compostos com alto grau de confiança, o que não seria possível apenas com base nas características de retenção/eluição dos compostos, fornecidas por outros detectores utilizados [65]. Assim, as análises em tandem propiciam maior seletividade e sensibilidade do sistema cromatográfico.
5.3 Identificação e Quantificação de Compostos Voláteis
A maneira mais simples de identificar compostos voláteis é comparando os tempos de retenção (tR) dos picos de interesse com os picos de padrões analíticos
puros. Quando não há a disponibilidade de padrões, outros parâmetros podem auxiliar na identificação do analito desconhecido, aumentando, assim, o grau de confiabilidade. As opções mais empregadas para este fim são: quando possível, o conhecimento prévio dos constituintes da amostra analisada; comparar o índice de retenção (ou índice de Kovats) calculado para o analito com aqueles fornecidos pela literatura para a substância em questão, obtidos em colunas com a mesma fase estacionária; comparar o índice de retenção em duas circunstâncias, uma utilizando uma coluna de fase polar e outra apolar [66]; considerar a posição do analito em relação a outros constituintes com identificação consolidada na mesma
amostra; e quando possível, relacionar os descritores sensoriais obtidos por olfatometria com os termos descritivos apresentados na literatura para o mesmo composto, principalmente quando o pico registrado pelo MS não possui razão sinal/ruído suficientemente grande para fornecer um espectro de qualidade [46].
Quando se utiliza espectrometria de massas para a identificação e confirmação dos compostos voláteis previamente separados, utiliza-se a informação estrutural proveniente da relação massa/carga (m/z) do íon molecular e dos fragmentos registrada nos espectros de massas obtidos. O analito é considerado positivamente identificado quando o seu espectro é idêntico ao obtido para a substância pura [67].
As análises quantitativas podem ser desenvolvidas utilizando padronização interna ou externa. No método de padronização interna uma quantidade de uma substância medida cuidadosamente, que atua como padrão interno, é introduzida em cada padrão e na amostra, e a razão entre as áreas do pico do analito e do padrão interno funcionam como parâmetro analítico. O método de padronização externa envolve a preparação de uma série de soluções-padrão de composições próximas à concentração do analito na amostra. A altura ou áreas dos picos obtidos no cromatogramas dos padrões são então utilizadas em um gráfico em função da concentração. Idealmente a curva obtida deve ser uma reta que passa pela origem e a concentração da amostra é obtida a partir da equação desta reta [68, 69].
A quantificação dos picos de compostos voláteis identificados deve ser realizada depois da validação do método. É essencial que os estudos de validação sejam representativos e conduzidos de modo que a variação da faixa de concentração e os tipos de amostras sejam adequados, garantindo a confiabilidade e reprodutibilidade do método analítico utilizado. Os parâmetros analíticos normalmente encontrados para validação de métodos de separação são: seletividade; linearidade e faixa de aplicação; precisão; exatidão; limite de detecção; limite de quantificação e robustez [68, 69].
6. REFERÊNCIAS
[1] JACKSON, R. Chemical Constituents of grapes. In: Wine Science: principles
and applications. 3th ed. London: Academic Press, p. 270 - 331. 2008
[2] INGLEZ DE SOUZA, J. S. Uvas para o Brasil. Piracicaba: FEALQ, 1996. 791p.
[3] GUERRA, C. C.; MANDELLI, F.; TONIETTO, J.; ZANUS, M. C.; CAMARGO, U. A. Conhecendo o essencial sobre uvas e vinhos. Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinhos, 2009.
[4] OIV. International Organisation of Vine and Wine. Statistical Report on World
Vitiviniculture 2013. Disponível em: http://www.oiv.int/oiv/cms/index. Acesso
em 08/set/2013.
[5] MELLO, L. M. R. de. Vitivinicultura brasileira: Panorama 2012. Bento
Gonçalves, 2012. Disponível em:
