Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
José Américo Nabuco Leva Ferreira de Freitas
Letalidade de miócitos cardíacos de rato
submetidos a estímulos multidirecionais
Campinas
2016
Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
José Américo Nabuco Leva Ferreira de Freitas
Letalidade de miócitos cardíacos de rato submetidos a
estímulos multidirecionais
Dissertação apresentada à Faculdade de En-genharia Elétrica e de Computação da Uni-versidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Elétrica, na Área de Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Xavier de Oliveira
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pelo aluno José Américo Nabuco Leva Ferreira de Freitas, e orientada pelo Prof. Dr. Pedro Xavier de Oliveira
Campinas
2016
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129
Freitas, José Américo Nabuco Leva Ferreira de,
F884L FreLetalidade de miócitos cardíacos de rato submetidos a estímulos
multidirecionais / José Américo Nabuco Leva Ferreira de Freitas. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
FreOrientador: Pedro Xavier de Oliveira.
FreDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação.
Fre1. Letalidade. 2. Miócitos cardíacos. 3. Desfibriladores. 4. Campos elétricos. I. Oliveira, Pedro Xavier de,1975-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Lethality of cardiac rat myocytes subjected to multidirectional
stimuli Palavras-chave em inglês: Lethality Cardiac myocytes Defibrillators Electrical fields
Área de concentração: Engenharia Biomédica Titulação: Mestre em Engenharia Elétrica Banca examinadora:
Pedro Xavier de Oliveira [Orientador] Diogo Coutinho Soriano
Eduardo Tavares Costa
Data de defesa: 27-10-2016
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Elétrica
Candidato: José Américo Nabuco Leva Ferreira de Freitas RA: 105153 Data da Defesa: 27 de outubro de 2016
Título da Tese: Letalidade de miócitos cardíacos de rato submetidos a estímulos
multi-direcionais
Prof. Dr. Pedro Xavier de Oliveira (Presidente, FEEC/UNICAMP) Prof. Dr. Diogo Coutinho Soriano (UFABC)
Prof. Dr. Eduardo Tavares Costa (FEEC/UNICAMP)
A ata de defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão Julgadora, encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Agradeço à minha família, Clarissa N. L. F. de Freitas, Josneimar F. de Freitas, Hernâni N. L. F. de Freitas e Marília N. L. F. de Freitas, por sempre acreditar no meu potencial e me incentivar a seguir meus sonhos;
À Taína M. Magalhães, pelo apoio incondicional;
Ao professor Pedro X. de Oliveira, por guiar-me durante a execução do projeto com paciência e sabedoria;
Aos demais professores do Departamento de Engenharia Biomédica, pelo interesse em ajudar e pela disponibilidade;
À secretária do Departamento de Engenharia Biomédica, Ana Lúcia F. Sastre, pela prontidão e pela atenção;
Aos técnicos do Centro de Engenharia Biomédica, Carlos A. L. da Silva, Flávio R. Santos, Mauro S. Martinazzo pelo apoio técnico e à pesquisadora Rosana A. Bassani e à bióloga Elizângela S. de Oliveira, pelo preparo das soluções e isolamento dos miócitos;
Aos meus colegas de laboratório e amigos, Fernanda S. C. Leomil, Marcelo Zoc-coler e Priscila C. Antoneli, por todos os conselhos relativos ao projeto e pela amizade incondicional;
Aos demais alunos do Departamento de Engenharia Biomédica, meus prezados amigos, Ahmad Almazloum, Arnaldo F. Neto, Carina M. Germer, Carlos A. Ferri, Dé-bora E. C. Matoso, Eliane C. Rodrigues, Fernando O. Andrade, Gustavo R. Raposo, Heitor S. Fernandes, Jair T. Goulart, Jeferson G. Gomes, João Carlos M. de Almeida, Lizandra A. Sá, Marcelo A. Viana, Rafael M. Farias e Willi D. L. Mota pelos momentos compartilhados;
A todos que contribuíram para que este trabalho se concretizasse.
Apoio
O presente trabalho foi realizado com apoio do CNPq, Conselho Nacional de De-senvolvimento Científico e Tecnológico - Brasil (Processo: 132319/2016-0), e da FAPESP, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo: 2014/18.798-1).
A desfibrilação é o único procedimento efetivo para reverter um quadro de fibrilação ven-tricular. Esta terapia, no entanto, pode lesar o tecido cardíaco, prejudicando a atividade contrátil ou induzindo uma nova fibrilação. A fim de reduzir os danos causados pelo tra-tamento, grupos de pesquisa tem estudado a eficiência de protocolos que consistem na aplicação de pulsos desfibrilatórios em diversas direções. Contudo, não há estudos sobre o potencial lesivo de tais protocolos. Neste trabalho, construímos um estimulador multidi-recional de alta intensidade e o utilizamos na determinação do campo elétrico letal para miócitos cardíacos isolados de rato para estímulos mono e multidirecionais. Um estímulo multidirecional foi composto por três pulsos de mesma amplitude e 5 ms de duração apli-cados a 60o no sentido horário, sem sobreposição temporal. O estimulador desenvolvido
é capaz de gerar três pulsos monopolares com amplitude de 1 kV com duração de 5 ms e intervalo entre pulsos de 1 ms. O campo elétrico que corresponde a uma probabilidade de morte de 50 % (E50) das células submetidas a estímulos monodirecionais foi de 98,45 V/cm (grupo MONO, N = 12). Para células submetidas a estímulos multidirecionais, o E50 foi de 99,5; 114,3 e 100,6 V/cm quando o primeiro pulso foi aplicado, respectivamente, a 0o (grupo MULTI0, N = 12), a 60o (grupo MULTI60, N = 12) ou 120o (grupo MULTI120, N
= 12) da direção longitudinal. Desta forma, a probabilidade de letalidade de um miócito submetido a estímulos multidirecionais é semelhante à probabilidade de letalidade para estímulos monodirecionais. Esperamos que estes resultados auxiliem futuros trabalhos na determinação dos efeitos da desfibrilação multidirecional e no desenvolvimento de terapias menos lesivas.
Defibrillation is the only effective procedure to revert a ventricular fibrillation condition. However, this therapy may injury the cardiac tissue, impairing its contractile function or inducing another fibrillation. Aiming to reduce the damage caused by this treatment, research groups have been studying the efficiency of protocols based on the application of stimuli in several directions. Yet, there are no studies about these protocols detrimental effects. In the present work, we built a high intensity multidirectional stimulator and used it to determine the lethal electric field of cardiac rat myocytes subjected to mono and multidirectional stimuli. A multidirectional stimulus was compound of three pulses with the same amplitude and 5 ms applied clockwise every 60o, with no temporal superposition.
The stimulator developed is able to generate three monophasic pulses up to 1 kV with 5 ms, spaced by 1 ms. The electric field correspondent to a lethality of 50 % (E50) of the cells subjected to monodirectional stimuli was 98.45 V/cm (group MONO, N = 12). For cells subjected to multidirectional stimuli, the E50 was 99.5, 114.3 and 100.6 V/cm for stimuli with first pulse applied, respectively, at 0o (group MULTI0, N = 12), at 60o (group MULTI60, N = 12) or 120o (group MULTI120, N = 12) of longitudinal direction. Thus, the probability of lethality of a myocyte subjected to multidirectional stimuli is similar to the probability of lethality for monodirectional stimuli. We hope those results help further studies in the determination of multidirectional defibrillation effects and in the development of less harmful therapies.
Figura 1 – Miócito cardíaco de rato Wistar adulto. . . 16
Figura 2 – Vias de condução elétrica do coração (Guyton & Hall, 2006). ©Elsevier. 17 Figura 3 – Potencial de ação (PA) em miócito ventricular. No topo, potencial transmembrana durante o PA e suas fases. Na porção inferior, repre-sentações dos principais íons que atravessam a membrana em cada fase. Modificado de Berne & Levy (2009). ©Elsevier. . . 18
Figura 4 – Transporte de Ca2+ durante o acoplamento excitação-contração: AT-Pase de íon cálcio (Ca2+) (ATP); ATPase de íon sódio (Na+)/íon po-tássio (K+) (ATP); mitocôndria (Mito); trocador Na+/Ca2+ (NCX); retículo sarcoplasmático (RS); receptor de rianodina (RyR). Detalhe: Relação temporal entre o disparo de um PA, o transiente de concentra-ção citosólica de Ca2+ e a contração da do miócito. Adaptado de Bers (2002). Licença número 3983710282856. . . 19
Figura 5 – Potencial elétrico durante a aplicação de um E em uma célula. As linhas verticais representam isopotenciais e regiões com cores mais próximas do vermelho possuem um potencial mais positivo que regiões com cores mais próximas do violeta. Modificado de Kotnik & Miklavcic (2000). Licença número 3953170657885. . . 21
Figura 6 – Segmento da membrana celular, orientado verticalmente (Kotnik et al., 2012). (A) Fosfolípides dispostos em dupla camada. (B) Poro hidrofí-lico. (C) Poro hidrofóbico. ©2012 IEEE. . . 22
Figura 7 – Conversor Flyback. A) Quando a chave T está fechada, a energia da fonte flui para o campo magnético que acopla os indutores. B) Quando a chave T se abre, o diodo D entra em condução e a energia dos indutores é transferida para o capacitor. . . 25
Figura 8 – Montagem experimental. . . 27
Figura 9 – Diagrama de blocos do estimulador multidirecional de alta intensidade (EAI) . . . 28
Figura 10 – Circuito do microcontrolador . . . 29
Figura 11 – Fluxo de execução do software do microcontrolador . . . 30
Figura 12 – Conversor Flyback . . . 31
Figura 13 – Circuitos de disparo do EAI. Os terminais de saída nos circuitos de disparo são conectados ao circuito comutador (seção 3.2.5) . . . 33
Figura 14 – Circuito de descarga dos capacitores após a execução do disparo . . . . 33
Figura 15 – Circuito comutador . . . 34
CE e protocolo de estimulação letal para o grupo MONO. B) Protocolo de estimulação letal para o grupo MULTI0. C) Protocolo de estimulação letal para o grupo MULTI60. D) Protocolo de estimulação letal para o grupo MULTI120. . . 40 Figura 18 – Estimulador multidirecional de alta intensidade (EAI). (A) Vista
su-perior. (B) Vista frontal. (C) Vista lateral (lado direito). . . 42 Figura 19 – Circuito do estimulador multidirecional de alta intensidade (EAI). (A)
Fontes. (B) Circuito de proteção do CF. (C) Conversor Flyback. (D) Microcontrolador. (E) Driver dos circuitos de disparo e descarga. (F) Capacitores. (G) Circuitos de disparo e descarga. (H) Circuito comutador. 43 Figura 20 – Formas de onda dos circuitos do estimulador de alta intensidade. A)
Botão de confirmação (ativo alto); B) Pulsos de chaveamento do CF; C) Capacitor de saída; D) Feedback do CF; E) EBI; F) Relé HJR1-2C; G) Relé AZ733; H) Disparos na CE; I) Sinal de descarga dos capacitores. 44 Figura 21 – Corrente (A) e tensão (B) na câmara submetida à estimulação
multi-direcional . . . 44 Figura 22 – Relação entrada-saída do EAI. As linhas verticais indicam o erro-padrão
da média. (N=5). . . 45 Figura 23 – Probabilidade de letalidade de miócitos cardíacos em função do campo
elétrico aplicado. . . 46 Figura 24 – Variação do potencial transmembrana teórica calculada para uma
cé-lula com dimensões médias (2a = 30 𝜇m e 2c = 120 𝜇m) submetida a um estímulo multidirecional com amplitude E = 100 V/cm. A) Grupo MULTI60. B) Grupo MULTI120. . . 52 Figura 25 – Representação de um miócito submetido a um E externo uniforme em
um sistema de coordenada cartesiano. O E está contido no plano xz e orientado a um ângulo 𝜃 da direção do maior eixo da célula (eixo z). . . 60 Figura 26 – Representação gráfica da transformação de coordenadas utilizada para
representar o esferoide prolato. . . 62 Figura 27 – ΔVminduzida por E em uma célula com dimensões médias. (A) Miócito
submetido a um E na direção longitudinal. (B) ΔVm induzida pela
aplicação do E na direção longitudinal em função do ângulo polar 𝛼. (C) Miócito submetido a um E a 60o da direção longitudinal. (D) ΔV
m
induzida pela aplicação do E a 60o em função do ângulo polar 𝛼. . . . 63
Figura 28 – Modelo do comportamento elétrico passivo da membrana celular. (A) Circuito equivalente a uma célula submetida a um E externo. (B) Evo-lução temporal do Vm durante a aplicação do estímulo (𝜏 = 1 ms). . . 65
induzida por dois estímulos consecutivos idênticos. . . 65 Figura 30 – ΔVm induzida por campo elétrico (E) em uma célula com dimensões
médias para as três direções dos estímulos multidirecionais. (A) Miócito submetido a um E na direção longitudinal. (B) Miócito submetido a um E a 60o da direção longitudinal. (C) Miócito submetido a um E a
120o da direção longitudinal. (D) ΔV
m induzida pela aplicação do E a
0o, 60o e 120o em função do ângulo polar. . . . . 66
Figura 31 – Valores de ΔVmem regime permanente no ponto de ΔVmax (𝛼 = 180o)
para os pulsos dos estímulos multidirecionais relativos a cada grupo experimental e evolução temporal ΔVm durante a aplicação dos
es-tímulos (𝜏 = 1 ms). (A) Grupo MULTI0. (B) Grupo MULTI60. (C) Grupo MULTI120. . . 67
Tabela 1 – Médias ± erros padrões da média do comprimento, largura, campo elétrico limiar de estimulação (ET,MONO), variação máxima do potencial
transmembrana no limiar de estimulação ΔVmax,T,MONO para pulsos
bipolares de 5ms em cada fase. Não houve diferença estatística entre os grupos para qualquer variável (análise de monovariância fatorial). . 45 Tabela 2 – Valores médios e intervalos de confiança para 95% (IC95) de campos
elétricos associados a 50% de probabilidade de letalidade (E50) e do coeficiente de Hill das curvas de letalidade (h) para cada grupo experi-mental. * Não sobreposição do IC95 com os grupos MONO, MULTI0 e MULTI120. # Não sobreposição do IC95 com os grupos MONO, MULTI60 e MULTI120. . . 46 Tabela 3 – Custo dos componentes do EAI . . . 47
ΔVmax máxima variação do potencial transmembrana
ΔVm variação do potencial transmembrana
ADC conversor analógico-digital AEC acoplamento excitação-contração ATP trifosfato de adenosina
Ca2+ íon cálcio
CE câmara de estimulação
CEB/UNICAMP Centro de Engenharia Biomédica da Universidade Estadual de
Cam-pinas
CF conversor Flyback
Cpl-P solução cardioplégica para dissociação e armazenamento das células E campo elétrico
E50 campo elétrico correspondente a 50% de letalidade EAI estimulador multidirecional de alta intensidade EBI estimulador multidirecional de baixa intensidade feixe AV feixe atrioventricular
FS fator de segurança FV fibrilação ventricular h coeficiente de Hill
IC95 intervalo de confiança para 95% IGBT Insulated Gate Bipolar Transistor K+ íon potássio
LED light emmiting diode
MONO grupo de células submetidas a estímulos de alta intensidade monodirecionais MULTI0 grupo de células submetidas a estímulos de alta intensidade multidirecionais,
com primeiro pulso a 0o
MULTI120 grupo de células submetidas a estímulos de alta intensidade multidirecionais,
com primeiro pulso a 120o
MULTI60 grupo de células submetidas a estímulos de alta intensidade multidirecionais,
com primeiro pulso a 60o
Na+ íon sódio
NCX trocador Na+/Ca2+
nodo AV nodo atrioventricular nodo SA nodo sinusal
NT solução de Tyrode Normal PA potencial de ação
RS retículo sarcoplasmático RyR receptor de rianodina
TyCI solução de Tyrode para isolamento de células VE tensão de entrada
Vm potencial transmembrana
1 Introdução . . . 16
1.1 Estimulação por campo elétrico . . . 20
1.2 Desfibrilação . . . 22
1.3 Conversor Flyback . . . 24
2 Objetivos . . . 26
3 Materiais e Métodos . . . 27
3.1 Montagem experimental . . . 27
3.2 Estimulador multidirecional de alta intensidade . . . 27
3.2.1 Microcontrolador . . . 28 3.2.2 Conversor Flyback . . . 31 3.2.3 Circuito de disparo . . . 32 3.2.4 Circuito de descarga . . . 33 3.2.5 Circuito comutador . . . 33 3.2.6 Chave de segurança . . . 34
3.3 Estimulador multidirecional de baixa intensidade . . . 35
3.4 Osciloscópio . . . 35 3.5 Microscopia . . . 35 3.6 Câmara de estimulação . . . 35 3.7 Animais . . . 37 3.8 Soluções fisiológicas . . . 37 3.9 Isolamento de células . . . 37 3.10 Protocolo experimental . . . 38 3.10.1 Preparação da câmara . . . 38
3.10.2 Dimensões e limiares de estimulação . . . 38
3.10.3 Determinação da relação entre o campo elétrico e letalidade . . . . 38
3.11 Processamento dos dados . . . 40
3.12 Determinação do potencial transmembrana induzido por um estímulo . . . 40
3.13 Análise estatística . . . 41
3.13.1 Curvas de letalidade . . . 41
4 Resultados . . . 42
4.1 Estimulador multidirecional de alta intensidade . . . 42
4.2 Relação entre a intensidade de estímulos multidirecionais e letalidade . . . 45
5 Discussão . . . 47
5.1 Estimulador multidirecional de alta intensidade . . . 47
5.2 Resultados experimentais . . . 50
6 Conclusão . . . 54
Bibliografia . . . 55
Apêndice A Variação do potencial transmembrana induzida por um estímulo multidirecional . . . 60
A.1 Estimulação monodirecional . . . 60
A.1.1 Representação em coordenadas esféricas . . . 61
A.1.2 Ponto de máxima variação do potencial transmembrana . . . 63
A.1.3 Dinâmica transiente da ΔVm . . . 64
A.2 Estimulação multidirecional . . . 66
A.3 Limitações da análise . . . 68
1 Introdução
O coração é um órgão do sistema circulatório que atua como uma bomba pulsátil, promovendo a circulação sanguínea que distribui nutrientes e hormônios para os tecidos. Ele é formado por quatro câmaras (dois átrios e dois ventrículos) que contraem de forma rítmica e coordenada em um ciclo com duas fases. Na diástole, o sangue entra no coração pelos átrios e flui para os ventrículos, que estão relaxados. Na sístole, os ventrículos contraem e o sangue é ejetado para os tecidos (Silverthorn, 2009).
O coração é composto por miócitos, células especializadas que constituem os teci-dos musculares. A Figura 1 é uma fotografia de um miócito cardíaco de rato isolado. Tais miócitos possuem formato aproximadamente cilíndrico (Milan, 2015), com um diâmetro da ordem de 30 𝜇m e comprimento de cerca de 120 𝜇m (Prado et al., 2016; Fonseca et al., 2013; Goulart et al., 2012; Oliveira et al., 2008). Eles são delimitados por uma membrana composta por fosfolípides, moléculas formadas por um glicerol ligado a um grupo fosfato e a duas cadeias de ácido graxo, denominada sarcolema ou membrana sarcoplasmática. Em células musculares especializadas, o retículo endoplasmático é chamado de retículo sarcoplasmático (RS) e é mais desenvolvido do que em outros tipos de célula. Sua função é armazenar Ca2+, que tem uma participação essencial no processo de contração da célula.
Outra característica de miócitos é a presença de miofilamentos, proteínas responsáveis por executar a contração celular (Silverthorn, 2009; Guyton & Hall, 2006).
Figura 1 – Miócito cardíaco de rato Wistar adulto.
A atividade contrátil das células cardíacas é coordenada pela atividade elétrica de um grupo de células auto-excitáveis que compõe o nodo sinusal (nodo SA), localizadas no átrio direito (Figura 2). Elas geram um potencial elétrico, potencial de ação (PA), que se
propaga pelos miócitos atriais através de junções comunicantes (gap junctions) até o nodo atrioventricular (nodo AV). Os átrios contraem e, enquanto o sangue é deslocado para os ventrículos, o potencial do nodo AV se propaga pelo feixe atrioventricular (feixe AV), onde sofre um atraso devido ao número reduzido de gap junctions. Uma barreira fibrosa entre os átrios e os ventrículos impede que o potencial seja conduzido por outras vias além do feixe AV. O sinal é rapidamente conduzido à extremidade inferior dos ventrículos por fibras de Purkinje, que se ramificam lateralmente no tecido cardíaco. Ao atingir as extremidades das fibras de Purkinje, o PA se propaga pelo músculo ventricular, que ejeta o sangue do coração ao contrair (Guyton & Hall, 2006; Burton, 1977).
Figura 2 – Vias de condução elétrica do coração (Guyton & Hall, 2006). ©Elsevier.
Um típico PA ventricular pode ser dividido em cinco fases (Figura 3; Berne & Levy, 2009; Alberts et al., 2002; Garcia, 2002). Na fase 0, canais de Na+ na membrana
se abrem e os íons Na+, cuja concentração extracelular é maior que a intracelular, fluem
para o interior da célula, e o potencial transmembrana (Vm) se eleva. Com o Vm em
valores mais positivos, mais canais de Na+ se abrem, caracterizando uma realimentação
positiva. Cerca de 2 ms após sua abertura, os canais de Na+ mudam de conformação
e se inativam, enquanto canais de K+ ativam-se, caraterizando início da fase 1 do PA.
Nesta fase, íons K+, cuja concentração intracelular é maior que a extracelular, fluem para
o exterior da célula, e o Vm tende a valores mais negativos. A fase 2 se inicia com a
abertura de canais de Ca2+, cuja dinâmina é mais lenta que a dos canais de Na+. Como
a concentração extracelular de íons Ca2+ é maior que a intracelular, há um fluxo de Ca2+
para o interior da célula. A entrada de Ca2+ ocorre simultaneamente à saída de K+, e
o Vm fica aproximadamente constante. Na fase 3 do PA, os canais de Ca2+ se fecham,
repouso, sendo que o influxo de K+ devido ao gradiente elétrico entre os meios intra e
extracelular é balanceado pelo efluxo de K+em virtude do gradiente de concentração entre
tais meios. Os íons Na+ que fluíram para o interior da célula durante o PA são removidos
pela atividade da Na+/K+ ATPase, uma proteína transmembrana que expulsa íons Na+ do meio interno e capta íons K+ do meio externo com gasto de trifosfato de adenosina (ATP; Berne & Levy, 2009).
Figura 3 – Potencial de ação (PA) em miócito ventricular. No topo, potencial transmem-brana durante o PA e suas fases. Na porção inferior, representações dos prin-cipais íons que atravessam a membrana em cada fase. Modificado de Berne & Levy (2009). ©Elsevier.
O PA desencadeia a contração do miócito em um processo denominado acopla-mento excitação-contração (AEC), representado na Figura 4 (Katz, 2006; Bers, 2002; Aidley, 1998). Durante o platô do PA (fase 2), a entrada de íons Ca2+ pelo trocador
Na+/Ca2+ (NCX; modo reverso) e por canais Ca2+ do tipo L induz a liberação de Ca2+
do RS através de canais de Ca2+ do RS, denominados receptores de rianodina (RyR),
que eleva a concentração citoplasmática do íon, assim, ativando os miofilamentos e evo-cando contração do miócito. A relação temporal entre o disparo de um PA, o transiente de concentração de Ca2+ e a contração da do miócito está representada no detalhe da
Figura 4. O processo de relaxamento da célula tem início com o fechamento dos canais de Ca2+ na membrana celular. A maior parte do Ca2+ no citoplasma então é recaptado
NCX (modo direto) e por ATPases de Ca2+ na membrana celular. Adicionalmente, uma
pequena porção do Ca2+ citosólico é transportado para o interior das mitocôndrias.
Figura 4 – Transporte de Ca2+ durante o acoplamento excitação-contração: ATPase
de Ca2+ (ATP); ATPase de Na+/K+ (ATP); mitocôndria (Mito); trocador Na+/Ca2+(NCX); retículo sarcoplasmático (RS); receptor de rianodina (RyR).
Detalhe: Relação temporal entre o disparo de um PA, o transiente de concen-tração citosólica de Ca2+ e a contração da do miócito. Adaptado de Bers (2002). Licença número 3983710282856.
Algumas patologias podem afetar o AEC, o PA e a sua propagação (Garcia, 2002). Pacientes identificados com paralisia periódica hipocalêmica possuem mutações no gene responsável pela codificação dos canais de Ca2+ dependentes de tensão e são acometidos por crises de fraqueza muscular generalizada e menor concentração citoplasmática de K+.
De forma semelhante, pacientes diagnosticados com a síndrome de Romano-Ward possuem alterações em genes que codificam algumas variantes dos canais de Na+ e K+, de forma
que as fases 3 e 4 do PA podem apresentar distúrbios, impactando na repolarização das células ventriculares.
Anomalias que afetam a atividade elétrica do coração, congênitas ou não, podem levar ao surgimento de arritmias cardíacas. A mais grave de todas as arritmias é a fibrilação ventricular (FV), que pode matar um indivíduo em minutos (Dosdall et al., 2010; Guyton & Hall, 2006) e da qual cerca de 30 % dos pacientes sobrevivem (Mozaffarian et al., 2015).
Ela consiste na contração assíncrona dos miócitos ventriculares, reduzindo drasticamente a ejeção de sangue. A única terapia conhecida para reversão da FV é a desfibrilação (Dosdall et al., 2010; Malmivuo & Plonsey, 1995), que consiste na aplicação de um E de alta intensidade no tórax do indivíduo com a finalidade de estimular uma porção significativa do tecido cardíaco.
1.1
Estimulação por campo elétrico
Na Figura 5, um miócito, cuja membrana está representada por duas elipses, está suspenso em um meio condutor durante a aplicação de um E. O E aplicado está associado a um gradiente de potencial no meio externo, que se estabelece em regime permanente. Como o sarcolema possui baixa condutividade (Kotnik et al., 1997), não há condução de corrente no interior do miócito e o potencial no citoplasma é aproximadamente constante (Kotnik & Miklavcic, 2000; Kinosita et al., 1988). Desta forma, o Vm, dado pela diferença
entre os potenciais interno e externo da célula, varia espacialmente com o potencial externo (Dosdall et al., 2010; Cheng et al., 1999; Kinosita et al., 1988). Os pontos da membrana cuja amplitude da ΔVmé máxima em módulo são os mais próximos dos eletrodos, em que
o anodo induz uma ΔVm negativa, e o catodo, uma ΔVm positiva (Kotnik et al., 2011;
Sharma & Tung, 2002). A amplitude da ΔVm depende da amplitude e da direção do E
e atinge níveis mais altos quando este é paralelo ao maior eixo da célula (Kotnik et al., 2011; Ranjan & Thakor, 1995; Klee & Plonsey, 1976).
Embora a Figura 5 seja produto de uma simulação númerica, os mesmos valores de ΔVm podem ser obtidos utilizando-se o modelo analítico proposto por Klee & Plonsey
(1976), pois os dois trabalhos aproximam o formato das células cardíacas como o de um esferoide prolato. No entanto, Milan et al. (2014) reconstruíram o formato tridimensional de miócitos cardíacos a partir de imagens de microscopia e compararam as previsões de modelos analíticos que consideram a geometria celular como um esferoide prolato com simulações por elementos finitos da ΔVm induzida, constatando que o modelo não é
tão preciso quanto as simulações a partir de dados experimentais, mas gera estimativas confiáveis e requer menor processamento computacional.
Como a membrana celular possui uma alta resistividade e está imersa em um meio condutor, seu comportamento elétrico passivo dinâmico pode ser modelado como um circuito RC (Aidley, 1998; Kotnik et al., 1997; Malmivuo & Plonsey, 1995). Logo, para estímulos de baixa amplitude, sublimiares, a ΔVm induzida por um E tem uma
evolução temporal semelhante à carga de um capacitor. Caso dois estímulos sublimiares de mesma amplitude sejam aplicados em seguida, a ΔVm induzida pelo segundo estímulo
pode somar-se à induzida pelo primeiro, resultando em um ΔVm com amplitude maior
Figura 5 – Potencial elétrico durante a aplicação de um E em uma célula. As linhas ticais representam isopotenciais e regiões com cores mais próximas do ver-melho possuem um potencial mais positivo que regiões com cores mais pró-ximas do violeta. Modificado de Kotnik & Miklavcic (2000). Licença número 3953170657885.
(Guyton & Hall, 2006).
Quando a ΔVm induzida atinge um valor limiar de estimulação, entre 20 e 30 mV
em miócitos cardíacos de rato (Brown et al., 1981), ocorre o disparo de um PA (Alberts
et al., 2002; Garcia, 2002). A indução da ΔVm, contudo, não ocorre no exato instante
em que o E é aplicado. A capacitância da membrana celular faz com que o Vm varie
gradualmente, sendo que a taxa de aumento da ΔVm é proporcional à intensidade do E
aplicado. Desta forma, o E limiar de excitação depende da duração do estímulo e é maior para estímulos com menor tempo de aplicação. (Prado et al., 2016; Aidley, 1998).
Após o PA, nem sempre o miócito está em um estado excitável em que, por meio de um estímulo, um segundo PA é disparado. Ao serem inativados, os canais de Na+
permanecem neste estado até que o Vm retorne a seu valor de repouso, de forma que
o miócito entra em um estado refratário. O período em que a célula encontra-se neste estado possui duas fases: período refratário absoluto e período refratário relativo. Durante o período refratário absoluto, não é possível induzir o disparo de um PA. No período refratário relativo, é necessário aplicar estímulos de maior intensidade para o disparo de um PA, pois o limiar de estimulação é maior (Dosdall et al., 2010; Alberts et al., 2002; Tacker & Geddes, 1996; Malmivuo & Plonsey, 1995).
Entretanto, se um estímulo for alto o suficiente para induzir uma ΔVm entre
200 mV e 1 V (Saulis, 2010; Chen et al., 2006), a membrana sacroplasmática pode ser lesada, levando à contração irreversível do miócito (Klauke et al., 2009). A membrana é majoritariamente formada por fosfolípides dispostos em uma dupla camada (Figura 6A). A agitação térmica destas moléculas causa a formação de poros hidrofóbicos na membrana,
que não permitem a passagem de íons e moléculas polares (Figura 6B; Kotnik et al., 2012; Saulis, 2010; Chen et al., 2006). Quando uma ΔVm alta é induzida, os fosfolípides
se reorientam, de forma que os poros hidrofóbicos atinjam um raio crítico e se convertam em poros hidrofílicos, fenômeno denominado eletroporação (Figura 6C; Lewis, 2003). O surgimento de poros hidrofílicos acarreta na passagem não seletiva de substâncias através da membrana, inclusive íons Ca2+. O aumento massivo da concentração citoplasmática
de Ca2+ ativa os miofilamentos, levando à hipercontratura e morte do miócito (Klauke
et al., 2009).
Figura 6 – Segmento da membrana celular, orientado verticalmente (Kotnik et al., 2012). (A) Fosfolípides dispostos em dupla camada. (B) Poro hidrofílico. (C) Poro hidrofóbico. ©2012 IEEE.
Como a desfibrilação consiste na aplicação de um E elevado no tórax do paciente, algumas regiões do tecido cardíaco estão sujeitas a valores elevados de ΔVm induzida
e à eletroporação durante a aplicação de estímulos desfibrilatórios (Dosdall et al., 2010; Nikolski & Efimov, 2005; Al-Khadra et al., 2000).
1.2
Desfibrilação
O objetivo da desfibrilação é estimular uma massa crítica entre 75 % e 90 % do miocárdio a fim de cessar as ondas de despolarização que se propagam pelo tecido (Li & Chen, 2014; Al-Khadra et al., 2000). Como o coração é anisotrópico, constituído de fibras musculares orientadas em múltiplas direções, intercaladas com camadas de tecidos conjuntivo, o E induzido pelo choque desfibrilatório é distribuído heterogeneamente no órgão (Dosdall et al., 2010; Nikolski & Efimov, 2005; Al-Khadra et al., 2000). Deste modo, é necessário que o estímulo aplicado seja intenso o suficiente para estimular uma fração
considerável do miocárdio, mesmo em regiões nas quais o E tem valores reduzidos. Além da anisotropia do coração, boa parte do tecido encontra-se no período refratário durante a FV, demandando a aplicação de E ainda mais intensos (Dosdall et al., 2010; Guyton & Hall, 2006).
Durante a desfibrilação, o E pode atingir mais de 100 V/cm em alguns pontos do coração, como em regiões próximas aos eletrodos ou nas quais o tecido possui maior condutividade (Al-Khadra et al., 2000; Yabe et al., 1990). Tais valores de E podem induzir eletroporação em células cardíacas, levando à morte celular (Prado et al., 2016; Goulart
et al., 2012; Oliveira et al., 2008), podendo reduzir a eficiência bombeatória do coração
ou induzir uma nova FV (Li & Chen, 2014; Dosdall et al., 2010).
Os danos causados por pulsos desfibrilatórios podem ser reduzidos com a utiliza-ção de formas de onda bipolares, sem prejuízo da efetividade do tratamento (Li & Chen, 2014; Dosdall et al., 2010). Faddy et al. (2003) observaram que choques desfibrilatórios com forma de onda bipolar permitem uma diminuição de 35 % na amplitude do estímulo para uma mesma eficiência desfibrilatória e que choques bipolares reduzem o risco de persistência da FV em 81 % quando comparados com choques monopolares de mesma in-tensidade. Zhang et al. (2003), por sua vez, identificaram uma maior taxa de desfibrilação bem sucedida para estímulos bipolares ao aplicar choques com diversos níveis de energia em suínos.
A melhor eficiência desfibrilatória do estímulo bipolar pode ser explicada pelo limiar de estimulação e pela probabilidade de letalidade de células cardíacas isoladas. A amplitude necessária para disparo de PA é menor para estímulos bipolares que para estímulos monopolares (Bassani et al., 2006). Para estímulos com mesma duração total, formas de onda bipolares também são menos letais que formas de onda monopolares (Oliveira et al., 2008). Desta forma, a razão entre o E letal e o E limiar é maior para estímulos bipolares (Oliveira et al., 2008).
Protocolos desfibrilatórios que envolvem a aplicação de pulsos em múltiplas dire-ções também são mais eficientes. Viana et al. (2016) construíram um desfibrilador de três direções e obtiveram uma diminuição de 30 % da energia necessária para reverter FV em 50 % de uma população de suínos. Pagan-Carlo et al. (1998) observaram maiores taxas de desfibrilação bem-sucedida em cães para estímulos multidirecionais em relação a estímulos monodirecionais. Para níveis de energia até 100 J, estímulos multidirecionais monopolares são mais eficientes que estímulos bipolares. Exner et al. (1994) mediram o limiar desfibri-latório de humanos e observaram que o limiar desfibridesfibri-latório para estímulos formados por dois pulsos monopolares ortogonais é 10 % menor que o limiar para estímulos bipolares monodirecionais.
A maior eficiência de protocolos multidirecionais pode ser explicada pela influência da direção do E na ΔVminduzida. Como citado anteriormente, a ΔVmé máxima quando o
E é aplicado paralelamente ao maior eixo da célula (Kotnik et al., 2011; Ranjan & Thakor, 1995; Klee & Plonsey, 1976). Assim, a amplitude do E necessária para disparar um PA é mínima quando este é aplicado na direção longitudinal, como verificado por Oliveira
et al. (2008) e Bassani et al. (2006). Fonseca et al. (2013) constataram que o E limiar
de estimulação para estímulos monopolares monodirecionais é idêntico ao E limiar para estímulos monopolares multidirecionais. Contudo, ao aplicar um estímulo multidirecional em populações de células aleatoriamente orientadas, o recrutamento observado foi duas vezes maior que o obtido com a aplicação de um estímulo monodirecional em virtude do maior número de células alinhadas com a direção de um dos pulsos.
Entretanto, a probabilidade de letalidade de um miócito é maior para um estímulo aplicado na direção longitudinal do que para um estímulo aplicado na direção transversal, analogamente ao limiar de estimulação (Oliveira et al., 2008). Assim, são necessários mais estudos para determinar se um protocolo de estimulação multidirecional pode causar mais lesões às células cardíacas. Neste trabalho, determinamos o E letal de células cardíacas isoladas de rato in vitro para estímulos mono e multidirecionais. Para realização dos experimentos, também foi necessário desenvolver um estimulador multidirecional de alta intensidade, baseado em um conversor Flyback (CF).
1.3
Conversor Flyback
O estimulador multidirecional de alta intensidade (EAI) desenvolvido neste tra-balho foi projetado para gerar pulsos de até 1 kV com duração de alguns milissegundos, semelhantes aos gerados por desfibriladores (Viana et al., 2016; Li & Chen, 2014; Pagan-Carlo et al., 1998; Exner et al., 1994). Um estimulador com tais especificações pode ser implementado com uso de um CF (Viana et al., 2016; Pomilio, 2014).
Resumidamente, um CF opera com a abertura e fechamento de uma chave, trans-ferindo a energia de uma fonte para um capacitor (Pomilio, 2014). Seu circuito está repre-sentado na Figura 7 e possui um par de indutores acoplados que garantem o isolamento elétrico entre saída e entrada. Quando a chave T está fechada, a energia da fonte de tensão é transferida para o campo magnético que acopla os indutores (Figura 7A). A circulação de corrente no indutor primário induz uma diferença de potencial nos terminais do indu-tor secundário, polarizando reversamente o diodo D. Quando T se abre, o transformador induz corrente no secundário a fim de manter a continuidade de seu fluxo magnético. O diodo D entra em condução e a energia armazenada nos indutores é transferida para o capacitor na saída (Figura 7B). A cada ciclo de abertura e fechamento da chave, a ener-gia da fonte de alimentação é transferida para o transformador e redirecionada para o capacitor, aumentando a tensão na saída do CF.
Figura 7 – Conversor Flyback. A) Quando a chave T está fechada, a energia da fonte flui para o campo magnético que acopla os indutores. B) Quando a chave T se abre, o diodo D entra em condução e a energia dos indutores é transferida para o capacitor.
2 Objetivos
• Desenvolver instrumentação para estimulação de miócitos cardíacos de rato por campo elétrico de alta intensidade em três direções.
• Investigar o efeito na letalidade de miócitos cardíacos de rato devido à aplicação de pulsos em três direções.
3 Materiais e Métodos
3.1
Montagem experimental
A montagem experimental está representada na Figura 8.
Figura 8 – Montagem experimental.
Os miócitos foram depositados em uma câmara de estimulação (CE, desenvolvida no CEB/UNICAMP) situada sobre o estágio de um microscópio. As imagens das células eram captadas por uma câmera de vídeo conectada a um computador e exibidas durante os experimentos.
A CE estava conectada ao EAI, desenvolvido neste trabalho e projetado para disparar três pulsos monopolares de até 1 kV com 5 ms de duração, ou ao estimulador multidirecional de baixa intensidade (EBI, desenvolvido no CEB/UNICAMP), capaz de fornecer três pulsos retangulares sequenciais (mono ou bipolares simétricos; 0-50 V; 0,5 Hz; 5 ms de duração). A comutação entre o EAI e o EBI foi feita por relés internos ao EAI. Os dois estimuladores possuem resistores de precisão em suas saídas, que permitem determinar a corrente elétrica que atravessa a câmara.
3.2
Estimulador multidirecional de alta intensidade
O diagrama de blocos do EAI desenvolvido neste trabalho pode ser visualizado na Figura 9.
O usuário inicialmente seleciona a amplitude desejada por meio da interface com o usuário. Ao pressionar o botão confirmação, o microcontrolador ativa o chaveamento do CF, carregando os capacitores. O CF possui um circuito de realimentação, de forma que a tensão nos capacitores possa ser medida indiretamente pelo microcontrolador. Assim
Figura 9 – Diagrama de blocos do estimulador multidirecional de alta intensidade (EAI)
que a tensão nos terminais dos capacitores atinge o valor inserido pelo usuário, o mi-crocontrolador interrompe o carregamento do CF. O mimi-crocontrolador aguarda um pulso do EBI, que está ligado à CE através do circuito comutador, para chavear a saída do EAI para os circuitos de disparo. No próximo pulso do EBI, o microcontrolador aciona o disparo do EAI na CE e, em seguida, desconecta a saída de ambos os estimuladores. Os capacitores são descarregados em um circuito interno de descarga. Ao reiniciar o ciclo, o EBI é novamente ligado à CE.
O EAI também possui uma chave de segurança que permite cessar o carregamento do CF e acionar a descarga dos capacitores independentemente do microcontrolador para casos em que o usuário deseje interromper o procedimento.
Este estimulador também foi utilizado para gerar pulsos monodirecionais de alta intensidade, em que a CE foi ligada a apenas uma saída de estímulo.
3.2.1
Microcontrolador
Foi utilizado um microcontrolador PIC18F4550 (Microchip Technolgy Inc., Chan-dler, AZ, USA) com um cristal de 20 MHz. O software foi desenvolvido em linguagem C no ambiente MPLAB IDE® (Microchip Technolgy Inc., Chandler, AZ, USA). A distribuição dos terminais utilizada encontra-se na Figura 10.
Quando o sistema é ligado, o circuito comutador, controlado pelos terminais RD2 e RD3 do microcontrolador, liga a saída ao EBI, de modo que os miócitos cardíacos possam ser estimulados com pulsos de baixa intensidade. Durante a estimulação de baixa
inten-Figura 10 – Circuito do microcontrolador
sidade, o usuário pode escolher a amplitude dos pulsos de alta intensidade por meio dos botões, controlados pelos terminais RD4-7 e RC6-7. O valor selecionado é visualizado no
display de cristal líquido (LCD), controlado pelos terminais RB0-7 do microcontrolador.
Quando o usuário confirma a amplitude de saída desejada, o microcontrolador envia pulsos para o CF (pulsos de 47 kHz, duty-cycle de 12 %, terminal RA3) e inicia a leitura do sinal de realimentação por meio do terminal RA0, configurado como entrada analógica (frequência de amostragem de 1,3 kHz). O pulso de chaveamento do CF é gerado por interrupções de alta prioridade disparadas pelo Timer0 do microcontrolador, e o sinal de realimentação é convertido pelo conversor analógico-digital (ADC) por uma rotina de interrupção.
A tensão de realimentação está relacionada com a tensão nos capacitores de alta tensão (ver ver seção 3.2.2), de modo que, assim que a tensão os capacitores de alta tensão atingir o valor inserido pelo usuário, o microcontrolador pare de enviar pulsos para o CF. Enquanto a leitura da tensão de realimentação e o envio de pulsos ocorrem, o LCD imprime o valor da tensão nos capacitores.
Assim que a tensão de saída atinge o valor desejado, o microcontrolador inicia um protocolo de sincronismo com o EBI. Quando o primeiro pulso ocorre, o microcontrolador detecta-o por intermédio do terminal RB1 (interrupção externa), aguarda 150 ms e posi-ciona o comutador de modo a ligar a CE às saídas dos circuitos de disparo. No próximo pulso do EBI, o microcontrolador aciona o disparo do EAI através dos terminais RE0, RE1 e RE2, um para cada saída. Cada pulso de alta intensidade é disparado separada-mente, com 5 ms de duração e 1 ms de intervalo. A duração dos pulsos é determinada por
uma interrupção do Timer3.
O microcontrolador desconecta os capacitores da CE por intermédio do circuito comutador e aciona o descarregamento dos capacitores do CF em resistores internos. Após o intervalo de 3 segundos, o usuário pode pressionar o botão de confirmação para repetir o ciclo.
O fluxo de execução do software encontra-se na Figura 11.
3.2.2
Conversor Flyback
O CF implementado encontra-se na Figura 12 e é composto de três circuitos: fonte Flyback, circuito de realimentação e circuito de proteção de sobrecorrente.
Figura 12 – Conversor Flyback
O sinal enviado para a fonte Flyback atravessa o circuito de proteção. Como indi-cado na Figura 10, o terminal RA3 (CHAVEAMENTO) do microcontrolador está conec-tado ao CF, através de uma porta AND (U4, Figura 12). Uma vez que a aplicação de 5 V não é suficiente para que Q1 entre em condução, o sinal de saída da porta AND está co-nectado a um comparador LM311 (U3, Figura 12), que eleva-o até 15 V. Este sinal aciona Q1, correspondente à chave T (Figura 7), que chaveia a corrente que passa pelo primário de TR1 e transfere energia da fonte de entrada (que possui uma tensão de 68 VCC) para
o fluxo magnético dos indutores. Quando o sinal de chaveamento vai para o nível baixo, não há canal em Q1 e o fluxo magnético mantém sua continuidade ao induzir correntes elétricas nas espiras secundárias de TR1, que atravessam os diodos D1 a D8 e carregam os capacitores C3 a C7. No próximo período do sinal de chaveamento, o primário volta a conduzir e os diodos impedem que a energia armazenada nos capacitores seja devolvida à fonte.
O circuito de realimentação está conectado ao terceiro enrolamento do transforma-dor. Durante o período em que os capacitores carregam, o secundário e o terciário de TR1 conduzem simultaneamente e estão magneticamente acoplados. Deste modo, a razão entre as diferenças de potencial entre seus terminais é igual à razão entre o número de voltas em cada espira, uma relação linear que permite a inferência da tensão nos capacitores
de alta tensão (C3 a C5, Figura 12) a partir da tensão no capacitor C6 (Figura 12). O número de voltas nas espiras de TR1 é 10 no primário, 224 no secundário e 5 no terciário (Figura 12). O capacitor C6 (Figura 12) foi conectado em paralelo a um divisor resis-tivo (R10 e R11, Figura 12), que reduz a tensão para níveis seguros para o ADC (tensão de realimentação). O microcontrolador converte a amplitude da tensão de realimentação para um valor digital por meio do terminal RA0 (FEEDBACK, Figuras 10 e 12), para tratamento em software. O diodo zener (D9, Figura 12) foi adicionado para garantir que a tensão de entrada jamais ultrapasse 5,1 V, protegendo o microcontrolador.
O circuito de proteção de sobrecorrente consiste de um sensor, um comparador e uma porta AND. A tensão nos terminais do sensor, resistor de 1 Ω (R8, Figura 12), é comparada (U3, Figura 12) com a tensão ajustada no potenciômetro (RV1, Figura 12). Deste modo, o valor da tensão em R8 é idêntico ao valor da corrente que o atravessa, de forma que o valor em volts ajustado no potenciômetro é idêntico ao valor máximo em ampéres da amplitude da corrente que atravessará o primário do CF. Este circuito mantém a saída do comparador em nível lógico alto (5 V) enquanto a corrente no resistor R8 é menor que a corrente de referência e em nível baixo caso contrário, ou seja, caso a corrente do primário ultrapasse a corrente ajustada no potenciômetro a saída do compa-rador vai para zero. O compacompa-rador está conectado a uma porta lógica AND (U4, Figura 12), cuja segunda entrada é o pulso de controle do microcontrolador. Quando a corrente do primário está abaixo da ajustada no potenciômetro, a saída da porta lógica é idêntica à do microcontrolador, e o circuito funciona exatamente como descrito acima. Caso con-trário, a saída é igual a zero. Dessa forma, os pulsos do microcontrolador não atingem o transistor Q1, desligando o chaveamento em TR1 e garantindo que a corrente circulando pelo CF não atinja valores elevados, acima de 5 A, evitando a queima de componentes. Este circuito funciona independentemente do microcontrolador, aumentando a segurança.
3.2.3
Circuito de disparo
O circuito de disparo dos pulsos de alta intensidade está apresentado na Figura 13.
Os três sinais de disparo do microcontrolador estão acoplados a três entradas de um driver ULN2003A (U5, Figura 13), que os converte de 5 V para 15 V. Cada saída do driver está conectada a um optoacoplador 4N25 (U6-8, Figura 13), que ativa seu respectivo Insulated Gate Bipolar Transistor (IGBT) IXBX25N250 (Q2-4, Figura 13). Ao ser acionado, cada IGBT permite que a carga armazenada no capacitor de seu circuito (C3-5, Figura 12) flua através da CE, passando pelo circuito comutador (seção 3.2.5). Note que os optoacopladores isolam eletricamente o circuito de controle do circuito de disparo, que chaveia a alta tensão.
Figura 13 – Circuitos de disparo do EAI. Os terminais de saída nos circuitos de disparo são conectados ao circuito comutador (seção 3.2.5)
são utilizados para monitoramento da corrente que atravessa os eletrodos da câmara, durante a aplicação do estímulo.
3.2.4
Circuito de descarga
O circuito de descarga (Figura 14), utilizado para garantir que não haja carga nos capacitores após a execução de um disparo, é semelhante ao circuito de disparo, com a diferença de que a carga armazenada nos capacitores será dissipada em resistores internos.
Figura 14 – Circuito de descarga dos capacitores após a execução do disparo
O sinal do microcontrolador alimenta a entrada do driver para conversão do sinal de 5 V em um sinal de 15 V. A saída do driver está acoplada à entrada de três optoacopladores 4N25 (U9-11, Figura 14), que acionam os respectivos IGBTs (Q5-7, Figura 14). Quando os IGBTs entram em modo de condução, a carga dos capacitores do CF é descarregada em três resistores de potência R23, R25 e R27 (10 Ω/20 W, Figura 14).
3.2.5
Circuito comutador
O circuito comutador é composto de um conjunto de seis relés para o chaveamento da saída entre o EBI e o EAI (Figura 15).
Figura 15 – Circuito comutador
Cada uma das três saídas possui dois relés de dois pólos/duas posições conectados em série. O primeiro relé é um HJR1-2C (Ningbo Tianbo Ganglian Electronics, Ningbo, Zhejiang, China) que chaveia entre uma entrada não conectada e o EBI e conduz sinais de baixa intensidade (relés de baixa intensidade, RL4-6, Figura 15). Sua saída está conectada a um AZ733 (American Zetler, Aliso Viejo, CA, USA) que chaveia entre o HJR1-2C (entrada não conectada ou EBI) e o EAI e suporta tensões de até 5kV (relés de alta intensidade, RL1-3, Figura 15). As saídas desses relés de alta intensidade constituem as saídas do EAI e foram conectadas aos eletrodos da CE.
Quando o programa inicia, o EBI está ligado à CE. Logo após o carregamento dos capacitores, os relés desconectam o EBI e conectam o EAI à CE para realização do disparo dos pulsos de alta intensidade em sincronismo com o EBI. Após o disparo, os dois estimuladores são desconectados da câmara e o ciclo pode ser reiniciado de acordo ao comando do usuário.
Cada conjunto de relés é controlado por um terminal independente do microcon-trolador: o terminal RD2 controla os relés de baixa intensidade e o terminal RD3, os relés de alta intensidade (Figura 10) com o auxílio do driver ULN2003A (U12, Figura 15). O diodo zener, ligado entre o driver e a fonte de alimentação, garante que apenas 12 V sejam aplicados aos relés.
3.2.6
Chave de segurança
A chave de segurança (chave alavanca 2 posições 6 terminais) permite que o ope-rador cesse o carregamento do CF e descarregue os capacitores quando achar conveniente. Na posição normal da chave, o microcontrolador é capaz de controlar o transistor do CF e de acionar a descarga dos capacitores. Quando ativada, a chave conecta a entrada de chaveamento do CF ao terra (terminal CHAVEAMENTO, 12) e a entrada do circuito de
descarga à fonte de 5 V, descarregando os capacitores (terminal DESCARGA, U5, figura 13).
3.3
Estimulador multidirecional de baixa intensidade
O EBI foi fabricado no Centro de Engenharia Biomédica, Unicamp, Campinas, SP. Ele possui três saídas que geram pulsos retangulares sem sobreposição temporal. Os pulsos são disparados sequencialmente, com um intervalo de 1 ms no modo bipolar ou de 7 ms no modo monopolar. Cada fase do pulso tem 5 ms de duração. Os estímulos são gerados a uma frequência de 0,5 Hz com amplitude máxima de 50 V. Os circuitos e sistemas de controle do chaveamento foram descritos por Fonseca et al. (2013).
3.4
Osciloscópio
Para observação e medição dos pulsos estimulatórios foi utilizado um osciloscópio digital (modelo TDS 2014C, 100 MHz, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA).
3.5
Microscopia
Durante os experimentos, a CE foi colocada sobre o estágio de um microscópio (Zeiss, Jena, Alemanha) adaptado. O sistema de iluminação é baseado em um light
em-miting diode (LED) branco de alta luminância alimentado por uma bateria de 9 V. A luz
atravessa a CE pelo orifício da peça de acrílico opaco (ver sessão 3.6), atingindo a objetiva (10x, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). A imagem das células foi captada por uma câ-mera de video (Webcam 3810 Leadership; 5 MP) fixada na parte superior do microscópio e exibida na tela de um computador (Laptop Dell Inspiron 5520; Intel Core i7 2,20 GHz; 8 GB RAM 1 TB HD; Ubuntu 14.04), como mostrado na Figura 8.
A razão de amplificação do sistema foi determinada utilizando-se uma lâmina mi-crométrica de calibração, cujo comprimento foi medido em pixels. Este valor foi utilizado como referência para determinação das dimensões de cada célula.
3.6
Câmara de estimulação
A CE (fabricada no Centro de Engenharia Biomédica, Unicamp, Campinas, SP) pode ser visualizada na Figura 16. Ela é constituída de material acrílico transparente cilíndrico com 10 mm de raio e 5 mm de altura (Bassani et al., 2006). Os eletrodos de platina, cada um com 5 mm de comprimento e 0,5 mm de diâmetro, foram posicionados
de 60o em 60o perpendicularmente à base da câmara, sendo que eletrodos diametralmente
opostos compõe uma direção de estimulação.
Figura 16 – Vista explodida da câmara de estimulação (CE) (Fonseca, 2009)
As células foram depositadas em uma lâminula de vidro apoiada sobre a base da câmara. Na base, há uma peça de acrílico opaco cujo centro possui um orifício de 2mm. Este orifício delimita a área de trabalho onde o E cuja direção varia menos que 1o e cuja
amplitude varia menos de 1% em relação ao campo no centro da câmara. O E dentro da área de trabalho é dado por (Bassani et al., 2006):
𝐸 = 2𝐼
𝑏𝜋𝜎ℎ (3.1)
Em que I é a corrente que atravessa os eletrodos, b = 10 mm é o raio, h = 5 mm, a altura e 𝜎 = 0,0146 Ω-1cm-1, a condutividade da solução de Tyrode Normal (NT)
3.7
Animais
Os miócitos cardíacos utilizados foram retirados de ratos Wistar adultos (3-7 meses de idade) de ambos os sexos. Os animais foram provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB/UNICAMP) e do Biotério do Centro de Engenharia Biomédica da Universidade Estadual de Campinas (CEB/UNICAMP). Eles foram aloja-dos em gaiolas coletivas, onde receberam água e ração à vontade, sob um ciclo claro-escuro de 12:12 horas. Os ratos não sofreram nenhuma manipulação experimental até o dia de serem sacrificados para o isolamento das células.
O procedimento experimental foi analisado pela Comissão de Ética na Experimen-tação Animal – Instituto de Biologia – UNICAMP e aprovado com o protocolo: 4093-1(I).
3.8
Soluções fisiológicas
As soluções utilizadas estão listadas a seguir, e as concentrações dos solutos estão expressas em milimolar (mM).
• Solução de Tyrode Normal (NT): NaCl 140, KCl 6, MgCl2.6H2O 1.5, HEPES 5,
glicose 11.1, CaCl2.2H2O 1.
• Solução de Tyrode para isolamento de células (TyCI): tem composição igual a NT, exceto por ter CaCl2 substituído por MgCl2 e conter 10 mM HEPES.
• Solução Krebs-Henseleit para isolamento de células: NaCl 115; KCl 4,6; KH2PO4
1,2; NaHCO3 25; MgSO4 2,4; glicose 11,1.
• Solução cardioplégica para dissociação e armazenamento das células (Cpl-P): KH2PO4
10; KCl 30; MgCl2 1; taurina 20; glicose 11; HEPES 10; ácido glutâmico 70; pH 7,4
a 23oC ajustado com KOH.
3.9
Isolamento de células
Os miócitos cardíacos utilizados foram retirados de ratos Wistar adultos (3-7 me-ses de idade) de ambos os sexos e isolados por digestão enzimática do coração (Penna & Bassani, 2010). Os animais foram sacrificados por exsanguinação sob anestesia profunda com isoflurano, com imediata retirada do coração. O coração foi perfundido com solução de Krebs-Henseleit sem cálcio a 37oC em um sistema de Langendorff por 5 minutos. Em seguida, o coração foi perfundido com a mesma solução contendo 0,5 mg/ml de colagenase tipo I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, EUA) por 15-20 minutos. A enzima foi removida por perfusão com solução de Tyrode para isolamento de células
(TyCI) contendo albumina sérica bovina (0,5 mg/ml) por cerca de 10 minutos. O tecido ventricular esquerdo foi então delicadamente triturado em solução cardioplégica para dis-sociação e armazenamento das células (Cpl-P), para disdis-sociação das células. A mesma solução foi usada para lavagem e armazenamento das células.
3.10
Protocolo experimental
Durante os experimentos, a temperatura do laboratório foi mantida em torno de 24oC.
3.10.1
Preparação da câmara
600 𝜇l de solução Cpl-P, contendo as células cardíacas isoladas, foram colocados em um tubo cônico para microcentrífuga (Eppendorf ) para sedimentação dos miócitos. Após 5 minutos, a solução sobrenadante foi removida e substituída pelo mesmo volume de solução NT.
A solução no Eppendorf foi homogeneizada e 100 𝜇l foram depositados na CE em cada experimento. Após 20 minutos para adesão das células, 1470 𝜇l de solução NT foram cuidadosamente adicionados à CE.
3.10.2
Dimensões e limiares de estimulação
Inicialmente, escolheu-se células alinhadas a algum par de eletrodos da câmara, com um desvio máximo de 5o. Uma imagem da célula em repouso foi utilizada para determinação das dimensões (comprimento e largura) da célula.
A célula foi estimulada com pulsos bipolares monodirecionais supralimiares de baixa intensidade, com duração de 5ms e frequência de 0,5 Hz, paralelos ao maior eixo da célula. Diminuiu-se gradativamente a amplitude do estímulo até que não houvesse resposta da célula. Considerou-se limiar de estimulação a menor amplitude de estímulo ao qual a célula respondeu com contração.
Os estímulos bipolares evitam a polarização dos eletrodos.
3.10.3
Determinação da relação entre o campo elétrico e letalidade
A estimulação supralimiar (1,2 x E limiar de estimulação) foi retomada para que as contrações do miócito entrassem em regime permanente. Um estímulo bipolar foi subs-tituído por um estímulo de alta intensidade (ver seção 3.2.1) de acordo com o grupo de estudo (ver seção 3.10) e a estimulação foi cessada. Caso não houvesse contração irrever-sível, esperava-se até 10 minutos para que a célula se recuperasse, a estimulação bipolar
era retomada e repetia-se o protocolo com estímulos cada vez maiores. O experimento era finalizado quando a célula apresentasse contração irreversível. Os valores dos pulsos de alta intensidade foram de 12, 16, 20, 25, 30 e 35 vezes o limiar de estimulação.
O E letal foi determinado para quatro grupos de células. Cada grupo foi nomeado de acordo com o estímulo de alta intensidade ao qual os miócitos foram submetidos:
• Grupo MONO: estímulos monodirecionais com pulso aplicado a 0o (paralelo ao
maior eixo da célula; N = 12).
• Grupo MULTI0: estímulos multidirecionais com pulsos aplicados a 0o, 60o e 120o,
respectivamente, com relação ao maior eixo da célula (N = 12).
• Grupo MULTI60: estímulos multidirecionais com pulsos aplicados a 60o, 120oe 180o, respectivamente, com relação ao maior eixo da célula (N = 12).
• Grupo MULTI120: estímulos multidirecionais com pulsos aplicados a 120o, 180o e
240o, respectivamente, com relação ao maior eixo da célula (N = 12).
Deste modo, estudamos os três casos em que um pulso coincide com a direção longitudinal da célula (0o ou 180o).
A aplicação dos estímulos está representada na Figura 17. A Figura 17A representa um miócito alinhado a um par de eletrodos sobre a área de trabalho da CE. Os eletrodos foram posicionados a cada 60o e cada par de eletrodos diametralmente opostos compõe
uma direção de estímulo.
O estímulo monodirecional de alta intensidade foi composto de um único pulso com duração de 5 ms (grupo MONO). Ele também foi produzido pelo EAI, mas apenas o primeiro canal estava conectado à CE (Figura 17A).
Os estímulos multidirecionais de alta intensidade consistiram em 3 pulsos com duração de 5 ms e intervalo de 1 ms entre eles (sem sobreposição temporal) aplicados no sentido horário. No grupo de células submetidas a estímulos de alta intensidade mul-tidirecionais, com primeiro pulso a 0o (MULTI0), o primeiro pulso foi sempre aplicado
paralelamente ao maior eixo da célula (direção longitudinal); o segundo, a 60o do
pri-meiro no sentido horário e o terceiro, a 120o, como indicado na Figura 17B. Para o grupo
MULTI60, o primeiro pulso foi aplicado a 60o da direção longitudinal do miócito; o
se-gundo, a 120o e o terceiro, a 180o (direção longitudinal, vide Figura 17C). Analogamente, para o grupo MULTI120, o primeiro pulso foi aplicado a 120o da direção longitudinal; o segundo, a 180o e o terceiro, a 240o, também representado na Figura 17D.??
Figura 17 – Protocolos de estimulação letal. A) Miócito (fora de escala) dentro da CE e protocolo de estimulação letal para o grupo MONO. B) Protocolo de estimu-lação letal para o grupo MULTI0. C) Protocolo de estimuestimu-lação letal para o grupo MULTI60. D) Protocolo de estimulação letal para o grupo MULTI120.
3.11
Processamento dos dados
Todos os cálculos foram realizados com auxílio do programa Prism 5.03 (Graph-Pad, San Diego, CA, EUA).
3.12
Determinação do potencial transmembrana induzido por um
estímulo
A máxima variação do potencial transmembrana (ΔVmax) foi calculada
utilizando-se o modelo proposto por Klee & Plonutilizando-sey (1976).
Resumidamente, o modelo supõe que a célula possui a forma de um esferoide prolato de comprimento 2c, largura 2a e altura 2a, dado pela equação (3.2).
(𝑥 𝑎) 2+ (𝑦 𝑎) 2+ (𝑧 𝑐) 2 = 1 (3.2)
A ΔVmax induzida por um campo elétrico aplicado a um ângulo 𝜃 em relação ao
eixo longitudinal da célula (eixo z) é dada por:
Δ𝑉max(𝐸, 𝜃, 𝑎, 𝑐) = 𝐸 * (𝑎2𝐴2𝑠𝑖𝑛2𝜃 + 𝑐2𝐶2𝑐𝑜𝑠2𝜃)
1
2 (3.3)
𝐴 = {1 − 1 2𝜖3(𝜖 + 1 − 𝜖2 2 𝑙𝑛( 1 − 𝜖 1 + 𝜖))} −1 𝐶 = {1 − 1 2𝜖3(2𝜖(𝜖 2− 1) − (1 − 𝜖2) + 𝑙𝑛(1 − 𝜖 1 + 𝜖))} −1 𝜖 = √︂ 1 − (𝑎 𝑐) 2 (3.4)
Em que 𝜖 é a excentricidade do esferoide e A e C são parâmetros dependentes da geometria da célula.
3.13
Análise estatística
Os dados obtidos relativos a comprimento, largura, E limiar e ΔVmax limiar dos
miócitos de cada um dos quatro grupos foram analisados utilizando-se três testes de nor-malidade (Kolmogorov-Smirnov, D’Agostino & Pearson e Shapiro-Wilk). A distribuição de um grupo foi considerada normal se pelo menos dois testes apresentassem p > 0,05.
As médias foram comparadas utilizando-se análise de variância monofatorial. Va-lores de p < 0,05 foram considerados indicativos de significância estatística. Os dados obtidos estão apresentados como média acompanhada do erro padrão da média.
3.13.1
Curvas de letalidade
Os valores obtidos para os campos elétricos letais e subletais máximos foram trata-dos utilizando análise de sobrevivência (Kaplan & Meier, 1958) seguida de uma regressão não linear (equação 3.5) para obtenção as curvas de letalidade.
𝑃 (𝐸) = 1
1 + (𝐸50𝐸 )ℎ (3.5)
Em que E50 é o valor do campo elétrico correspondente a 50% de letalidade e h é o coeficiente de Hill, que determina a inclinação da curva (Weisstein, 2015). Os parâmetros obtidos pelo ajuste não linear estão apresentados acompanhados do intervalo de confiança para 95% (IC95). A não sobreposição do IC95 entre dois grupos foi considerada indicativo de significância estatística.
4 Resultados
4.1
Estimulador multidirecional de alta intensidade
O EAI pode ser visualizado na Figura 18. A interface de usuário foi instalada na face superior da caixa (Figura 18A). Na face frontal (Figura 18B), estão a chave de segurança (seção 3.2.6), o conector para o EBI e os terminais de monitoramento da tensão e corrente em cada saída do EAI durante o disparo (seção 3.2.3). Na face lateral da caixa (Figura 18C), estão as três saídas do EAI, provenientes do circuito comutador (seção 3.2.5).
Figura 18 – Estimulador multidirecional de alta intensidade (EAI). (A) Vista superior. (B) Vista frontal. (C) Vista lateral (lado direito).
A Figura 19 é uma fotografia dos circuitos implementados. A divisão está de acordo com a divisão do diagrama em blocos apresentado na seção 3.2.
As formas de onda dos circuitos do EAI podem ser visualizadas na Figura 20. Quando o usuário pressiona o botão de confirmação (Figura 20A), o microcontrolador gera pulsos (Figura 20B) para o CF, que carrega os capacitores de saída (Figura 20C). O microcontrolador mede a tensão de saída de modo indireto, por meio do circuito de realimentação (Figura 20D), cuja tensão está relacionada com a tensão dos capacitores de saída. Assim que a tensão desejada é atingida, os pulsos são interrompidos, juntamente com o carregamento dos capacitores (Figura 20B, C e D). Com os capacitores carregados, o microcontrolador aguarda um pulso do EBI, que está acoplado à CE através do circuito comutador (Figura20E, segundo pulso) e aciona o relé (Figura 20F), que desacopla o EBI, concomitante com o relé que acopla o estágio de alta intensidade (Figura 20G). No próximo pulso do EBI, o EAI é acionado e dispara o estímulo na câmara (Figura 20 H).
Figura 19 – Circuito do estimulador multidirecional de alta intensidade (EAI). (A) Fontes. (B) Circuito de proteção do CF. (C) Conversor Flyback. (D) Microcontro-lador. (E) Driver dos circuitos de disparo e descarga. (F) Capacitores. (G) Circuitos de disparo e descarga. (H) Circuito comutador.
O microcontrolador desconecta os estimuladores da câmara (Figura 20G) por meio do circuito comutador e aciona o descarregamento dos capacitores por meio do circuito de descarga (Figura 20I e C), para garantir que não haja energia armazenada enquanto o sistema encontra-se em repouso. O EBI permanece desconectado da câmara até que o usuário pressione novamente o botão de confirmação (Figura 20F e A).
A corrente e a tensão na câmara durante a aplicação de um estímulo multidirecional estão apresentadas na Figura 21. Este sinal também está representado na Figura 20H. O tempo de subida e de descida dos pulsos é de cerca de 1,5 𝜇s. A constante de tempo do decaimento das ondas é de, aproximadamente, 10 ms. Note que o potencial gerado pelo E em uma direção pode ser detectado nos eletrodos das outras direções (Figura 21B, pulsos de menor amplitude.
A relação entrada-saída do estimulador está apresentada na Figura 22. A tensão de entrada é a selecionada pelo usuário, e a tensão de saída é a amplitude dos
estímu-Figura 20 – Formas de onda dos circuitos do estimulador de alta intensidade. A) Botão de confirmação (ativo alto); B) Pulsos de chaveamento do CF; C) Capacitor de saída; D) Feedback do CF; E) EBI; F) Relé HJR1-2C; G) Relé AZ733; H) Disparos na CE; I) Sinal de descarga dos capacitores.
Figura 21 – Corrente (A) e tensão (B) na câmara submetida à estimulação multidirecional
los disparados pelo EAI. Fez-se um ajuste linear dos pontos obtidos, obtendo-se VS =
Figura 22 – Relação entrada-saída do EAI. As linhas verticais indicam o erro-padrão da média. (N=5).
4.2
Relação entre a intensidade de estímulos multidirecionais e
le-talidade
A Tabela 1 contém as médias e os erros padrões dos valores de comprimento, largura, campo elétrico limiar (ET,MONO) e máxima variação do potencial transmembrana
limiar (ΔVmax,T,MONO) para estímulos monodirecionais bipolares de 5ms. Os valores de
comprimento, largura, ETe ΔVmax,T não foram estatisticamente diferentes entre os grupos
(p > 0,05).
Tabela 1 – Médias ± erros padrões da média do comprimento, largura, campo elétrico limiar de estimulação (ET,MONO), variação máxima do potencial
transmem-brana no limiar de estimulação ΔVmax,T,MONO para pulsos bipolares de 5ms
em cada fase. Não houve diferença estatística entre os grupos para qualquer variável (análise de monovariância fatorial).
MONO (N = 12) MULTI0 (N = 12) MULTI60 (N = 12) MULTI120 (N = 12) Comprimento[𝜇m] 126±4,3 127±5,3 120±2,5 122±3,7 Largura[𝜇m] 34,1±2,39 33,8±2,21 32,1±2,70 34,7±1,76 ET,MONO [V/cm] 2,93±0,11 3,02±0,17 3,04±0,12 3,00±0,13 ΔVmax,T,MONO [mV] 20,0±0,64 20,6±0,64 20,3±0,58 19,9±0,49
Os parâmetros (E50 e h) das curvas de letalidade (Figura 23) estão apresentadas na Tabela 2. Observa-se um pequeno deslocamento à direita das curva MULTI0 e MULT60 com relação à curva do grupo MONO.
